3. Versuche zum Erhalt eines spezifischen DEG7-Antikörpers
3.3 Ein Peptidantikörper gegen DEG7 Glu545-Ser558 detektiert kein natives DEG7 in
Durch die Aufreinigung des Peptidantiserums α-DEG7Lys202-Gly216 aus dem Rohserum wurde die Detektion von DEG7 zwar verbessert, das Signal beim Molekulargewicht der größeren Spleißvariante von DEG7α ist aber im Kernextrakt der ∆deg7-Mutante noch schwach zu erkennen. Das Antiserum scheint weiterhin mit einem zweiten Kernprotein bei 130 kDa zu reagieren. Ein funktionsfähiger und spezifischer Antikörper, der neben rekombinantem DEG7 auch pflanzliches DEG7 zweifelsfrei erkennt, wird weiterhin für die endgültige subzelluläre Lokalisierung über Immunoblotdetektion und für die Identifizierung von putativen Substraten über beispielsweise Immunopräzipitation benötigt. Es wurde deshalb nach einem alternativen Epitop zur Herstellung eines weiteren Antiserums gesucht.
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3.3.1 Ein Antigen im Bereich zwischen den beiden Hälften von DEG7 verspricht hohe Spezifität und Immunogenität
Über das Programm OptimumAntigen™Design Tool von GenScript wurden Vorschläge für Antigene in der Sequenz von DEG7 erhalten. Die Antigene wurden mit abnehmender Antigenität aufgelistet und des Weiteren mit einer BLAST-Suche gegen das Genom des Kanninchens (Oryctolagus cuniculus) nach ähnlichen Peptiden überprüft. Im Rahmen dieser Arbeit wurde über eine BLAST-Suche gegen das Genom von A. thaliana überprüft und ausgeschlossen, ob die Antigensequenzen neben DEG7 noch in weiteren A. thaliana Proteinen vorhergesagt werden. Außerdem wurde die Zugänglichkeit des Antigens im Protein überprüft indem ein Proteinmodel von DEG7 mit dem Programm Phyre2 (Kelley und Sternberg 2009) erstellt wurde. Anhand dieser drei Kriterien wurden die Aminosäuren Glu545 bis Ser558 im Bereich zwischen den beiden HtrA-ähnlichen Strukturen als Antigen ausgewählt (Abb. 24 (A)).
Das Antiserum gegen das Peptid E545TSSGDGSQNDFGS558 (α-DEG7Glu545-Ser558
)
müsste beide DEG7-Spleißvarianten detektieren können. Die kleinere Spleißvariante DEG7β, bei deren mRNA in Exon15 ein fakultatives Intron ausgespleißt wird, ist nämlich um 33 As im Bereich zwischen den beiden duplizierten HtrA-Proteasen verkürzt. Die Antigensequenz befindet sich aber nicht in diesen 33 As und ist somit in der kleineren Spleißvariante noch vorhanden (Abb.24 (A)). Bei der seitlichen Ansicht (Abb. 24 (B)) auf das Antigen im Proteinmodel von DEG7 wurde ersichtlich, dass das Antigen nicht im Inneren der vorhergesagten dreidimensionalen Struktur verborgen ist, sondern sich gut zugänglich an der Peripherie des Proteins befindet. Des Weiteren ragt aus dem Protein heraus eine Art Tentakel mit zwei β-barrel-haltigen Strukturen, den beiden C-terminalen PDZ-Domänen. Dass PDZ-Domänen als Tentakelarme agieren, wurde bereits beim DegP Hexamer beschrieben, wobei die Tentakelarme Substrate einfangen und auf diese Weise den Zugang in die innere Kammer mit der proteolytischen Aktivität kontrolliert (Clausen et al. 2002). Nach Bindung eines Substrates ist es wahrscheinlich, dass die PDZ-Tentakel im DEG7-Model einklappen würden und auf diese Weise das Substrat zum proteolytisch aktiven Zentrum führt. In diesem Substrat-gebundenen Zustand von DEG7 wäre das Antigen vermutlich nicht mehr so frei zugänglich. Da der polyklonale Antikörper hauptsächlich für Immunodetektion, wo die Proteine denaturiert vorliegen, verwendet werden soll, ist dies nicht von weiterer Bedeutung.
Das Antiserum α-DEG7Glu545-Ser558 wurde von GenScript hergestellt und des Weiteren über eine Affinitätsreinigung mit dem synthetischen Peptid aufgereinigt. Anschließend wurde ein indirekter ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) mit isoliertem Peptid durchgeführt um erste Angaben über die Verdünnung für die Verwendung bei Immunoblots zu erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der erhaltene affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper weiter charakterisiert.
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Abb. 24: Proteinmodel von DEG7 mit dem ausgewählten Antigen (rot) zur Herstellung eines Antikörpers bei GenScript
(A)Schematische Darstellung der Domänenanordnung von DEG7 und die Lokalisierung des Antigens im Bereich zwischen den beiden HtrA-ähnlichen Strukturen. (B+C) Vorhersage eines Proteinmodels für DEG7 durch das Programm Phyre2, als Vorlage für die Vorhersage nutzt Phyre2 homologe Proteine mit bekannter Struktur. In diesem Model liegt DEG7 als Monomer vor. Das Antigen (rot) wurde als Kugel-Stab im Proteinmodel repräsentiert. (B) Seitliche Perspektive auf das Antigen. (C) Perspektive auf das Antigen von oben.
3.3.2 α-DEG7Glu545-Ser558 erkennt rekombinantes DEG7 aus E. coli und überexprimiertes DEG7-GFP in Zellkernextrakt aus A. thaliana
Der affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper gegen das Peptid ETSSGDGSQNDFGS (α-DEG7Glu545-Ser558) wurde in dieser Arbeit im Immunoblot überprüft hinsichtlich seiner Fähigkeit, nativ exprimiertes DEG7 in A. thaliana zu detektieren (Abb. 25 (A)). Hierfür wurde aus
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Pflanzen Gesamtprotein extrahiert sowie Chloroplasten isoliert. Neben Wildtyp-Zellkernen wurden auch Zellkerne aus DEG7-GFP überexprimierenden Pflanzen und aus einer
∆deg7-1 T-DNA Insertionslinie (siehe Kapitel 5.1) isoliert. Die Immunoblot-Anlayse wurde neben dem Antiserum auch mit dem Präimmunserum durchgeführt um unspezifische Proteine, die bereits durch das Präimmunserum erkannt werden, zu identifizieren, damit sie anschließend im Immunblot mit dem Antiserum α-DEG7Glu545-Ser558 bekannt sind (Daten nicht gezeigt). Bei dem Protein zwischen 72 und 110 kDa in Abb. 25 (A), das im Gesamtprotein und im Proteinextrakt der Zellkernisolate durch das α-DEG7Glu545-Ser558 Antiserum erkannt wird, handelt es sich um ein solches Protein, das bereits vom Präimmunserum erkannt wird. Es handelt sich um ein Protein gegen das das Kaninchen bereits vor der Immunisierung einen Antikörper gebildet hat.
Abb. 25: α-DEG7Glu545-Ser558 detektiert neben rekombinantem DEG7 im Gesamtprotein von E. coli auch überexprimiertes DEG7-GFP in A. thaliana
(A) Durch einen Immunblot wurde überprüft, ob der affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper α-DEG7Glu454-Ser558
DEG7 detektieren kann. α-DEG7Glu545-Ser558 das gegen ein Antigen aus 14 Aminosäuren im Bereich zwischen den beiden HtrA-ähnlichen Strukturen in DEG7 gerichtet ist, detektierte kein Signal bei 120 kDa, dem errechneten Molekulargewicht von nativem DEG7, weder in Gesamtprotein noch in isolierten Chloroplasten und den Zellkernisolaten aus A. thaliana Blättern. DEG7-GFP (147 kDa) wurde im Kernextrakt von Überexpressor-Pflanzen, die DEG7-GFP überexprimieren, detektiert. (10 µg / Spur) (B) Im Gesamtproteinextrakt aus E. coli, das DEG7 heterolog exprimiert, wurde rekombinantes DEG7 in einer Verdünnungsreihe bei 130 kDa mit abnehmender Intensität detektiert. (ng rekombinantes DEG7 / Spur)
Der affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper α-DEG7Glu545-Ser558 reagierte im Gegensatz zu den Immunoblots mit dem α-DEG7Lys202-Gly216 Antiserum im Bereich des errechneten Molekulargewichts von nativem DEG7 (ca. 120 kDa) weder im Gesamtproteinextrakt noch in Proteinextrakten von isolierten Chloroplasten oder Zellkernen aus A. thaliana mit einem Protein (Abb.25 (A)). Im Zellkernisolat der Überexpressor-Pflanze ist jedoch ein Signal in der Nähe von 170 kDa entstanden. Es handelt sich höchstwahrscheinlich um DEG7-GFP (147 kDa). Die
Ergebnisse und Diskussion Auftrennung von Proteinen im hochmolekularen Bereich und die Genauigkeit des Markers ist unzuverlässig, so dass bei dem detektieren Protein davon ausgegangen werden kann, dass es sich um das überexprimierte DEG7-GFP handelt. Als nächstes wurde überprüft ob und mit welcher Sensitivität der neue polyklonale Antikörper das Antigen in rekombinantem DEG7 erkennt. Dazu wurde eine Verdünnungsreihe von Gesamtprotein aus E. coli-Zellen, in denen DEG7 heterolog exprimiert wurde, aufgetragen (Abb. 25 (B)). Die Konzentration von rekombinantem DEG7 im Gesamtprotein von E. coli wurde anhand eines SDS-Gels mit bekannten Konzentrationen an BSA abgeschätzt (Daten nicht gezeigt). Im Immunoblot detektierte das Antiserum α-DEG7Glu545-Ser558 das rekombinante DEG7 bei ungefähr 130 kDa (Abb. 25 (B)). Die Intensität des Signals nimmt mit abnehmender Konzentration an rekombinantem DEG7 im Gesamtprotein ab. Bei den niedrigen Verdünnungen wurden neben rekombinantem DEG7 zwei weitere unspezifische Banden bei 72 und 110 kDa detektiert.
Entweder handelt es sich um E.coli Proteine, die eine Proteinsequenz enthalten, die Ähnlichkeit zum Antigen aufweisen oder gegen die bereits Antikörper im Präimmunserum vorlagen und bei der Affinitätsreinigung nicht vollständig entfernt wurden. Die Detektionsgrenze des α-DEG7Glu545-Ser558 Antiserums liegt bei ungefähr 0,5 ng rekombinantem DEG7. Im Vergleich zum aufgereinigten α-DEG7Lys202-Gly216 Antiserum (siehe Kapitel 3.1), der gerade noch 2,5 ng rekombinantes DEG7 im Immunoblot erkennt (Abb. 23 (B)), ist der neue Antikörper gegenüber rekombinantem DEG7 im Gesamtprotein von E. coli sensitiver. Es ist nicht plausibel erklärbar, dass trotz der hohen Sensitivität des α-DEG7Glu545-Ser558 Antiserums für DEG7, das Antiserum neben dem überexprimierten DEG7-GFP im pflanzlichen Proteinextrakt nicht mit nativem DEG7 reagiert. Mit dem aufgereinigten, weniger sensitiveren Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216 ist dies nämlich noch gelungen. Bei dem neuen Antiserum kann deshalb nicht argumentiert werden, dass es aufgrund der niedrigen Expression von DEG7 zu Schwierigkeiten bei der Detektion kommt. Deshalb sollte als nächstes eine Immunoblot-Membran hergestellt werden, die identische Kernextraktproteine enthält. Die zwei identischen Membranhälften können dann mit beiden Antiseren parallel analysiert werden, was einen direkten Vergleich ermöglichen würde.
Es wurde in dieser Arbeit zwei Antiseren, α-DEG7Lys202-Gly216 und α-DEG7Glu545-Ser558, hergestellt und charakterisiert, die zwar mit rekombinantem DEG7 aus E. coli reagieren und deren Detektionsgrenze für heterolog exprimiertes DEG7 zwischen 0,5 - 2,5 ng liegt, die aber leider nativ exprimiertes DEG7 in isolierten Organellen aus A. thaliana nicht spezifisch erkennen können. Damit sind die beiden Antiseren für weitere Experimente um DEG7 im Zellkern über Immunoblot-Analyse nachzuweisen nicht brauchbar und ebenso wenig geeignet um über Immunopräzipitation nach Substraten zu suchen.
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