Primärzellkultur

Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war nicht bekannt, ob die Mutation das UCP3-Gen selbst (cis) oder ein anderes Gen (trans) oder sogar mehrere Gene betrifft. Nur der resultierende Phänotyp der Mutation, also das Fehlen der UCP3-mRNA im braunen Fettgewebe, konnte zur Identifikation der Mutanten genutzt werden. Mittels der Zellkultur wurde überprüft, ob das Fehlen von UCP3 in Zellkultur unabhängig von äußeren Faktoren erhalten bleibt.

Zunächst wurde in einer BAT-Primärkultur von Wildtyphamsterzellen untersucht, welche Behandlung zu einer hohen Expression von UCP3 führen. Dazu wurde die Wirkung verschiedener Reagenzien getestet und die effektivsten anschließend auf Mutanten- und Wildtypzellkultur im Vergleich angewandt.

4.3.1 Die Steuerung des UCP3-Gens über PPARs

Die Northern-Blot-Analyse der Wildtypzellkultur ergab, dass ETYA, Troglitazon, Wy14643 und eine Kombination aus Wy14643 und Troglitazon unterschiedlich starke Effekte auf die UCP3-mRNA-Expression brauner Adipozyten haben (Abb. 22).

Troglitazon, ETYA und Wy14643 sind künstliche Aktivatoren von PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors), einer Familie von Kernrezeptoren, für die der Promoter des UCP3-Gens mehrere Bindestellen (PPREs) besitzt (Acin et al., 1999). ETYA und Wy14643 wirken hauptsächlich auf PPARα und Troglitazon auf PPARγ, wobei angenommen wird, dass alle drei Substanzen anstelle der natürlichen Liganden an die PPARs binden (Santilli et al., 1974; Tobias und Hamilton, 1979; Day, 1999). PPARs aktivieren als Homodimere oder in Kombination mit RXRα (retinoic X receptor α) verschiedene Gene. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann gefolgert werden, dass die UCP3-mRNA-Expression in braunen Adipozyten sowohl über PPARα, als auch verstärkt über PPARγ reguliert werden kann.

Der Ausgangspunkt für die Wahl der künstlichen Aktivatoren der PPARs als potentielle UCP3-Stimulatoren war, dass diese eine Zunahme der UCP1-mRNA-Expression in Hamster- und Rattenzellkultur bewirken (Schneider, 1998; Teruel et al., 1999). Ihre Fähigkeit zur Induktion von UCP3 zeigt sich auch in Primärzellkultur fötaler BAT-Zellen von Ratten, in denen sich die UCP3-Expression durch den PPARγ-Aktivator Rosiglitazon⁴ oder Wy14643 erhöhen läßt. Eine Kombination von beiden führt zu einer synergistischen Steigerung (Teruel et al., 2000). Auch durch orale Verabreichung von Pioglitazon¹ läßt sich die UCP3-mRNA-Expression im BAT erhöhen (Matsuda et al., 1998).

4 Gehört wie Troglitazon zu den Thiazolidindionen

Die Steuerung der Aktivität des UCP3-Gens im braunen Fettgewebe ist weitestgehend unbekannt. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte Aktivierung über PPARγ (Abb. 22) konnte durch Transfektion des Hamster-UCP3-Gens in HEK-Zellen bestätigt werden, dabei bildet PPARγ ein Heterodimer mit RXRα (Fromme, 2003). Über PPARα liegen diesbezüglich keine Befunde vor, aber es konnten zwei potentielle Cofaktoren der UCP3-Genregulation, COUP-TF1 (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 1) und PGC1 (PPARγ coactivator 1) identifiziert werden. Im Unterschied zur UCP3-mRNA-Expression im braunen Fettgewebe, werden in der Skelettmuskulatur nicht PPARα oder PPARγ, sondern PPARα und PPARδ zur Induktion der Genexpression benötigt (Son et al., 2001; Solanes et al., 2003). Experimente zur Regulation der UCP3-Expression in einer Skelettmuskelzelllinie führten zur Erstellung eines Modells, demzufolge PPARα, PPARδ oder Thyroxin zusammen mit RXRα die UCP3-Genregulation über ein DR1/TRE1-Element im Promoter vermitteln. Die Promoteraktivität wird von MyoD über eine E-Box kontrolliert (Solanes et al., 2003; Solanes et al., 2005). Dieser Steuerungsmechanismus ist aber nicht von Muskelzellen auf braune Fettzellen übertragbar, da MyoD nur muskelspezifisch aktiv ist (Weintraub et al., 1991).

Die Existenz mehrerer Möglichkeiten, die UCP3-Genexpression zu steuern, zeigt auf, wie diese in zwei verschiedenen Geweben unabhängig voneinander reguliert werden kann, und ermöglicht im braunen Fettgewebe und in der Skelettmuskulatur eine voneinander unabhängige Genexpressionssteuerung. Als Transkriptionsfaktoren regulieren PPARγ und PPARα Gene des Fettstoffwechsels; eine ähnliche Funktion wird für PPARδ diskutiert (Willson et al., 2000; Chawla et al., 2001; Smith, 2002b). PPARα wird vor allem in Geweben mit erhöhter β-Oxidation gebildet, steuert die Trankription der daran beteiligten Proteine (z.B. FATP fatty acid transport protein) und blockiert die de novo Fettsäuresynthese (van Raalte et al., 2004). Während PPARα so eher die Fettmobilisierung unterstützt, fördert PPARγ die Fettspeicherung durch eine erhöhte Adipozyten-differenzierung und die Tanskription lipogener Proteine wie zum Beispiel LPL (Lipoproteinlipase) (Auwerx, 1999; Chawla et al., 2001). Die Aktivierung des UCP3-Gens über Transkriptionsfaktoren, die den Fettstoffwechsel regulieren, lassen auf eine Funktion von UCP3 im Fettstoffwechsel schließen.

4.3.2 Vergleich der UCP3-mRNA-Expression in Zellkultur und Gewebe

Bei der Betrachtung der mRNA-Signale auf dem Northern-Blot fällt auf, dass sowohl die Expression der UCP3- als auch die der PPARγ−mRNA in Zellkultur um einiges schwächer ist als im Gewebe (Abb. 22, Abb. 24). Zellen können außerhalb des Zellverbandes im Medium nicht genauso versorgt werden wie im Körper. Insofern ist ein Unterschied zwischen in vitro und in vivo in einem gewissen Maße zu erwarten, aber hier ist die Differenz besonders groß.

Voraussetzung für die Bildung von UCP1 und UCP3 in braunen Fettzellen ist, dass diese voll ausgereift sind (Prunet-Marcassus et al., 1999; Klaus, 1991; Carmona et al., 1998). Die Zellen in den Zellkulturen der vorliegenden Arbeit entwickelten sich im Vergleich zu bisherigen Hamster-Primärzellkulturen, deren braune Adipozyten nach zwölf Tagen ausdifferenziert waren, langsamer (Klaus, 1991). Vermutlich ist diese Verzögerung auf die Zusammensetzung des Mediums zurückzuführen. Insbesondere die Zusammensetzung des fötalen Kälberserums (FCS), welches u.a. Wachstumsfaktoren enthält, könnte eine Rolle spielen. Verschiedene Chargen FCS wirken sich auf die Proliferation und die Differenzie-rung unterschiedlich aus (Suryawan und Hu, 1993; Schneider, 1998). Bis zu Beginn der Stimulation der Zellen mit PPAR-Liganden waren aber schließlich 70-80% der Zellen ausdifferenziert. Dennoch kann die UCP3-mRNA-Expression direkt durch einige Bestand-teile des FCS beeinflußt worden sein, denn ohne Verwendung von FCS im Medium ist keine UCP3-mRNA in den Zellen nachweisbar (Teruel et al., 2000).

Die optimalen Bedingungen, die zu einer hohen UCP3-Expression in Zellkultur führen, sind bisher nicht untersucht worden. Die Zellkultur in der vorliegenden Arbeit wurde unter Bedingungen durchgeführt, die für die Expression von UCP1 optimiert worden waren, in der Annahme, dass die Zellen zur UCP3-Expression ähnliche Bedingungen benötigen, vor allem bestimmte Konzentrationen an Insulin und Thyroxin (Klaus, 1991; Klaus et al., 1991). Diese Bedingungen waren für die hier durchgeführten Experimente hinreichend, könnten aber durch gezielte Veränderungen sicher noch zu einer Steigerung der UCP3-mRNA Expression führen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivierung der UCP3-mRNA-Expression über PPARγ und PPARα untersucht, wofür eine ausreichende, endogene Konzentration dieser Transkriptionsfaktoren eine Vorraussetzung ist. Der niedrige PPARγ-mRNA-Level legt eine geringe PPARγ-Proteinkonzentration als Ursache für die niedrige UCP3-Expression nahe (Abb. 24). Im Vergleich dazu konnte in BAT-Primärzellkultur ausgehend von Mäusen eine ebenso hohe PPARγ-mRNA-Konzentration wie im Gewebe gemessen werden (Valmaseda et

al., 1999). Hier kommen vermutlich sowohl ein Zelkulturmedien- als auch ein Speziesunterschied zum Tragen. Das von Valmaseda für die Mauszellen verwendete Medium unterscheidet sich nur geringfügig von dem für die Hamsterzellkultur. Die Insulinkonzentration ist etwas höher (20 statt 17 nM) und Insulin kann die Aktivität von PPARα unabhängig von Liganden über Phosphorylierung steuern (Shalev et al., 1996).

Auch die PPARγ-mRNA-Menge in Hamster-BAT-Zellkultur wird von Insulin beeinflusst (Schneider, 1998), allerdings geschieht dies erst bei einer Vervielfachung der Konzentration.

Die Konzentrationsdifferenz von 3 nM ist wahrscheinlich zu gering, um sich experimentell auszuwirken. Eine größere Auswirkung dürfte die Verwendung von Hamster- statt Maus-zellen haben. So konnten in Hamsterzellkultur - im Unterschied zur Mauszellkultur - vergleichbar hohe PPARγ-mRNA-Mengen in Zellkultur nur nach Inkubation mit dem β-adrenergem Agonisten Isoproterenol gemessen werden (Boeuf et al., 2001).

4.3.3 Braune Adipozyten der Mutanten in Zellkultur

Um beobachten zu können, wie sich braune Adipozyten der Mutanten in Zellkultur unabhängig von systemischen Einflüssen entwickeln, wurde Primärzellkultur ausgehend vom braunen Fettgewebe der Mutanten angelegt. Da der Genotyp der Hamster beim Anlegen der Zellkultur unbekannt war, konnten die isolierten Zellen von einzelnen Hamstern für die Zellkultur nicht zusammengeführt und gemeinsam ausgesät werden. Stattdessen wurde von jedem Hamster getrennt eine Kultur angelegt werden, was die Anzahl der Zellkulturplatten pro Genotyp verringerte.

Die Zellkultur ausgehend von Mutanten-BAT entwickelte sich hinsichtlich Zell-, Fett-vakuolen-, Mitochondriengröße und -dichte ebenso gut, wie die ausgehend von Wildtyp-BAT (Abb. 23). Die Morphologie und die Entwicklung der Zellen gaben keinen Hinweis darauf, dass die braunen Adipozyten trotz fehlenden UCP3s nicht voll funktionsfähig waren.

Auch erste elektronenmikroskopische Aufnahmen vom braunen Fettgewebe der Mutanten zeigten keine Auffälligkeiten, ein direkter Vergleich mit Wildtyphamstergewebe steht aber noch aus (Abb. 25, Abb. 26). Offenbar hat keine UCP3 keine lebenswichtige oder Entwicklungsfördernde Funktion.

Die ausdifferenzierten Zellen wurden für 24 Stunden mit den PPARγ- und -α-Liganden Troglitazon und Wy14643 inkubiert. Auch nach dieser Behandlung war kein morphologischer Unterschied zwischen Wildtyp- und Mutantenkulturen zu sehen (Abb. 23).

Die anschließende Northern-Blot-Analyse der Zellen zeigte, dass in den Mutantenzellen im Gegensatz zu den Wildtypzellen keine mRNA vorhanden war (Abb. 24). Das UCP3-Defizit im braunen Fettgewebe der Mutantenhamster wurde also in isolierten braunen Adipozyten in Zellkultur aufrechterhalten. Damit ist gezeigt, dass der Phänotyp der

UCP3-Mutation nicht durch extrazelluläre Faktoren bewirkt wird, sondern unabhängig von systemischen Einflüssen wie zum Beispiel Hormonen besteht.

Dass die braunen Adipozyten der Mutanten trotz Stimulation kein UCP3 bilden, stimmt gut mit vorhergehenden Beobachtungen überein, denen zufolge die Mutanten weder durch Kälteexposition noch durch Hungern zur UCP3-Expression im braunen Fettgewebe angeregt werden konnten (von Praun, 1999; Liebig et al., 2004). Dennoch war dieser Befund nicht unbedingt zu erwarten, da auch die UCP3-Expression in der Skelettmuskulatur beeinträchtigt ist (von Praun, 1999; Liebig et al., 2004). Deshalb wäre z.B. auch ein Modell denkbar gewesen, in dem extrazelluläre Faktoren mit unterschiedlicher Wirkung auf beide Gewebe agieren. Während die Mutation im BAT intrinsisch besteht, kann nicht ausgeschlossen werden, dass die UCP3-mRNA-Expression in Skelettmuskelzellen durch extrazelluläre, muskelspezifisch wirkende Faktoren unterstützt wird. Deshalb wäre es interessant zu sehen, wie sich Skelettmuskelzellen der Mutanten in Kultur entwickeln und ob sie ihren im Vergleich zu Wildtypzellen etwas verringerten UCP3-mRNA-Gehalt beibehalten, mehr oder gar keine UCP3-mRNA exprimieren. Dadurch könnte man nicht nur Näheres über die Wirkungsweise der Mutation bei den Hamstern, sondern auch weiteren Einblick in die Steuerung der UCP3-Expression im Allgemeinen gewinnen.

Bisher wurde ausschließlich versucht, die UCP3-Genexpression in den braunen Adipozyten der Mutanten mit Troglitazon und Wy14643 zu stimulieren. Möglicherweise könnte man in weiteren Experimenten die Mutantenzellen mit einer Behandlung durch andere Faktoren zur UCP3-mRNA-Expression bewegen.

So kann die UCP3-mRNA-Expression in Zellkultur von braunen Adipozyten mit T3 stimuliert werden (Teruel et al., 2000). Da T3 darüber hinaus im Medium eine Vorraussetzung für Lipideinlagerung und UCP1-mRNA-Expression in Fettzellen ist, könnte eine akute oder eine chronische Behandlung der Mutantenzellen eine UCP3-Expression bewirken (Klaus, 1991; Klaus et al., 1991). Auch durch Zugabe von Noradrenalin kann die UCP3-mRNA-Expression gesteigert werden (Yoshitomi et al., 1998; Teruel et al., 2000).

Überdies verringert Noradrenalin die PPARγ-Proteinmenge zumindest vorübergehend (Lindgren et al., 2004), so dass vielleicht mit Noradrenalin der Signalweg über PPARγ wenigstens zum Teil umgangen wird. Andererseits war es nicht möglich, eine UCP3-mRNA-Expression im braunen Fettgewebe der Mutanten durch Kälte zu induzieren (von Praun, 1999). Angenommen, dass für UCP3 wie für UCP1 bei Kälte Noradrenalin der Signaltransmitter ist, macht dies eine Wirkung von Noradrenalin auf die UCP3-Expression der braunen Adipozyten der Mutanten in Zellkultur eher unwahrscheinlich.

9-cis-Retinsäure ist ein Ligand für RXRα und bewirkt in fötalen braunen Adipozyten und in braunen HB2-Adipozyten eine Erhöhung des UCP3-mRNA-Gehalts (Irie et al., 1999; Teruel

et al., 2000). Da RXRα aber vermutlich zusammen mit einem PPAR als Heterodimer wirkt, und PPARγ- und PPARα-Liganden in Mutantenzellen keine Wirkung hatten, wäre eine Wirkung der Retinsäure bei diesen eher nicht zu erwarten. Denkbar wäre aber eine Dimerisierung von RXRα mit anderen Kernrezeptoren wie z.B. RAR (retinoic acid receptor) unabhängig von den PPARs (Solanes et al., 2000).

4.3.4 PPARγ-mRNA-Expression in braunen Adipozyten der Mutanten

Als die Zellkultur durchgeführt wurde, war die Mutation noch nicht auf der DNA lokalisiert, deshalb war auch eine Mutation in einem anderen Gen denkbar. Da das in den Experimenten eingesetzte Troglitazon über PPARγ eine Steigerung der UCP3-mRNA-Expression in den Wildtypzellen, jedoch nicht in den Mutantenzellen bewirkte (Abb. 24), war eine Modi-fikation des Transkriptionsfaktors PPARγ, die in trans auf die UCP3-Expression wirkt, denkbar. Deshalb wurden das braune Fettgewebe und die braunen Adipozyten in Zellkultur mittels Northern-Blot-Analyse auch auf Anwesenheit von PPARγ-mRNA getestet. Dabei konnte jedoch kein Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante festgestellt werden (Abb. 24). Es gibt also keinen Hinweis darauf, dass der Signalweg über den Trankriptionsfaktor PPARγ an dieser Stelle unterbrochen wäre. Auch bewirkt das UCP3-Defizit bei den Mutanten keine kompensatorische Hochregulierung der PPARγ-mRNA. Im Unterschied zu Troglitazon wirkt Wy14643 hauptsächlich über PPARα auf die UCP3-mRNA-Expression. Auch die PPARα-mRNA konnte im BAT der Mutanten nachgewiesen werden, wobei kein Unterschied zu den Wildtyphamstern erkennbar wurde (Liebig, 2004).

Da PPARγ nicht nur bei der Transkription, sondern auch auf Translations- und Proteinebene reguliert wird, muß die gemessene mRNA-Menge nicht unbedingt die Proteinmenge und -funktionsfähigkeit widerspiegeln (Nedergaard et al., 2005). Eine Mutation in PPARγ selbst ist unwahrscheinlich, da PPARγ als Transkriptionsfaktor an der Steuerung vieler Gene, insbesondere auch an der Adipozytenentwicklung beteiligt ist. Ohne PPARγ entwickeln sich weder weiße noch braune Adipozyten, eine PPARγ-knockout-Mutation ist letal (Barak et al., 1999). Eine Mutation in PPARγ wäre wohl bereits anhand einer langsameren Entwicklung der Zellen sichtbar geworden, da die Stimulation von PPARγ die Differenzierung der braunen (Prä-)Adipozyten beschleunigt (Tai et al., 1996).

Wahrscheinlich wird der Signalweg über PPARγ an anderer Stelle beeinträchtigt. Hier wären zum Beispiel die Cofaktoren des PPARγ-RXRα-Komplexes wie CoupTF1 oder PGC1 mögliche Kandidatengene (Fromme, 2003). Bisher ist das braune Fettgewebe von Phodopus sungorus, weder von Wildtypen noch von Mutanten auf die Existenz von COUP-TF1 oder PGC1 hin überprüft worden.

Mittlerweile ist nachgewiesen, dass sich die Mutation in cis auswirkt. Dies konnte mit Hilfe der Transfektion von UCP3-Reportergenkonstrukten in HEK293-Zellen gezeigt werden, (mündl. Mitteilung T. Fromme). Mit der vollständigen Sequenzierung des UCP3-Gens der Mutanten ist die Lokalisation einer Punktmutation im ersten Intron bekannt. (Fromme, 2003). Die Mutation ist funktionell aber nicht zuzuordnen, solange die normale Genregulation von UCP3 im braunen Fettgewebe nicht bekannt ist.

4.3.5 Zusammenfassung der Zellkultur

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die UCP3-mRNA-Expression in braunen Adipozyten von Hamstern über PPARγ und PPARα reguliert werden können. Dies ist bei den braunen Adipozyten der Mutanten nicht der Fall, was zeigt, dass die Mutation in den BAT-Zellen intrinsisch besteht. Dadurch ist die Grundlage für weitere Experimente mit den braunen Adipozyten der Mutanten in Zellkultur gegeben.

Die Primärzellkultur ergab keine Hinweise auf eine mögliche Funktion von UCP3, da die braunen Adipozyten der Mutanten bis auf das Fehlen der UCP3-mRNA in jeder Hinsicht mit Wildtypzellen vergleichbar waren.