Untersuchungen zur Expression und Lokalisationen des Cryptochrom3 in Arabidopsis thaliana

Untersuchungen zur Expression und Lokalisation

von Arabidopsis thaliana Cryptochrom 3

D

ISSERTATION

zur Erlangung

des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem Fachbereich Biologie

der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Julia Sommer

(geb. Kopecky aus Kassel)

Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität als Disseration

angenommen am:

Erstgutachter: Prof. Dr. Alfred Batschauer

Zweitgutachter: Prof. Dr. Uwe Maier

Tag der mündlichen Prüfung:

Inhaltsverzeichnis

1.

Einleitung ... 8

1.5. Putative UV-B Rezeptoren ... 16

1.6. Cryptochrome ... 17

1.6.1. Cryptochrome in Tieren ... 18

1.6.2. Cryptochrome in Pflanzen ... 20

1.6.3. Bifunktionelle Photolyasen/ Cryptochrome... 26

1.6.4. Die cry-DASH Familie ... 28

1.7. Zielsetzung ... 33

2.

Material ... 34

2.1. Chemikalien ... 34

2.2. Puffer und Lösungen ... 34

2.3. Geräte ... 34 2.4. Organismen ... 35 2.4.1. Arabidopsis thaliana ... 35 2.4.2. Escherichia coli ... 36 2.4.3. Agrobakterium tumefaciens ... 36 2.5. Antikörper ... 37 2.6. Plasmide ... 37 2.7. Oligonukleotide ... 38 2.7.1. Primer für real-timePCR ... 38

2.7.2. Primer zur Amplifikation des CRY3-Promotors ... 38

2.7.3. Primer zur Amplifikation des CRY3-Gens ... 39

2.7.4. Primer zur Amplifikation des Transitpeptids der Ferrodoxin-NADP+ -Oxidoreduktase ... 39

2.7.5. Primer zur Amplifikation des Signalpeptids der Isovaleryl-CoA Dehydro- genase ... 39

2.7.6. Primer zur Amplifikation der NES aus RanBP1a ... 40

2.7.7. Primer zur Deletion der α-Helix aus cry3 ... 40

3.

Methoden ... 41

3.1. Arbeiten mit Arabidopsis thaliana Pflanzen und Zellkulturen ... 41

3.1.1. Pflanzenanzucht in Erde ... 41

3.1.3. Flüssigkultur ... 42

3.1.4. Zellkultur ... 42

3.1.5. Herstellung von Protoplasten aus Zellkultur ... 42

3.1.6. Herstellung von Protoplasten aus Blättern oder Wurzeln von Arabidopsis thaliana

………...

3.1.7. PEG vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana Protoplasten ... 43

3.1.8. Agrobakterien-vermittelte Transformation von Arabidopsis Pflanzen durch floral dip

………...

3.2. Proteinbiochemische Methoden ... 45

3.2.1. Herstellung von Protein-Gesamtextrakt aus Arabidopsis thaliana ... 45

3.2.2. Kernproteinisolation aus Arabidopsis Zellkultur ... 45

3.2.3. Konzentrationsbestimmung von Proteinen mit Amidoschwarz ... 46

3.2.4. SDS-Page nach Lämmli ... 46

3.2.5. Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen ... 47

3.2.6. Immobilisierung von Proteinen auf Nitrocellulose-oder PVDF-Membran ... 47

3.2.7. Immunodetektion von Proteinen ... 47

3.2.8. Rehybridisierung einer Membran ... 48

3.3. Molekularbiologische Methoden ... 48

3.3.1. Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli ... 48

3.3.2. Isolation genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana ... 49

3.3.3. Isolation von mRNA aus Arabidopsis thaliana ... 49

3.3.4. cDNA Herstellung aus Arabidopsis RNA ... 49

3.3.5. Amplifikation von DNA durch PCR ... 49

3.3.6. Aufarbeitung der real-timePCR Rohdaten ... 50

3.3.7. Agarosegelelektrophorese... 50

3.3.8. Restriktion und Ligation von DNA-Fragmenten ... 51

3.3.9. Sequenzierung... 51 3.3.10. Datenbankanalysen ... 51 3.4. Fluoreszenzmikroskopie ... 52 3.4.1. Konfokale Laserscanning-Mikroskopie ... 52 3.4.2. Epifluoreszenz-Mikroskopie ... 52

4.

Ergebnisse ... 53

4.1. Cryptochrom 3 Expression in Organen von Arabidopsis thaliana ... 53

4.2. Cryptochrom 3 Proteingehalt in Organen von Arabidopsis thaliana ... 55

4.3. Chloroplasten-Import des cry3 Proteins ... 57

4.3.1. Möglicher Einfluss von Licht auf den Import von cry3 in Chloroplasten ... 57

4.3.2. Die Rolle der N-terminalen α-Helix für den Plastidenimport... 60

4.3.3. cry3-GFP wird in transgenen Pflanzen in Chloroplasten importiert ... 62

4.4.1. Das FNR-Transitpeptid adressiert cry3 an die Chloroplasten... 65

4.4.2. Das Targeting-Signal der IVD dirigiert cry3 in Mitochondrien ... 67

4.5. Das cry3 Protein lokalisiert im Nucleolus ... 72

4.5.1. cry3-GFP-NES lokalisiert nicht im Nucleolus ... 73

4.5.2. cry3-GFP lokalisiert im Zellkern in transgenen 35S:cry3-GFP Pflanzen ... 75

5.

Diskussion ... 79

5.1. Das cry3 Protein liegt vermehrt in Wurzeln und Blüten vor ... 79

5.2. Die Chloroplasten-Lokalisation von cry3 ist lichtunabhängig ... 82

5.3. Cry3 ist auch im Nucleolus lokalisiert ... 86

6.

Zusammenfassung ... 91

7.

Literatur ... 92

8.

Anhang ... 108

8.1. Plasmide ... 108

Abkürzungsverzeichnis

μm Mikrometer Abb. Abbildung

A.dest. destilliertes Wasser AK Antikörper

At Arabidopsis thaliana

bp Basenpaare

Bph Bakterielle Phytochrome BSA Rinderserumalbumin

(bovine serum albumine) cDNA complementary DNA CPD Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer Cph cyanobakterielle Phytochrome CRY Cryptochrom-Apoprotein cry Cryptochrom-Holoprotein

CRY Wildtyp Cryptochrom-Gen

cry mutiertes Cryptochrom-Gen

DAS D-Motiv, saure Amino-säuren, Serin-reiche Sequenz;

DIC Differential Interference

Contrast

DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreithol

E. coli Escherichia coli ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat EtOH Ethanol FAD Flavinadenindinukleotid fg Femtogramm FMN Flavinmononukleotid FNR Ferrodoxin-NADP-Oxidoreduktase Fph Phytochrome in Pilzen g Gramm

GFP Green Fluorescent Protein

Gl Gleichung GUS b-Glucuronidase h Stunde(n) HIR Hochintensitätsreaktion HKRD Histidinkinase-related Domain HRP Horseradish Peroxidase Hz Hertz

i.d.R. in der Regel IgG Immunglobulin G IVD

Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase kDa Kilo Dalton

L Liter

LFR Low Fluence Response

LOV Light, Oxygen, Voltage

M mol pro Liter Mbp Megabasenpare min Minute(n) mM millimolar

MTHF Methenyltetrahydrofolat N2 Stickstoff

NES Nucleus Export Sequenz

NB Nuclear Bodies

NLS Nucleus Import Sequenz NoLS Nucleolus Import Sequenz nm Nanometer OD optische Dichte p() Precursor PCR Polymerase Chain Reaction Phy Phytochrome Phot Phototropin PHR Photolyase related RNA Ribonukleinsäure rpm rounds per minute

RRM RNA recognition motif

RT Raumtemperatur oder Reverse Transkription s Sekunde(n) SCN suprachiasmatische Nuklei SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese TEMED N,N,N‘,N‘,-Tetramethylendiamin Tris/HCl Tris-(hydroxymethyl)- aminoethanhydrochlorid

u Unit

ubi Ubiquitin UV Ultraviolett

v Volumen

VLFR Very Low Fluence Response

w Gewicht

WT Wildtyp (x) g Vielfaches der

1.

Einleitung

1.1.

Photorezeptoren

Pflanzen sind als sessile, photoautotrophe Organismen abhängig von der Lichtqualität bzw. –quantität, die an ihrem Standort herrscht. Um sich diesen Bedingungen optimal anzupassen und z.B. die zur Photosynthese benötigte optimale Lichtmenge zu absorbieren, besitzen Pflanzen Photorezeptoren. Mit diesen können sie die einfallende Lichtenergie sowie die Wellenlängen wahrnehmen und daraus Rückschlüsse auf ihre Position (z.B. im Wald unter einem Blätterdach) ziehen und mit verändertem Wachstum reagieren.

Lichtqualität bezieht sich auf die Wellenlänge (λ, angegeben in nm) und wird vom menschlichen Auge im Bereich von 400-700 nm wahrgenommen. Pflanzen können darüber hinaus Licht im nahen UV-Bereich sowie im Dunkelrotbereich perzipieren (Batschauer, 1998). Die Lichtquantität wird auch als Fluenzrate bezeichnet und gibt die Photonenmenge pro Fläche und Zeit (µmol/m2_{s) an.}

Abb. 1.1: Die Photorezeptoren der Pflanzen. Funktion der (Blau-)Lichtrezeptoren in

Arabidopsis thaliana für den Phototropismus, Photomorphogenese und photoperiodisches

Blühen (gestrichelte Pfeile). Die Mitglieder der Zeitlupe Familie sind hier nicht berücksichtigt (aus Lin, 2002).

Phototropin Cryptochrom Phytochrom

Alle höheren Pflanzen verfügen über mehrere Klassen von Photorezeptoren. Dies sind die UV-A/Blaulicht absorbierenden Cryptochrome, Phototropine sowie die Zeitlupe- (ZTL) Proteinfamilie, und die Rot und Dunkelrot absorbierenden Phytochrome (Übersichtsartikel Banerjee und Batschauer 2005). Auch Licht im UV-B Bereich kann von Pflanzen wahrgenommen werden. Der hieran beteiligte Photorezeptor konnte jedoch noch nicht molekular identifiziert werden.

1.2.

Phytochrome

Phytochrome (im Folgenden als phy bezeichnet) sind dimere Proteine, die durch Absorption von rotem bzw. dunkelrotem Licht einer reversiblen Konformationsänderung unterliegen, die ihre Absorptions-Eigenschaften verändern. Sie liegen in der Zelle in der sog. Pr oder Pfr Form vor, wobei die Pr-Form rotes (660 nm, red), die Pfr-Form dunkelrotes (730 nm, far-red) Licht absorbiert und das Protein damit in die jeweils andere Form überführt (Übersichtsartikel Batschauer, 1998; Rockwell et al., 2006). Daraus ergibt sich ein Equilibrium aus Pr- und Pfr-Form, das der Pflanze die Lichtbedingungen am Standort reflektiert. Phytochrome steuern verschiedene Prozesse in der Pflanzenentwicklung (Keimung, De-Etiolierung, Blütenentwicklung), die zusammen als Photomorphogenese bezeichnet werden. Phytochrome von Arabidopsis thaliana haben ein MW von ~125 kDa und tragen N-terminal den Chromophor Phytochromobilin - ein offenkettiges, lineares Tetrapyrrol, welches kovalent gebunden ist. Die cis-trans Isomerisierung des Chromophors (Mancinelli, 1994), die die Absorptionseigenschaften des Photorezeptors verändert, ist auch Auslöser für die lichtinduzierte Konformationsänderung des Proteins (Park et al., 2000). Phytochrome besitzen eine photosensorische Domäne (N-terminal) und einer regulatorischen Domäne (C-(N-terminal), die für die Dimerisierung zuständig ist. Die photosensorische Region ist aus einem PAS-ähnlichen Motiv, einer GAF-Domäne (entfernt verwandt mit PAS, kommt vor in pflanzlichen Phytochromen und cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen), die den Chromophor trägt, und einer Phytochrom-spezifischen Domäne aufgebaut. Im C-Terminus sind zwei PAS-Domänen (in pflanzlichen Phytochromen) sowie eine Histidin-Kinase ähnliche Domäne (HKRD) konserviert (Abb. 1.2). Der C-Terminus vermittelt die Homodimerbildung und ist obligat für die Bildung von

Nuklear Bodies (siehe unten, Oka et al., 2004), von denen man annimmt, dass sie den Ort der Degradation von Transkriptionsfaktoren (den PIFs) darstellen (Chen et al., 2005). In

Arabidopsisthaliana hat die Genfamilie der Phytochrome fünf Mitglieder (Phy A-E, Clack et al., 1994), in Oryza sativa drei (Takano et al., 2005) und in Pinus vier. Grundsätzlich

lassen sich die Phytochrome in TypI und II einteilen: PhyA gehört zu TypI und kommt in großen Mengen in etiolierten Pflanzen vor, seine Pfr-Form ist lichtinstabil (Quail et al., 1995). PhyA kontrolliert Schwachlicht-Antworten (VLFR, Very Low Fluence Response) sowie Starklicht-Reaktionen im dunkelroten Bereich (FR-HIR, Far-Red High-Irradiance Response). TypII kommt hauptsächlich in grünen Pflanzen vor, aber auch in etiolierten Keimlingen. Die Schwachlicht-Reaktion (LFR) und die Starklicht-Antwort auf hellrotes Licht (HIR) werden durch PhyB-E gesteuert. Sie gehören zu TypII (Quail, 2002).

Die Pfr-Formen der TypII Phytochrome sind im Gegensatz zu phyA stabil und werden konstitutiv exprimiert (Somers et al., 1991). Die verschiedenen Mitglieder dieser Genfamilie haben sowohl spezielle als auch gemeinsame Funktionen bei der Kontrolle der Pflanzenentwicklung (Smith et al., 1997; Franklin et al., 2003; Monte et al., 2003).

Bei Dunkelheit lokalisieren die Phytochrome hauptsächlich im Cytosol, (phyB-E zeigen ein schwaches Kernsignal als GFP-Fusionsprotein), bei Belichtung werden sie jedoch in den Kern transportiert, wo sie sich zu sog. Nuclear Bodies formieren (NBs, Hisada et al., 2000; Kircher et al., 2002). In etiolierten Keimlingen wird phyA sehr schnell in den Kern transloziert und die maximale Bildung von NBs ist nach 10 min Belichtung erreicht. Dabei ist Licht jeder Wellenlänge wirkungsvoll und phyA wird vermutlich in diesen Körperchen ubiquitiniert und anschließend abgebaut. PhyB wird bei Belichtung wesentlich langsamer

Photosensorische Regulatorische Domäne

Abb. 1.2: Domänenstruktur der Phytochrom-Familie. Alle Mitglieder besitzen

N-terminal eine photosensorische Region und eine regulatorische C-N-terminale Domäne, verwandt mit Zwei-Komponenten Histidin-Kinasen (HKRD). Nur pflanzliche Phytochrome (Phy) verfügen über zwei zusätzliche PAS-Domänen in der regulatorischen Region. Phytochrome aus Pilzen (Fph) gleichen in ihrer Struktur den bakteriellen (Bph) und cyanobakteriellen (Cph) Phytochromen, tragen aber C-terminal eine regulatorische Empfängerdomäne (RR, Response Reguator, weitere Abk. siehe Text). (Aus Rockwell et al., 2006.)

in den Kern importiert, die sich dort formierenden NBs sind stabil und in Dunkelheit nach etwa 24 h wieder aufgelöst (Gil et al., 2000). Nur Dauerrot- oder Weißlicht können den Kernimport von phyB bewirken, während dunkelrotes oder blaues Licht sowie einzelne Lichtpulse wirkungslos sind. PhyC-E werden ebenfalls im Weißlicht in den Kern transloziert und eine maximale Formation von NBs ist nach 2 h zu beobachten (Kircher et al., 2002). Die Anzahl und Größe der NBs ist abhängig von der Fluenzrate. Nach dem Transport in den Kern können die Phytochrome dort mit anderen Proteinen ihrer Signalkette interagieren, die auch Teil der NBs sein können. So konnten Bauer et al. (2004) zeigen, dass PIF3 (ein basischer Helix-Loop-Helix Transkirptionsfaktor, Phytochrome Interacting Factor) mit den frühen NBs von phyA, B und D co-lokalisiert, jedoch nicht mit den sich spät bildenden NBs.

Durch Deletionskonstrukte konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von phyB allein konstitutiv in den Kern transportiert wird (Nagy und Schafer, 2000; Nagy et al., 2001; Chen et al., 2005). Die PAS-Motive im C-Terminus sind für den Transport von phyB in den Kern notwendig (Chen et al., 2005). Sie enthalten eine NLS, die in der Pr-Form von phyB von der N-terminalen Domäne des Proteins maskiert wird. Lichtabhängig ändert sich die Konformation und gibt in der Pfr-Form die PAS-Domäne und damit die NLS frei. Der Kernimport von phyA ist von den kleinen, pflanzenspezifischen Proteinen FHY1/FHL abhängig (Hiltbrunner et al., 2005; Hiltbrunner et al., 2006; Rösler et al., 2007). Beide Proteine haben eine klassische NLS (und NES) und eine Interaktion mit phyA wurde im

Pull-down nachgewiesen.

Neben den pflanzlichen Phytochromen gibt es verwandte Proteine in vielen Organismen. In Cyanobakterien wurden bereits Ende der 90er Jahre prokaryotische Phytochrome entdeckt, die als chromophore Gruppe Phycocyanobilin tragen (Kehoe und Grossman, 1996; Hughes et al., 1997; Yeh et al., 1997). In filamentösen Pilzen existieren die Fphs (Blumenstein et al., 2005; Froehlich et al., 2005), die ebenso wie die in Eubakterien gefundenen Bphs (Jiang et al., 1999; Bhoo et al., 2001) Biliverdin als Chromophor tragen. Damit sind die Absorptionseigenschaften dieser Phytochrome mehr in den blauen (Synechocystis) bzw. in den dunkelroten Bereich des sichtbaren Lichts verschoben. Diese Phytochrome tragen C-terminal keine PAS und HKRD-Domäne (siehe Abb. 1.2), sondern eine Histidin-Kinase, deren Autophosphorylierungsfunktion in Synechocystis gezeigt werden konnte (Yeh et al., 1997). Die Histidin-Kinasen der bakteriellen und pilzlichen Phytochrome arbeiten als Rezeptoren in einem Zwei-Komponenten-System. Eine

Response-Regulator Domäne ist im entfernten C-Terminus der Cphs, Bphs und Fphs konserviert, in pflanzlichen Phytochromen gibt es diese nicht (Abb. 1.2).

Eine Ausnahme zu dieser konservierten Domänenstruktur gibt es in Grünalgen und Farnen; der dort gefundene Photorezeptor wird „Neochrom“ genannt: er kombiniert den lichtsensorischen N-Terminus der Phytochrome mit einer LOV (Light/Oxygen/Voltage) Domäne, die für Phototropine typisch ist (Suetsugu et al., 2005).

1.3.

Phototropine

Seit dem Jahr 1817 sind große Mengen an Daten über physiologische Antworten von Pflanzen auf Blaulicht gesammelt worden (Historischer Review: Briggs, 2006). Dazu gehören die Inhibition des Längenwachstums von Keimlingen, die sich im Dunkel entwickelt haben, sowie der Phototropismus (Wachstum des Sprosses (i.d.R.) hin zum Licht, bzw. von Wurzeln weg vom Licht), die Öffnung der Stomata, das Blattwachstum und die Chloroplastenbewegung (Übersichtsartikel Briggs, 2007; Christie, 2007). Das Phänomen des positiven (Spross) und negativen (Wurzel) Phototropismus wurde zur Erforschung der Blaulicht-Perzeption und Signalweiterleitung genutzt. Von Arabidopsis thaliana gibt es eine Reihe Mutanten, die einen verminderten Phototropismus des Hypokotyls als Antwort auf schwaches Blaulicht zeigen. Einigen dieser Mutanten fehlt die aktive Form eines Proteins, das Blaulicht-abhängig phosphoryliert wird (Liscum und Briggs, 1995). Dieses Protein wurde zunächst nph1 (non phototropic hypocotyl) genannt. Nachdem nachgewiesen war, dass es sich dabei um den Lichtrezeptor des Phototropismus handelt, wurde es in phototropin1 (phot1) umbenannt (Christie et al., 1999). In

Arabidopsis thaliana wurde noch ein zweites Phototropin gefunden (phot2, Jarillo et al.,

2001). Beide vermitteln den Phototropismus unter starkem einseitigem Blaulicht, während unter Schwachlichtbedingungen allein phot1 als Photorezeptor für die Hypokotyl-krümmung fungiert (Sakai et al., 2000).

Abb. 1.3: Proteinstrukturen von Phototropin und Neochrom Photorezeptoren. Die

Domänen mit ihren zugehörigen Chromophoren sind farblich dargestellt (Abb. aus Christie, 2007).

Phototropin

Neochrom

LOV1 LOV2

Phytochrom photosens. Domäne LOV Domäne

Jα-Helix

Serin/Threonin Kinase Domäne

Flavin Mononukleotid Phytochromobilin

Phototropine können in zwei Bereiche unterteilt werden: den N-terminalen photosensorischen Teil und den C-terminalen Teil, welcher eine Serin/Threonin-Kinase-Domäne enthält. Der photo-sensorische N-Terminus trägt zwei LOV-Serin/Threonin-Kinase-Domänen (Light Oxygen Voltage), die mit den PAS-Domänen eng verwandt sind. Die LOV-Domänen binden den Cofaktor FMN (Flavinmononukleotid) und dienen dem Protein als Blaulichtsensoren (Christie et al., 1999, Abb. 1.3). Die Lichtanregung dieser Domänen führt zur Autophosphorylierung des Proteins.

Blaulicht-Antworten wurden auch in Kryptogamen untersucht und so wurden im Farn

Adiantum capillus-veneris zwei Phototropine (Nozue et al., 1998; Kagawa et al., 2001) und das bereits oben genannte Neochrom (Neo) gefunden. Dieser Photorezeptor gleicht einem Phototropin, an das N-terminal eine photosensorische Phytochrom-Domäne fusioniert ist (Nozue et al., 1998; Suetsugu et al., 2005) (Abb. 1.3). Das Neochrom (auch Acphy3 genannt) steuert den Phototropismus und die Chloroplastenbewegung, beides wird durch Rot- und Blaulicht vermittelt (Kawai et al., 2003). Auch in Algen wurden Phototropine und Neochrome gefunden (z.B. Mougoetia scalaris: 2 phot, 2 Neo). Ein Vergleich der NEO Gene zeigte, dass die Neochrome von Adiantum capillus-veneris und

Mougeotia scalaris unabhängig voneinander entstanden sind (konvergente Evolution) (Suetsugu et al., 2005).

Die LOV-Domänen der Phototropine bestehen aus fünf ß-Strängen verbunden durch zwei α-Helices. Das Chromophor wird durch Hydrogen- und Van-der-Waals-Kräfte in einer Mulde gehalten (Crosson und Moffat, 2001). Bei Bestrahlung mit blauem Licht wird eine kovalente Bindung zwischen dem C(4)-Atom des FMN und einem konservierten Cysteinrest in der LOV-Domäne ausgebildet (FMN-Cysteinyl Addukt). Im Dunkel löst sich diese Bindung sehr schnell und es findet eine Dunkelreversion statt. Somit gibt es einen Photozyklus der LOV-Domänen, der auch an der Veränderung der Absorptions-eigenschaften beobachtet werden kann (Salomon et al., 2000; Kasahara et al., 2002). Es konnte durch gezielte Mutagenese gezeigt werden, dass LOV2 für die Autophosphorylierung von phot1 und die dadurch vermittelte Hypokotyl-Krümmung notwendig ist, nicht jedoch LOV1 (Christie et al., 2002). NMR Studien mit LOV Fragmenten aus Hafer zeigten, dass die C-terminal von LOV2 befindliche α-Helix (Jα) bei Dunkelheit mit LOV2 assoziiert ist. Die lichtbedingte FMN-Cysteinyl-Bildung führt zu einer Konformationsänderung des Proteins und verhindert dadurch diesen Kontakt (Harper et al., 2004). Es wird daher vermutet, dass diese Jα-Helix als eine Art Gelenk fungiert, die den Kinase-Teil des Proteins lichtabhängig freigibt.

Die Autophosphorylierung des Plasmamembran-assoziierten Phototropins auf der belichteten Seite des Sprosses führt zum Auxin-abhängigen Wachstum auf der Schattenseite (Salomon et al., 1997a; Salomon et al., 1997b). Es wurde daher ein Modell vorgeschlagen, bei dem die Signalweiterleitung auf einem Phosphorylierungsgradienten des Phototropins basiert. Die Auxin-Empfindlichkeit der Pflanze ist für den Phototropismus notwendig: ohne die Auxin-regulierten Transkriptionsfaktoren NPH4 und MSG2 findet keine phototrophe Krümmung statt (Stowe-Evans et al., 1998; Harper et al., 2004; Tatematsu et al., 2004). Transkriptomanalysen zeigten einen Anstieg der NPH4 (Non Phototropic Hypocotyl) regulierten Gene α–Expansin1 und 8 in Brassica oleracea während der phototropischen Hypokotylkrümmung. Mitglieder der α-Expansin Familie vermitteln das Zellwand Wachstum (Esmon et al., 2006). NPH3 ist ein Protein, das für den lateralen Auxingradienten und den Phototropismus notwendig ist (Liscum und Briggs, 1995; 1996). Es konnte gezeigt werden, dass NPH3 mit phot1 interagiert und auch mit der Plasmamembran assoziiert ist (Motchoulski und Liscum, 1999; Haga et al., 2005). NPH3 liegt in Dunkelheit phosphoryliert vor und wird im Blaulicht dephosphoryliert. Sowohl NPH3 als auch phot1 werden von PKS1 (Phytochrom Kinase Substrat1) gebunden. Da die phototropische Krümmung auch von Phytochromen beeinflusst wird, stellen PKS-Proteine evtl. eine gemeinsame Komponente der Phytochrom und Phototropin-Signalwege dar (Iino, 2006; Lariguet et al., 2006).

1.4.

ZTL/ADO-Familie

Eine weitere Klasse putativer Blaulichtrezeptoren bilden Proteine, die ebenfalls LOV- Domänen besitzen. Ihr gehören drei Mitglieder an: ZTL (Zeitlupe, auch ADO für Adagio genannt), FKF1 (Flavin-binding, Kelch Repeat, F-box1) und LKP2 (LOV Kelch, Protein2) (Übersicht in Banerjee und Batschauer, 2005). Diese Proteine sind für die Funktion der circardianen Rhythmik und die Steuerung des Blühzeitpunktes in Arabidopsis thaliana

notwendig (Übersichtsartikel Christie, 2007; Demarsy und Fankhauser, 2009). Die Proteine haben drei Domänen gemeinsam: eine N-terminale LOV-Domäne, ein F-Box Motiv und C-terminal sechs Kelch Motiv Wiederholungen. F-Box Proteine gehören zu den SCF-Typ (Skp1, Culin, F-box) E3-Ubiquitin-Ligasen. Diese Enzyme führen Proteine für ihren Abbau dem Proteasom zu. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Funktion der ZTL-Proteine darin besteht, andere regulatorische Komponenten für ihre Proteolyse zu markieren (Mas et al., 2003; Imaizumi et al., 2005). Die Kelch-Domänen formen eine ß-Propeller-Struktur, die vermutlich Protein-Protein Interaktionen vermittelt. Die

LOV-Domänen der ZTL-Proteine wurden in E. coli exprimiert und hatten den Cofaktor FMN gebunden. Wie bei den Phototropinen findet eine lichtabhängige Cysteinyl-Addukt Bildung statt, jedoch keine Dunkelreversion. Ein Photozyklus wie der der Phototropine fehlt somit (Imaizumi et al., 2003; Nakasako et al., 2005). Nur von FKF1 wurde die Photorezeptor-Funktion nachgewiesen. Seine Transkriptmengen oszillieren mit circadianer Rhythmik, es ist aber selbst nicht an der Funktion der endogenen Uhr beteiligt. FKF1 reguliert die Stabilität von CDF1 (Cycling Dof Factor1), wodurch die Expression des Blühinduktion-Gens CONSTANS (CO) unterdrückt wird (Imaizumi et al., 2005). CO wiederum induziert die Expression von FT (Flowering Locus T) in der Abenddämmerung. Die LOV-Domäne von FKF1 interagiert mit GI (GIgantea). Dieses Protein ist ebenfalls wie FKF1 ein positiver Regulator der CO Expression. Diese Interaktion findet nur Blaulicht-abhängig statt und hängt von der Lichtanregung der LOV-Domäne ab. GI interagiert auch direkt mit CDF1 in einem Komplex mit FKF1. Dieser Komplex bewirkt die Degradation von CDF1 (Sawa et al., 2007). ZTL interagiert ebenfalls lichtabhängig mit GI wodurch es sich selbst stabilisiert. Da GI in Abhängigkeit von der endogenen Uhr exprimiert wird, führt diese Interaktion zu einer tageszeitabhängigen Akkumulation des ZTL-Proteins, obwohl das Gen konstitutiv exprimiert wird (Somers, 2001; Kim et al., 2007). Die Akkumulation von ZTL führt über den ZTL-SCF Komplex zu hohen Amplituden in der TOC1 Menge. TOC1 ist Zielprotein des ZTL-SCF Komplexes und ist einer von fünf Regulatoren, die die Funktion des endogenen Oszillator gewährleisten (Somers, 2001; Kim et al., 2007; Fujiwara et al., 2008).

Abb. 1.4: Schema der Zeitlupe Protein-Familie. Die Photorezeptoren tragen eine

N-terminale LOV Domäne, gefolgt von einem F-Box Motif und sechs Kelch Wiederholungen in der C-terminal Region. Analog zu anderen Proteinen könnten die Kelch Motive der Protein– Protein Interaktion dienen (nach Demarsy & Fankhauser 2007).

LOV1 F-BOX KELCH

FMN

GI Interaktion SCF Interaktion

1.5.

Putative UV-B Rezeptoren

UV-B-Licht (280–320 nm) kann die Pflanze schädigen oder als Signal für ihre Entwicklung dienen, abhängig von der Intensität der UV-B Strahlung. Die Mechanismen, durch die starke UV-B-Strahlung die Pflanze schädigt und ihr Reparatur-System aktiviert, sind gut untersucht. Über die Perzeption und Signalweiterleitung von schwachem (low fluence) UV-B-Licht ist dagegen nur wenig bekannt. In Arabidopsis thaliana gibt es verschiedene Reaktionen auf die Einstrahlung von schwachem UV-Licht: die Inhibition des Hypokotylwachstums in etiolierten Keimlingen, die Synthese von UV-B-Licht absor-bierenden Sekundärmetaboliten (Flavonoide und andere) sowie eine Veränderung im Gen-expressionsmuster (Fuglevand et al., 1996; Kim et al., 1998; Boccalandro et al., 2001). Suesslin und Frohnmeyer (2003) suchten in einer Bank von T-DNA Linien nach einer Mutante, die in dieser Reaktion beeinträchtigt ist und identifizierten so das ULI3 Gen ( UV-B Light Insensitive). Das Protein ist ~80 kDa groß und trägt eine putative Häm- und Diacylglycerol-Bindestelle. Es wird hauptsächlich in den äußersten Gewebeschichten exprimiert und nicht in Wurzeln. UV-B Licht steigert die Expression des ULI3-Gens. Phylogenetische Untersuchungen zeigten, dass ULI-Proteine Brassicaceen-spezifisch sind (Lariguet und Dunand, 2005).

Tong et al. (2008) isolierten eine Mutante, deren Wurzeln hypersensitiv auf UV-B Strahlung reagieren, wenn die Pflanzen auf Agar-Platten angezogen werden. Nach der Keimung wachsen die Wurzeln nicht und der Keimling bildet keine post-embryonalen Blätter aus. Ohne UV-B Strahlung kann die Pflanze normal wachsen. Für die Reaktion ist der Ausfall des in den Wurzeln exprimierten Proteins RUS1 (Root UV-B-Sensitiv) verantwortlich. Dies ist 66 kDa groß und trägt eine DUF647 Domäne von unbekannter Funktion, die in Proteinen der meisten Eukaryoten vorkommt. Da die Reaktion auf das UV-B-Licht extrem sensitiv ist, spekulieren Tong et al., dass der verantwortliche Rezeptor einen speziellen Chromophor trägt; die bekannten Photorezeptoren sind an dieser Reaktion nicht beteiligt.

UV-B abhängige Änderungen der Genexpression betreffen u.a. den Transkriptionsfaktor HY5 (Brown et al., 2005a), an dessen UV-Regulierung die Proteine COP1 (COnstitutive Photomorphogenic) und UVR8 beteiligt sind. UVR8 (UV Response Locus) ist ein 47 kDa großes Protein, dessen Nullmutante nicht auf UV-B Licht reagiert (Favory et al., 2009). Die Autoren konnten zeigen, dass UVR8 und COP1 Schlüsselkomponenten der UV-B Signalweiterleitung darstellen. Die Funktion von COP1 ist hier eine andere als die als Repressor der Photomorphogense in Dunkelheit. Auch ein funktionierender

Brassino-steroid-Biosyntheseweg ist für die Signalweiterleitung notwendig (Brassinosteroide sind wichtig für das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen und steigern die Stress-Toleranz, Savenstrand et al., 2004). Pflanzen, in denen dieser Biosyntheseweg gestört ist, zeigten ein verändertes Genexpressionmuster einiger Markergene (CHS, PYROA, PR-5, MEB5.2) als Antwort auf UV-B Licht im Vergleich zum Wildtyp.

1.6.

Cryptochrome

Cryptochrome (cry) sind Flavoproteine, die für ein breites Spektrum an UV-A- und Blaulicht-Antworten in Organismen aller Reiche bis auf Archeen verantwortlich sind. Sie bilden zusammen mit den Photolyasen die Cryptochrom/ Photolyase-Familie (CPF), die in mehrere Untergruppen eingeteilt werden kann (siehe Abb. 1.7). Ihr gehören drei Klassen von Photolyasen an, die entsprechend ihrer Substrate unterschieden werden: CPD-Photolyasen reparieren Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere und kommen in Organismen aller Reiche vor (Sancar et al., 1984), Photolyasen katalysieren die Reparatur von (6-4)-Photoprodukten und konnten nur in Eukaryoten gefunden werden (Todo et al., 1993). Anhand unterschiedlicher Proteinsequenzen werden die CPD-Photolyasen weiter unterschieden in Klasse I, II (Kanai et al., 1997) und III (Ozturk et al., 2008). Die Cryptochrom-Vertreter der CPD-Familie setzen sich zusammen aus den pflanzlichen Cryptochromen, die den CPD Klasse I Photolyasen sehr nahe stehen, den tierischen Cryptochromen, die den (6-4)-Photolyasen näher sind (Cashmore et al., 1999) und der cry-DASH Klasse (Brudler et al., 2003). In Säugern sind die Cryptochrome Bestandteil der inneren Uhr und steuern das circardiane Verhalten, als Photorezeptoren wie in Drosophila

synchronisieren sie die circardiane Uhr durch Perzeption von Lichtsignalen(Lin und Todo, 2005). In Vögeln sind sie möglicherweise für die Wahrnehmung des Magnetfeldes zuständig (Wiltschko und Wiltschko, 2005), diese Funktion konnte kürzlich auch in

Drosophila gezeigt werden (Gegear et al., 2008). In Pflanzen kontrollieren Cryptochrome zusammen mit anderen Photorezeptoren die De-Etiolierung von Keimlingen, den Blühzeitpunkt und ebenfalls das Synchronisieren der inneren Uhr (Übersichtsartikel Li & Yang, 2007) sowie das Öffnen der Stomata (Mao et al., 2005). In allen Reichen einschließlich der Archeen konnten außerdem Vertreter der cry-DASH Familie gefunden werden, für die neben der Blaulicht-Perzeption (Brudler et al., 2003) die Reparaturfunktion von Thymindimeren in einzelsträngiger DNA und in Loop-Strukturen von Duplex-DNA charakteristisch ist (Selby und Sancar, 2006; Pokorny et al., 2008).

Cryptochrome haben große Sequenzähnlichkeit mit den DNA Photolyasen, weisen aber (mit Ausnahme von cry-DASH) keine Reparaturaktivität auf. Die beiden Familien zeigen viele Gemeinsamkeiten, wie ähnliche Proteinstrukturen und FAD als Kofaktor (Essen, 2006). Der N-Terminus, der den Photolyasen ähnlich ist, besteht aus einer α/β-Domäne, gefolgt von einer Interdomänenschleife und daran anschließend C-terminal einer helikalen Domäne, die FAD bindet (siehe Abb. 1.6 und 1.8). Der zweite Kofaktor, der in Cryptochromen vermutlich wie in vielen Photolyasen Methenyltetrahydrofolat ist, ist in der Spalte zwischen N-terminalem und C-terminalem Teil der PHR-Domäne gebunden (Klar et al., 2007). Der Cryptochrom-spezifische C-Terminus fehlt den Photolyasen und trägt das sog. DAS-Motiv (D-motif, Acidic amino acids, Serine rich Sequence; Lin, 2002). Es konnte gezeigt werden, dass die C-terminale Extension für Protein-Protein-Interaktionen notwendig ist. Z.B. konnte für Arabidopsis CRY1 und CRY2 eine Interaktion mit COP nachgewiesen werden (Yang et al., 2000; Wang et al., 2001). Zusätzlich wurde eine Blaulicht-abhängige Phosphorylierung der C-terminalen Extension gezeigt (AtCRY1 und hCRY1 in vitro (Ahmad et al., 1998a; Bouly et al., 2003, Shalitin et al., 2003).

1.6.1. Cryptochrome in Tieren

In Tieren gibt es eine zentrale circardiane Uhr, die im Gehirn lokalisiert ist. In Drosophila melanogaster gibt es ein Cryptochrom, Dmcry und dieses ist für die Lichtregulation der inneren Uhr zuständig (Stanewsky et al., 1998). Dmcry interagiert lichtabhängig mit TIM (TIMeless) und unterdrückt somit die negative Regulation der Uhr (Ceriani et al., 1999). Die Bildung eines Dimers aus TIM und PER (PERiod) wird verhindert und die Ubiquitinierung und damit der Abbau der Proteine eingeleitet (s. Abb. 1.5). Das PER-TIM Dimer wird selbst in den Kern transportiert und verhindert dort die Transkription der eigenen Gene sowie des CRY Gens. Dmcry ist jedoch nicht der einzige Photorezeptor, der in Drosophila für das Stellen der inneren Uhr notwendig ist, da Drosophila cry-Mutanten einen lichtabhängigen circardianen Rhythmus zeigen, solange noch Sehpigmente vorhanden sind. Kürzlich wurde das Drosophila Cryptochrom als lichtabhängiger Magnetorezeptor nachgewiesen (Gegear et al., 2008). Dmcry defiziente Fliegen zeigten kein magnetosensitives Verhalten im Weißlicht. Es wurde schon zuvor diskutiert, dass Blaulichtrezeptoren an der Wahrnehmung des Erdmagnetfelds in Vögeln beteiligt sein könnten (Ritz et al., 2000). Das FAD-Tryptophan-Radikal Paar, dessen Entstehung für Atcry1 unter Belichtung gezeigt wurde (Zeugner et al., 2005), könnte der hierbei beteiligte Rezeptor sein (Rodgers und Hore, 2009). In Säugern scheinen die Cryptochrome keine direkte lichtabsorbierende Funktion zu haben. So gibt es z.B. in

Mäusen und auch im Menschen zwei Cryptochrome (Lin und Todo, 2005). Sie funktionieren als Repressoren der BMAL1/CYCLE und CLOCK Transkriptionsfaktoren, die als Heterodimere die transkriptionnelle negative Feedback-Schleife zum Stellen der inneren Uhr darstellen (in allen bisher untersuchten Tieren). Die zentrale circardiane Uhr sitzt im SCN (SupraChiasmatischer Nukleus) an der Basis des Hypothalamus im Gehirn der Säugetiere und ist u.a. direkt von der Retina innerviert (Übersichtsartikel Hastings et al., 2007). Der Gehalt an PER1-, PER2-, CRY1- und CRY2-mRNA steigt im Laufe des Tages in den Neuronen des SCN an und mit einigen Stunden Verzögerung auch ihre Proteinpegel. Am Ende des Tages haben die Proteingehalte ihr Maximum erreicht und aufgrund der negativen Feedbackschleife wird die Transkription der PER und CRY Gene inhibiert. Für den Lichteingang zur inneren Uhr ist das Photopigment Melanopsin verantwortlich. Es wurde in einer Gruppe photorezeptiver retinaler Ganglionzellen in Mäusen gefunden (Qiu

et al., 2005) und ist alleinig für das Synchronisieren der innern Uhr mit der Tageslänge verantwortlich. Clock-Gene werden ebenso in vielen peripheren Geweben exprimiert, man spricht hier von peripheren circardianen Uhren. Die peripheren Uhren werden u.a. in Abhängigkeit von der Nahrungsaufnahme synchronisiert und dafür konnte die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) verantwortlich gemacht werden (Lamia et al., 2009). Sie phosphoryliert zwei Serinreste im cry1 Protein und bewirkt so dessen Abbau, wodurch es zur Transkription der Clock-Gene kommt (bei Nahrungsaufnahme). Entgegen der Annahme, dass eine gestörte Funktion der inneren Uhr zu einem erhöhten Krebsrisiko führt, konnte gezeigt werden, dass der Verlust von Cryptochromen in p53-Mäusen (einer Linie, die schnell und häufig Krebs entwickelt) zu einer Verlängerung der Lebenszeit um 50% führt (Ozturk et al., 2009). Möglicherweise werden von Krebs befallene Zellen, die keine Cryptochrome aufweisen, besser apoptotisch abgebaut. Im Gegensatz dazu stehen die Daten von Hoffmann et al., (2010), die zeigen, dass in Brustkrebszellen signifkant häufig die hCRY2 Expression vermindert ist. Dies ist auf die vermehrte Methylierung des

CRY2-Promotors zurückzuführen. Die verringerte hCRY2 Expression bewirkt eine veränderte Expression einiger Krebs-relevanter Gene. Die Autoren postulieren, dass das circardiane System eine wichtige Rolle bei der Hormon-gesteuerten Tumorbildung spielt.

1.6.2. Cryptochrome in Pflanzen

Cryptochrome wurden in vielen Pflanzen gefunden. Beispielsweise gibt es in Oryza sativa

und Solanum lycopersicum wie in Arabidopsis thaliana zwei Cryptochrom-Gene, in

Solanum und Arabidopsis und weiteren Pflanzen außerdem ein CRY-DASH Gen (Über-sichtsartikel Lin und Todo, 2005; Facella et al., 2006). Auch niedere Pflanzen wie der Farn

Adiantum capillus-veneris, das Moos Physcomitrella patens und die Alge Chlamydomonas reinhardtii besitzen Cryptochrome. Aufgrund der wesentlichen Unterschiede zwischen den pflanzlichen Cryptochromen und den Cryptochromen der cry-DASH Familie werden diese

Abb. 1.5: Regulation der circardianen Uhr durch Cryptochrome. (a) In Drosophila: Cryptochrome unterdrücken die negative Feedback Schleife der circardianen Uhr durch lichtabhängige Bindung an TIM. Dies führt zur Ubiquitinierung und zum Abbau von TIM, wodurch die Bildung eines PER-TIM Dimers verhindert wird. Dieser würde im Kern die Bindung von Clock-Proteinen an die Promotorregion von PER und CRY und damit deren Transkription inhibieren.

(b) In Säugetieren sind Cryptochrome interner Teil der negativen Feedback Schleife. CRY und PER interagieren und inhibieren die Funktion der Transkriptionsfaktoren CLK und BMAL1. Eine Rolle bei der Synchronisation der Uhr mit Lichtsignalen über die Retina konnte für Cryptochrome nicht nachgewiesen werden, diese Aufgabe wird dem Photosensor Melanopsin zugeschrieben (Qiu et al., 2005, Abb. aus Lin & Todo 2005).

im Folgenden getrennt besprochen, wenngleich auch beide in Arabidopsis thaliana

vorkommen.

Arabidopsis cry1 und cry2

CRY1 aus Arabidopsis wurde durch eine Mutation des hy4 Gens gefunden (Koorneef et al.,

1980). Diese Mutante zeigte keine De-Etiolierung im Blau-/UV-A Licht (Ahmad und Cashmore, 1993). Später wurde hy4 in cry1 umbenannt. Cry2 wurde durch eine spät blühende Mutante gefunden, die anfangs fha genannt wurde (Koornneef et al., 1991, Guo

et al., 1998). Cry2 ist lichtlabil und es spielt bei der De-Etiolierung unter schwachem Blaulicht eine Rolle (Ahmad et al., 1998). Cryptochrome interagieren mit den Phytochromen bei der Photomorphogenese, der Blühinduktion sowie dem Stellen der circardianen Uhr (Somers et al., 1998; Mockler et al., 2003), diese Interaktion konnte auch physikalisch nachgewiesen werden (Ahmad et al., 1998; Tatematsu et al., 2004). Kang et al., (2008) konnten positive wie negative Interaktionen von Cryptochrom- und Phototropin-abhängigen Signalwegen zeigen. Es wurden synergistische Effekte bei der phototropistischen Hypokotylkrümmung (Whippo und Hangarter, 2003), der Photomorphogenese und der Anthocyan-Akkumulation nachgeweisen. Außerdem hemmen Cryptochrome Blaulicht-abhängig die Expression des Phot1-Gens (Kang et al., 2008).

Abb. 1.6: Vergleich der Domänen der drei Cryptochrome aus Arabidopsis thaliana. Der Photolyase-verwandte Bereich (PHR-Domäne) ist bei allen Cryptochromen hoch konserviert, dieser bindet auch die beiden Chromophore FAD und MTHF nicht kovalent. cry1 und cry2 tragen auf ihrem C-Terminus das Cryptochrom-spezifische DAS-Motiv. Dieses Motiv ist bei Arabidopsis cry-DASH N-terminal lokalisiert. Auf dem C-Terminus von cry2 ist eine zweiteilige Zielsteuerungssequenz für den Zellkern (NLS) lokalisiert. Im C-Terminus von

Arabidopsis cry-DASH konnte eine pat7 NLS gezeigt werden (diese Arbeit). Die ersten 40 AS

von cry-DASH fungieren als Transitpeptid, um das Protein in Mitochondrien und Chloroplasten zu dirigieren. -43 Signal DAS 1 41 ₅₂₅ PHR- Domäne FAD MTHF 470 50 PHR- Domäne FAD MTHF 1 DAS 612 50 PHR- Domäne FAD MTHF 1 DAS 681 Atcry1 Atcry2 Atcry-DASH _{= NLS}

Die physiologischen Funktionen der Cryptochrome im Einzelnen:

•

Photomorphogenese

Die Photomorphogenese umfasst die Prozesse der De-Etiolierung, die in der Pflanze nach der Keimung bei Belichtung ablaufen: die Öffnung des Hypokotyl-Hakens und der Kotyledonen, reduziertes Hypokotylwachstum, die Förderung des Blatt- und Wurzelwachstums, die Bildung von Pigmenten wie Anthocyanen, die Ausbildung von Seitenwurzeln, die Chlorophyllbiosynthese und die Entwicklung von Etioplasten und Proplastiden zu Chloroplasten.

Studien an Photorezeptor-Mutanten konnten cry1 eine Hauptrolle bei der Photomorphogenese zuschreiben, cry2 spielt hierbei nur im schwachen Blaulicht eine Rolle (Lin et al., 1998). Die Inhibition des Hypokotylwachstums wird von cry1 und cry2, die Anthocyan-Akkumulation von cry1 gesteuert (Ahmad und Cashmore, 1993; Ahmad et al., 1995; Wu und Spalding, 2007). Cry1 liegt in Dunkelheit in der Zelle überwiegend im Kern vor, bei Belichtung wird es in das Cytoplasma exportiert (Cashmore et al., 1999). Cry2 zeigt dagegen eine lichtunabhängige konstitutive Zellkernlokalisation, was durch den Nachweis einer Kernlokalisationssequenz (NLS) in der CCT-Domäne bestätigt wurde (Guo

et al., 1999, Kleiner et al., 1999, Abb. 1.6). Im Gegensatz zu cry2 wurde in cry1 keine NLS gefunden. Wu und Spalding (2007) transformierten die cry1 Mutante mit cry1NES oder cry1NLS und untersuchten die Licht-Antworten im Vergleich zum Wildtyp. Es konnte gezeigt werden, dass im Kern lokalisiertes cry1NLS das Hypokotyl- und Wurzelwachstum im Blaulicht hemmt und die Anthocyanbildung fördert. Cry1NES dagegen fördert das Kotyledonen- und Wurzel-Wachstum. Die Lokalisation von cry1 hängt also direkt mit seiner Funktion zusammen: die Regulation der Expression des Chalconsynthase-Gens sowie der Anionenkanäle in der Zellmembran setzt eine Kernlokalisation von cry1 voraus. Cytoplasmatisches cry1 reguliert das Wurzel- und Kotyledonenwachstum im Blaulicht. Die Expression von Genen, die an der Photomorphogenese beteiligt sind, wird von Transkriptionsfaktoren reguliert, von denen einige bekannt sind: HY5 (Oyama et al., 1997), HYH (Holm et al., 2002), LAF1 (Seo et al., 2003), HFR1 (Kim et al., 2002). Die Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren hängt von COP1 ab: in Dunkelheit ist COP1 im Zellkern lokalisiert und fungiert als E3 Ligase. Transkriptionsfaktoren wie HY5 und LAF1 werden durch COP1 ubiquitiniert und im Proteasom abgebaut (Osterlund et al., 2000). Bei Belichtung wird COP1 ins Cytosol transloziert und die Transkriptionsfaktoren können sich im Kern ansammeln (Osterlund und Deng, 1998). Die Blaulicht-abhängige Anreicherung von HY5 im Zellkern führt zur Induktion vieler lichtregulierter Gene (Partch et al., 2005). Der lichtabhängige Transport von COP1 zwischen den Zellkompartimenten wird von

Phytochromen und Cryptochromen gesteuert. Cry1 und cry2 interagieren direkt mit COP1 (Yang et al., 2000; Wang et al., 2001).

•

Regulation des Blühzeitpunktes

Arabidopsis ist eine fakultative Langtagpflanze. Sie blüht schneller im Langtag (16 h Licht), kommt jedoch auch im Kurztag (<10 h Licht/Tag) zur Blütenbildung.

Die photoperiodische Regulation des Blühzeitpunktes wird von der circardianen Uhr gesteuert und CONSTANS (CO) spielt dabei eine zentrale Rolle (Putterill et al., 1995; Coupland et al., 1998). Die CO-mRNA akkumuliert im Langtag nach der Abend-dämmerung. Cry2, phyA und cry1 stabilisieren das CO-Protein am Tagesende, phyB dagegen fördert seinen Abbau. Diese antagonistische Funktion führt zu einer circardianen Rhythmik in der CO-Proteinmenge. CO aktiviert die Transkription der FT (Flowering locus T) Gene, die das Blühen fördern (Mockler et al., 2003). Einen Überblick über die ganze Komplexizität der Regulation des Blühzeitpunktes gibt der Review von Turck et al., (2008). Mit CIB1 (Liu et al., 2008) wurde ein direkter Interaktionspartner von cry2 identifiziert, der durch Bindung an die E-Box Elemente des FT-Gens dessen Expression und damit die Blühinduktion fördert. CIB1 (Cryptochrome Interacting Basic helix-loop-helix) ist ein Transkriptionsfaktor mit einem basischen Helix-Loop-Helix Motiv, dessen physikalische Interaktion mit cry2 durch Co-Immunipräzipitation in Blau- und Weißlicht bestrahlten Proben nachgewiesen wurde, nicht jedoch in Rotlicht-bestrahlten. Die Autoren postulieren, dass die Interaktion von Cryptochromen mit CIB1 und anderen CIB-Proteinen ein frühes Element der Signalperzeption und –weiterleitung darstellt.

•

Stellen der circardianen Uhr

Unter der Kontrolle der circardianen Uhr sind in Pflanzen u.a. die Genexpression, Blattbewegungen und die Photosynthese. An dem Synchronisieren der inneren Uhr mit den aktuellen Lichtbedingungen sind neben den Phytochromen auch die Cryptochrome beteiligt. Die cry1 Mutante zeigt eine verlängerte Periodenlänge (ursprünglich gemessen in Expression des Luciferase-Reporters unter Kontrolle der regulatorischen Region eines circadian exprimierten Gens) im Vergleich zum Wildtyp unter starker und geringer Blaulicht-Intensität. Die cry2 Mutante zeigte eine schwache Periodenverlängerung unter starkem Blaulicht, bei geringer Lichtintensität dagegen eine Verkürzung der Periodenlänge. Im Weißlicht hat cry2 keinen Einfluss auf die Periodenlänge (Somers et al., 1998). Cry1 und cry2 agieren redundant im Blaulicht-Input zur inneren Uhr. Die cry1cry2

endogene Rhythmik nicht vollständig (Yanovsky et al., 2000). Cry1 und cry2 sind somit nicht Teil des zentralen Oszillators, wie es in Tieren der Fall ist, und auch andere Photorezeptoren können den Lichteingang zur inneren Uhr vermitteln.

Struktur und Funktion von Arabidopsis thaliana cry1 und cry2

In ihrer aktiven Form liegen cry1 und cry2 als Dimer vor (Sang et al., 2005; Rosenfeldt et al., 2008). Wie bereits oben beschrieben, sind Cryptochrome aus zwei Domänen aufgebaut: der N-terminalen, Photolyase-ähnlichen PHR-Domäne, die die Chromophore MTHF und FAD trägt, sowie der C-terminalen Domäne, die den Photolyasen fehlt und bei cry1 und cry2 unterschiedlich lang ist (Abb. 1.6). Die PHR-Region von Atcry1 konnte kristallisiert werden (Brautigam et al., 2004). Die PHR-Domänen haben bei allen Mitgliedern der Photolyase/Cryptochrom-Familie den gleichen Aufbau: eine α/β-Domäne und eine helikale Domäne, die miteinander über eine Interdomänen-Schlaufe verbunden sind (Park et al., 1995; Brudler et al., 2003; Brautigam et al., 2004; Huang et al., 2006; Klar et al., 2007). Die α/β-Domäne nimmt eine Dinukleotid-Bindungs-Faltung ein, die aus fünf parallelen ß-Faltblättern seitlich flankiert von α-Helices besteht. Die helikale Domäne formt eine Tasche, in der FAD nicht kovalent gebunden wird. FAD liegt in der für Photolyasen charakteristischen U-förmigen Konformation vor, das Adenin und die Isoalloxazin-Ringe zeigen zum Boden der Tasche. Neben den Gemeinsamkeiten unterscheiden sich die Pflanzen-Cryptochrome von den Photolyasen und cry-DASH in einigen Punkten: cry1 hat im Gegensatz zu den zwei letztgenannten Proteinen keine positiv geladene Oberfläche in der Rinne, die bei Photolyasen für die Bindung von DNA erforderlich ist (Mees et al., 2004). Die Oberfläche von cry1 ist überwiegend negativ geladen, bis auf einige positive Reste nahe der Bindetasche. Außerdem ist die FAD-Bindetasche von cry1 größer und tiefer. Im Gegensatz zu den Photolyasen bindet cry1 kein Pyrimidin-Dimer in dieser Tasche, die Bindung eines ATP-Analgos konnte jedoch nachgewiesen werden (Brautigam et al., 2004).

Der Reaktionsmechanismus der Cryptochrome konnte teilweise aufgeklärt werden und FAD spielt dabei eine zentrale Rolle. Die verwandten CPD-Photolyasen besitzen in vivo

den vollständig reduzierte katalytischen Cofaktor FADH― _{(Übersichtsartikel Essen, 2006).} Sie binden lichtunabhänig an ein Pyrimidin-Dimer (einen DNA-Schaden, der zwischen zwei Pyrimidinen entsteht). Die lichtabhängige Reparatur erfolgt durch Anregung des vollständig reduzierten FADH―_{. Im angeregten Zustand überträgt das FADH}―_{* ein} Elektron auf den CPD-Schaden, die Spaltung des Dimers erfolgt spontan und nach Rückgabe des Elektrons wird das vollständig reduzierte FADH― _{wieder regeneriert. Eine}

effizientere Nutzung der Lichtenergie erfolgt durch den Antennenchromophor (MTHF oder Deazaflavin), der mittels Förster-Energie-Transfer FADH― _{in den angeregten Zustand} bringen kann, jedoch für die Katalyse nicht essentiell ist (Übersichtsartikel Sancar, 2003). Im Gegensatz zu den Photolyasen befindet sich der Flavin-Cofaktor in pflanzlichen Cryptochromen im Grundzustand in der oxidierten FAD-Form (Ahmad et al., 2002) und das lichtinduzierte neutrale, semireduzierte FADHo _{Radikal spiegelt die aktive Form} (signaling state) des Photorezeptors wider (Banerjee et al., 2007; Bouly et al., 2007). Eine Gruppe von drei Tryptophanen ist in vitro für den Transport der Elektronen bei der Photoreduktion der E. coli Photolyase notwendig: W382, W359, und W306 (Aubert et al., 2000). In Atcry1 ist diese Tryptophan-Triade konserviert und für die Funktion des Rezeptors auch in vivo notwendig (Zeugner et al., 2005). Die weitere Signaltransduktion der Cryptochrome ist noch nicht geklärt. Atcry1 wird C-terminal und möglicherweise auch an anderen Stellen Blaulicht-abhängig phosphoryliert (Shalitin et al., 2002, 2003). Teil dieser Phosphorylierung ist Autophosphorylierung (Bouly et al., 2003) und dieser Prozess führt zu einer Konformationsänderung (Partch und Sancar, 2005; Kottke et al., 2006)des Proteins. Diese wurde auch für Atcry1 durch eine lichtunabhängige ATP-Bindung gezeigt (Burney et al., 2009). Die Signalweiterleitung der Cryptochrome erfolgt zumindest teilweise durch Interaktion mit anderen Proteinen, die durch den C-Terminus vermittelt wird (siehe oben). Der erwähnte basische Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktor HFR1 (long Hypocotyl in Far-Red) stellt eine Komponente der Signalkaskade von cry1 dar und ist außerdem ein positiver Regulator phyA-abhängiger Signalwege (Duek und Fankhauser 2003). Die direkte Interaktion von HFR1 und COP1 konnte von Yang et al., (2005) gezeigt werden. Der N-Terminus von HFR1 wird von COP1 ubiquitiniert und über das 26S-Proteasom abgebaut. In vivo verhindert Belichtung den Abbau von HFR1. Ein Vergleich der Expression Blaulicht-induzierter Gene in den hfr1- und cry1-Knockout Pflanzen zeigt eine Co-Regulation von 70% der Gene (Zhang et al., 2008). Die Autoren postulieren eine globale Rolle in der Genregulation für HFR1, die durch cry1 feinabgestimmt wird. Im Gegensatz zu diesem positivem Regulator ist SUB1 ein negativer Regulator der Cryptochrom- und Phytochrom A-Signalwege (Guo et al., 2001). SUB1 (Short Under Blue light) ist ein Ca2+_{-bindendes Protein, das die lichtabhängige Akkumulation von HY5} verhindert. Es ist im Cytosol lokalisiert und liegt vorwiegend in Assoziation mit der Kernhülle vor. Ein weiterer positiver Regulator Blaulicht-abhängiger Prozesse (Inhibierung des Hypokotylwachstums, Kotyledonen-Öffnung) ist PP7, eine Serin/Threonin-Phosphatase (Møller et al., 2003). Das Protein ist im Zellkern lokalisiert, eine direkte Interaktion mit Cryptochromen konnte jedoch nicht gezeigt werden. Vermutlich ist es an

der Signalweiterleitung der Cryptochrome durch die Blaulicht-abhängige Dephosphorylierung einer kernlokalisierten Signalkomponente beteiligt.

1.6.3. Bifunktionelle Photolyasen/ Cryptochrome

Die molekulare Funktion von Photolyasen und Cryptochromen in Pilzen ist bislang kaum untersucht. Verschiedene Proteine der Cryptochrom/Photolyase-Familie, die in jüngster Zeit in Pilzen identifiziert wurden, stellen die Trennung von Photolyasen (nur Reparaturfunktion) und Cryptochromen (nur Rezeptorfunktion) in Frage.

Die Expression von PHR1 (CPD-Photolyase) aus Trichoderma atroviride (ein mykoparasitischer Pilz) wird Blau- und UV-A-Licht abhängig induziert und sowohl PHR1 selbst als auch Blaulicht-Regulator-Proteine (BLRs) spielen dabei eine Rolle (Berrocal-Tito

et al., 2007). Der Knockout des PHL1-Gens (Cryptochrome-(6-4)-PHotolyase-Like) im pathogenen Pilz Cercospora zeae-maydis führt zur abnormalen Entwicklung in Zellkultur sowie zum kompletten Verlust der Photoreaktivierung nach UV-Bestrahlung (Bluhm und Dunkle, 2008). Die Expression der CPD-Photolyase sowie zwei weiterer Gene, die in DNA-Reparatur-Mechanismen involviert sind (RAD2 und RVB2), ist in phl1-defizienten Stämmen vermindert. Wie PHL1 UV-Licht absorbiert und das Signal weiterleitet, ist noch nicht geklärt. Die Autoren spekulieren, PHL1 könnte als Photorezeptor, als Regulator der lichtabhängigen Genexpression oder als multifunktionales Enzym mit DNA-Reparatur- und Signalweiterleitungs-Funktion fungieren.

Aspergillus nidulans hat nur einen Vertreter der Cryptochrom/Photolyase-Familie, der als cryA bezeichnet wird. CryA zeigt sowohl eine regulatorische Funktion der lichtabhängigen Entwicklung des Pilzes als auch DNA-Reparaturfunktion (in E. coli Reparatur-definzienten Stämmen und Aspergillus nidulans UV-hypersensitiven-Stämmen, Bayram et al., 2008). GFP-Fusionen mit cryA lokalisieren konstitutiv im Zellkern. Dort wirkt cryA UV-A/Blaulicht- abhängig als Transkriptionsrepressor von Genen der sexuellen Entwicklung des Pilzes, wobei cryA entweder direkt an die DNA bindet oder mit anderen Kernproteinen interagiert (Bayram et al., 2008). Die Photolyasen der Pilze haben eine N-terminale Extension, vergleichbar der von Arabidopsis thaliana cry-DASH, die den Photolyasen und Cryptochromen anderer Organismen fehlt. Diese etwa 70-140 AS lange Sequenz trägt ein putatives Mitochondrien- und Kernlokalisations-Signal (Berrocal-Tito et al., 2007). BLAST

Untersuchungen dieser Sequenzen von einigen Vertretern der Photolyase-Familie der Pilze zeigte eine hohe Konservierung und Homologien mit Protein-Bindungsmotiven anderer Proteine. Außerdem konnten mögliche Phosphorylierungsstellen gefunden werden (Berrocal-Tito et al., 2007). Die lichtabhängige Interaktion von ursprünglichen Vertretern

der Photolyase/Cryptochrom-Familie mit Regulatoren der Transkription könnte der Vorläufer vor der strikten Trennung von Cryptochromen und Photolyasen gewesen sein.

CPD-

Photolyasen DASH-Cryptochrome

(6-4)-Photolyasen

Cryptochrome

Cryptochrome/(6-4)-Photolyasen Pilze

Abb. 1.7: Stammbaum eines Teils der Cryptochrom/Photolyase-Familie. Mitglieder

der Cryptochrome und (6-4)-Photolyase-Orthologen aus Pilzen sind rot, DASH-Cryptochrome in orange, Cryptochrome aus Pflanzen und Tieren in blau, (6-4)-Photolyasen in violett und CPD-Photolyasen in grün dargestellt (aus Bluhm und Dunkle, 2008).

1.6.4. Die cry-DASH Familie

Die ersten Vertreter der cry-DASH Familie wurden 2003 in Synechocystis sp. und

Arabidopsis thaliana entdeckt (Brudler et al., 2003; Kleine et al., 2003). Das Gen sll1629 aus Synechocystis sp. PCC6803 wurde bereits im Jahr 2000 von Hitomi et al. als Cryptochrom diskutiert und war damit das erste in Prokaryoten gefundene Cryptochrom. Ein homologes Gen aus Arabidopsis thaliana (At5g24850) wurde von Kleine et al. (2003) charakterisiert und analog zu den zwei bereits bekannten Cryptochromen aus Arabidopsis thaliana cry3 genannt. Phylogenetische Berechnungen ergaben eine nahe Verwandtschaft dieser Proteine mit den tierischen Cryptochromen, und um diese zu verdeutlichen, wurde der Name cry-DASH (Drosophila, Arabidopsis, Synechocystis, Homo sapiens) von Brudler

et al. (2003) eingeführt. Weitere Vertreter wurden durch Datenbank-Analysen auch in Vertebraten gefunden (Danio rerio, Xenopus laevis), sowie in zahlreichen Eubakterien, Archeen und Pilzen (Daiyasu et al., 2004). Die DASH-Cryptochrome zeichnen sich dadurch aus, dass ihnen der Cryptochrom-spezifische C-Terminus fehlt, hingegen tragen sie eine kurze N-terminale Extension, in der in Atcry3 ebenfalls eine DAS-Domäne lokalisiert ist und die ansonsten als typisch für Cryptochrome von Landpflanzen gilt (Abb. 1.6). Die Photolyase-ähnliche (PHR) Domäne ist in Atcry3 konserviert und trägt die Chromophore FAD und MTHF (Kleine et al., 2003; Song et al., 2006, Klar et al., 2007). Auch in Solanum lycopersicum und Oryza sativa wurden cry-DASH Vertreter gefunden, die aber keine konservierten DAS-Motive zeigen (SWISSPROT CRYD_LYCES, CRYD_ORYSA).

Die N-terminalen 40 Aminosäuren von Atcry3 dienen als duale Targeting-Sequenz, die das - im Zellkern kodierte - Protein an Chloroplasten und Mitochondrien adressiert (Kleine et al., 2003). Diese Targeting-Sequenz konnte auch in den Sequenzen der homologen Gene von Oryza sativa und Solanum lycopersicum gefunden werden, die subzelluläre Lokalisation wurde jedoch nicht überprüft. Facella et al. (2006) zeigen die Expression des

CRY-DASH Gens aus Arabidopsis thaliana sowohl im Samen/Embryo als auch in adulten Pflanzenteilen, mit einem deutlichen Maximum in Wurzeln und Blättern. Außerdem ist die Expression photoperiodisch reguliert, sie erreicht in der Morgen- und Abenddämmerung ein Maximum und ist im cry1-Knockout bzw. CRY2-Überexpressions Hintergrund verändert (Facella et al., 2006). Aufgrund dieses Expressionsmusters schlagen die Autoren eine Rolle von cry-DASH in der Vermittlung des Lichteingangssignals an die innere Uhr vor. Bereits Hitomi et al. (2000) untersuchte das Synechocystis Protein sll1629 auf seine Photolyase-Aktivität und konnte keine Reparaturfunktion für (6-4)-Photoprodukte oder Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren in vitro nachweisen. Die Überexpression dieses Proteins in einem Photolyase-defizienten E.coli Stamm erhöhte jedoch die UV-Resistenz der Zellen,

was auf eine Reparaturfunktion in vivo hindeutet. Den gleichen Effekt zeigte auch die Überexpression von Danio rerio und Xenopus laevis cry-DASH (Daiyasu et al., 2004). In einem Photolyase-Assay wiesen diese beiden Cryptochrome eine schwache CPD-Reparaturaktivität auf. Die UV-Resistenz defizienter E.coli Zellen konnte durch die Überexpression von Atcry-DASH dagegen nicht gesteigert werden (Kleine et al., 2003).

c

b

Abb. 1.8: Arabidopsis thaliana cry3 Struktur: a DNA-Sequenz des CRY3-Gens mit Exon I-XII (oben) sowie das resultierende Protein (unten) mit seiner Domänenstruktur und den Cofaktoren. An Aminosäureposition 470 konnte WoLF PSORT eine putative NLS identifizieren. b Struktur des cry3-Monomers: die N-terminale Chromophor-tragende Domäne ist in grün, der FAD-bindende Teil in grau dargestellt (aus Klar et al., 2007)

c Struktur des DAS-Motivs (AS 2-40).

Der Verlust des sll1629 Gens hatte auch keinen Einfluss auf die UV-Sensitivität von

Synechocystis, was eine relevante Reparaturfunktion in situ ausschließt. Brudler et al. und Kleine et al. (2003) konnten nachweisen, dass cry-DASH aus Synechocystis und

Arabidopsis DNA Sequenz-unabhängig bindet. Für sll1629 wurde aufgrund von Microarray- Analysen eine Rolle als Transkriptionsrepressor postuliert.

Vibrio cholerae cry1 (Vccry1) ist ebenfalls ein Mitglied der cry-DASH Familie und trägt FAD und Methenyltetrahydrofoalt (MTHF) als chromophore Gruppen (Worthington et al.,

2003). Vccry1 zeigt keine DNA-Reparaturfunktion und wurde mit einem assoziierten RNA-Fragment von 60-70 Nukleotiden Länge co-aufgereinigt. Es handelte sich dabei um artifiziell überexprimiertes Protein. Für Vccry1 konnte in vivo die RNA-Bindung nicht nachgewiesen werden. Es ist das einzige Cryptochrom, bei dem die Bindung an eine Ribonukleinsäure gezeigt wurde (Worthington et al., 2003).

Dass DASH-Cryptochrome einzelsträngige DNA binden, konnten auch Selby und Sancar (2006) zeigen. Wenn Cyclobutan-Thymin-Dimere in einzelsträngiger DNA vorlagen, wurden sie von Arabidopsis thaliana, Xenopus laevis und Vibrio cholerae cry-DASH ebenso effizient lichtabhängig repariert wie von Vibrio cholerae Photolyase (Selby und Sancar, 2006). Im Photoreaktivierungs-Assay zeigten Vccry1 und Xlcry-DASH keine effektive Reparatur-funktion (Daiyasu et al., 2004; Selby und Sancar, 2006).

Durch Vergleiche der Kristallstrukturen von Synechocystis und Arabidopsis thaliana cry-DASH (Brudler et al., 2003, Klar et al., 2007) mit den Kristallstrukturen einiger Photolyasen (E. coli: Park et al., 1995, Anacystis nidulans: Tamada et al., 1997; Mees et al., 2004; Thermus thermophiles: Komori et al., 2001; Klar et al., 2006) sowie mit

Arabidopsis thaliana cry1 (Brautigam et al., 2004), lassen sich die strukturellen Gemeinsamkeiten bzw. Unterschiede der Proteine genauer analysieren (siehe auch Übersichtsartikel Müller und Carell, 2009). Die Proteinfaltung insgesamt gleicht sich aufgrund der in allen diesen Proteinen vorkommenden N-terminalen α/β-Domäne sowie der C-terminalen α-Domäne, die FAD in U-Konformation bindet. FAD ist der katalytische Cofaktor der Photolyasen und liegt im aktiven Zustand voll reduziert vor (FADH―_{). Es gibt} ein Elektron an das DNA-Photoprodukt ab, nachdem es selbst angeregt wurde (Park et al., 1995). Der Redox-Zustand des FAD-Cofaktors in Atcry3 wird Blaulicht-abhängig verändert (Song et al., 2006): in Dunkelheit liegt ein Equilibrium von FADox (40 %), FADHo (5 %) und FADH― _{(55 %) vor. Bei Belichtung wird FAD}

ox bzw. FADH0 in FADH― überführt, bei anhaltender Belichtung ist dieser Zustand nicht reversibel. Für das DASH-Protein aus

Danio rerio (Drcry-DASH) wurde gezeigt, dass FAD in Dunkelheit voll oxidiert vorliegt und Blaulicht-abhängig zu FADHo _{reduziert wird und bei weiterer Belichtung zu vollständig}

reduziertem FADH2 bzw. FADH― (Zikihara et al., 2008). Jüngste Untersuchungen an mutiertem cry3 Protein ohne MTHF-Cofaktor konnten den FAD Photozyklus für cry3 aufklären (Zirak et al., 2009, siehe Abb. 1.9). Bei kontinuierlicher Belichtung wird FAD in Atcry3 vollständig zu FADH― _{photoreduziert (Photozyklus II, Abb. 1.9), ein kurzer} Lichtpuls bewirkt dagegen die Bildung von FAD―_{, welches wieder zu FAD revertiert} (Photozyklus I). Photozyklus II wird auch von Atcry1 und Drcry-DASH durchlaufen (Kottke et al., 2006; Bouly et al., 2007). Die Form, die das Belichtungssignal übermittelt, ist bei Atcry1 und Atcry2 FADHo_{. In Atcry3 dagegen bildet FADH}― _{die katalytisch aktive Form,} ebenso wie in Photolyasen. Einen neuen Elektronentransportweg konnten Moldt et al.,

(2009) aufdecken, bei dem der zweite Cofaktor (MTHF) photoreduziert wird, vermutlich über den voll reduzierten katalytischen Cofaktor (FADH―_{). Hierbei entsteht} Methylen-Tetrahydrofolat.

Die Oberfläche rund um die FAD-Bindetasche zeigt bei cry-DASH viele basische Aminosäurereste und ähnelt damit mehr den CPD-Photolyasen als den Cryptochromen. Diese basischen Aminosäuren sind in Photolyasen essentiell für die DNA-Bindung (Mees et al., 2004) und ihre Präsenz in cry-DASH erklärt die DNA-Bindungseigenschaften des Proteins.

Abb. 1.9: Vereinfachtes Schema des Photozyklus des FAD-Cofaktors in cry3:

Photozyklus I gilt für dunkeladaptiertes Protein, mit zunehmender Belichtungszeit verändert sich der Zyklus zu Schema II, da das Protein eine lichtabhängige Konformationsänderung erfährt (aus Zirak et al., 2009).

Durch die Co-Kristallisation von Atcry-DASH mit einem synthetischen einzelsträngigen CPD-Analogon (fünf Thymine mit CPD Läsion zwischen T2 und T3), sowie durch Bindungs- und Reparaturstudien, konnten die Photolyase-Eigenschaften von cry-DASH detailliert untersucht werden (Pokorny et al., 2008). Die Bindung des T<>T Substrats durch Wassertstoffbrückenbindungen von Aminosäuren in der Flavin-Tasche ist in cry-DASH identisch zu der Bindung in konventionellen Klasse-I-Photolyasen. Allerdings ist die Flavin- und Substratbindetasche in cry-DASH weniger hydrophob. Das Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer wird auch in doppelsträngiger DNA repariert, wenn die Läsion von mindestens einer ungepaarten Base flankiert wird und die Thymine des CPDs keine Wasserstoffbrücken-Bindungen zum Komplementärstrang ausbilden können (Pokorny et al., 2008). Das bedeutet, dass die DASH-Cryptochrome ebenso wie die verwandten Photolyasen die Eigenschaft haben, CPD-Läsionen zu reparieren (und hierzu den gleichen Mechanismus verwenden), aber nicht dazu imstande sind, das CPD-Produkt aus dem DNA-Doppelstrang herauszuwinden. Der Grund dafür ist vermutlich die hydrophilere Oberfläche der FAD-Tasche (im Vergleich zu Photolyasen), die die Bindung des aus der DNA entwundenen Substrates destabilisiert.

Die Reparaturfunktion von cry-DASH unterstützt die Annahme, dass sich die Cryptochrome aus den Photolyasen entwickelt haben. Die lichtabhängige Interaktion von Mitgliedern der Cryptochrom/Photolyase-Familie mit Transkriptions-Regulatoren geht vermutlich der Aufspaltung der Cryptochrome und Photolyasen voraus (Berrocal-Tito et al., 2007). Unterstützt wird diese These von der in der Diatomee Phaeodactylum tricornutum vorkommenden Photolyase PtCPF1. Sie zeigt (6-4)-Photoreparatur sowie Aktivität als Transkriptions-Repressor in heterologer Expression in tierischen Zellen. Außerdem steuert sie die Blaulicht-abhängige Genexpression in Phaedactylum (Coesel et al., 2009). PtCPF1 wurde - wie Vccry1 - mit einem RNA-Fragment co-aufgereinigt und ist näher mit den (6-4)-Photolyasen/tierischen Cryptochromen verwandt als mit den CPD-Photolyasen. Die Alge besitzt sonst keine Cryptochrom-Gene und keine (6-4)-Photolyase, aber zwei Vertreter der DASH-Cryptochrome. Die Autoren diskutieren, dass CPF1 das Resultat unabhängiger Evolution und funktioneller Diversifikation in marinen Eukaryoten sein könnte. Es könnte die circardiane und diurnale Rhythmik mit dem Zell-Zyklus (Kontrollpunkte/ check points) in Verbindung bringen und damit ein Modell für die Erklärung des evolutionären Ursprungs der circadianen Uhr sein.

1.7.

Zielsetzung

Zu Beginn dieser Arbeit war die Familie der DASH-Cryptochrome und das zu dieser Gruppe gehörige Cryptochrom 3 aus Arabidopsis thaliana wenig erforscht; es lagen kaum Hinweise auf die Funktion dieses (putativen) Cryptochroms in vitro oder in vivo vor. Es war bekannt, dass cry3 in Arabidopsis in den Mitochondrien und Chloroplasten nach transienter Transfektion in Protoplasten lokalisiert ist (Kleine et al., 2003) und 2005 wurde die Kristallstruktur des Proteins aufgeklärt (Pokorny et al., 2005; Huang et al., 2006; Klar

et al., 2007).

Ziel dieser Arbeit war es, die Expression von cry3 in verschiedenen Organen bzw. Geweben von Arabidopsis thaliana auf RNA und Proteinebene zu untersuchen, um daraus Rückschlüsse auf die Funktion von cry3 ziehen zu können.

Durch Generierung transgener Pflanzen, die cry3-GFP exprimieren, sollte die Organellen-Lokalisation des Proteins auch in intakten transgenen Linien nachgewiesen werden. Zur Untersuchung einer möglichen Organell-spezifischen Funktion von cry3 war es außerdem wünschenswert, Pflanzenlinien zu etablieren, in denen das Protein nur in Mitochondrien- bzw. nur in Chloroplasten lokalisiert ist, um diese Linien dann phänotypisch mit dem Wildtyp vergleichen zu können.

Ferner sollte anhand transienter Expression des cry3-GFP Fusionsproteins eine mögliche lichtabhängige Lokalisation in den Chloroplasten untersucht werden. Diese wäre denkbar, da für Cryptochrom 1 in Arabidopsis thaliana eine lichtregulierte Veränderung der Lokalisation gezeigt wurde (Yang et al., 2000). Durch die während dieser Arbeit erfolgte Aufklärung der Kristallstruktur des Proteins (Klar et al., 2007) und somit seiner Faltungsmotive erlangte die N-terminale α-Helix von cry3 unser Interesse. Es wurde hierbei die Frage addressiert, ob diese für den Import in Chloroplasten eine Rolle spielt. Durch Expression entsprechender Deletionskonstrukte in Protoplasten sollte dies untersucht werden.

2.

Material

2.1.

Chemikalien

Alle Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, von den Firmen ROTH und

SIGMA bezogen. Die Verwendung und Lagerung erfolgte nach Herstellerangaben.

2.2.

Puffer und Lösungen

Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Medien ist im jeweiligen Kapitel beschrieben. Alle Lösungen wurden vor Gebrauch autoklaviert oder sterilfiltriert. Die Bezeichnung H2O bezieht sich immer auf bidestilliertes Wasser.

2.3.

Geräte

Tabelle 1.1: In der vorliegenden Arbeit verwendete Geräte

Gerät Bezeichnung Firma

Digitalkamera Coolpix 5000 NIKON

Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200 M ZEISS

Folienschweißgerät Vacupak KRUPS

Heizblock Thermomixer comfort EPPENDORF

Imagestation Gel Doc 1000 BIO-RAD

Konfokales Laserscan-

Mikroskop TCS SP2 Leica

Magnetrührer RCT basic IKAWerke

PCR-Cycler Mastercycler gradient Eppendorf

GeneAmp PCR System 9600 Perkin Elmer iCycler (real-time Cycler) Biorad pH-Meter Microprozessor pH/ION Meter

pMX 2000

Wissenschaftlich

Technische Werkstätten, Weilheim

Photometer UV-1202 UV-VIS Spectrophotometer k

Photmeter UV-2401 PC UV-VIS Recording Spectrophotometer

Shimadzu

Protein-Transferapparatur Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer _Cell Bio-Rad Schüttler Innova 4230 Refrigerated

Incubator Shaker

New Brunswick Scientific G24 Environmental Incubator

Shaker

NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC

Multitron II INFORS AG

Sterilbank Auro H 130 EHRET LABOR- UND

PHARMATECHNIK

Laminar flow cabinet FLOW LABORATORIES

Laflow PRETTL

Tischschüttler Typ 300 S GESELLSCHAFT FÜR

LABORTECHNIK MBH

Ultraschallgerät MSE(MEASURING &

SCIENTIFIC EQUIPMENT)

Wärmeschrank B 6060 HERAEUS INSTRUMENTS

Wasserbad Typ 1003 GESELLSCHAFT FÜR

LABORTECHNIK MBH

Zellmühle MM 200 RETSCH,HAAN

Zentrifugen Biofuge pico HERAEUS INSTRUMENTS

Labofuge 400 R HERAEUS INSTRUMENTS

J2-21 Centrifuge BECKMANN

2.4.

Organismen

2.4.1. Arabidopsis thaliana

Es wurden Wildtyp-Stämme der Ökotypen Columbia (Col) und Landsberg erecta (Ler) verwendet, sowie die Phytochrom A knockout-Mutante (phyA) (Nagatani et al., 1993). Eine Linie, die cry3 im Ler Hintergrund unter Kontrolle des 35S-Promotors (aus Cauliflower Mosaic Virus) überexprimiert (= 35S:cry3), wurde von Stefan Reisbacher in unserem Labor hergestellt (Dissertation, 2009). Eine Transposon-Insertionslinie mit Insertionsstelle im CRY3-Gen des Nossen-Wildtyps (Nos) wurde vom RIKEN BIORESOURCE CENTER bezogen

wurden in dieser Arbeit ebenfalls durch Agrobakterien vermittelte Transformation mittels

Floral Dip erzeugt, ihre Herstellung ist in 3.1.8 beschrieben. So entstanden die folgenden Linien: 35S:cry3-GFP: die Pflanze exprimiert ein Fusionsprotein aus cry3 (Volllänge) und GFP unter Kontrolle des 35S-Promotors im Ler Hintergrund. Eine weitere Linie exprimiert das GFP-Protein allein unter dem (hypothetischen) cry3-Promotor (cry3:GFP) im Ler Wildtyp. Das Transitpeptid aus der Ferrodoxin-NADP+_{-Oxidoreduktase (AS 1-55) aus} Spinacia oleracea fusioniert mit cry3 ohne N-terminale Zielsteuerungssequenz (AS 40-569) wird in zwei Transposon-Linien als GFP-Fusion (p(FNR)cry3-GFP), bzw. ohne (p(FNR)-cry3), überexprimiert. Anstelle des FNR-Transitpeptids wird das Targeting-Peptid der Isovaleryl-CoA Dehydrogenase aus Arabidopsis (AS 1-48) in gleichen Fusionen exprimiert: Linie p(IVD)-cry3-GFP und p(IVD)-cry3.

2.4.2. Escherichia coli

Es wurde der E. coli-Stamm XL1-Blue von STRATAGENE für Klonierungsarbeiten und

DNA-Präparationen verwendet.

2.4.3. Agrobakterium tumefaciens

Die stabile Transformation der Pflanzen wurde mit dem Agrobakterien-Stamm GV3101 (enthält das Helferplasmid pMP90) durchgeführt (Koncz und Schell, 1986). Der Stamm besitzt genomisch eine Rifampicillin-Resistenz und das Helferplasmid enthält das Gen für eine Gentamycin-Resistenz.