Charakterisierung einer Mutante von Phodopus sungorus
mit UCP3-Defizit im braunen Fettgewebe
D
ISSERTATIONzur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem
Fachbereich Biologie der
Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Christa von Praun
aus Haltern / Westfalen
Vom Fachbereich Biologie
der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am 28.08.2006 angenommen. Erstgutachter: HD Dr. Martin Klingenspor
Zweitgutachter: Prof. Dr.Gerhard Heldmaier Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2006
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
1.1 Die Familie der Entkopplerproteine ... 1
1.2 Die Funktionsweise von Entkopplerproteinen ... 2
1.3 Die Regulation von Entkopplerproteinen... 3
1.4 Entdeckung und Verbreitung von UCP3... 4
1.5 Hypothesen zur Funktion von UCP3... 5
1.5.1 UCP3 als Entkoppler ... 6
1.5.2 UCP3 als Radikalschutz ... 7
1.5.3 Fettstoffwechsel-assoziierte Hypothesen ... 8
1.6 Der Dsungarische Zwerghamster ... 9
1.7 Die Mutante - bisherige Ergebnisse ... 10
1.8 Fragestellung ... 11
2 Material und Methoden ... 12
2.1 Versuchstiere ... 12
2.1.1 Tierhaltung und Zucht ... 12
2.1.2 Mutantenzucht ... 12
2.2 Phänotyp und Genotyp ... 13
2.2.1 Tötung und Präparation ... 13
2.2.2 Phänotypisierung: Northern-Blot-Analyse... 13
RNA-Isolation aus Gewebe ... 13
RNA-Isolation aus Zellen ... 14
Photometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren ... 15
Gelelektrophorese ... 15
RNA-Transfer ... 16
Herstellung der DNA-Sonden... 16
Detektion der markierten DNA... 17
Dehybridisierung der Blots ... 18
2.2.3 Genotypisierung: DNA-Sequenzierung ... 18
DNA-Isolation ... 18
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 19
Pyrosequenzierung ... 20
2.3 Messungen an ganzen Tieren ... 21
2.3.1 Körpergewicht ... 21
2.3.2 Körperlänge ... 21
2.3.3 Körperzusammensetzung ... 21
Bestimmung der Körperzusammensetzung mittels Röntgenabsorptionsmessung ... 21
Bestimmung der Körperzusammensetzung durch Trocknen und Fettextraktion... 22
2.3.4 Futteraufnahme... 24
2.4 Primärzellkultur... 25
2.4.1 Anlegen einer Primärzellkultur aus braunen Adipozyten ... 25
2.4.2 Verlauf der Zellkultur... 26
2.5 Transemissionselektronenmikroskopie ... 28
2.6 Messungen an isolierten Mitochondrien ... 29
2.6.1 Mitochondrienisolation ... 29
2.6.2 Proteinquantifizierung ... 30
Messung mit dem Photometer ... 30
Messung mit dem ELISA-Reade ... 30
2.6.3 Mitochondrienmatrixvolumen... 31
2.6.4 Die Messung des Protonenlecks... 33
Aufbau der Messanlage ... 34
Aufbau, Funktionsweise und Kalibrierung der Clark-Elektrode ... 35
Aufbau, Funktionsweise und Kalibrierung der TPMP-Elektrode ... 35
Chemikalien... 39
Messverlauf ... 41
Messbedingungen ... 41
2.6.5 Auswertung der Protonenleckmessung ... 43
Auswertung der Sauerstoffverbrauchsmesung ... 43
Berechnung des Membranpotentials ... 44
2.6.6 Messung der Superoxid-Konzentration... 48
3 Ergebnisse... 50
3.1 Zucht... 50
3.2 Phänotyp und Genotyp ... 51
3.3 Körpergewicht ... 53
3.4 Körperlänge ... 54
3.5 Körperzusammensetzung ... 56
3.6 Futterverbrauch ... 60
3.7 Primärzellkultur brauner Adipozyten... 62
3.7.1 UCP3-mRNA-Expression in Primärzellkultur... 62
3.7.2 Braune Adipozyten der Mutanten in Primärzellkultur ... 63
3.7.3 PPARγ-mRNA-Expression in Primärzellkultur... 65
3.8 Elektronenmikroskopie ... 66
3.9 Mitochondrienvolumen ... 68
3.10 Protonenleckmessungen ... 70
3.10.1 Entkoppelte und gekoppelte Atmung ... 70
3.10.2 Der Einfluß von Sauerstoffradikalen auf die Atmung... 73
Protonenleckmessung... 73
Enzymtest... 76
3.10.3 Die maximalen Atmungsraten... 77
4 Diskussion ... 78
4.1 Der UCP3-Mutantenhamster... 79
4.1.1 Phänotyp und Genotyp ... 79
4.1.2 Die Zucht der UCP3-Mutantenhamster... 80
4.2 Anatomische Parameter... 83
4.2.1 Körpergewicht und Körperlänge ... 83
4.2.2 Körperzusammensetzung ... 86
4.2.3 Futteraufnahme... 90
4.2.4 Anatomische Parameter und Futteraufnahme: Schlussfolgerung ... 92
4.3 Primärzellkultur... 94
4.3.1 Die Steuerung des UCP3-Gens über PPARs... 94
4.3.2 Vergleich der UCP3-mRNA-Expression in Zellkultur und Gewebe ... 96
4.3.4 PPARγ-mRNA-Expression in braunen Adipozyten der Mutanten ... 99
4.3.5 Zusammenfassung der Zellkultur... 100
4.4 Mitochondriale Atmung ... 101
4.4.1 Bestimmung des Mitochondrienmatrixvolumens ... 101
4.4.2 Das Protonenleck... 102
4.4.3 Das Protonenleck der BAT-Mitochondrien ... 104
4.4.4 Messung der mit GDP gekoppelten state-4-Atmung ... 107
4.4.5 Die Wirkung von Superoxidradikalen auf das Protonenleck ... 109
4.4.6 Der Einfluß von UCP3 auf das Protonenleck... 112
5 Zusammenfassung ... 115
Abbildungen
Abb. 1: Topologisches Modell eines UCP-Monomers... 1
Abb. 2: Schematische Darstellung der Entkopplung der mitochondrialen Atmung ... 3
Abb. 3: Der Dsungarische Zwerghamster, Phodopus sungorus (PALLAS 1770). ... 9
Abb. 4: Zuordnung der Punktmutation zu Genotyp und Phänotyp ... 18
Abb. 5: Beispiel einer Röntgenabsorptionsmessung ... 22
Abb. 6: Soxhlet-Extraktionsapparat... 23
Abb. 7: Der Protonenkreislauf durch die innere Mitochondrienmembran ... 33
Abb. 8: Protonenleckmessung: schematischer Aufbau der Messanlage ... 34
Abb. 9: Triphenylmethylphosphoniumbromid (TPMP-Br)... 36
Abb. 10: Schematischer Aufbau der TPMP -sensitiven Elektrode.+ ... 36
Abb. 11: Schematische Darstellung der Wirkungsweise von Rotenon und Oligomycin ... 39
Abb. 12: Beispiel einer Aufzeichnung des Sauerstoffverbrauchs ... 43
Abb. 13: Beispiel einer mit DUO18 erstellten Messkurve ... 44
Abb. 14: Kalibrationskurve der TPMP -Elektroden.+ ... 45
Abb. 15: Körpergewichtsentwicklung der Dsungarischen Zwerghamster ... 53
Abb. 16: Abhängigkeit des Körpergewichts junger Hamster von der Wurfgrösse ... 54
Abb. 17: Zusammenhang zwischen Körperlängen und Körpergewichten ... 55
Abb. 18: Vergleichbarkeit von KGSOX und KGDEXA als Bezugsgröße... 56
Abb. 19: Beziehung zwischen Fett, fettfreier Masse und dem Körpergewicht. ... 58
Abb. 20: Zusammenhang zwischen fettfreier Trockenmasse und Körperlänge... 59
Abb. 21: Durchschnittliche Futteraufnahme pro Tag ... 60
Abb. 22: Die UCP3-mRNA-Expression brauner Adipozyten in Zellkultur... 62
Abb. 23: Primärzellkultur brauner Adipozyten von Wildtyp- und Mutantenhamstern... 64
Abb. 24: BAT-RNA von Wildtyphamstern und Mutanten aus Primärzellkultur... 65
Abb. 25: Ultrastruktur des braunen Fettgewebes eines Mutantenhamsters... 66
Abb. 26: Ultrastruktur des braunen Fettgewebes eines Mutantenhamsters... 67
Abb. 27: Mitochondrienmatrixvolumen der BAT-Mitochondrien... 68
Abb. 28: Sauerstoffverbrauch und Membranpotential von BAT-Mitochondrien. ... 70
Abb. 29: Protonenleck der BAT-Mitochondrien von Mutanten- und Wildtyphamstern... 71
Abb. 31: Protonenleckbestimmungen von BAT-Mitochondrien ohne und mit Zusatz von
Superoxidionen... 74
Abb. 32: Protonenleckbestimmungen von BAT-Mitochondrien ohne und mit Zusatz von Superoxiddismutase... 75
Abb. 33: Messung der Superoxidionen-Konzentration. ... 76
Abb. 34: Maximaler Sauerstoffverbrauch der BAT-Mitochondrien ... 77
Tabellen
Tabelle 1: cDNA-Sonden ... 16Tabelle 2: Atmungsreagenzien (~pH 7). ... 40
Tabelle 3: Zuchterfolg der MLT- und der LT-Zucht... 50
Tabelle 4: Phänotypisierung und Genotypisierung der Versuchstiere ... 51
Tabelle 5: Übersicht über die bisher auf die UCP3-Mutation hin untersuchten Hamster... 52
Tabelle 6: Körperlängen und Körpergewichte von Hamstern im Alter von 16 Wochen... 55
Tabelle 7: Körperzusammensetzung von Hamstern im Alter von 6 und 13 Monaten. ... 57
Tabelle 8: Futteraufnahme und Körpergewicht von neun Monate alten Hamstern ... 61
Abkürzungsverzeichnis
18S, 28S 18S-, 28S-Untereinheit der ribosomalen RNA ADP Adenosindiphosphat ANCOVA Kovarianzanalyse (analysis of covariance) ANOVA Varianzanalyse (analysis of variance) ATP Adenosintriphosphat BAT braunes Fettgewebe (brown adipose tissue) BMCP brain mitochondrial carrier protein
BMC Knochenmineralgehalt (bone mineral content) BMD Knochendichte (bone mineral density)
bp Basenpaare
BSA Bovine serum albumin
cDNA complementary-DNA
COUP-TF1 chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 1
c.p.m. gezählte Zerfälle pro Minute (counts per minute) dCTP Desoxycytosin-5´-triphosphat DEPC Diethylpyrophosphat
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s Medium
DEXA Dual-energy X-ray absorptiometry
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosid-5´-triphosphat d.p.m. Zerfälle pro Minute (desintegrations per minute) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA Ethylenglyol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure ETYA 3-,5-Eicosatetranoylarachidonat
FFM Fettfreie Masse
FCS Fötales Kälberserum (fetal calf serum)
FCCP Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazon GDP Guanosin-5’-diphosphat
GH Growth hormon
GIT Gastrointestinaltrakt
HEPES [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]-ethansulfonsäure IGF-1 Insulin-like growth factor 1
KS Korrelationskoeffizient nach Spearman LT Langtag(-zucht) MLT Mutanten-Langtagzucht MOPS 3-Morpholino-1-Propansulfonsäure MP Mitochondrienprotein Mt, Mut Mutante
MyoD Myoblast Determination protein
n.s. nicht signifikant
NST zitterfreie Wärmebildung (nonshivering thermogenesis) PBS Phosphatpuffer (phosphate buffered saline)
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PGC1 PPARγ coactivator 1
PMF protonenmotorische Kraft (protonmotive force) PPAR peroxisome proliferator- activated receptor
PPRE PPAR response element
PUMP plant uncoupling mitochondrial protein RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease
rRNA ribosomale RNA
ROS Superoxidradikale (reactive oxygen species) rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RLU relative light units
RT Raumtemperatur
RXR retinoic X receptor
SDS Natriumdodecylsulfat
SEM Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean) SOD Superoxid-Dismutase
SSC Standard-Saline-Citrate (Natriumchlorid, Natiumcitrat)
T3 Trijodthyronin
TES N-[Tris(Hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäure TEM Transemissionselektronenmikroskopie
TPMP-Br Triphenylmethylphosphoniumbromid
Tris Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure UCP Entkopplerprotein (uncoupling protein)
Wt Wildtyp XOD Xanthinoxidase
1 Einleitung
1.1 Die Familie der Entkopplerproteine
Die Entkopplerproteine (UCPs, uncoupling proteins) gehören zur Gruppe der mito-chondrialen Transportproteine, zu der auch der ADP/ATP-Transporter und der Phosphattransporter gezählt werden (Ricquier und Bouillaud, 2000; Borecky et al., 2001; Ledesma et al., 2002).
Die Entkopplerproteine sind nach dem zuerst entdeckten UCP1 (Thermogenin) und seiner Funktion benannt. Neben UCP1 gehören UCP2 und UCP3 zu den Entkopplerproteinen (Fleury et al., 1997; Boss et al., 1997). Bei dem gehirnspezifischen UCP4 und bei UCP5 ist die Gruppenzugehörigkeit aufgrund ihrer vergleichsweise niedrigen Sequenzähnlichkeit umstritten (Mao et al., 1999; Sanchis et al., 1998). Zunächst wurde angenommen, dass UCPs ausschließlich bei plazentaren Säugetieren vorkommen, man stellte aber mit der Zeit eine weitere Verbreitung fest. UCP-Homologe wurden mittlerweile bei Beuteltieren (Kabat et al., 2003), Fischen (Jastroch et al., 2005), Protozoen (Jarmuszkiewicz et al., 1999), Pflanzen (Laloi et al., 1997) und Pilzen entdeckt (Jarmuszkiewicz et al., 2000).
UCPs sind basische Membranproteine mit einer Molekülmasse zwischen 32 und 34 kDa. Die Moleküle sind kerncodiert, werden im Cytosol synthetisiert und mit den C- und N-termi-nalen Enden zum Cytosol hin in die innere Mitochondrienmembran eingebaut. Diese wird in drei Schlaufen bestehend aus sechs transmembranen α-helikalen Domänen durchlaufen (Abb. 1). Mitochondrienmatrix Intermembranraum C N Mitochondrienmatrix Intermembranraum C N C N
Abb. 1: Topologisches Modell eines UCP-Monomers in der inneren
Mitochondrien-membran. Die zwei gepunkteten Linien teilen die Sequenz in drei Domänen aus je zwei transmembranen Helices. Innerhalb jeder Domäne sind die beiden Helices durch eine lange hydrophile Schlaufe verbunden, von der man annimmt, dass sie in die Membran ragt.
Der funktionierende Transporter ist ein Homodimer, das in der Summe zwölf transmem-brane Helices hat (Lin et al., 1980). Man nimmt an, dass sich im Inneren ein hydrophiler Translokationsweg befindet, dessen Zugang wie bei Kanälen von Pforten kontrolliert wird (Saier, Jr., 2000). Diese Eigenschaften sind hauptsächlich aufgrund der DNA-Sequenz hergeleitet. Bisher ist es noch nicht gelungen, eines der UCPs mittels Röntgenstruktur-analyse zu erfassen.
Die Funktion der Entkopplerproteine ist nur im Falle des ersten Entkopplerproteins UCP1 geklärt. UCP1 wurde auf herkömmliche Art und Weise erforscht, d.h. es wurde erst ein physiologisches Phänomen beobachtet, dann eine zelluläre Erklärung gefunden und schließlich das verantwortliche Protein ermittelt. Da die neueren Entkopplerproteine aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit zu UCP1 entdeckt wurden, ist bei diesen die Abfolge der Forschungsschritte umgekehrt. Man ist noch auf der Suche nach den Funktionen und orientiert sich dabei oft an UCP1.
1.2 Die Funktionsweise von Entkopplerproteinen
UCP1 ist in den Mitochondrien des braunen Fettgewebes (BAT, brown adipose tissue) lokalisiert. Im braunen Fettgewebe findet zitterfreie Wärmebildung (NST, nonshivering
thermogenesis) statt, welche in kleinen und neugeborenen Säugern für die Aufrechterhaltung
der Körpertemperatur benötigt wird. Für diese spezielle Thermogenese ist UCP1 essentiell (Nicholls und Rial, 1984; Nicholls und Rial, 1999).
In den Mitochondrien werden Elektronen vom Substrat über die Atmungskette zum Sauerstoff übertragen. Dieser Elektronentransfer ist an den Protonentransport durch die Membran gekoppelt, welcher einen elektrochemischen Protonengradienten über der inneren Mitochondrienmembran erzeugt. Die Energie, die in diesem Protonengradienten gespeichert ist, wird dazu genutzt, die Synthese von ATP durch die ATP-Synthase anzutreiben. Sie wird auch als protonenmotorische Kraft (PMF, protonmotive force) bezeichnet (Lehninger et al., 2001).
Im Fließgleichgewicht gleicht die Anzahl der Protonen, die durch die ATP-Synthese oder andere Membrankomponenten wieder in die Matrix eintreten, der Anzahl der durch die Atmungskette gepumpten Protonen. So führt zum Beispiel ein erhöhter ATP-Bedarf der Zelle zu einer erhöhten Substratoxidation der Atmungskette. Deshalb spricht man von Kopplung der Substratoxidation und der ATP-Synthese.
Im braunen Fettgewebe wird Thermogenese erreicht, indem UCP1 den Protonen die Rückkehr in die Matrix erlaubt und damit die Substratoxidation von der ATP-Synthese entkoppelt. Dabei wird der von der Atmungskette gebildete Protonengradient abgebaut und die elektrochemische Energie des Protonengradienten als Wärme freigesetzt (Nicholls und
Rial, 1984; Ledesma et al., 2002) (Abb. 2). Durch die Aktivierung von UCP1 wird die Energieübertragung kurzgeschlossen und der Protonenleitwert der Membran erhöht. Dies wird auch als Protonenleck bezeichnet.
H
+H
+H
+ ADP+P ATPH
+H
+ ATPase I II III UCP1 UQNADH+H+ NAD+ Succinat
Glycerol-3-phosphat Fett-säuren 1/ 2O2+H+ H2O
Mitochondrienmatrix
IV c G3P-DH ETF UQIntermembranraum
H
+H
+H
+ ADP+P ATPH
+H
+ ATPase I II II III UCP1 UQNADH+H+ NAD+ Succinat
Glycerol-3-phosphat Fett-säuren 1/ 2O2+H+ H2O
Mitochondrienmatrix
IV c G3P-DH ETF UQIntermembranraum
Abb. 2: Schematische Darstellung der Entkopplung der mitochondrialen Atmung durch
UCP1 im braunen Fettgewebe. Auf der linken Seite ist die reguläre, gekoppelte Atmung mit den Atmungskettenkomplexen I bis IV und der ATP-Synthese dargestellt, auf der rechten Seite die Entkopplung der Atmung durch UCP1. G3P-DH: Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase, UQ: Ubichinon, ETF-UQ: Elektronen-übertragendes-Flavoprotein-UQ-Oxidoreduktase.
Diese Entkopplerfähigkeit von UCP1 wird auch für die anderen Mitglieder der UCP-Familie postuliert, ist aber möglicherweise nicht auf alle übertragbar. Insofern könnte die Bezeichnung der UCP-Familienmitglieder als „Entkopplerproteine“ im Hinblick auf ihre physiologische Funktion irreführen.
1.3 Die Regulation von Entkopplerproteinen
UCPs werden sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Proteinebene reguliert. Es gibt wenige Daten zur Steuerung der Aktivität der neueren Entkopplerproteine, aber die Regulation von UCP1 ist hinreichend untersucht.
Bei Kälte wird das braune Fettgewebe über das sympathische Nervensystem aktiviert. Auf die sympathische Stimulation durch Noradrenalin erfolgt Lipolyse und die dabei frei werdenden Fettsäuren agieren als Substrat für die Atmung und aktivieren als sekundäre Boten UCP1. Bei stärkerem Anreiz aktiviert Noradrenalin auch die UCP1-Proteinsynthese (Silva und Rabelo, 1997).
Der Entkopplungsmechanismus von UCP1 ist nicht ständig aktiv, seine Aktivität wird durch Nukleotide und Fettsäuren beeinflußt (Klingenberg und Echtay, 2001). Die Anwesenheit freier Fettsäuren ist eine Vorraussetzung für die Entkopplung der Atmung durch UCP1 (Rial et al., 1983). Der Mechanismus der Entkopplung durch Fettsäuren wird noch diskutiert. Das
proton-buffering–Modell schlägt eine Cofaktor-Funktion vor, bei der Fettsäuren als
prosthetische Gruppen im Protonenkanal des UCP1 agieren. So könnten sie als Donor-Akzeptor-Gruppen, die UCP1 selbst fehlen, beim Protonentransport helfen (Winkler und Klingenberg, 1994). Das alternative fatty-acid-cycling-Modell postuliert, dass nicht UCP1, sondern Fettsäuren die Protonen in die Matrix transportieren, indem die protonierten Fettsäuren über einen Flipflop-Mechanismus die Membran durchqueren. In der Matrix werden sie deprotoniert und von UCP1 wieder aus den Mitochondrien herausbefördert (Skulachev, 1991).
Die Aktivität von UCP1 kann durch Purinnukleotide gehemmt werden, die von der cytosolischen Seite an UCP1 binden. Diese Bindung ist zunächst nur lose, erst in einem zweiten, langsameren Schritt bindet das Nukleotid fest und wirkt inhibierend (Huang und Klingenberg, 1996). Vermutlich geschieht diese Hemmung in vivo durch ATP und wird über die Komplex-Bildung von ATP mit Mg2+ gesteuert. Neusten Erkenntnissen zufolge wirkt die Hemmung von UCP1 durch Nukleotide und die Aktivierung durch Fettsäuren kompetitiv (Shabalina et al., 2004).
Des weiteren wurde Ubiquinon (Coenzym Q) als essentieller Cofaktor für die Aktivität von UCP1, UCP2 und UCP3 beschrieben, seine physiologische Relevanz wird aber noch diskutiert (Echtay et al., 2000; Echtay et al., 2001; Jaburek und Garlid, 2003; Moreno et al., 2003; Esteves et al., 2004).
1.4 Entdeckung und Verbreitung von UCP3
UCP3 wurde erstmals 1997 beschrieben und die genomische DNA 1999 sequenziert (Boss et al., 1997; Acin et al., 1999). Das UCP3-Gen besitzt sieben Exons unterbrochen durch sechs Introns und erstreckt sich über ~8,5 kb der genomischen DNA. Die größte Sequenz-ähnlichkeit hat es zu UCP2 aus dem es vermutlich durch Genduplikation hervorgegangen ist (Solanes et al., 1997). UCP3 wird vor allem in den Mitochondrien der Skelettmuskulatur und des braunen Fettgewebes gebildet (Larkin et al., 1997; Boss et al., 1997). UCP3-mRNA konnte aber auch im weißen Fettgewebe, im Herzen und in der glatten Muskulatur nachgewiesen werden (Gong et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997).
UCP3 ist für die Stoffwechselphysiologie von besonderem Interesse, weil seine Expression, anders als bei UCP1, nicht auf das braune Fettgewebe beschränkt ist. Dadurch ist es auch bei
größeren Säugern, die kein BAT haben, in größerem Maße vorhanden und ist auch beim Menschen ein möglicher Kandidat für die Regulierung des Energiestoffwechsels.
Die Expression der UCP3-Transkription steht unter strenger, transkriptioneller Kontrolle. In der Nähe der 5´-Region des UCP3-Gens gibt es mehrere potentielle Bindesequenzen für regulierende Faktoren wie PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors) oder Thyroidhormonrezeptoren (Acin et al., 1999). Der molekulare Mechanismus, der die UCP3-Expression kontrolliert, ist erst zum Teil geklärt (Solanes et al., 2003; Solanes et al., 2005). In der Skelettmuskulatur wird UCP3 über PPARα und PPARδ gesteuert. Die PPARs sind eine Unterfamilie der Kernrezeptoren. Zusammen mit RXRs (retinoid X receptors) bilden sie Heterodimere, die an PPREs (PPAR-Bindestellen) in der Promoterregion binden, und regulieren so die Transkription verschiedener Gene. Anstelle von PPARα oder PPARδ kann auch der Thyroxidrezeptor mit RXR dimerisieren und die UCP3-Transkription aktivieren. Als weitere Faktoren sind MyoD und p300 beteiligt.
Experimente zeigen, dass die mRNA-Regulation von UCP3 im braunen Fettgewebe unabhängig und zuweilen konträr zur Regulation in der Skelettmuskulatur erfolgt (von Praun et al., 2001; zusammengefasst von Boss et al., 1998a). Der Mechanismus hierzu ist noch völlig unbekannt.
1.5 Hypothesen zur Funktion von UCP3
Seiner Struktur zufolge ist UCP3 ein Transportprotein. Welche Ionen genau von den UCPs transportieren werden, ist nicht einmal für UCP1 genau geklärt. So ist UCP1 unter experimentellen Bedingungen in der Lage Chlorid (Nicholls, 1974) und organische Ionen (Jezek und Garlid, 1990; Jaburek et al., 1999) zu transportieren. Dies muß nicht not-wendigerweise auch unter physiologischen Bedingungen der Fall sein.
Nach der Entdeckung von UCP3 folgten viele physiologische Experimente, in denen die Regulation der UCP3-mRNA als Reaktion auf verschiedene Faktoren getestet wurde. Einfluß auf die UCP3-mRNA-Menge haben unter anderem Temperatur, Futterentzug, Thyroxin und Leptin (Überblick in Boss et al., 1998a; Ricquier und Bouillaud, 2000).
Zur Erforschung der Funktion von UCP3 gibt es mehrere Herangehensweisen und Hypothesen. Die meisten Hypothesen werden auch für UCP2 diskutiert (Überblick in Nedergaard und Cannon, 2003; Krauss et al., 2005). Einige dieser Funktionshypothesen wie zum Beispiel die Thermogenesefunktion, oder die Gewichtsregulation setzen eine Entkopplerfunktion von UCP3 voraus. Bei der Schutzfunktion vor Radikalen und dem Transport von Fettsäuren ist eine Entkopplerfunktion optional, aber nicht zwingend erforderlich.
1.5.1 UCP3 als Entkoppler
In Anlehnung an UCP1 basieren viele Funktionshypothesen auf der potentiellen Fähigkeit UCP3s, die Atmung zu entkoppeln. Um Hinweise darauf zu erhalten, ob UCP3 entkoppelt, wurde das Protein in Proteoliposomen integriert oder in Hefe exprimiert (Boss et al., 1998b; Gong et al., 1997), woraufhin UCP3 eine Entkopplung der Atmung bewirkte.
Mittlerweile gibt es drei verschiedene UCP3-knockout-Mäuse, an deren Skelettmuskel-mitochondrien die Atmung gemessen wurde. Die Resultate sind entweder eine verringerte Atmungsrate (Vidal-Puig et al., 2000) oder ein erhöhtes Membranpotential aber kein Absinken der Atmungsrate (Gong et al., 2000), während eine andere Messung überhaupt keine Veränderung erbrachte (Cadenas et al., 2002). Die Daten deuten an, dass das Protonenleck in UCP3-knockout-Mitochondrien reduziert sein könnte, sie sind aber wider-sprüchlich und nur bedingt vergleichbar. Dagegen war die Atmung der Mitochondrien von UCP3-überexprimierenden Mäusen verstärkt entkoppelt (Clapham et al., 2000). Dies wurde aber als Artefakt durch falschen oder übermäßigen Einbau von Proteinen bewertet, da sich das Protonenleck nicht durch Fettsäuren und GDP regulieren ließ (Cadenas et al., 2002). Deshalb ist nicht klar, ob UCP3 entkoppelt und wenn ja, ob dies seiner physiologischen Funktion entspricht.
Als Entkoppler wären für UCP3 mehrere potentielle Funktionen denkbar. Erstens könnte UCP3 wie UCP1 Wärme freisetzen, zweitens könnte es überschüssige Energie als Wärme abgeben und drittens den Protonengradienten abbauen und damit die Produktion von Radikalen als Nebenprodukt der Atmung verringern.
Die Expression von UCP3 im braunen Fettgewebe, die Sequenzähnlichkeit zu UCP1, die Erhöhung der Expression in Kälte und die Thyroidrezeptor-Bindestelle in der Promoterregion führten zur Entwicklung von Thermogenesehypothesen. Thermogenese durch UCP3 ist denkbar in Form von Kälte-induzierter NST, Diät-induzierter NST und thyroidaler Thermogenese. Außerdem wurde im Zusammenhang mit Fieber und medika-mentös induzierter Thermogenese ein UCP3-mRNA-Anstieg beobachtet (Busquets et al., 1998; Mills et al., 2003).
Kälte veranlasst zitterfreie Wärmebildung im braunen Fettgewebe. An dieser könnte neben UCP1 auch UCP3 beteiligt sein. Gegen eine Involvierung von UCP3 spricht, dass UCP3-knockout-Mäuse fähig sind, auf Injektion von Noradrenalin mit zitterfreier Wärmebildung reagieren (Gong et al., 2000), während UCP1-knockout-Mäuse, die in normalem Umfang UCP3 enthalten, auch nach Wochen in Kälte noch genauso wie zu Anfang zittern (Golozoubova et al., 2001). UCP3 ist also nicht in der Lage, die thermogenetische Funktion von UCP1 zu ersetzen.
Zu einer Erhöhung der Körpertemperatur kommt es auch im hyperthyroiden Zustand. In mehreren Untersuchungen wurde der Thyroxinspiegel von Ratten und Mäusen mit einem erhöhten UCP3-mRNA- und –Proteingehalt in Zusammenhang gebracht (Gong et al., 1997; Larkin et al., 1997; Lanni et al., 1999; De Lange et al., 2001; Short et al., 2001; Simonyan et al., 2001). Einer direkten kausalen Verbindung zwischen UCP3 und der thyroidalen Thermogenese steht entgegen, dass UCP3-knockout-Mäuse auf Thyroxin wie normale Mäuse mit Temperaturerhöhung reagieren (Gong et al., 2000).
Die Produktion von Wärme kann nicht nur zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur, sondern auch zur Abgabe von überschüssiger Nahrungsenergie verwendet werden, um den Körper durch Entkoppeln vor Übergewicht schützen. Experimente mit künstlichen Entkopplern führen beim Menschen tatsächlich zur Gewichtsabnahme (Parascandola, 1974; Harper et al., 2001). Generell führt die Gabe einer hochkalorischen Diät zur Erhöhung der Stoffwechselrate und des Noradrenalin-induzierten Stoffwechsels (Rothwell und Stock, 1979). Da eine Cafeteriadiät (d.h. hochkalorisches, schmackhaftes Futter) auch bei UCP1-knockout-Mäusen – also unabhängig von UCP1 - zu einer Temperaturerhöhung führt (Nedergaard und Cannon, 2003), könnte dies durch eine Aktivierung von UCP3 geschehen. Eine konträre Hypothese, in der UCP3 an der Entwicklung von Übergewicht beteiligt ist, wurde ebenfalls aufgestellt, da die Gene von UCP2 und UCP3 in einer genomischen Region lokalisiert sind, die mit der Stoffwechselrate und Fettleibigkeit in Verbindung gebracht wird (Bouchard et al., 1997; Fleury et al., 1997).
Gegen beide Hypothesen spricht, dass UCP2- und UCP3-knockout-Mäuse von sich aus weder dick noch dünn werden (Arsenijevic et al., 2000; Gong et al., 2000).
1.5.2 UCP3 als Radikalschutz
Ein Elektronenstau in der Atmungskette kann dazu führen, dass die aufgestauten Elektronen mit Sauerstoff reagieren, so dass Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) entstehen (Raha und Robinson, 2000). UCP3 könnte durch Entkoppeln der mitochondriellen Atmung den Elektronendruck mindern und dadurch die Radikal-Produktion reduzieren (Skulachev, 1998). Alternativ ist auch ein Transport der Radikale selbst durch UCP3 vorstellbar. Dabei würde ROS von UCP3 exportiert um außerhalb der Mitochondrien entgiftet zu werden. Grundlage für die Erstellung dieser Hypothesen waren erhöhte ROS-Level in Skelettmuskelmitochondrien von UCP3-knockout-Mäusen (Vidal-Puig et al., 2000). Atmungsmessungen an Mitochondrien weisen auf eine Entkopplung durch UCP3 in Verbindung mit ROS (Echtay et al., 2002). Analoge Befunde für UCP2 wurden aber experimentell in Frage gestellt (Couplan et al., 2002), und die beobachteten Schädigungen durch Sauerstoff sind statistisch grenzwertig (Brand et al., 2002). Auch kommen viele
Gewebe ohne durch UCPs als Schutz gegen Superoxide aus. Es gibt keine Berichte über Kurzlebigkeit oder Krebsneigung von UCP3-knockout-Tieren.
1.5.3 Fettstoffwechsel-assoziierte Hypothesen
UCP2 und UCP3 kommen hauptsächlich in Fettsäure verbrennenden Geweben und unter Bedingungen vor, unter denen der Fettstoffwechsel überwiegt. Eine Konzentrationserhöhung der freien Fettsäuren im Blut führt zu einer Steigerung der UCP2- und der UCP3-mRNA-Mengen (Weigle et al., 1998). Da experimentell nachgewiesen werden konnte, dass UCP3 fähig ist, Fettsäuren zu transportieren (Jaburek et al., 1999), wird für UCP3 eine Rolle beim Fettstoffwechsel diskutiert.
In den Mitochondrien werden bestimmte Fettsäuren in ihrer Acyl-CoA-Ester-Form schlechter oxidiert als andere. Dies könnte zu einer Ansammlung von Fettsäureacyl-CoA-Estern in den Mitochondrien führen, so dass es zu einem Engpass ungebundener CoAs käme. Die mitochondriale Acyl-CoA-Thioesterase I (MTE-I) kann diese CoAs durch Hydrolyse der Ester freisetzen und so den mitochondrialen CoA-Pool reguliern. Dabei lassen sie jedoch Fettsäuren in den Mitochondrien zurück, die dort in dieser Form nicht mehr verstoffwechselt werden können (Alexson und Nedergaard, 1988; Hunt und Alexson, 2002). Da die mRNA-Expressionen von UCP3 und MTE-I korrelieren (Clapham et al., 2001; Lanni et al., 2002), wurde vorgeschlagen, dass UCP3 ― angetrieben durch das Membranpotential ― diese Fettsäuren aus der Mitochondrienmatrix heraustransportiert (Himms-Hagen und Harper, 2001). Da beide Gene unter PPAR-Kontrolle stehen, ist eine parallele, aber nicht unbedingt funktional gekoppelte Rekrutierung wahrscheinlicher.
Eine alternative Idee setzt UCP3 ebenfalls als Fettsäuretransporter ein und entspricht dem
fatty-acid-cycling-Model für UCP1 von Skulachev (Skulachev, 1991), (s. Kapitel 1.3, S. 4).
Fettsäuren werden im Membranzwischenraum der Mitochondrien protoniert. Dies ermöglicht es ihnen, passiv getrieben durch den Protonengradienten die innere Mitochondrienmembran zu queren (Flipflop) und sich in der Matrix anzusammeln. UCP3 würde die Fettsäuren wieder heraustransportieren (Schrauwen et al., 2001; Schrauwen et al., 2002).
Eine weitere Hypothese schlägt eine Involvierung von UCP3 bei der Verschiebung der Substratverbrennung vom Kohlenhydrat- zum Fettstoffwechsel, vor, wie er zum Beispiel bei Futterentzug geschieht. Dafür spricht, dass die UCP3-mRNA-Regulation auf Fasten stärker in glykolytischen Muskeln als in oxidativen, hauptsächlich fettverbrennenden Muskeln reagiert (Samec et al., 1998; Dulloo et al., 2001). Eine konkrete funktionelle Rolle für UCP3 wurde bisher nicht formuliert und es gibt diesbezüglich keine Experimente.
Der experimentelle Beweis dieser Fettstoffwechsel-assoziierten Hypothesen wird dadurch erschwert, dass Fettsäuren nicht nur funktionell an UCP gebunden, sondern auch unabhängig von diesem als Substrat die Atmung antreiben.
1.6 Der Dsungarische Zwerghamster
Der Dsungarische Zwerghamster Phodopus s. sungorus (Pallas 1770) ist in den Kaltsteppen Zentralasiens beheimatet, wo ein kontinentales Klima mit einer ausgeprägten, jahreszeitlichen Temperaturamplitude herrscht (Abb. 3) (Flint, 1966; Grizimek, 1969; von Weiss, 1996).
Abb. 3: Der Dsungarische Zwerghamster, Phodopus sungorus (PALLAS 1770).
Um unter diesen rauhen Bedingungen überleben zu können, verfügt der Dsungarische Zwerghamster über eine Reihe saisonaler morphologischer, physiologischer und biochemischer Anpassungen (Figala et al., 1973; Heldmaier und Steinlechner, 1981a; Heldmaier und Steinlechner, 1981b). Dazu gehört im Winter eine größere Kältetoleranz, die neben einer verbesserten Fellisolation und Nestbau, vor allem auf die vergrößerte Kapazität zur zitterfreien Wärmebildung zurückzuführen ist (Heldmaier et al., 1982a). Durch die Reduktion des Körpergewichts und täglichen Torpor mit Hypothermie wird der Nahrungs-bedarf reduziert. Diese jahreszeitlichen Anpassungen sind von einer Fellumfärbung begleitet und werden vorrangig durch die Photoperiode gesteuert (Heldmaier et al., 1982b). Zusätzliche Kälteexposition führt im braunen Fettgewebe zu einer verstärkten Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen, Hypertrophie ausgereifter Adipozyten, Mitochon-drienbiogenese und einer erhöhten Expression und Aktivität von UCP1 (zusammengefasst von Klingenspor, 2003).
Aufgrund seiner Fähigkeit, seinen Energiehaushalt in besonderem Maße den Jahreszeiten anzupassen, ist der Dsungarische Zwerghamster schon seit längerem Forschungsobjekt zur Untersuchung der Regulationsmechanismen des Energiehaushalts.
1.7 Die Mutante - bisherige Ergebnisse
Als die Dsungarischen Zwerghamster das erste Mal auf die neuen Entkopplerproteine hin untersucht wurden, wurden bei einer Northern-Blot-Analyse zufällig drei Hamster entdeckt, bei denen die UCP3-Expression verändert war (von Praun, 1999). Diese Hamster stammten alle von demselben Zuchtpaar ab. Ein Zuchtansatz mit den Geschwistern dieser Tiere zeigte, dass es sich um eine vererbbare Mutation handelte (von Praun, 1999). Da sich solcherart eine natürliche Mutante anbot, um neue Erkenntnisse über UCP3 zu gewinnen, wurde auf Basis dieser Tiere eine Zuchtlinie aufgebaut (von Praun, 1999).
Der Phänotyp dieser Hamster zeigt sich in einem gewebespezifischen UCP3-mRNA-Defizit. Im braunen Fettgewebe fehlt die UCP3-mRNA und ist auch durch Kälte oder Futterentzug nicht zu stimulieren (Liebig et al., 2004; Liebig, 2004). In der Skelettmuskulatur ist sie auf zwei Drittel des normalen Levels verringert (von Praun, 1999). Western-Blots bestätigten diesen Befund auf Proteinebene im BAT (Liebig et al., 2004). Des Weiteren wurde gefunden, dass im braunen Fettgewebe der Mutanten mehr UCP1- und UCP2-mRNA gebildet werden (Liebig et al., 2004). Die UCP1-Proteinmenge ist jedoch unverändert, die UCP2-mRNA-Expression konnte wegen fehlender Antikörper auf Proteinebene nicht überprüft werden (Liebig et al., 2004).
In Anlehnung an die Thermogenesefunktion von UCP1 wurde der Einfluss von UCP3 auf die Fähigkeit der Hamster, zitterfreie Thermogenese zu betreiben, untersucht. Dazu wurde zunächst der Ruhestoffwechsel (RMR) bestimmt und dann Noradrenalin injiziert, um die maximale NST-Kapazität zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass der Ruhestoffwechsel der Mutanten nicht verändert ist; dennoch ist die NST-Kapazität bei den Mutanten geringfügig aber signifikant höher (Liebig et al., 2004). Um diesen Unterschied durch die nähere Betrachtung der Mitochondrien zu bestätigen, wurde die Atmung von BAT-Mitochondrien kalt-akklimatisierter Hamster gemessen. Dabei zeigten die Mitochondrien der Mutanten bei allen Messungen einen normalen Sauerstoffverbrauch. Stattdessen wurde eine Erhöhung der Cytochrom-C-Oxidase1-Aktivität bei den Mutanten gefunden, die aber keine Auswirkung auf die Atmungsrate hatte (Liebig et al., 2004).
Mit Ausnahme eines tendenziell höheren Körpergewichtes konnten bisher keine äußeren Merkmale der Mutanten beobachtet werden (von Praun, 1999; Liebig et al., 2004; Liebig, 2004).
Die Lokalisation der Mutation in der DNA war zu Beginn der vorliegenden Arbeit unbekannt. Es war ungewiss, ob die Mutation überhaupt im UCP3-Gen selbst oder in einem anderen Gen lag. Mittlerweile konnte das UCP3-Gen von Phodopus sungorus sowohl vom Wildtyphamster als auch von der Mutante sequenziert, und eine Punktmutation im UCP3-Gen gefunden werden (Fromme, 2003). Somit wurde bestätigt, dass es sich bei den Hamstern tatsächlich um eine nicht-transgene UCP3-„knockout“-Mutante handelt.
1.8 Fragestellung
Ziel der Arbeit ist es, den Phänotyp des Mutantenhamsters näher zu beschreiben und von den Ergebnissen auf die Funktion und Steuerung von UCP3 zu schließen. Dazu wurden die Hamster in verschiedenen, von einander unabhängigen Ansätzen untersucht, wobei unterschiedliche Hypothesen verfolgt wurden.
Da es sich bei den Mutantenhamstern um eine neue Zuchtlinie handelt, wurde die Zucht dokumentiert. Die Zuchtdaten wurden nach Unterschieden zur Wildtypzucht durchgesehen. Es folgte eine allgemeine Beschreibung von Wachstum, Körpergewicht, Körperlänge und Körperzusammensetzung. Zusammen mit der Bestimmung der Futteraufnahme zielten diese Messungen darauf, Hinweise auf einen möglichen Einfluß des UCP3-Defizits auf den Energiestoffwechsel zu bekommen.
Auf Zellebene wurde die Entwicklung und Morphologie der braunen Adipozyten der Mutanten in Primärzellkultur betrachtet und damit die Grundlage für weitere Arbeiten in Zellkultur geschaffen. Dabei wurde die Induzierbarkeit der UCP3-mRNA-Expression getestet und die Auswirkung der Mutation näher eingegrenzt.
Durch elektronenmikroskopische Betrachtung des braunen Fettgewebes wurde nach morpho-logischen Auswirkungen der Mutation auf die Mitochondrien der Mutanten im Zellverband gesucht.
Schließlich wurde untersucht, ob die Atmung isolierter BAT-Mitochondrien durch das Fehlen von UCP3 beeinträchtigt ist. Dazu wurde die Bestimmung des mitochondrialen Protonenlecks durch parallele Messung des Sauerstoffverbrauchs und des Membran-potentials etabliert. Es wurden Messungen bei verschiedenen Konditionen durchgeführt, wobei die Frage nach einer Beteiligung von UCP3 am mitochondrialen Protonenleck im Vordergrund stand. Des Weiteren wurde in Hinblick auf eine potentielle Schutzfunktion von UCP3 vor Radikalen, wurde auch der Einfluß von Superoxidradikalen auf die mito-chondriale Atmung untersucht.
2 Material und Methoden
2.1 Versuchstiere
2.1.1 Tierhaltung und Zucht
Das Versuchstier in allen Versuchen ist der Dsungarische Zwerghamster Phodopus sungorus (PALLAS 1770). Die Hamster stammen alle aus der institutseigenen Zucht des Fachbereichs Biologie der Philipps-Universität Marburg. Die Tiere werden dort einzeln in Makrolon-Käfigen (22x17x15cm) auf Holzspaneinstreu bei 23 °C gehalten und bekommen Futter (Altromin 7014) und Wasser ad libitum sowie einmal die Woche einen viertel Apfel.
Alle in dieser Arbeit verwendeten Hamster wurden in einem künstlichen Langtag (LT) Licht : Dunkel = 16 : 8 Stunden gehalten, was die Zucht der Hamster das ganze Jahr über ermöglicht (LT-Zucht).
Zuchtpaare werden permanent monogam gehalten und können ein bis neun Würfe, bestehend aus bis zu neun Jungtieren bekommen. Im Alter von drei Wochen wird der Nachwuchs von den Eltern getrennt, bleibt aber als Wurf noch eine weitere Woche zusammen, bevor die Hamster endgültig vereinzelt werden. Die Tiere werden bei der Trennung von der Mutter im Alter von 21 Tagen ins Zuchtbuch eingetragen.
Bei der Auswahl der Versuchstiere wurde auf ein ausgeglichenes Geschlechterverhältnis geachtet. Für die Messungen an isolierten Mitochondrien (Kapitel 2.6, S. 29ff) wurden die Hamster mindestens vier Wochen lang bei 5°C kalt-akklimatisiert.
2.1.2 Mutantenzucht
Bei einer Northern-Blot-Analyse wurde zufällig eine spontan aufgetretene Mutation gefunden. Sie zeichnet sich durch eine fehlende UCP3-mRNA- und Protein-Expression im braunen Fettgewebe (BAT) aus, in der Skelettmuskulatur ist die mRNA-Expression um ein Drittel verringert (von Praun, 1999). Seit 1998 wurde basierend auf drei Zuchtpaaren eine eigene Zuchtlinie aufgebaut.
Diese Mutantenhamster wurden unter den gleichen Bedingungen wie die reguläre Langtagzucht (LT) gehalten und deshalb als Mutanten-Langtagzucht (MLT) bezeichnet. Die Zucht wurde wie die LT-Zucht als Auszucht mit Pedigree-Verpaarung geführt, d.h. die Zuchtpartner wurden nach möglichst geringem Verwandschaftsgrad ausgewählt, um den vorhandenen Genpool zu erhalten.
2.2 Phänotyp und Genotyp
Die Hamster, die in den Messungen zum Einsatz kamen, wurden zunächst nur aufgrund ihrer Abstammung als Mutante (aus der MLT-Zucht) oder Wildtyp (LT-Zucht) eingestuft. Erst nach Beendigung der Experimente wurde der tatsächliche Phänotyp oder Genotyp aller Versuchstiere bestimmt.
Um den Phänotyp zu bestimmen wurde eine Northern-Blot-Analyse2 der RNA aus dem braunen Fettgewebe durchgeführt. Auf dem Northern-Blot wurde die UCP3-mRNA mit einer radioaktiven cDNA-Sonde detektiert. Hamster, deren RNA UCP3-mRNA enthielt, wurden als „Wildtyp“, Hamster ohne UCP3-mRNA im BAT als „Mutante“ bezeichnet. Wenn möglich, wurden die Hamster vor der Phänotypisierung in Kälte gesetzt, um die UCP3-mRNA-Expression zu verstärken.
Die dem Phänotyp zugehörige Mutation im ersten Intron des UCP3-Gens wurde erst während des letzten Teils der vorliegend Arbeit entdeckt. Dies machte die Genotypisierung der Hamster mittels PCR und Restriktionsverdaus oder Sequenzierung möglich.
Messwerte von Hamstern, deren Phänotyp oder Genotyp nicht eindeutig zu bestimmen war, wurden nicht weiter verwendet. Die Bezeichnungen „Mutante“ und „Wildtyp“ beziehen sich in dieser Arbeit meistens auf den Phänotyp. Eine Übersicht über die Phäno- und Genotypisierung der Versuchstiere aufgeteilt nach Experimenten gibt Tabelle 4, Seite 51.
2.2.1 Tötung und Präparation
Die Hamster wurden mit CO2 betäubt, ventral eröffnet und nach einer Durchtrennung des Zwerchfells im Brustraum durch einen Schnitt in die Vena cava posterior getötet. Die Gewebeproben wurden möglichst schnell entnommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei -70 °C gelagert. Für die Tötung zur Organentnahme lagen Genehmigungen des Regierungspräsidiums Giessen vor.
2.2.2 Phänotypisierung: Northern-Blot-Analyse
RNA-Isolation aus Gewebe
Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzolTM (GIBCO BRL) isoliert, basierend auf der
„single-step“-RNA-Isolation nach (Chomczynski und Sacchi, 1987). TRIzolTM enthält Guanidinisothiocyanat, welches Proteine denaturiert und dadurch RNAsen inaktiviert. Ein
weiterer Bestandteil ist Phenol, mit dem Proteine und DNA durch Extraktion entfernt werden.
Die tiefgefrorene Gewebeprobe wird in TRIzolTM gegeben und sofort durch Ultraschall mit dem Ultra-turrax (Janke und Kunkel GmbH) homogenisiert. Das Homogenat wird 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann bei 2500 g und 4 °C 5 min zentrifugiert, um Fett abzutrennen. Durch die Fettschicht wird das klare Homogenat entnommen und in ein sauberes Reaktionsgefäß überführt. Die Phasentrennung und die RNA-Fällung erfolgen nach dem Protokoll des TRIzolTM-Herstellers.
Um eventuell noch vorhandene RNAsen zu zerstören, wird die RNA nach der Isolation zusätzlich mit Sol D behandelt. Dazu löst man das Pellet nach der RNA-Fällung mit Isopropanol vollständig in 600 µl Sol D + Mercaptoethanol. Anschließend werden 500 µl Isopropanol hinzugegeben, es wird gemischt und die RNA mindestens 15 min bei -20 °C gefällt. Dann wird die RNA 5 min bei 12000 g und 4 °C runterzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit 1 ml 75%igem Ethanol einige Minuten bei Raum-temperatur gewaschen. Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 10000 g und 4 °C wird der Überstand verworfen und das Pellet an der Luft getrocknet.
Die RNA wird in 10 bis 20 µl DEPC-Wasser gelöst und dazu 10 min bei 55 - 60°C inkubiert und alle 2 min kurz gemischt. Bis zur weiteren Verwendung wird die RNA bei -70°C eingefroren.
Sol D: 4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM NaCitrat (pH 7), 0,5 % (w/v) Natriumdodecylsulfat,
Lagerung maximal 3 Monate lichtgeschützt bei Raumtemperatur.
Sol D + Mercaptoethanol: 50 ml Sol D + 360 µl Mercaptoethanol (Endkonz.: 9,2x10-5 M).
DEPC-Wasser: Wasser mit 0,1 % v/v DEPC (Diethylpyrophosphat) über Nacht bei RT
stehen lassen, autoklavieren.
RNA-Isolation aus Zellen
Bei den Zellkulturexperimenten (Kapitel 2.4, Seite 25ff) wurde RNA nicht nur aus Gewebe-proben sondern auch aus Zellen isoliert. Die Zellkulturplatten waren zum Abschluss der Zellkultur bei -70 °C eingefroren worden.
Auf jede (noch gefrorene) Zellkulturplatte werden 1,8 ml Sol D + Mercaptoethanol pipettiert und dann zusammen mit den Zellen mit einem „Rubber Policeman“ zusammengeschabt und in ein 12 ml-Polypropylen-Röhrchen pipettiert. Nacheinander werden 200 µl 2 M Natrium-acetat (pH 4), 400 µl Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) und 2 ml Phenol (pH 4.5-5, Roth) hinzugegeben, gemischt, 10 min auf Eis inkubiert und dann bei 10000 g und 4 °C 10 min zentrifugiert. Anschließend wird die obere, wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt, 4 ml Isopropanol hinzugegeben, gemischt, 30 bis 60 min bei –20 °C gefällt und dann bei 4 °C mit 10000 g 15 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, das Pellet in
0,5 ml Sol D vollständig gelöst, in 1,5 ml-Cups überführt, 0,5 ml Isopropanol hinzugegeben, invertiert, gemischt, 30 min bei –20 °C gefällt und bei 4 °C mit 12000 g und 15 min zentrifugiert. Wieder wird der Überstand verworfen, dann 1 ml 75 %iges Ethanol zum Pellet hinzugegeben und das Reaktionsgefäß bewegt, bis sich das Pellet von der Wand gelöst hat. Dann wird bei 4 °C und 12000 g 10 min zentrifugiert, das Ethanol verworfen und das Pellet an der Luft getrocknet. Schließlich wird die RNA in 10 bis 40 µl DEPC-Wasser gelöst (s.o.) und bei -70 °C eingefroren.
Sol D: 4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM NaCitrat (pH 7), 0,5 % (w/v) Natriumdodecylsulfat,
Lagerung maximal 3 Monate lichtgeschützt bei Raumtemperatur.
Sol D + Mercaptoethanol: 50 ml Sol D + 360 µl Mercaptoethanol (Endkonz.: 9,2x10-5 M).
Photometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren
Die Konzentration der RNA wird photometrisch durch die Messung der optischen Dichte bestimmt (Ultrospec 2100 pro, Amersham Pharmacia Biotech). Dazu verdünnt man die RNA mit Wasser und misst die Extinktion in einer Quarzküvette bei 260 nm und 280 nm (SwiftIIQuantification, Vers. 2.02, Biochrom Ltd.).
Gelelektrophorese
Die Gesamt-RNA wird durch Gelelektrophorese in einem denaturierenden Agarosegel der Größe nach aufgetrennt. Dazu werden je 10 µg RNA mit dem 2 bis 2,5-fachen Volumen Denaturierungspuffer und 2 µl Ethidiumbromid versetzt und 10 min bei 60 °C denaturiert. Nachfolgend wird die Probe sofort 5 min auf Eis gestellt und dann 2 µl Farbpuffer hinzugegeben.
Für ein 1 %iges Agarosegel (100 ml) erhitzt man 1 g Agarose in 87 ml Wasser bis die Agarose vollständig gelöst ist. Nachdem sich das Gel etwas abgekühlt hat, gibt man unter dem Abzug 10 ml 10 x MOPS und 5 ml 37 %iger Formaldehyd hinzu, mischt und gießt dann sofort das Gel. Als Laufpuffer wird 1 x MOPS verwendet. Die RNA-Proben werden in die Taschen pipettiert und dann die Elektrophorese bei 60-180 V gestartet. Wenn die Elektrophorese beendet ist, wird das Gel unter UV-Licht fotografiert. Dabei wird die RNA durch das eingelagerte Ethidiumbromid sichtbar und die gleichmäßige Beladung des Gels kann überprüft werden.
10 x MOPS: 0,2 M MOPS (3-Morpholino-1-propansulfonsäure), 0,05 M Natriumacetat,
0,01 M Di-Natrium-EDTA, pH 7,0 mit NaOH einstellen, steril filtrieren und in autoklavierte dunkle Flasche füllen.
6 x RNA-Farbpuffer: 300 µl H2O, 500 µl Glycerin, 100 µl 2,5 %iges Bromphenolblau, 100 µl 2,5 %iges Xylencyanol, 2 µl 0,5 M EDTA, pH 8,0.
Denaturierungspuffer: 750 µl Formamid, 150 µl 10 x MOPS, 250 µl Formaldehyd, 100 µl
bidest. H2O
Ethidiumbromid: 0,5 mg/ml
RNA-Transfer
Vor dem Blotten wird das Gel zweimal mindestens 15 Minuten mit 10 x SSC gewaschen. Dadurch wird das Formaldehyd entfernt und der MOPS-Laufpuffer im Gel gegen den SSC-Transferpuffer ausgetauscht.
Das Gel wird über Nacht mit 10 x SSC im Kopfüber-Verfahren, d.h. von oben nach unten geblottet. Beim Blotten wird die RNA vom Gel auf eine Nylonmembran (Hybond N, Amersham) übertragen. Die SSC-Lösung wird durch das Gel und die Nylon-Membran in einen Papierstapel gesogen. Dabei wandert die RNA mit und bleibt auf der Membran haften. Der Farbpuffer und das Ethidiumbromid werden mit übertragen, so dass man nach dem Blotten die 18- und die 28S-rRNA-Banden als Größenmarker auf der Membran mit Bleistift markieren kann. Zum Schluß wird die RNA mit UV-Licht kovalent an die Membran gebunden (Cross-Link, UV-Stratalinker, Stratagene). Der Blot wird in Folie eingeschlagen und bis zur Hybridisierung im Kühlschrank aufbewahrt.
20 x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0 mit HCl einstellen und autoklavieren.
Herstellung der DNA-Sonden
Für die Hybridisierung der Northern-Blots wurden cDNA-Sonden verwendet, die mit α-[32P]-dCTP (ICN) radioaktiv markiert waren. Die Sonden wurden ausgehend von einem DNA-Template der gewünschten Sequenz nach der Random-Priming-Methode unter Ver-wendung des „rediprime DNA labelling system“ (Amersham) hergestellt. Im Anschluß an die Synthese wurde die Sonde über eine Molekularsiebsäule (NucTrap Probe Purification Columns, Stratagene) von den freien dNTPs getrennt (erfolgte nach Angaben des Herstellers). Um zu bestimmen, ob die Synthese der Sonde erfolgreich war, wurden 2 µl der Sonde in 3 ml Rothiszint® eco plus (Roth) im Szintillationszähler (Beckman LS6500) gemessen. Es wurden drei verschiedene Sonden verwendet:
Tabelle 1: cDNA-Sonden
Sonde Beschreibung Größe Hybridisierungstemperatur
phodUCP3 (11/14) UCP3 von Phodopus sungorus 584 bp 64 °C phodUCP3 (38/14) UCP3 von Phodopus sungorus 826 bp 64 °C
Hybridisierung der Northern-Blots
Die Hybridisierung von Northern-Blots wird in Hybridisierungsröhren in einem Drehofen (Hybaid) durchgeführt. Vor der Hybridisierung werden die Blots zweimal kurz in bidestilliertem Wasser gewaschen, und dann in Hybridisierungsröhren für mindestens eine Stunde mit Hybridisierungslösung prä-hybridisiert. Die Hybridisierungstemperatur, bei der außer der Hybridisierung auch die Prähybridisierung und das Waschen der Blots nach der Hybridisierung durchgeführt werden, ist von der Sequenz der verwendeten Sonde abhängig (Tabelle 1, S. 16).
Vor der Hybridisierung wird die Sonde 10 min bei 100 °C denaturiert, anschließend auf Eis abgekühlt und dann direkt in die Hybridisierungsröhre gegeben. Die Hybridisierung benötigt mindestens 18 Stunden.
Nach der Hybridisierung werden die Blots gewaschen, um überschüssige und unspezifisch gebundene Sonden zu entfernen. Gewaschen wird zweimal 15 min bei Raumtemperatur mit Waschlösung I und zweimal 15 min bei Hybridisierungstemperatur mit Waschlösung II. Zum Schluss werden die Blots in Folie eingeschlagen und bis zur Weiterverwendung im Kühlschrank aufbewahrt.
Hybridisierungslösung: 125 ml 0,5 M Na2PO4/NaH2PO4 (pH 7,0), 0,5 ml 0,5 M EDTA, 87,5 ml 20 %iges SDS, 2,5 g BSA, mit bidest. H2O auf 250 ml auffüllen, unter Rühren und mäßigem Erhitzen auflösen.
Waschlösung I: 2 x SSC; 0,1 % SDS.
Waschlösung II: 0,1 x SSC; 0,1 % SDS .
Detektion der markierten DNA
Für die Detektion der radioaktiv markierten cDNA-Sonde auf der Membran wurden zwei verschiedene Methoden eingesetzt. In beiden Fällen wird auf die Blots ein Film aufgelegt, der die Radioaktivität detektiert.
Für die Autoradiografie werden Fotokassetten mit Verstärkerfolien und Kodak X-QMAT AR-Film verwendet. Auf die radioaktiv markierten Blots wird unter Rotlicht Röntgenfilm aufgelegt und die Geltaschen, 18S- und 28S-Banden auf dem Film eingezeichnet. Die Exposition erfolgt in der Filmkassette bei -70 °C.
Alternativ wurde, wenn die Signale sehr schwach waren, anstelle eines Films ein
Phosphorscreen (Molekular Dynamics) aufgelegt. Die Exposition in einer Fotokassette bei
Raumtemperatur dauert nur ein bis zwei Tage. Der Phosphorscreen wird in einem speziellen Scanner (Storm 860, Molecular Dynamics) mit einem Laserstrahl eingelesen.
Dehybridisierung der Blots
Wenn ein Blot mehrmals nacheinander mit verschiedenen Sonden hybridisiert wurde, wurde vor der nächsten Hybridisierung die vorherige Sonde von dem Blot abgewaschen. Zur Dehybridisierung wird Dehybridisierungslösung (0,1 x SSC, 0,5 % SDS) zum Kochen gebracht und auf die Blots gegossen. Dann wird mindestens eine halbe Stunde bei Hybridisierungstemperatur gewaschen. Dieser Vorgang wird ein- bis zweimal wiederholt. Zwischen den Waschgängen werden die Blots mit einem Geigerzähler auf verbliebene Radioaktivität überprüft.
2.2.3 Genotypisierung: DNA-Sequenzierung
Das UCP3-Gen trägt an den Positionen -1797 und -614 vor dem Startcodon im ersten Intron zwei Punktmutationen, die durch Restriktionsverdau oder Sequenzierung nachgewiesen werden können (Abb. 4). Mittlerweile konnte SNP1 (SNP, single-nucleotide polymorphism) als die phänotypisch relevante Mutation identifiziert werden (mündl. Mitteilung T. Fromme).
Phänotyp Genotyp SNP1 SNP2 Allel
————A————G———— 1
Mutante mut / mut
————A————G———— 2 ————G————A———— 1 Wildtyp mut / wt ————A————G———— 2 ————G————A———— 1 Wildtyp wt / wt ————G————A———— 2 Position bezgl. Startcodon: -1797 -614
Abb. 4: Zuordnung der Punktmutationen SNP1 und SNP2 zum Genotyp und Phänotyp der
Dsungarischen Zwerghamster in der Marburger Zucht; wt=Wildtyp, mut=Mutante.
Die Genotypisierungen wurden größtenteils von Tobias Fromme am Institut für molekulare Biotechnologie in Jena (IMB) durchgeführt.
DNA-Isolation
Die DNA wurde aus etwa 10 mg Milz, BAT oder Skelettmuskel mit dem „QIAamp DNA Mini Kit“ (QIAGEN) nach Anleitung des Herstellers (tissue protokoll, www1.quiagen.com) isoliert. Alternativ wurde die DNA nach folgendem Protoll isoliert:
Auf etwa ein sechstel Milz werden 100 µl Proteinase K (0,5 mg/ml) gegeben und über Nacht bei 55 °C inkubiert. Am nächsten Tag werden nacheinander 300 µl Wasser, 350 µl Chloroform / Isoamylalkohol (24:1) und 350 µl neutrales Phenol hinzugegeben. Es wird durch Invertieren gemischt und 30 min bei RT auf einem Schüttler inkubiert. Nach einer Zentrifugation von 10 min mit 10000 g bei RT wird die obere Phase in ein neues Cup überführt. Es werden 40 µl 10 M Ammoniumacetat und 1 ml 100 %iges Ethanol hinzu-gegeben und 30 min bei RT gefällt. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 12000 g wird dekantiert und das Zentrifugat mit 1 ml 70 %igem Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation (10 min, 12000g, RT) wird dekantiert, das Pellet getrocknet und dann in 40 µl EB-Puffer gelöst, indem es 15 min bei 60 °C inkubiert wird.
Proteinase K (ICN): 0,5 mg/ml in NTES-Puffer.
NTES-Puffer: 50 mM Tris-Cl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,025 % SDS, pH 8,0. EB-Puffer (Quiagen): 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Mit Hilfe von zwei aufeinanderfolgenden PCRs wurde der DNA-Abschnitt, in dem die Punktmutationen liegen, amplifiziert. Die PCRs wurden mit den PuRe Taq Ready-To-Go™ PCR-Beads nach Anleitung des Herstellers durchgeführt (Amersham Biosciences).
Das Produkt der ersten PCR umfasst 1743 bp und beinhaltet einen großen Teil des ersten Introns mit beiden Punktmutationen.
forward-Primer: CAA GTC ACC CAG CAG CCT A
reverse-Primer: TAT TCC AGA TAG ATG CCG CC Programm:
Denaturierung 120 s 95 °C;
36 Zyklen: 30 s 95 °C Denaturierung, 30 s 55 °C Annealing,
105 s 72 °C Verlängerung; finale DNA-Synthese 10 min 72 °C.
Ausgehend vom Produkt der ersten PCR werden mit einer zweiten, inneren PCR zwei kurze Abschnitte, die je ein SNP enthalten, amplifiziert.
PCR-Primer für das SNP1-Fragment (248 bp):
forward-Primer CAG TAC CTC CTG CTG GGA AG
reverse-Primer AGT CAG ACC TTG GCT CTC CA PCR-Primer für das SNP2-Fragment (188 bp):
forward-Primer: TTT ATT CCA CCA AGC CAA GC
Programm für beide PCRs:
Denaturierung 120 s 95 °C;
36 Zyklen: 30 s 95 °C Denaturierung, 30 s 52 °C Annealing,
30 s 72 °C Verlängerung; finale DNA-Synthese 10 min 72 °C.
Bei dieser inneren PCR ist der jeweilige reverse-Primer biotinyliert. Für die folgende Pyrosequenzierung wird der biotinylierte Einzelstrang aus der PCR abgeschmolzen und über Avidin an einer Matrix verankert (96-Well-Platte).
Pyrosequenzierung
Die Pyrosequenzierung ist eine Methode zur genauen Sequenzierung kurzer DNA-Fragmente (PSQ™HS 96A System, Biotage, www.pyrosequencing.com). Im Prinzip wird die DNA synthetisiert und dabei gleichzeitig sequenziert.
Sequenziert wird mit zwei weiteren Primern:
für SNP1: TGA ATA AGT GTT TTC TTA AC für SNP2: ACC TGT AGG TGG GTC TC
Wie bei der PCR bindet der Primer an den Einzelstrang und wird mit Klenow-Fragment, Apyrase, ATP-Sulfurylase und Luciferase als Enzyme und Luciferin und sulfuryliertes AMP als Substrate inkubiert. Dann werden nacheinander in einer festgelegten Reihenfolge dNTPs dazugegeben. Ist das dNTP komplementär zur DNA, so wird es eingebaut und dabei Pyro-phosphat abgespalten. Die ATP-Sulfurylase tauscht dieses Pyrophosphat gegen den Schwefel am sulfurylierten AMP, es entsteht ATP. Mit ATP kann die Luciferase Luciferin in Oxyluciferin umwandeln. Dabei entsteht Licht welches proportional zur Menge der einge-bauten dNTPs ist. Wird das Nukleotid nicht eingebaut, passiert nichts. Überschüssige und nicht eingebaute Nukleotide werden durch Apyrase abgebaut, welche Nukleotide in etwas kürzerer Zeit zerlegt, als Klenow zum Einbau braucht.
2.3 Messungen an ganzen Tieren
2.3.1 KörpergewichtDie Körpergewichtsentwicklung von Hamstern während des Wachstums wurde verfolgt, indem juvenile Wildtyp- und Mutantenhamster gewogen wurden. Um das Alter der Tiere exakt bestimmen zu können, wurde jeden Tag kontrolliert, ob die Zuchtpaare Nachwuchs hatten. Die Hamster wurden im Alter von drei Wochen abgesetzt. Nach dem Vereinzeln der Hamster im Alter von vier Wochen bis zum Alter von 16 Wochen wurde das Körpergewicht in wöchentlichen Abständen bestimmt.
2.3.2 Körperlänge
Parallel zur Körpergewichtsmessung wurde bei einigen Mutanten- und Wildtyphamstern im Alter von 16 Wochen die Körperlänge bestimmt. Dazu wurden die Tiere durch Inhalation von etwas Halothan (Fluothan®, Zeneca) betäubt. Auf dem Rücken liegend wurde mit einem Lineal der Abstand zwischen Nasenspitze und After gemessen.
2.3.3 Körperzusammensetzung
Die Körperzusammensetzung wurde zum einen bei sechs Monate alten Mutanten- und Wildtyphamstern mittels der nicht invasiven Röntgenabsorptionsmessung gemessen. Zum anderen wurde die Körperzusammensetzung bei 13 Monate alten Hamstern durch Trocknen und Fettextraktion bestimmt.
Bestimmung der Körperzusammensetzung mittels Röntgenabsorptionsmessung
Die Körperzusammensetzung von einem halben Jahr alten Mutanten- und Wildtyphamstern (LT, 23 °C) wurde mittels der Dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA) bestimmt. Diese Technik erlaubt eine schnelle, nicht-invasive Bestimmung der Knochendichte (BMD, bone
mineral density), des Knochenmineralgehaltes (BMC, bone mineral content), der Fettmasse
und der knochen- und fettfreien Gewebemasse.
Zur Messung der Körperzusammensetzung wurden die Tiere auf dem Scanner des PIXImus2 (GE Lunar) positioniert. Um völlige Bewegungslosigkeit während der Aufnahme zu gewährleisten wurden die Hamster kurz durch Inhalation von Halothan (Fluothan®, Zeneca) betäubt und anschließend mit intraperitoneal injiziertem Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg Körpergewicht, Ketavet, Pharmacia und Upjohn GmbH) für wenige Minuten narkotisiert.
Abb. 5: Beispiel einer Röntgenabsorptionsmessung: auf dem Monitor erscheint das
Röntgenbild des Hamsters, das Programm grenzt automatisch Körper- und Knochenumrisse ab und berechnet die Körperzusammensetzung. Der Schädel ist von der Berechnung ausgenommen.
Das Prinzip der Messung beruht auf der verschieden starken Absorption der Röntgenstrahlen, die sich durch die Dicke, die Dichte und die chemische Zusammensetzung der geröntgten Tiere ergibt (Nagy, 2001). Das PIXImus2 röntgt den Hamster bei zwei Energiestufen (40 und 70 keV) und erzeugt dabei ein Bild, in welchem die verschiedenen Absorptionseigenschaften der Gewebe eine optische Unterscheidung ermöglichen (Abb. 5). Der Schädel des Tieres wird von der Messung ausgenommen. Ein densitometrisches Ver-fahren bestimmt die Gewebetypen und deren prozentualen Anteil am Körper.
Bestimmung der Körperzusammensetzung durch Trocknen und Fettextraktion
Die Körperzusammensetzung wurde von 13 Monate alten Mutanten- und Wildtyphamstern beiderlei Geschlechts aus dem Langtag bei 23 °C bestimmt (Reynolds und Kunz, 2001). Die Tiere wurden getötet (Kapitel 2.2.1, S. 13) und zur späteren Phäno- und Genotypisierung Milz und etwa ein halbes suprasternales BAT-Depot (200-250 mg) entnommen, gewogen und eingefroren. Diese Gewebeproben, sowie 0,5 bis 1 ml Blut, fehlen bei der Messung.
r, wurden die Proben ein weiteres Mal extrahiert und die Gewichts-differenz bestimmt.
Außerdem wurde der Gastrointestinaltrakt (GIT) einschließlich der Bauchspeicheldrüse entfernt, sowie Blase und Backentaschen geleert, um bei der anschließenden Bestimmung der Körperzusammensetzung durch unterschiedliche Füllung bedingte Modifikationen zu vermeiden.
Dann werden die Kadaver gewogen, in saugfähiges Krepppapier verpackt, wieder gewogen und bis zur Gewichtskonstanz bei 50-60 °C im Heizschrank getrocknet. Während das Wasser verdunstet, wird das austretende Fett vom Krepppapier aufgenommen. Der Wasser-gehalt der Hamster ergibt sich aus der Gewichtsdifferenz vor und nach dem Trocknen (= Trockenmasse). Bis zur Fettextraktion wurden die Kadaver eingefroren und vor der Extraktion im Heizschrank kurz aufgetaut.
Der Fettgehalt wird durch Extraktion des Körperfetts aus den getrockneten Kadavern mittels Chloroform (Handschuhe, Abzug!) bestimmt. Das Chloroform wird im Rundkolben zum Sieden gebracht (ca. 62°C), der Dampf steigt auf, kondensiert im Rückflusskühler und tropft herunter in den Soxhlet-Extraktor auf die darin befindlichen zwei bis vier Proben (Abb. 6). Das Körperfett wird ausgewaschen und mit dem jetzt dunkel gefärbten Chloroform über das Heberrohr zurück in den Rundkolben geführt. Die Extraktion beginnt von neuem, wobei aufgrund der Siedepunktdifferenz nur Chloroform verdampft, während sich das Fett im Rundkolben ansammelt. Diese Prozedur wird so lange durchgeführt, bis das Chloroformextrakt klar ist. Nach dem Abkühlen der Anlage werden die Tiere herausgenommen und erst unter dem Abzug, dann im Trockenschrank ca. drei Tage bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Abb. 6: Soxhlet-Extraktionsapparat (Quelle).
Der Fettgehalt ergibt sich aus der Differenz zwischen der Trockenmasse und der nach der Extraktion übrig bleibenden fettfreien Trockenmasse. Zur Kontrolle, ob das Fett vollständig extrahiert worden wa
2.3.4 Futteraufnahme
Die Futteraufnahme wurde von Mutanten- und Wildtyphamstern im Alter von 8,5 bis 10 Monaten bestimmt. Bereits vor der Messung bekamen die Hamster seit mindesten zwei Wochen ausschließlich Trockenfutter. Zu Beginn der Messung wurden alle Raufen mit etwa derselben Menge Futter befüllt. Das Futter war vorher mindestens eine Woche in dem Raum, in dem es gemessen wurde, gelagert und gut gemischt worden, da sich mit der Luftfeuchtig-keit des Raumes der Wassergehalt und damit das Futtergewicht ändert.
Zwei Wochen lang wurden alle zwei bis drei Tage die gefüllten Raufen zur selben Tageszeit gewogen und aus der Differenz das verbrauchte Futter berechnet. Bei großen Abweichungen vom erwarteten Wert wurde die Streu nach Futterresten durchsucht. Während der gesamten Zeit wurde parallel das Körpergewicht kontrolliert. Um den Einfluss schwankender Luft-feuchtigkeit auf das Futtergewicht zu überprüfen, wurden parallel zur Messung Dummys (Futterraufen mit vergleichbarer Futtermenge) gewogen. Die Gewichtsschwankungen waren vernachlässigbar.
2.4 Primärzellkultur
In Zellkultur wurde überprüft, ob das UCP3-Defizit im braunen Fettgewebe der Mutanten zellintern zum Ausdruck oder von zellexternen Faktoren abhängig ist. Dazu war es zunächst notwendig, herauszufinden unter welchen Kulturbedingungen isolierte braune Adipozyten zur Expression von UCP3 stimuliert werden können. Deshalb wurde in einem ersten Experiment eine BAT-Primärzellkultur von Wildtyphamstern mit Reagenzien in unter-schiedlichen Konzentrationen und Kombinationen behandelt. In einem weiteren Experiment wurden Primärzellkulturen ausgehend vom BAT von Mutanten und Wildtypen angelegt und mit den entsprechenden Substanzen behandelt.
2.4.1 Anlegen einer Primärzellkultur aus braunen Adipozyten
Das Anlegen der Primärzellkultur beruht auf der Isolation von Präadipozyten (undiffe-renzierten Fettzellvorläuferzellen) aus der stromal-vaskulären Fraktion des braunen Fettgewebes. Die Zellen differenzieren in einem nährstoffreichen Medium zu Adipozyten. Da die Phänotypen der Hamster zu Beginn der Experimente unbekannt waren, mussten die Adipozyten jedes einzelnen Tieres getrennt isoliert werden. Deshalb wurde für jedes Tier ein eigenes Präparationsbesteck, Trichter mit Gaze, Petrischalen etc. benutzt. Alle zur Kultur verwendeten Geräte waren autoklaviert oder heißluftsterilisiert. Die Arbeiten wurden soweit wie möglich unter dem Sterilabzug (Clean-Air) durchgeführt.
Die Zellkultur wurde nach einem Protokoll von Susanne Klaus (Klaus, 1991) angelegt. Juvenile 6-8 Wochen alte Dsungarische Zwerghamster werden mit CO2 getötet und das braune Fettgewebe (suprasternales, axilliares, dorso-cervicales, subscapulares und inter-scapulares BAT-Depot) unter dem Sterilabzug entnommen. Ein Stück des braunen Fettgewebes wird zur späteren Phänotypisierung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Aus dem restlichen BAT werden Präadipozyten isoliert. Das BAT wird in Petrischalen mit vorgewärmtem DMEM/F12-Medium gegeben, gewogen, möglichst klein geschnitten und dann in Röhrchen mit vorgewärmtem Kollagenasepuffer überführt. Das Gewebe wird etwa 30 Minuten bei 37 °C verdaut, wobei die Röhrchen alle 5 Minuten kräftig geschüttelt werden (Vortexer).
Nach dem Verdau wird die Suspension durch Nylongaze (250 µm) filtriert und dann einige Minuten stehen gelassen, damit sich das Fett oben absetzen kann. Nachdem mit einer 10 ml-Glaspipette das Fett abgenommen wurde, wird die Zellsuspension durch Gaze (60 µm) filtriert. Anschließend wird die Zellsuspension 10 min mit 800 g bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen. Um das Pellet zu waschen, wird es mit einer Glaspipette in 10 ml Medium homogenisiert, dann auf 40 ml aufgefüllt und 5 min mit 800 g
bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Zentrifugat in 10 ml 10 % FCS-haltigem DMEM/F12-Medium resuspendiert. Schließlich wird mit Medium auf das erwünschte Volumen aufgefüllt (35 ml pro Gramm anfänglich eingesetzten BAT-Gewebes), die Zellen werden auf Petrischalen verteilt (7 ml d.h. 0,2 g BAT / Platte, 10 cm ∅) und in den Inkubator gestellt (Forma Scientific, 37 °C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit).
2.4.2 Verlauf der Zellkultur
Allen Zellkulturen liegt der gleiche Zeitverlauf zugrunde. Nach der Aussaat an Tag 0 wird das Medium an Tag 1, 3, 6, 9, 12 und 15 gewechselt; ab dem dritten Tag werden 17 nM Insulin und 1 nM T3 (Trijodthyronin) hinzugefügt und der FCS-Gehalt von anfänglichen 10 % auf 7 % FCS gesenkt. Während des Kulturverlaufs werden die Zellen regelmäßig mikroskopisch auf Proliferation und Differenzierung überprüft und anhand der Zellentwicklung der Zeitpunkt zur Behandlung bestimmt.
Für die Experimente wurden Reagenzien gewählt, die auf die Genexpression der Zellen über PPARs (peroxisome proliferator- activated receptors) wirken. PPARs sind Trankriptions-faktoren. Werden sie aktiviert, binden sie an spezifischen Stellen der DNA und regulieren verschiedene Gene der Fettzelldifferenzierung (Smith, 2002a). Eingesetzt wurden:
o Troglitazon ((±)-5-[4-[(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl)methoxy]benzyl]-2,4-thiazolidindion), ein künstlicher PPARγ-Ligand, ist ein Thiazolidindion und ein Medikament aus der Diabetesforschung, das die Insulinempfindlichkeit von Zellen erhöht (Day, 1999).
o ETYA (3-,5-Eicosatetranoylarachidonat) ist ein natürliches Arachidonsäurederivat und wirkt auf PPARα (Tobias und Hamilton, 1979).
o Wy14643, (4-chloro-6-(2,3-xylidine)-(pyrimidinylthio)-essigsäure wirkt auf PPARα (Santilli et al., 1974).
Experiment 1:
In der ersten Zellkultur wurde BAT von drei Langtaghamstern vereinigt. Am 15. Tag wurde für 24 Stunden behandelt und dann geerntet. Behandelt wurde je eine Platte mit:
1 µM ETYA, 10 µM ETYA, 1 µM Troglitazon, 10 µM Wy14643, 100 µM Wy14643, 10 µM Wy14643 & 1 µM ETYA, 10 µM Wy14643 & 1 µM Troglitazon, als Kontrollen 7 µl und 50 µl DMSO (Dimethylsulfoxid).
