Arabidopsis thaliana Mutanten jin1 und jin4
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt der
Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät
(mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich)
der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von Anja Nickstadt
geb. am 12. Dezember 1974 in Wernigerode
Gutachter:
1. Prof. Dr. K. Humbeck
2. Prof. Dr. D. Scheel
"...und eines Tages war es soweit,
daß wir alles wieder verloren,
denn träumend stirbt eine alte Zeit,
und aus Träumen werden neue geboren."
Arthur O'Shaugressy
(1844-1881)
Nickstadt, A., Thomma, B.P.H.J., Feussner, I., Kangasjärvi, J., Zeier, J., Löffler, C., Scheel, D., Berger, S. (2004): The jasmonate-insensitive mutant jin1 shows increased resistance to biotrophic as well as necrotrophic pathogens. Molecular Plant Pathology 5 (5), 425-434
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis V
1. Einleitung 1
1.1 Reaktionen der Pflanze auf Stress 1
1.1.1 Interaktionen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen 1 1.1.2 Konstitutive und induzierbare pflanzliche Abwehrmechanismen 3
1.1.3 Induzierte Resistenzen (IR) 6
1.1.4 Signaltransduktion bei der Pathogenabwehr 6 1.1.5 Pseudomonas syringae als bakterielles Phytopathogen 8
1.1.6 Reaktion der Pflanzen auf Ozon 8
1.2 Jasmonate als pflanzliche Signalstoffe und deren Biosynthese 11
1.3 Arabidopsis thaliana Mutanten mit Veränderungen der
JA-Biosynthese und JA-Signaltransduktion
12
1.4 Kartierung von Mutationen 17
1.4.1 Molekulare Marker 17
1.4.2 Meiotische Rekombinationskartierung 18
1.5 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 19
2. Material und Methoden 20
2.1 Verwendete Materialien 20
2.1.1 Chemikalien und Enzyme 20
2.1.2 Geräte 20
2.1.3 Software und Websites 21
2.1.3.1 Software 21
2.1.3.2 Websites 21
2.1.4 Antibiotika 21
2.1.5 Radiochemikalien 22
2.1.6 Molekularbiologische „Kit“ Systeme 22
2.1.7 Enzyme 22
2.1.8 Restriktionsenzyme 22
2.2 Gängige Lösungen, Puffer und Medien 22
II
2.2.2 Herstellung häufig verwendeter Puffer und Lösungen 23
2.3 Verwendete Organismen 24
2.3.1 Pflanzen 24
2.3.2 Bakterien 24
2.4 Pflanzenanzucht und Stressbehandlung 24
2.4.1 Pflanzenanzucht 24
2.4.2 Sterilisation von Arabidopsis thaliana Samen 25 2.4.3 Agrobakterien vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana 25
2.4.4 Ozon-Experimente 26
2.4.4.1 Ozon-Behandlung 26
2.4.4.2 Quantifizierung des Zelltodes nach Ozonbehandlungen 26
2.4.5 Pathogenbehandlungen 26
2.4.5.1 Anzucht von Pseudomonas syringae 26
2.4.5.2 Infektion von Arabidopsis Pflanzen mit Pseudomonas syringae 27 2.4.5.3 Bestimmung des Pseudomonas Wachstums in der Pflanze 27 2.4.6 Bestimmung des Chlorophyllgehalts in Arabidopsis Blättern 27
2.4.6.1 Aceton-Methode 27
2.4.6.2 Bestimmung mittels SPAD-Analyser 28
2.4.7 Flottieren von Pflanzen 28
2.5 Molekularbiologische Techniken 28
2.5.1 Verwendete Bakterienvektoren 28
2.5.2 Methoden zur Nukleinsäurechemie 29
2.5.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA 29
2.5.2.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Pflanzengewebe (Quick DNA MiniPrep)
29
2.5.2.3 DNeasy Plant Kit 30
2.5.2.4 DNA-Isolation aus Blättern 30
2.5.2.5 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzengewebe 30 2.5.2.6 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA und RNA 31 2.5.2.7 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA 31 2.5.2.8 Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA 31 2.5.2.9 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 31
2.5.2.10 Restriktionsverdau 31
2.5.2.11 Ligation 32
2.5.3 Transfertechniken 32
III
2.5.3.2 Southern Blot 32
2.5.4 Radioaktive Markierung von Nukleinsäure-Fragmenten 33 2.5.4.1 DNA-Hybridisierungsexperimente (Southern-Analysen) 33 2.5.4.2 RNA-Hybridisierungsexperimente (Northern-Analysen) 33 2.5.4.3 Visualisierung mittels Phosphorscreen 33
2.5.5 PCR 34 2.5.5.1 Standard-PCR 34 2.5.5.2 Semiquantitative RT-PCR 35 2.5.5.3 Inverse PCR 35 2.5.5.4 3’Race -PCR 35 2.5.5.5 Kolonie-PCR 36
2.5.6 Klonierung von PCR-Produkten 36
2.5.7 Sequenzierung 36
2.5.7.1 Automatisierte Sequenzierung 37
2.5.7.2 Computergestützte Sequenzdatenverarbeitung 37
2.6 Mikrobiologische Methoden 37
2.6.1 Herstellung von Glycerinkulturen 37
2.6.2 Herstellung kompetenter Zellen (Escherichia coli) 37
2.6.3 Transformation von Escherichia coli 37
2.6.4 Transformation von Agrobacterium tumefaciens 38
2.7 Übersicht über die verwendeten Primer 39
3. Ergebnisse 41
3.1 Charakterisierung der Mutanten jin1 und jin4 41
3.1.1 Einfluss von Methyljasmonat und Coronalon auf das Wurzelwachstum
41 3.1.2 Infiltration von Pseudomonas syringae 43
3.1.2.1 Makroskopische Beobachtungen 43
3.1.2.3 Einfluss von Pseudomonas syringae-Infiltrationen auf den Chlorophyllgehalt der Blätter
44 3.1.2.4 Vergleich der Bakterienausbreitung in Wildtyppflanzen und
Mutanten
46 3.1.2.5 Genexpression nach Infiltration von Pseudomonas syringae 49
3.2 Vergleichende Untersuchungen zur Ozonempfindlichkeit der
Mutanten jin1 und jin4
56 3.2.1 Untersuchte Wildtypen, Mutanten und Doppelmutanten 56
IV
3.2.2 Ozonbehandlungen 58
3.2.3 Expression ozonresponsiver Gene 63
3.3 Kartierung des jin1 Locus 65
3.3.1 Vorarbeiten (Grobkartierung) 65
3.3.2 Feinkartierung von jin1 66
3.4 Sequenzierung von AtMyc2 in jin 68
3.5 Komplementation des Mutantenphänotyps 73
3.5.1 Komplementation unter Kontrolle des 35S-Promotors 73 3.5.2 Komplementation unter Kontrolle des endogenen Promotors 75
3.6 Untersuchungen zur Expression von AtMYC2 77
3.6.1 In welchen Pflanzenteilen wird AtMYC2 exprimiert? 77 3.6.2 Expression von AtMYC2 nach Verwundung 78 3.6.3 Expression von AtMYC2 nach Applikation von Abscisinsäure und
Methyljasmonat
78 3.6.4 Expression von AtMYC2 nach Infiltration von Pseudomonas syringae
pv. tomato
79
4. Diskussion 81
4.1 Auswirkung der Jasmonatinsensitivität auf die
Pathogenresistenz
81 4.1.1 Welchen Einfluss hat das Phytotoxin Coronatin auf die Resistenz von
jin1 ?
82 4.1.2 Sind veränderte Salizylat- oder Jasmonat-Spiegel für die Resistenz
von jin1 verantwortlich?
83 4.1.3. Führt die veränderte Expression von Abwehrgenen zur gesteigerten
Resistenz von jin1
85 4.1.3.1 Expression jasmonatresponsiver Gene 85 4.1.3.2 Expression nicht jasmonatresponsiver Gene 86
4.2 Auswirkung der Jasmonatinsensitivität auf die Ozonsensitivität 89
4.3 AtMYC2 - ein neues Element der Jasmonat-Signaltransduktion 91
4.4 Weiterführende Arbeiten 95
5. Zusammenfassung 97
6. Literaturverzeichnis 99
Abkürzungsverzeichnis
ABA Abscisinsäure Abb. Abbildung
BAC "bacterial artificial chromosome" bp Basenpaare
bzw. Beziehungsweise ca. zirka
cDNA komplementäre DNA
cfu koloniebildende Einheiten ("colony forming units") cm Zentimeter
cM ZentiMorgan
DNA Internationale Bezeichnung für Desoxyribonukleinsäure d.h. das heißt
EtBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol
g Gramm
h Stunden
HR hypersensitive Reaktion ("hypersensitive reaction") ISR induzierte systemische Resistenz
JA Jasmonate
kb Kilobasenpaare kD Kilodalton
L Liter
LAR lokal erworbene Resistenz ("local acquired resistance")
M molar
MeJA Methyljasmonat min Minuten
MIPS Munich information center for protein sequences, GSF µg Mikrogramm mg Milligramm ml Milliliter µl Mikroliter mM millimolar µM mikromolar mRNA messenger RNA
nl Nanoliter
OCD oxidativer Zelltod ("oxidative cell death") OD optische Dichte
ORF offenes Leseraster ("open reading frame")
PCD programmierter Zelltod ("programmed cell death") PCR Polymerasekettenreaktion
Psm Pseudomonas syringae pv. maculicola
Pst Pseudomonas syringae pv. tomato
RNA Internationale Bezeichung für Ribonukleinsäure ROS reaktive Sauerstoffspezies ("reactive oxygen species") RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkription mit anschließender Polymerasekettenreaktion sec. Sekunden
SA Salizylsäure (Salicylic acid)
SAG glucosidisch gebundene Salizylsäure
SAR systemisch erworbene Resistenz ("systemic acquired resistance") SD Standardabweichung
Tab. Tabelle
rpm runs per minute (Umdrehungen pro Minute) z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
Ein- und Drei-Buchstaben-Code der Aminosäuren:
A Ala Alanin M Met Methionin
C Cys Cystein N Asn Asparagin
D Asp Asparaginsäure P Pro Prolin E Glu Glutaminsäure Q Gln Glutamin F Phe Phenylalanin R Arg Arginin
G Gly Glycin S Ser Serin
H His Histidin T Thr Threonin
I Ile Isoleucin V Val Valin
K Lys Lysin W Trp Tryptophan
1. Einleitung
1.1 Reaktionen der Pflanze auf Stress
Pflanzen besitzen in der Regel nicht die Fähigkeit der freien Ortsbewegung. Sie ha-ben daher im Laufe der Evolution ein breites Spektrum an Methoden entwickelt, um auf Veränderungen der Umweltbedingunge n wie Licht, Wasser, Nährstoffe, Schadstoffe, Berührung bzw. Verwundung oder Befall durch phytopathogene Orga-nismen reagieren zu können. Pflanzen sind einer Vielzahl verschiedener Pathogene wie z.B. Bakterien, Viren und Pilzen ausgesetzt, die in der Landwirtschaft nicht sel-ten zu erheblichen Ertragseinbußen führen (Oerke et al., 1994; Baker et al., 1997). Gegenstand der modernen Phytopathologie ist es daher, die molekularen Grundla-gen des Wechselspiels zwischen Pflanze und Mikroorganismus aufzuklären.
1.1.1 Interaktionen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen
Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und pathogenen Mikroorganismen können in kompatible (verträgliche) und inkompatible (unverträgliche) Interaktionen unterteilt werden (Prell, 1996). Bei einer kompatiblen Interaktion wird das Pathogen als viru-lent bezeichnet, da es die Wirtspflanze besiedeln und sich auf bzw. in ihr vermehren kann. Dadurch wird die Wirtspflanze geschädigt. Bei der Infektion mit avirulenten Phytopathogenen spricht man von einer inkompa tiblen Interaktion, bei der durch Abwehrmechanismen eine weitere Vermehrung des Pathogens eingeschränkt bzw. verhindert wird.
Einen Sonderfall stellt die Toleranz dar. Hierbei zeigt die Pflanze trotz massiven Pa-thogenbefalls keine oder nur schwach ausgepr ägte Krankheitssymptome (Agrios, 1997).
Im Regelfall sind Pflanzen gegenüber den meisten potentiell pathogenen Mikroorga-nismen resistent (Bell, 1981). Diese Art der Resistenz wird als Basis- oder Nicht-Wirts-Resistenz bezeichnet (Ebel & Scheel, 1992; Prell, 1996) und ist genetisch de-terminiert. Bei der Basisresistenz sind die meisten potentiell pathogenen Mikroor-ganismen nicht in der Lage, die konstitutiven Abwehrbarrieren der Pflanzen zu überwinden (Heath, 2000). Wird die Pflanze dennoch von einem Pathogen befallen, kann der betroffene Bereich durch die Aktivierung induzierbarer
Abwehrmechanis-men lokal abgegrenzt werden. Die MechanisAbwehrmechanis-men der Nicht-Wirts-Resistenz werden auch unter dem Begriff der Basisinkompatibilität zusammengefasst. Die Interaktion zwischen Pflanze und Pathogen ist inkompatibel.
Gelingt es einem Pathogen, die Abwehrmechanismen der Pflanze zu überwinden, spricht man von Basiskompatibilität. Diese Interaktion ist kompatibel und die Pflanze erkrankt (Hammond-Kossack & Jones, 2000; Heath 2000). Durch die Ent-wicklung von Rassen-Sorten-spezifischen Mechanismen kann diese vonseiten der Pflanzen jedoch wieder in eine inkompatible Interaktion umgewandelt werden. Die meisten pathogenen Mikroorganismen sind nur auf die Besiedelung eines engen Wirtspflanzenspektrums spezialisiert. Allerdings können auch bei diesen Wirts-pflanzen Resistenzen ausgeprägt sein (Heath 2000, Rausher, 2001). Bei diesen Wirtsresistenzen wird zwischen horizontaler (genereller/quantitativer) und vertika-ler (spezifischer/qualitativer) Resistenz unterschieden.
Bei der horizontalen Resistenz, häufig auch als Feldresistenz bezeichnet, ist ein Ge-notyp einer Pflanzenart gegenüber einigen bzw. allen Rassen eines Pathogens resis-tent. Diese Art der Resistenz, die unter komplexer genetischer Kontrolle steht, ist zwar dauerhaft und rassenunspezifisch, aber zumeist unvollständig.
Bei der vertikalen Resistenz sind Pflanzen nur gegenüber bestimmten Rassen eines Pathogens resistent (Prell, 1996). Diese Form der Wirtsresistenz ist monogenetisch determiniert und wird durch die "Gen-für-Gen-Hypothese" (Flor, 1971) beschrieben. Die "Gen-für-Gen-Hypothese" basiert auf dem "Schlüssel-Schloss-Prinzip", das heißt zu jedem resistenzvermittelnden Wirtsgen (Resistenzgen, R) existiert aufseiten des Pathogens ein korrespondierendes Avirulenzgen (Avr). Die meisten Resistenzge-ne der Pflanzen sind dominant. Hingegen sind beim Pathogen die AvirulenzgeResistenzge-ne dominant. Nur beim Aufeinandertreffen eines dominanten Resistenzgens und eines dominanten Avirulenzgens kommt es zu einer spezifischen Resistenzreaktion. Die direkte oder indirekte Interaktion dieser Genprodukte führt zur Auslösung von Ab-wehrreaktionen und somit zur Resistenzausprägung (van der Biezen & Jones, 1998; Takken & Joosten, 2000; Dangl & Jones, 2001; Schneider, 2002). Bei allen anderen Kombinationen liegt eine kompatible Interaktion vor und die Pflanze ist anfällig. Bislang wurden mehr als 40 R-Gene identifiziert (Hammond-Kosack & Parker, 2003). Diese R-Gene verfügen häufig über leucinreiche Sequenzwiederholungen (LRRs, "leucine rich repeats") und „coiled-coil“-Domänen, wodurch sie in der Lage sind, Protein/Protein-Wechselwirkungen einzugehen (Kobe & Kajava, 2001).
Durch die Erkennung von Pathogenen werden in Pflanzen verschiedene Abwehrme-chanismen induziert. Die Erkennung des Pathogens, also die Fähigkeit zwischen "eigen" und "fremd" zu unterscheiden, bildet die Grundlage der Aktivierung von
Ab-wehrmechanismen der sogenannten angeborenen Immunität ("innate immunity") (Nürnberger & Brunner, 2002; Nürnberger & Scheel, 2001).
1.1.2 Konstitutive und induzierbare pflanzliche Abwehrmechanismen
Pflanzen stehen zur Abwehr von Pathogenen zwei unabhängige Wege zur Verfü-gung: die konstitutive präformierte Abwehr und die induzierte Abwehr.
Zu den konstitutiven präformierten Abwehrmechanismen zählen vor allem strukt u-relle und chemische Barrieren, die einen primären Schutz gegen das Eindringen von Pathogenen darstellen. Hierzu gehören durch Lignineinlagerung verstärkte Zellwände, die Kutikula mit Kutin- und Suberineinlagerungen sowie die Anzahl und Beschaffenheit der Stomata und in der Zellwand gespeicherte antimikrobielle Sub-stanzen, die das Eindringen und das Wachstum der Pathogene hemmen. Antibi o-tisch wirkende Substanzen findet man auch als Glykosidderivate in der Vakuole, die nach dem Eindringen des Pathogens in die Zelle durch Abspaltung des Zucker-restes induziert werden können (Osbourn, 1996).
Neben den konstitutiven Abwehrmechanismen existieren in Pflanzen eine Vielzahl induzierbarer Abwehrmechanismen, die ein weiteres Eindringen des Pathogens ver-hindern. Diese können sowohl durch das Pathogen selbst als auch durch Verwun-dung oder spezifische Signalmoleküle, sogenannte Elicitoren, ausgelöst werden (Maleck & Dietrich, 1999). Als Elicitoren werden Signalsubstanzen bezeichnet, die in Pflanzen Abwehrreaktionen auslösen können (Boller, 1995; Ebel & Scheel, 1997; Nürnberger, 1999). Ursprünglich wurden unter dem Begriff Elicitor nur die Molekü-le verstanden, die die Bildung und Akkumulation von PhytoaMolekü-lexinen (niedermoMolekü-leku- (niedermoleku-lare, antimikrobiell wirkende Substanzen) induzieren (Keen, 1975; Darvill & Albers-heim, 1984).
Zu den induzierbaren pflanzlichen Abwehrmechanismen gehören u.a. Modifikatio-nen der pflanzlichen Zellwand, die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies ("oxidati-ve burst"), die Bildung von Phytoalexinen und PR - ("pathogenesis-related") Protei-nen. Die Induktion von Abwehrmechanismen auf lokaler Ebene erfolgt bereits weni-ge Minuten bis Stunden nach Kontakt mit dem Pathoweni-gen. Die Ausbildung einer sys-temischen Resistenz als Schutz gegen erneuten Pathogenbefall kann dagegen meh-rere Tage dauern.
Zellwandmodifikationen erlauben es der Pflanze, den mechanischen Einwirkungen und der Aktivität hydrolytischer Enzyme von Seiten des Pathogens standzuhalten und somit dessen Eindringen zu verhindern bzw. zu erschweren. Dies kann durch die Einlagerung von Zellwandbestandteilen wie z.B. Kallose, Lignin, Suberin und
prolinreicher Glykoproteine erreicht werden (Bowles, 1990). Diese Substanzen wer-den z.T. zur weiteren Stabilisierung polymerisiert oder untereinander vernetzt (Hammond-Kosack & Jones, 1996).
Eine frühe Komponente der pflanzlichen Pathogenabwehr, die bereits wenige Minu-ten nach Pathogenbefall bzw. Elicitierung auftritt, ist der "oxidative burst" (Lamb & Dixon, 1997). Hierbei handelt es sich um eine schnelle und transiente Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies ("reactive oxygen species", ROS), wie z.B. Super-oxidanionen, Hydroperoxyl- und Hydroxylradikalen sowie Wasserstoffperoxid (Lamb & Dixon, 1997). Die reduktive Bildung von ROS aus atmosphärischem Sauerstoff beruht auf der Aktivität membrangebundener NADPH-Oxidasen und/oder apo-plastischer Peroxidasen (Kombrink & Somssich, 1995).
Für ROS werden in Pflanzen verschiedene Funktionen bei der Resistenzantwort diskutiert. In Abwehrreaktionen gegen Pathogene besitzen ROS zunächst direkt an-timikrobielle Eigenschaften, sie haben aber auch eine Funktion bei der oxidativen Vernetzung von Glykoproteinen mit der Zellwand, bei der Auslösung von Signaltransduktionskaskaden und der Hypersensitiven Reaktion ((Levine et al., 1994; Lamb & Dixon 1997, Nürnberger et al., 1997; Bolwell, 1999; Mittler, 2002). Vor allem in inkompatiblen Interaktionen von Pflanzen und Pathogenen kommt es nach einer schnellen Bildung von O2-. Und H2O2 zu einem weiteren, z.T. länger an-dauernden "oxidative burst" (Baker & Orlandi, 1995; Lamb & Dixon, 1997; Scheel, 2002), was zum Absterben der Pflanzenzellen am Infektionsort führen kann. Dieser frühe Abwehrmechanismus der Pflanze auf lokaler Ebene wird auch als Hypersensi-tive Reaktion (HR) bezeichnet. Die HR dient vermutlich dazu, das weitere Eindrin-gen eines PathoEindrin-gens zu verhindern und seine Ausbreitung auf einen möglichst klei-nen Gewebeabschnitt zu beschränken. Da es sich bei der HR um eiklei-nen aktiven Vorgang handelt, der die Biosyntheseleistung der Pflanze erfordert, wird die HR als Form des programmierten Zelltods (PCD, "programmed cell death") betrachtet. Im Zuge der HR kommt es zu Modifikationen der Zellwand, Membranschädigungen, Elektrolytverlust, Lipidperoxidation, Induktion von Enzymen, Dekompartimentie-rung, Degeneration der DNA und zur Bildung apoptotischer Vesikel (Dangl et al., 1996). Dies führt schließlich zum Kollabieren der Zellen. Durch das Absterben der Zellen wird den biotrophen Pathogenen die Nahrungsgrundlage entzogen und ein weiteres Ausbre iten verhindert (Hammond-Kosack & Jones, 1996). Dagegen kommt es bei der Besiedlung mit hemibiotrophen Pathogenen häufig zur Freisetzung toxi-scher Verbindungen aus den Vakuolen (Dangl et al., 1996).
Eine erfolgreiche Abwe hrreaktion der Pflanze gegenüber Pathogenen setzt jedoch nicht immer das Auftreten einer HR voraus. So zeigen Arabidopsis thaliana dnd
Mutanten ("defense, no death") trotz fehlender Hypersensitiver Reaktion eine erhöh-te Resiserhöh-tenz gegenüber pathogenen Bakerhöh-terien (Clough et al., 2000). Umgekehrt sind die Arabidopsis thaliana eds Mutanten ("enhanced disease susceptibility") an-fällig gegenüber Pathogenen, obwohl eine Hypersensitive Reaktion auftritt (Rogers & Ausubel, 1997; Dewdney et al., 2000).
Nach Pathogenbefall werden in Pflanzen nahe der Infektionsstelle Phytoalexine ak-kumuliert (Dixon, 1986). Bei Phytoalexinen handelt es sich um niedermolekul are Substanzen verschiedener Stoffklassen, die sich durch eine antimikrobielle Wir-kung auszeichnen (Paxton, 1981). Bennet & Wallsgrove (1994) zeigten eine Korrela-tion zwischen Phytoalexinsynthese und Resistenz der Pflanze gegen Pathogene. Zu-nächst wurde vermutet, dass H2O2 die Bildung von Phytoalexinen induzieren kann und somit eine direkte Verbindung zwischen der Bildung reaktiver Sauerstoffspe-zies und der Induktion der Phytoalexinproduktion besteht. Untersuchungen zeigten jedoch, dass die Produktion von ROS nicht unbedingt für die Induktion der Phytoa-lexinsynthese erforderlich ist (Devlin & Gustine, 1992; Degousée et al., 1994; Wojtaszek et al., 1997).
Wenige Minuten bis Stunden nach Pathogenbefall akkumulieren in Pflanzen die Transkripte einer Vielzahl "pathogenesis-related proteins" (PR-Proteine) und anderer "defense-related proteins". Bisher wurden mindestens 17 PR-Protein-Familien klas-sifiziert, die $-1,3-Glucanasen, Chitinasen, Proteinase-Inhibitoren, Endoproteinasen und Peroxidasen sowie Proteine mit antifungalen Eigenschaften umfassen (Collinge
et al., 2002; Christensen et al., 2002). Die Induktion verschiedener PR-Proteine ist
salizylatabhängig (z.B. PR1, PR2 und PR5) und gilt als Marker (vor allem PR1) für die Aktivierung der Pathogenabwehr (Salmeron & Vernooij, 1998; Kinkema et al., 2000; Glazebrook, 2001).
Arabidopsis-Mutanten, die eine veränderte Expression von PR-Genen aufweisen,
verdeutlichen die Bedeutung von PR-Proteinen in der Pathogenabwehr. So führt die konstitutive Expression von PR-Genen in den cpr Mutanten (cpr1, cpr5 oder cpr6: “constitutive expression of pr1", "pr5" bzw. “pr6") zu erhöhter Resistenz (Clarke et al., 1998, 2000; Bowling et al., 1997; Glazebrook, 2001). npr1 Mutanten (“non
expres-sion of pr1") von A. thaliana, in denen keine Expresexpres-sion von PR1 stattfindet,
verfü-gen dageverfü-gen über eine verminderte Resistenz geverfü-genüber einiverfü-gen Pathoverfü-genen (Gla-zebrook, 1999; Kinkema et al., 2000).
1.1.3 Induzierte Resistenzen (IR)
Bereits zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurde beobachtet, dass die Behandlung von Pflanzen mit nur schwach virulenten Pathogenrassen vor einer später folge nden Infektion mit einer virulenten Rasse des Pathogens schützen kann (Ray, 1901; Chester, 1933). Die induzierte Resistenz wirkt gegen ein breites Spektrum an Phy-topathogenen (Kessmann et al., 1994) und kann mehrere Tage bis Monate anhalten (Schneider et al., 1996).
Bei der salizylsäureabhängigen induzierten Resistenz wird zwischen systemisch er-worbener Resistenz (SAR, "systemic acquired resistance") und lokal erer-worbener Re-sistenz (LAR, "local acquired resistance") unterschieden (Ross, 1961a & 1961b). Bei der LAR werden die Abwehrmechanismen durch endogene Signale nur in den Zellen aktiviert, die sich in unmittelbarer Nähe der Infektionsstelle befinden. Dagegen wird bei der SAR der Reiz vom Ort des Befalls über endogene Signale in weiter entfernte, befallsfreie Pflanzenteile geleitet und löst dort die entsprechenden Abwehrmecha-nismen aus, die zu einer Immunisierung der Pflanze gegen einen weiteren Befall mit Pathogenen führt. Das Auftreten der SAR ist mit der Expression verschiedener Gene verbunden (Ward et al., 1991; Sticher et al., 1997), deren Genpr odukte eine direkte antimikrobielle Wirkung gegen Pathogene besitzen, andere gehören z.B. zu den PR-Proteinen (Ryals et al., 1994).
An der durch Rhizobakterien (meist Pseudomonaden) ausgelösten induzierten sys-temischen Resistenz (ISR), die salizylsäureunabhängig vermittelt wird, sind als Sig-nalmoleküle Ethylen und Jasmonate beteiligt. Die ISR löst Abwehrreaktionen in entfernten Geweben aus, die zur Resistenz gegen Blattpathogene führen und unab-hängig von der Expression von PR-Genen sind (van Wees et al., 2000). Sowohl ISR, als auch SAR werden durch NPR1 vermittelt, ein Gen, das bisher nur in die durch Salizylsäure vermittelte Abwehr von Pathogenen eingeordnet wurde (Cao et al., 1997; Feys & Parker, 2000).
1.1.4 Signaltransduktion bei der Pathogenabwehr
Die Auslösung von Abwehrreaktionen gegen Phytopathogene setzt die Erkennung des Pathogens bzw. eines von ihm freigesetzten Elicitors durch pflanzliche Rezept o-ren voraus. Dabei stellen Signaltransduktionskaskaden die Verbindung zwischen der Erkennung durch die Pflanze und der Resistenzantwort dar. Als ein erstes frü-hes Element der Signaltransduktion auf intrazellulärer Ebene fungieren hierbei
Än-derungen der Ionenpermeabilität der Plasmamembran (Nürnberger & Scheel, 2001). Es kommt zum Öffnen von Ionenkanälen, was den Einstrom von Ca2+ und H+ sowie den Ausstrom von K+ und Cl- zur Folge hat (Nürnberger et al., 1994). Der erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel kann einerseits die Auslösung von Phosphorylie-rungskaskaden bewirken, die wichtige posttranskriptionelle Regulationsmechanis-men darstellen. In diesem ZusamRegulationsmechanis-menhang wird die Aktivierung von MAPK-Kaskaden diskutiert, die zur Induktion von Abwehrmechanismen führen (Zwerger & Hirt, 2001). Auf der anderen Seite induzieren der Anstieg des cytosolischen Ca2+ -Gehaltes und die Depolarisierung der Plasmamembran die extrazelluläre Produkti-on vProdukti-on ROS und führen somit zum "oxidative burst" (Scheel, 1998; Bl ume et al., 2000). Inwieweit ROS als sekundäre Botenstoffe (sogenannte "second messenger") agieren, ist noch nicht völlig geklärt. Es gibt jedoch Hinweise, dass reaktive Sauer-stoffspezies nicht alleine Abwehrreaktionen auslösen, sondern weitere Signalmole-küle erforderlich sind. So wurde zusammen mit ROS auch Stickstoffmonoxid (NO) als "second messenger" bei der Aktivierung von Abwehrreaktionen beschrieben (Durner & Klessig, 1999; Delledone et al.,1998, 2001).
Als weitere endogene Signalmoleküle kommen Salizylsäure (SA), Jasmonate (JA) und Ethylen, die nach Pathogenkontakt (aber auch nach Verwundung und Umwelt-stress) synthetisiert werden, in Frage. Diese Moleküle können über den Gasraum, durch Diffusion oder aktiv durch die Leitgewebe transportiert werden.
Eine Schüsselrolle nimmt hier die Salizylsäure ein, die sowohl an der lokalen Ab-wehr als auch an der SAR beteiligt ist. Arabidopsis-Mutanten, die ein Hybrid-Gen aus zwei bakteriellen Genen der Salizylsäure -Biosynthese exprimieren, weisen ei-nen erhöhten SA-Gehalt im Cytosol und damit einhergehend eine erhöhte Resistenz gegenüber Pathogenen auf (Mauch et al., 2001). In nahG-Pflanzen, die die bakteriel-le Salizylathydroxylase konstitutiv exprimieren, wird SA zu Katechol abgebaut und kann so nicht mehr akkumulieren (Durner et al., 1997). Diese Pflanzen sind nicht in der Lage, die SAR auszuprägen (Gaffney et al., 1993). Auch die Arabidopsis-Mutanten sid1- und sid2 (salicylic acid-induction deficient) zeigen bei fehlender SA-Akkumulation eine erhöhte Pathogenanfälligkeit (Nawrath & Métraux, 1999).
Als Teil der Signaltransduktion, die zur Expression von PR-Genen führt, wurde in Tabak eine MAP-Kinase identifiziert, die durch SA induziert werden kann: SIPK
(SA-inducible protein kinase) (Zhang & Klessig, 1997). Ein weiteres Element dieser
Signaltransduktion "stromabwärts" der SA-Akkumulation stellt NPR1 dar.
Neben der durch Salizylsäure vermittelten Genaktivierung spielen auch die Phyto-hormone Ethylen und Jasmonsäure bei Abwehrreaktionen eine bedeutende Rolle (Pieterse & van Loon, 1999). Während der HR nach Pathogenbefall und
Verwun-dung steigt der Ethylengehalt, was zu weiteren Abwehrreaktionen führt. Hier zu nennen sind die beschleunigte Seneszenz, das Abtrennen befallener Organe und die Induktion spezifischer Gene (Chang & Shockey, 1999).
Eng verbunden mit dem durch Verwundung ausgelösten Anstieg des Ethylengehal-tes ist die Erhöhung des Jasmonsäure- bzw. JasmonatgehalEthylengehal-tes.
1.1.5 Pseudomonas syringae als bakterielles Phytopathogen
In den letzten Jahre rückten verstärkt die beiden nahe verwandten Stämme
Pseu-domonas syringae pv. tomato (Pst) und PseuPseu-domonas syringae pv. maculicola (Psm)
in das Interesse der Arabidopsis-Forschung (Preston, 2000). Bereits 1991 erkann-ten Whalen et al. die Möglichkeit, mit Hilfe der genannerkann-ten Organismen die Interak-tionen zwischen Pflanzen und Bakterien zu studieren. Auch in der vorliegenden Ar-beit soll die Interaktion zwischen Arabidopsis thaliana Pflanzen und den oben ge-nannten Pseudomonaden untersucht werden.
Pseudomonas syringae ist ein gram-negatives, obligat aerobes, stäbchenförmiges
und polar begeißeltes Bakterium. Es zählt phylogenetisch zur g-Gruppe der Prote o-bakterien. Mit über 50 Pathovarietäten besitzt P. syringae ein großes Wirtsspekt-rum. Die Bezeichnung Pathovarietät (pv.) steht dabei für die Fähigkeit eines Stam-mes, auf einer bestimmten Wirtspflanze pathogen zu sein, d.h. auf dieser Pflanze Krankheiten hervorrufen zu können. Verschiedene Pathovare werden zusätzlich in sogenannte physiologische Rassen eingeteilt. Diese Rassen sind phänotypisch nicht unterscheidbare Untereinheiten eines Pathovars, die nur einzelne Kultivare einer Wirtspflanze befallen können.
1.1.6 Reaktion der Pflanzen auf Ozon
Neben Pathogenen sind Pflanzen, vor allem in Industrieländern, Luftschadstoffen wie Ozon ausgesetzt. Das Gas Ozon (O3) wurde 1839 von Christian F. Schönbein bei der Elektrolyse von Wasser entdeckt und nach dem griechischen „ozein“ (das Duf-tende) benannt. Ozon ist ein bei Raumtemperatur blaues Gas und zeichnet sich besonders durch seine hohe Reaktivität aus. Es reagiert als eines der stärksten Oxidationsmittel besonders mit ungesättigten, organischen Verbindungen. Ozon kommt natürlich in unserer Atmosphäre vor. In der Stratosphäre schützt es die
Er-de vor schädlicher UV-Strahlung, während es in Er-der Troposphäre als Schadgas wirkt.
Zu Beginn der 40er Jahre ergaben erste Beobachtungen, dass Ozon (damals als photochemischer "Smog" bezeichnet) Pflanzen schädigen kann. In den 50er Jahren wurde dann spezifisch Ozon als Luftschadstoff für verschiedene Pflanzenarten ent-deckt: Wein (Richards et al., 1958), Kiefer (Miller et al., 1963) und Tabak (He ggestad & Middleton, 1959). Heggestad und Middleton korrelierten bereits 1959 das Auftre-ten von sogenannAuftre-ten "Wetterflecken" auf Tabakblättern mit erhöhAuftre-ten Ozonkonzent-rationen. In Studien an Tabak konnte Heggestad (1991) feststellen, dass Ozonsensi-tivität ein erbliches Pflanzenmerkmal darstellt.
Die Aufnahme von Ozon in Pflanzen erfolgt fast ausschließlich über die Stomata der Blätter während des Gasaustausches. Die Kutikula zeigte sich als weitgehend im-permeabel für das Schadgas. In den Blättern bewirkt Ozon die Verringerung der stomatären Leitfähigkeit und dadurch das Schließen der Spaltöffnungen (Lyons et
al., 1999). Dies führt zu einer Verminderung der CO2-Aufnahme und Photosynthe-serate und folglich zur Verringerung des Wachstums.
Durch die Reaktivität des Ozons und seiner Transformationsprodukte im Apo-plasten der Mesophyllzellen werden vor allem die Zellmembranen geschädigt, was im Extremfall zur Entwicklung von sichtbaren Blattschäden führen kann. Diese Blattschäden zeichnen sich zunächst als sogenannte "water-soaked spots" ab und entwickeln sich später zu weißen, pergamentartigen Stellen, die stark an die Blatt-schäden erinnern, die bei der Hypersensitiven Reaktion (HR) einer inkompatiblen Interaktion zwischen Pflanze und Pathogen beschrieben wurden. Neuere Ergebnisse haben gezeigt, dass die Antwort der Pflanze auf Ozon teilweise Komponenten der HR gleicht (Kangasjärvi et al., 1994; Sharma & Davis, 1994; Sandermann et al. 1998). Die größte Ähnlichkeit ist wohl das Auftreten von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Die Akkumulation von H2O2 als Antwort auf Ozon wurde in Tabak (Schraud-ner et al., 1998) und Birken (Pellinen et al., 1999) beschrieben. In Arabidopsis
tha-liana wurde die ozoninduzierte Akkumulation von sowohl H2O2 als auch O2- von Rao & Davis (1999) ge zeigt. ROS sind aufgrund ihrer hohen Reaktivität toxisch für Zellen und an der Auslösung des oxidativen Zelltodes beteiligt ("oxidative cell
death," OCD). ROS stellen weiterhin wichtige Komponenten von Abwehrreaktionen
und Signalketten dar (Lamb & Dixon, 1997; Rao et al., 2000b).
ROS können weiterhin eine Reihe von Abwehrgenen induzieren. Levine et al. (1994) konnten z.B. die Induktion von Glutathion-S-Transferasen (GST) nachweisen, Chamnongpol et al. (1998) detektierten eine erhöhte Expression von PR1 und Desi-kan et al. (1998) zeigten die Induktion der Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL).
Neben reaktiven Sauerstoffspezies sind auch die Signalstoffe Jasmonsäure, Salizyl-säure und Ethylen an ozoninduzierten Reaktionen beteiligt. In ozoninduzierten Antworten scheint Jasmonsäure die Rolle eines negativen Regulators des Zelltods zu spielen. Jasmonsäure greift an zwei verschiedenen Stellen in die Signalwege ein: auf der einen Seite vermindert Jasmonsäure die Akkumulation von ROS, auf der anderen Seite schwächt sie die Wirkung von Salizylsäure beim Zelltod (Rao et al., 2000b; van Breusegem et al., 2001). Behandelt man Pflanzen vor Beginn der Ozon-behandlungen mit Jasmonsäure, Methyljasmonat oder Verwundung kommt es zu einer deutlichen Verringerung der ozoninduzierten Blattschäden (Örvar et al., 1997; Rao et al, 2000a).
Ethylen (C2H4) ist ein endogenes Pflanzenhormon, dass diverse Entwicklungs- und Wachstumsprozesse in Pflanzen reguliert: Samenkeimung, Zellelongation, Ge-schlechtsbestimmung, Fruchtreife, Seneszenz von Blüten und Abszission von Blät-tern (Johnson & Ecker, 1998; Alonso et al, 1999). Ethylen gilt als früher und be-ständiger Marker für eine erhöhte Ozon-Sensitivität in Pflanzen (Sandermann, 1996). So produzieren ozontolerante Pflanzen kein bzw. deutlich weniger Ethylen als ozonempfindliche Sorten (Wellburn & Wellburn, 1996). Ethylen fördert die ROS-Bildung und Zelltod.
Die durch Ozon induzierte Steigerung der Ethylenemission resultiert aus der Akti-vierung verschiedener ethylenbildender Enzyme (Tuomainen et al., 1997). Die Syn-these von Ethylen erfolgt aus dem im Yang-Zyklus gebildeten S-Adenosylmethionin (SAM) über 1-Aminocyclopropan-1-Carbonsäure (ACC; katalysiert durch ACC-Synthase), welches durch ACC-Oxidase zu Ethylen umgewandelt wird (Johnson & Ecker, 1998). Sowohl ACC-Synthase als auch die ACC-Oxidase sind durch Ozon regulierte Enzyme (Tuomainen et al., 1997).
Salizylsäure spielt nicht nur bei der Abwehr von Pathogenen eine wichtige Rolle. Auch nach Ozonexposition wird Salizylsäure akkumuliert. Im Vergleich zweier
Ara-bidopsis thaliana Ökotypen bildet der empfindlichere (Cvi-0) deutlich mehr
Salizyl-säure als der ozontolerante Ökotyp (Col-0) (Rao & Davis, 1999).
Während der durch Ozon ausgelösten Läsionenbildung sind Ethylen und Salizyl-säure notwendig, um sichtbare Läsionen auszulösen. JasmonSalizyl-säure hingegen ver-mittelt For tschreiten bzw. Einschränkung der Läsionenausbreitung (Overmyer et
1.2 Jasmonate als pflanzliche Signalstoffe und deren Biosynthese
Wie bereits in den vorhergehenden Kapiteln beschrieben, spielen Jasmonate (Jas-monsäure und ihre Derivate) eine wichtige Rolle bei der Reaktion der Pflanze auf Stress, der z.B. bei Befall durch Phytopathogene oder durch Applikation von Ozon entsteht.
Jasmonate bilden eine eigene Klasse von Phytohormonen. Wie alle Phytohormone sind auch Jasmonate ubiquitär im Pflanzenreich verbreitet (Meyer et al., 1984). Der Methylester der Jasmonsäure, das Methyljasmonat (MeJA), wurde bereits 1962 von Demole et al. als Hauptkomponente des ätherischen Öls von Jasminum
grandi-florum L. isoliert.
Die Biosynthese der Jasmonsäure wurde 1984 von Vick & Zimmermann aufgeklärt (Abb.1.1). Eingebettet im pflanzlichen Oxylipinstoffwechsel dient als Ausgangssub-strat die Linolensäure, die durch eine Lipoxigenase (LOX) zur 13-Hydroperoxyoctadecatriensäure umgewandelt wird. Durch die Allenoxidsynthase (AOS) wird dann das Allenoxid, die 12,13-Epoxyoctadecatriensäure gebildet. Im nächsten Schritt wird diese von einer Allenoxidcyclase (AOC) zu 12-Oxo-phytodiensäure zyklisiert. Anschließend katalysiert die 12-Oxophytodien-säurereduktase (OPR) die Reduktion der ringständigen Doppelbindung unter Bil-dung von 12-Oxophytoensäure. Nach drei terminalen β-Oxidations-schritten an der Carboxylseitenkette entsteht die (+)-7-iso-Jasmonsäure, die im Gleichgewicht mit der isomeren (–)-Jasmonsäure steht.
Die Wirkungen von Jasmonaten in der Pflanze sind sehr vielfältig. Im allgemeinen werden nach der Applikation hemmende Effekte auf das Keimlings- und Wurzel-wachstum sowie auf die Samenkeimung beobachtet. Es gibt aber auch Prozesse, die durch Jasmonate unterstützt werden, wie Fruchtreife, Seneszenz, Knollenbi ldung, Rankenwindung und Pollenbildung (Creelman & Mullet, 1997).
Ähnliche Effekte wie die Jasmonate, insbesondere MeJA (Herrmann et al., 1987) zeigt auch die Biosynthesevorstufe 12-Oxophytodiensäure (OPDA) (Weiler et al., 1993) oder das bakterielle Phytotoxin Coronatin (Feys et al., 1994; Weiler et al., 1994; Benedetti et al., 1995 & 1998).
Abbildung 1.1: Jasmonsäure-Biosynthese ausgehend von der Linolensäure (nach Hamberg
& Gardner, 1992)
1.3 Arabidopsis thaliana Mutanten mit Veränderungen der JA-Biosynthese und JA-Signaltransduktion
Für die Untersuchung verschiedener Signaltransduktionswege, einschließlich der Jasmonatsignaltransduktion erwiesen sich Arabidopsis thaliana Mutanten als wert-volles "Werkzeug".
Die Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. gilt als das herausragende Untersuchungsobjekt für Pflanzenforscher auf der ganzen Welt. Diese Blütenpflan-ze, die zu den Brassicaceae gehört, wurde im 16. Jahrhundert vom Arzt Johannes Thal entdeckt und beschrieben. Bereits 1943 entdeckte der Frankfurter Botaniker Friedrich Laibach das Potential der Ackerschmalwand als genetischer
Modell-organismus. A. thaliana wird im Zustand der Samenreife, den sie nach einer Gene-rationsdauer von etwa sechs Wochen erreicht, ca. 30 cm hoch. An der Basis bildet sie eine Rosette aus. Die Infloreszenz besteht aus ca. 200 Blüten. Normalerweise geht aus jeder Blüte nach Selbstung eine Schote hervor. Eine Pflanze bringt bis zu 10.000 Samen hervor. Die Pflanze ist sowohl in Erde als auch auf künstlichen Me-dien kultivierbar und kann wegen ihrer leicht zugänglichen Blüten relativ einfach gekreuzt werden. Das Genom von A. thaliana ist auf nur fünf Chromosomen lokali-siert. Mit ungefähr 125 Mb besitzt die Ackerschmalwand ein für Pflanzen kleines Genom. Die Sequenzierung des Genoms im Jahre 2000 führte zu einem Quanten-sprung in der Arabidopsis-Forschung. All diese Besonderheiten prädestinieren
A. thaliana als Modellpflanze für die molekulare Genetik.
Für die Untersuchung von jasmonatregulierten Prozessen wurden in letzter Zeit immer häufiger A. thaliana Mutanten mit Störungen in der Biosynthese, JA-Perzeption oder JA-Signaltransduktion genutzt (Berger, 2002, Devoto & Turner, 2003).
Jasmonat-Biosynthese-Mutanten sind nicht mehr in der Lage, Jasmonsäure oder ihre Vorstufen zu synthetisieren. Alle bisher bekannten JA-Biosynthese-Mutanten sind männlich steril bzw. weisen eine stark reduzierte Fertilität auf (Tab.1.1), wobei die Sterilität durch exogene Applikation von Jasmonaten überwunden werden kann.
Die jasmonatdefizienten fad3-2fad7-1fad8 Mutanten ("triple fad") enthalten nur geringfügige Mengen an dreifach ungesättigten C16- und C18- Fettsäuren und sind somit nicht in der Lage, ausreichende Mengen an Jasmonsäure zu bilden (McConn & Browse, 1996).
Eine weitere Biosythese -Mutante opr3 bildet zwar noch OPDA, aber da das Gen, das die OPDA-Reduktase kodiert, mutiert ist, können diese Pflanzen keine Jasmonsäure synthetisieren (Stintzi & Browse, 2000). Die männliche Sterilität dieser Mutante kann demzufolge nur durch die Applikation von Jasmonaten, nicht jedoch durch Zugabe von OPDA aufgehoben werden.
Reduzierte Fertilität zeigt die Mutante aim1 (abnormal inflorescence meristem1), bei der möglicherweise eine Störung der β-Oxidationsschritte in der Jasmonatbi o-synthese vorliegt (Richmond & Bleecker, 1999).
Neben den jasmonatdefizienten Mutanten sind inzwischen einige jasmonatinsensiti-ve Mutanten bekannt und teilweise gut charakterisiert. Diese Mutanten zeichnen sich durch eine reduzierte Hemmung des Wurzelwachstums unter Einfluss von Me-thyljasmonat und/oder Coronatin und durch eine Änderung in der Aktivierung jas-monatregulierter Gene im Vergleich zu Wildtyppflanzen aus. Auch unter diesen
Mutanten gibt es einige, die sich durch männliche Sterilität oder reduzierte Fertili-tät auszeichnen (Tab.1.1.). Anders als bei den Biosynthese-Mutanten lässt sich die männliche Sterilität bei jasmonatinsensitiven Mutanten nicht durch die Applikation von Jasmonaten aufheben.
Da Jasmonate bei der Pathogenabwehr der Pflanze eine entscheidende Rolle spie-len, wurden zahlreiche JA-Biosynthese- und JA-Signaltransduktionsmutanten hin-sichtlich ihrer Reaktion auf Phytopathogene untersucht (Tab.1.1).
So zeigen "triple fad" Mutanten eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber den Pathogenen
Pythium mastophorum und Pythium irregulare (Vijayan et al., 1998; Staswick et al.,
1998). Die beobachtete erhöhte Sensitivität gegenüber Insektenbe fall (Bradysia
im-patiens) kann durch exogene Applikation von JA aufgehoben werden (McConn et al., 1997).
Im Gegensatz zu den "triple fad" Mutanten zeigen opr3-Pflanzen keine erhöhte Sen-sitivität gegenüber Bradysia impatiens und Alternaria brassicicola (Stintzi et al., 2001).
Die Mutante coi1 (coronatine-insensitive) wurde aufgrund ihrer Insensitivität gegen-über dem Toxin Coronatin (aus Pseudomonas syringae) selektiert (Feys et al., 1994). Als Ort der coi1-Mutation wurde ein Gen kloniert, das für ein leucinreiches Protein mit einer F-Box-Domäne codiert (Xie et al., 1998). Gegenüber dem bakteriellen Phy-topathogen Pseudomonas syringae zeichnet sich coi1 durch eine erhöhte Resistenz aus (Feys et al., 1994). Bei der Infektion mit nekrotrophen Pathogenen, wie Pythium
mastophorum, Alternaria brassicicola und Botrytis cinerea findet man hingegen eine
erhöhte Suszeptibilität (Vijayan et al., 1998; Thomma et al., 1998). Die Empfind-lichkeit gegenüber dem biotrophen Pilz Peronospora parasitica unterscheidet sich jedoch nicht vom Wildtyp.
Umfangreiche Untersuchungen zur Resistenz gegenüber verschiedenen Pathogenen liegen für die Mutante cev1 ("constitutive expression of VSP1") vor, deren durch Jasmonate regulierte Signaltransduktionskette konstitutiv aktiv ist (Ellis & Turner, 2001). Diese Mutante zeigt eine erhöhte Resistenz gegenüber dem biotrophen Pilz
Erysiphe cichoracearum, dem bakteriellen Pathogen Pseudomonas syringae und der
Blattlaus Bradysia impatiens (Ellis et al., 2002).
Wie in cev1 werden auch in der Mutante cex1 jasmonatregulierte Gene, wie Vsp,
Pdf1.2, Thi2.1 konstitutiv exprimiert (Ellis & Turner, 2001; Xu et al., 2001).
Für die jasmonatinsensitiven Mutanten jin1 und jin4, deren Charakterisierung Ge-genstand dieser Arbeit ist, wurden Untersuchungen zur Sensitivität gegenüber an-deren Phytohormonen und zur Expression von jasmonatresponsiven Genen durch Berger et al. (1996) durchgeführt.
jin4 (jasmonate-insensitive), die zu der Mutante jar1 (jasmonate-resistent) allel ist,
zeigt eine reduzierte Hemmung des Wurzelwachstums in jasmonathaltigem Medium und ist fertil. Abscisinsäure hemmt die Keimung von jar1 (Staswick et al., 1992) und jin4 (Berger et al., 1996) stärker als in den entsprechenden Wildtypen. In jar1 liegt eine Mutation in einem Gen vor, das eine Jasmonatadenylase kodiert (Staswick
et al., 2002).
jin1 (jasmonateinsensitive1) wurde durch Bestrahlung des Arabidopsis thaliana
-Wildtyps Col-gl1 (WtC) mit Röntgenstrahlen erzeugt. Die Selektion der Mutante er-folgte in der M2-Generation auf MeJA-haltigem MS-Medium. Während das Wurzel-wachstum im Wildtyp durch Methyljasmonat gehemmt wurde, zeigten sich jin1-Pflanzen unempfindlich gegenüber dieser Substanz (Tab.1.1). Die Selektion von jin4 erfolgte nach dem selben Prinzip. Allerdings wurde eine
T-DNA-Insertions-Tabelle 1.1: Übersicht über bekannte A. thaliana Mutanten in der Biosynthese,
JA-Perzeption und JA-Signaltransduktion und deren Phänotypen.
Gen männliche Fertilität Sensitivität gegenüber nekrotrophen Pathogenen Sensitivität gegenüber virulenten Bakterien Sensitivität gegenüber biotrophen Pilzen Sensitivität gegenüber Insekten Ozon- sensitivität Referenz JA-Biosynthese-Mutanten fad3-2fad7-1fad8 ("triple fad") FAD3, 7, 8 Fettsäure-Desaturase
steril erhöht erhöht erhöht Browse et al., 1993 McConn et al., 1994 McConn & Browse, 1996
opr3 / dde1 OPR3
12-oxophytodien- säurereduktase
steril reduziert reduziert Sanders et al., 2000 Stinzi & Browse, 2000 Stinzi et al., 2001
aim1 reduziert Richmond & Bleecker, 1999
dad1 DAD1 Chloroplasten-Phospholipase A1 steril Ishiguro et al., 2001 dde2 AOS Allenoxidsynthase
steril von Malek et al., 2002
aos CYP74A
Cytochrom P450, AOS
steril Park et al., 2002
Signaltransduktions/Perzeptions-Mutanten
jin1 fertil wie Wildtyp Berger et al., 1996
jin4 / jar1 JA-Adenylase fertil erhöht wie Wildtyp erhöht Staswick et al., 1992, Berger et al., 1996
coi1 COI1
F-Box -LRR
steril erhöht reduziert wie Wildtyp erhöht erhöht Feys et al., 1994 Xie et al., 1998 Kloek et al., 2001 Ellis et al., 2002 mpk4 MPK4 Mitogen- aktivierte Proteinkinase
reduziert reduziert reduziert Petersen et al., 2000
axr1-24 AXR1
Nedd8/RUB1 aktivierende Enzym-Untereinheit
reduziert erhöht Leyser et al., 1993 Tiryaki & Staswick, 2002
cev1 AtCesA3
Zellulosesynthase
fertil reduziert reduziert reduziert Ellis & Turner, 2001 Ellis et al., 2002
cet1 bis cet9 Hilpert et al., 2001
cex1 fertil Xu et al., 2001
cas1 fertil, aber
keine Samen
Kubigsteltig & Weiler, 2003
joe1 und joe2 Jensen et al., 2002
sammlung (stock no. 3115) vom Arabidopsis Biological Resource Center an der Ohio State University durchsucht. Die jin4 Mutante hat als genetischen Hinter-grund den A. thaliana - Wildtyp Wassilewskija (WS).
Wurzellänge(mm)
MeJA (µM) WtC jin1 WS jin4
0 45,9 + 5,4 39,0 + 8,4 44,4 + 6,2 46,0 + 3,7
10 8,0 + 3,0 16,4 + 5,6 9,7 + 2,5 24,9 + 5,1
100 3,8 + 1,3 8,1 + 2,3 5,2 + 1,8 8,7 + 2,6
Berger et al. (1996) untersuchten weiterhin die Sensitivität von jin1 und jin4 gegen-über anderen Phytohormonen. Die Samenkeimung beider Mutanten wurde durch ABA gehemmt. Dabei erwies sich jin4 doppelt so empfindlich gegenüber ABA wie
jin1 und die Wildtypen. Die hemmende Wirkung von Ethylen auf das Wachstum des
Hypokotyls war in beiden Mutanten identisch, und es zeigten sich keine Unter-schiede im Vergleich zu den korrespondierenden Wildtyppflanzen.
Ferner wurde bereits die Aktivierbarkeit verschiedener jasmonatresponsiver Gene (AtVsp, AtLox1, AtLox2, AtPal1) in Wurzeln bzw. in Blättern beider Mutanten unter-sucht. AtVsp kodiert ein Protein, das homolog zu VSP A und VSP B der Sojabohne ist. Die Akkumulation von AtVSP-mRNA steigt in Blättern und Wurzeln nach Be-handlung der Keimlinge mit MeJA an (Berger et al, 1995). In Wurzeln von jin1 und
jin4 zeigten sich nach Applikation von MeJA keine Unterschiede in der Expression
von AtVSP im Vergleich zu den Wildtypen WtC und WS. In Blättern allerdings war
AtVSP in WtC und WS nach Applikation von MeJA stärker exprimiert als in den
Mutanten.
Lox1 und Lox2 kodieren Lipoxigenasen und sind ebenfalls durch MeJA induzierbar.
Während LOX1 vor allem in Wurzeln exprimiert wird (Melan et al., 1993), findet man LOX2 hauptsächlich in Blättern (Bell & Mullet, 1993). Die Expression von
LOX1 nach MeJA-Behandlung war in Wurzeln von jin1 und jin4 unverändert
vergli-chen mit den korrespondierenden Wildtypen. Auch für die Expression von LOX2 nach MeJA-Applikation zeigte sich in Blättern dasselbe Expressionsmuster in Wild-typen und Mutanten.
Weiterhin wurde die Expression von PAL1 untersucht, von dem be kannt ist, dass es in anderen Pflanzenarten durch Jasmonate induziert werden kann (Gundlach et al.,
Tabelle 1.2: Hemmung des Wurzelwachstums durch MeJA. Die
Wur-zeln von jin1 sind auf 10 bzw. 100µM MeJA ca. 2mal länger als in WtC. jin4 hat auf 10µM MeJA etwa 2,5fach und auf 100µM MeJA ca. 1,6fach längere Wurzeln als der Wildtyp WS. (aus Berger et. al, 1996)
1992). Eine schwache Induktion durch MeJA konnte auch in jin1 und jin4 nachge-wiesen werden, die sich allerdings nicht von der Expression in den entsprechenden Wildtypen unterschied.
Untersuchungen auf Proteinebene zeigten, dass das Expressionsmuster von AtVSP- mRNA mit der gebildeten Proteinmenge korreliert. Verglichen mit den Wildtypen wurde in Blättern der Mutanten jin1 und jin4 nach MeJA-Applikation deutlich we-niger AtVSP-mRNA und dementsprechend wewe-niger Protein gebildet.
Berger et al. (1996) prüften außerdem die Expression von AtLOX2 und AtVSP, die durch Verwundung induziert werden können. Nach Verwundung von Blättern konnte eine starke Induktion von AtVSP in WtC und jin1 nachgewiesen werden. In
jin4 dagegen fiel das Signal deutlich schwächer aus als im entsprechenden Wildtyp
WS. AtLOX2 wurde sowohl in den Mutanten als auch in den Wildtypen nach Ver-wundung stark expr imiert.
1.4 Kartierung von Mutationen
Das Genom von A. thaliana besteht aus etwa 125 Millionen Basenpaaren und ko-diert für ca. 25000 Proteine (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Die Gene werden funktionell durch ihre mutanten Phänotypen charakterisiert. Prinzipiell werden zwei Wege unterschieden: die "Vorwärtsgenetik" und die "Rückwärtsgenetik". Bei der "Rückwärtsgenetik" wird eine bekannte DNA-Sequenz durch Mutation auf ihre biologische Funktion überprüft (T-DNA-Insertionslinien).
Bei der "Vorwärtsgenetik" werden zunächst Mutanten isolie rt, von denen das betrof-fene Gen isoliert und charakterisiert wird. Diese Strategie wurde in der vorliegenden Arbeit zur Kartierung der jin1 Mutante genutzt. Das kartierungsgestützte Klonieren ("map-based cloning") eines Gens erfordert zwei Voraussetzungen. Zum einen müs-sen molekulare Marker vorhanden sein mit denen die Mutation kartiert werden kann und zum anderen muss eine genomische DNA-Bibliothek existieren, aus der überlappende DNA-Fragmente aus der Region des zu isolierenden Gens zu einem zusammenhängenden DNA-Abschnitt ("contig") zusammengefügt werden können. 1.4.1 Molekulare Marker
Als molekulare Marker können DNA-Polymorphismen genutzt werden, die sich zwi-schen Individuen oder Populationen unterscheiden und an homologen Stellen im Genom vorkommen.
Beim RFLP (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus) unterscheiden sich homologe DNA-Abschnitte (Allele) im Abstand zwischen zwei Schnittstellen oder im Vorkommen einer Schnittstelle für ein Restriktionsenzym. Durch einen Restrik-tionsverdau entstehen verschieden lange DNA-Fragmente.
Bei CAPS ("cleaved amplified polymorphic sequence") Markern unterscheiden sich homologe DNA-Abschnitte mit bekannter Sequenz im Vorkommen einer Schnittstel-le für ein Restriktionsenzym. Nach PCR-Amplifikation mit sequenzspezifischen Pri-mern werden die PCR-Produkte mit einem Restriktionsenzym verdaut, wodurch un-terschiedliche Fragmente entstehen.
Eine andere Klasse von Markern sind die SSLP- ("simple sequence length
poly-morphism") oder Mikrosatellitenmarker. Mittels sequenzspezifischer Primer werden
unterschiedlich lange Wiederholungen repetitiver Sequenzen (Dinukleotidwieder-holungen, "tandem repeat"), z.B. (CA)n von genomischer DNA amplifiziert.
Bei den SNP- Markern ("single nucleotide polymorphism", Einzelnukleotidpoly-morphismus) findet man Unterschiede (Polymorphismen) von einzelnen Basen in-nerhalb eines Genoms bei verschiedenen Individuen.
1.4.2 Meiotische Rekombinationskartierung
Die meiotische Rekombinationskartierung folgt dem gleichen Prinzip wie die "klassi-sche" Rekombinationsanalyse, bei der zwei Mutationen gegeneinander kartiert wer-den. Wichtig für die Genkartierung mit molekularen Markern ist, dass sich die mutanten Pflanzen von den Wildtyp-Pflanzen in der DNA-Sequenz hinreichend un-terscheiden. Bei Arabidopsis verwendet man für die molekulare Genkartierung so-genannte Ökotypen. Das sind Linien verschiedener geographischer Herkunft, die sich in ca. 1% der Nukleotidsequenzen unterscheiden. Die am häufigsten verwende-ten Ökotypen sind Columbia (Col )und Landsberg erecta (Ler).
1.5 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Als Modellpflanze bietet Arabidopsis thaliana die Möglichkeit, verschiedene Signaltransduktionswege mit Hilfe von Mutanten zu untersuchen. In der vorliegen-den Arbeit sollte die durch Jasmonate vermittelte Signaltransduktion untersucht werden. Die Mutanten jin1 und jin4 zeichnen sich durch eine verringerte Sensitivi-tät gegenüber Jasmonaten aus, sind aber in der Jasmonatbiosynthese nicht ge-stört. Da Jasmonsäure eine entscheidende Rolle in den Abwehrreaktionen der Pflanze spielt (Vijayan et al., 1998), sollten diese Mutanten hinsichtlich ihrer Resis-tenz gegenüber dem phytopathogenen Bakterium Pseudomonas syringae charakte-risiert werden. Dies sollte zum einen über die Bestimmung des Bakterienwachs-tums in der Pflanze zum anderen über die Expression verschiedener Abwehrgene erfolgen.
Jasmonsäure ist aber auch an der Signaltransduktion nach Ozonstress beteiligt. In Tabak wurde gezeigt, dass vor Ozonbehandlung applizierte Jasmonsäure die Pflan-zen sogar bei hohen OzonkonPflan-zentrationen vor Nekrosen schützt (Örvar et al., 1997). Im Rahmen eines DAAD-Austauschprogramms mit der Universität Helsinki (Institu-te of Bio(Institu-technology) soll(Institu-te die Reaktion von jin1, jin4 und wei(Institu-teren in verschiedenen Signaltransduktionwe gen betroffenen Mutanten (ein2, rcd1) auf Ozonstress unter-sucht werden. Die Untersuchung von Doppelmutanten sollte Hinweise auf die Ver-knüpfung der in diesen Mutanten betroffenen Signaltransduktionswege mit den Wirkungen von Ozon geben.
Ziel dieser Arbeit war weiterhin die Isolierung des in jin1 mutierten Gens, um ein Element der Jasmonat-Signaltransduktionskette zu isolieren. Da das Jin1 Genpro-dukt nicht bekannt ist, sollte die Kartierung über das "map-based cloning" erfolgen, das keine Informationen über das Protein erfordert. Nach der Sequenzierung von
jin1 sollte der mutante Phänotyp durch ein Wildtyp-Allel komplementiert werden.
In Northern Blot-Analysen sollten ferner die zeitlichen und räumlichen Expres-sionsmuster des in jin1 mutierten Gens sowie dessen Induzierbarkeit durch Jas-monate, andere Phytohormone und durch Verwundung untersucht werden.
2. Material und Methoden
2.1 Verwendete Materialien
2.1.1 Chemikalien und Enzyme
Alle verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, bei Sigma (München), Roth (Karlsruhe), Fluka (Buchs, Schweiz), Invitrogen (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Roche (Mannheim), Amersham Bioscience (Freiburg) und Merck (Darmstadt) bestellt.
Die für molekularbiologische Arbeiten notwendigen Enzyme wurden von MBI Fer-mentas (St. Leon-Rot), New England Biolabs (Frankfurt/Main), Promega (Mann-heim), Invitrogen (Karlsruhe) oder Roche (Mannheim) bezogen.
Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) synthetisiert. 2.1.2 Geräte
Soweit nicht gesondert angegeben, kamen folgende Geräte zum Einsatz:
Autoklav Varioklav® Dampfsterilisator Typ 400 und Typ 500 (H+P Laborservice, Oberschleißheim)
Elektrophoresekammern HorizonTM (Life Technologies, Karlsruhe) Hybridisierungsinkubator 7602 (GFL, Burgwedel)
Inkubationsschüttler Unitron, HT (Infors, Schweiz)
Laborschüttler KS 250basic (IKA Labortechnik, Staufen)
Netzgerät Elektrophoresis Powersupply PHERO-stab. 500 (Biotec-Fischer, Reiskirchen)
pH-Meter pH 526 (WTW, Weilheim)
Phosphor Imager Storm 860 (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA, USA) Photometer RNA/DNA Calculator GeneQuant (Pharmacia, Freiburg)
UltrospecIII LKB (Pharmacia, Freiburg) Schüttelinkubator 3032 (GFL, Burgwedel)
Vakuumtrockner SpeedVac SC100 (Savant, Instruments, Farmingdale, NY, USA)
Transilluminator UVT 2020 (302 nm) (Herolab GmbH Laborgeräte, Wies-loch)
Vortex Genie 2 (Bender & Hobein AG, Zürich, Schweiz) Zentrifugen Centrifuge 5415 C (Eppendorf, Hamburg)
Centrifuge 5403 (Eppendorf, Hamburg) Centrifuge 5810 R (Eppendorf, Hamburg) AvantiTMJ-25 Centrifuge (Beckmann, München) Wasserbad Schüttelwasserbad GFL 1083 (GFL, Burgwedel) 2.1.3 Software und Websites
2.1.3.1 Software Adobe Photoshop 6.0 CorelDraw 10
Microsoft Excel, Microsoft Corporation Microsoft Powerpoint, Microsoft Corporation Microsoft Word, Microsoft Corporation BioEdit sequence alignment editor 2.1.3.2 Websites http://www.arabidopsis.org http://www.arabidopsis.org/Cereon/index.jsp http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://mips.gsf.de 2.1.4 Antibiotika Amp Ampicillin Gent Gentamycin Kan Kanamycin Rif Rifampicin Spec Spectinomycin Tet Tetracyclin
2.1.5 Radiochemikalien
[a-32P]-dATP, 3000Ci/mmol ICN, Eschwege 2.1.6 Molekularbiologische „Kit“ Systeme
Megaprime DNA-labelling Kit Amersham Pharmacia, Freiberg QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden
QIAEX®II Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit MBI Fermentas, St. Leon-Rot TOPO TA Cloning® Kit Invitrogen, Karlsruhe
2.1.7 Enzyme
Pfu DNA Polymerase Promega, Mannheim (3 units pro µl)
Taq DNA Polymerase Invitrogen, Karlsruhe (5 units pro µl) T4 DNA Ligase Promega, Mannheim (1-3 units pro µl) 2.1.8 Restriktionsenzyme
Pst I, Bam HI, BspHI, Eco RI, Hind III, Kpn I, Nco I, Not I, Sal I, Sca I, XbaI, Xcm I, Eco 72I, Eco RII, Eco 31I
Alle Restriktionsenzyme wurden bei Roche (Mannheim), MBI Fermentas (St. Leon-Rot) oder New England Biolabs (Frankfurt/Main) bestellt und mit den entsprechen-den Puffern verwendet.
2.2 Gängige Lösungen, Puffer und Medien
Alle Lösungen, Puffer und Medien wurden mit Wasser aus einer Milli-Q-Anlage (Mil-lipore, Schwalbach) hergestellt.
2.2.1 Herstellung häufig verwendeter Medien
Medium Zusammensetzung und Herstellung
LB-Medium 10g Trypton, 5g Hefe-Extrakt, 10g NaCl, ph 7,0, autoklavieren
King’s B-Medium (KB)
(King et al., 1954)
20g Glycerin, 40g Proteose Pepton No. 3, autoklavieren, nach Abkühlen
Zugabe von 10ml 10% K2HPO4 (w/v) (sterilfiltriert), 10ml 10% MgSO4
(sterilfiltriert) und 50µg/ml Rif MS-Medium
(Mu-rashige & Skoog, 1962)
4g MS-Salz 5519 (Sigma, München), 10g Saccharose, 0,5g MES, pH=5,7 (KOH), autoklavieren
Für LB- und KB-Platten wurden dem entsprechenden Medium jeweils 15g A-gar/Liter und für MS-Platten 8g Phytagel/Liter (Sigma,München) zugesetzt.
Für Selektionsmedien und –platten wurde das entsprechende Antibiotikum nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf 50°C zugegeben (Amp 50mg/l, Kan 50mg/l, Tet 12,5 mg/l, Gent 10mg/l, Rif 50 bzw. 100mg/l). Für die Selektion des jasmona-tinsensitiven Phänotyps wurde das MS-Medium nach dem Abkühlen mit 10 µM Me-thyljasmonat (NIPPON ZEON, Tokyo, Japan) versetzt.
2.2.2 Herstellung häufig verwendeter Puffer und Lösungen
Puffer/Lösung Zusammensetzung und Herstellung
5xDNA-Stop 20mM Tris-HCl pH 8,0 120mM EDTA 50% Glycerin 0,1% Bromphenolblau (w/v) 10xRNA-Stop 1mM EDTA 50% Glycerin 0,25% Bromphenolblau (w/v) 20xSSC 3M NaCl 0,3M Na3Citrat pH 7,0 10xTAE 0,4M Tris-HCl, 0,2M Natriumacetat 10mM EDTA, pH 8,2 1xTBE 89mM Tris-Borat 2mM EDTA pH 8,0 pH=8,3 1xTE 10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH 8,0
10xMOPS 0,4M MOPS (pH 7,0) (3-(N-Morpholino)propansulfonsäure)
0,1M Natriumacetat 10mM EDTA (pH 8,0)
2.3 Verwendete Organismen
2.3.1 Pflanzen
A. thaliana L.
Ökotypen: Columbia (Col-gl1) WtC Landsberg erecta (Ler) Wassilewskija (WS) Mutanten: jin1 (Berger et al., 1996)
jin4 (Berger et al., 1996) rcd1 (Overmyer et al., 2000) coi1 (Feys et al., 1994) ein2 (Alonso et al., 1999) cpr5 (Boch et al., 1998)
2.3.2 Bakterien
Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 (Koncz & Schell, 1986) Pseudomonas syringae:
o P. syringae pv. tomato DC3000
o P. syringae pv. tomato DC3000avrRpm1
o P. syringae pv. maculicola avrRpm1 (Psm M2) (Debener et al., 1991) o P. syringae pv. maculicola CR299 (Ritter & Dangl, 1995)
Escherichia coli
Stamm Genotyp
DH5a supE44 .lacU169 (F80 lacI q Z .? 15)hsdR17 recA1 end A1 gyr A96
thi-1 rel A1 One Shot
TOP10 (In-vitrogen, Karlsruhe)
F - mcrA .(mrr-hsdRMS-mcrBC) f 80 lacZ .M15 lacZX74 deoR araD139 .(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str r ) endA1 nupG
2.4 Pflanzenanzucht und Stressbehandlung
2.4.1 Pflanzenanzucht
Die Anzucht von A. thaliana Pflanzen erfolgte bei 23°C und einer Lichtstärke von ca. 250µmol/m2s in Klimaschränken bzw. in klimatisierten Phytokammern (Percival
Scientific, bezogen über CLF Laborgeräte, Emersacker). Für vegetatives Wachstum wurden die Pflanzen unter Kurztagsbedingungen (8h Tag, 16h Nacht), für generati-ves Wachstum unter Langtagsbedingungen (16h Tag, 8h Nacht) kultiviert.
Das Kultursubstrat bestand aus einem Gemisch aus Erde und Vermiculite (2-3mm Körnung, Marmullar, Witten).
2.4.2 Sterilisation von A. thaliana Samen
Für die in vitro Anzucht von Arabidopsis Pflanzen wurden die Samen für zwei Minu-ten mit 70%igem Ethanol behandelt und anschließend 10 MinuMinu-ten in einer Natri-umhypochloridlösung (ca. 5% aktives Chlor, 0,15% Tween® 20) leicht geschüttelt. Danach wurden die Samen viermal mit sterilem Wasser gewaschen.
2.4.3 Agrobakterien-vermittelte Transformation von A. thaliana
Die Agrobakterien-vermittelte Transformation von A. thaliana erfolgte nach der Blü-tentauchmethode (floral dip) (Clough & Bent, 1998). Dafür wurden zunächst 500ml LB-Medium (mit Kan, Rif, Gent) mit einer 50ml Agrobakterien-Übernachtkultur an-geimpft und erneut über Nacht bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Agr o-bakterien abzentrifugiert (10min, 4000 x g) und das Bakterienpellet in 100ml 5%iger Saccharose-Lösung mit 0,05% Silwet L-77 aufgenommen. In diese Suspen-sion wurden die Blütenstände und Blattrosetten von gerade mit dem Blühen begin-nenden Pflanzen für einige Sekunden getaucht.
Die getauchten Pflanzen wurden mit Frischhaltefolie abgedeckt, für 24 Stunden dunkel gestellt und bis zum Reifen der Samen unter Langtagbedingungen kultiviert. Für die Selektion transgener Pflanzen mit dem BAR-Gen als Resistenzmarker wur-den die Samen auf Erde ausgesät und die Pflanzen im Keimblattstadium mit einer 1:5000-Verdünnung des Herbizids Basta® (Hoechst Schering AgrEvo GmbH) be-sprüht. Falls erforderlich wurde die Behandlung im Abstand von 5-10 Tagen wie-derholt, bis eine ausreichende Selektion der transgenen Pflanzen erkennbar war. Die Kultur erfolgte bei 23°C unter Kurztagbedingungen.
2.4.4 Ozon-Experimente 2.4.4.1 Ozon-Behandlung
Drei Wochen alte A. thaliana Pflanzen wurden in Klimaschränken für 6 Stunden Ozonkonzentrationen von 250nl/l ausgesetzt. Das Ozon wurde durch einen Ozon-generator aus reinem Sauerstoff erzeugt und in die Klimaschränke geleitet. In den Klimaschränken wurde die Ozonkonzentration durch einen Ozonanalyzer (Dasibi 1008-RS, Amko Systems Inc., Ontario, Canada) kontrolliert (Pellinen et al., 1999). Für Northern-Analysen wurden ganze Pflanzen (ohne Wurzel) 0, 6 und 24 Stunden nach der Ozonbehandlung geerntet.
2.4.4.2 Quantifizierung des Zelltodes nach Ozonbehandlungen
Visuelle Einschätzung der geschädigten Pflanzen
Im unmittelbaren Anschluss an die Ozonbehandlung wurden die durch Ozon ge-schädigten Pflanzen sowie die Anzahl der gege-schädigten Blätter pro Pflanze ausge-zählt. Die Zählung wurde nach 6 und 24 Stunden wiederholt.
„Ion leakage“ (Ionendurchlässigkeit)
Die Bestimmung des „Ion leakage“ erfolgte 2 Stunden nach Ende der Ozonbehand-lung. Dafür wurden je drei Pflanzen (ohne Wurzel) in 15ml MilliQ-Wasser eine Stunde bei 250rpm geschüttelt. Anschließend wurde die Leitfähigkeit in µS/cm ge-messen, um die Konzentration ausgetretener Ionen zu bestimmen. Die selben Pro-ben wurden nun 30 Minuten gekocht und eine weitere Stunde geschüttelt, bevor die Leitfähigkeit erneut gemessen wurde (Gesamtionen). Der „Ion leakage“ wird als % der Gesamtionen ausgedrückt.
2.4.5 Pathogenbehandlungen
2.4.5.1 Anzucht von Pseudomonas syringae
Die Anzucht der P. syringae-Bakterien erfolgte in King’s B-Medium mit den entspre-chenden Antibiotika bei 28°C für 2 Tage. Zur Konservierung wurden die Stämme als Glycerinkultur bei – 80°C gelagert.
2.4.5.2 Infektion von Arabidopsis Pflanzen mit P. syringae
Für Pflanzeninfektionen wurden P. syringae Bakterien aus einer 3ml Übernachtkul-tur in 50ml frisches Flüssigmedium überimpft und bis zu einer OD600nm von 0,2 (entspricht 108 cfu/ml) wachsen gelassen. Anschließend wurde die Kultur abzentri-fugiert (1000 x g, 10 min) und in sterilem 10mM MgCl2 resuspendiert.
Für Wachstumskurven wurde eine Suspension 5 x 105cfu/ml verwendet. Die Inoku-lation der Pflanzen erfolgte von der Blattunterseite mit einer 1ml Spritze ohne Kanüle (in eine Fläche von 0,5cm im Durchmesser). Das Volumen pro Inokulation betrug etwa 10µl.
Für die Isolierung von RNA aus Blättern für spätere Northern-Analysen erfolgte die Inokulation mit einer Suspension von 108 cfu. Als Negativkontrolle wurde 10mM MgCl2 infiltriert.
2.4.5.3 Bestimmung der Pseudomonas Vermehrung in der Pflanze
Für Wachstumskurven wurden Blätter mit einer Bakteriensuspension von 5 x 105 cfu infiltriert. Für jeden Zeitpunkt wurden je 2 Blattscheibchen von 3 verschiede-nen Pflanzen mit einem Korkbohrer (Durchmesser: 0,7cm) ausgestanzt, je 2 Blatt-scheiben in einer Probe vereint und in 1ml steriler 10mM MgCl2 – Lösung gemör-sert. Die Anzahl der Bakterien wurde 0, (12), 24, 48 und 72 Stunden nach Inokula-tion bestimmt. Die aufgemörserten Proben wurden in einer Verdünnungsreihe (1:10 bis 1:10000, in 1:10 Verdünnungsschritten) auf KB-Platten (mit den entsprechen-den Antibiotika) ausplattiert. Nach 2 bis 3-tägiger Inkubation bei 28°C wurentsprechen-den die Kolonien gezählt.
2.4.6 Bestimmung de s Chlorophyllgehalts in Arabidopsis Blättern 2.4.6.1 Aceton-Methode
Zur Bestimmung des Chlorophyllgehaltes wurden je acht Blätter in einer Probe ver-eint, mit 8ml 80% -igem Aceton versetzt und mit einem Stab zerkleinert. Der Ansatz wurde für mindestens 12 Stunden im Dunkeln inkubiert und einige Male geschüt-telt. Nach dem Abzentrifugieren wurde der Überstand bei 645nm und 663nm pho-tometrisch vermessen.
