7.1 Gesamtprotein-Extraktion aus S. cerevisiae durch NaOH-Lyse
Es wurden 2 ml YPAD-Übernachtkultur (10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Glucose, 40 mg/l Adeninsulfat) bei 8000 g für 2 min pelletiert. Das Pellet wurde anschließend in 110 µl 0.1 M NaOH resuspendiert und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der alkalischen Lyse wurde die OD600 gemessen und auf 0.8 eingestellt, indem die Zellen durch Zentrifugation bei 14 000 g für 1 min pelletiert wurden und in einem entsprechendem Volumen 1xSDS-Ladepuffer aufgenommen wurden. Anschließend wurden die Proteine bei 95°C denaturiert und nochmals zentrifugiert bei 14 000 g für 1 min. 10 µl des Überstands wurde pro Spur auf ein SDS-Gel geladen (modifiziert von Kushnirov (2000)).
7.2 Gesamtprotein-Extraktion aus E. coli, die DEG7Met1-Asp1070 heterolog exprimieren
Für die Immunoblots mit rekombinantem DEG7 wurde der E. coli Stamm BL21Star™(DE3) (Tab. 4) zunächst mit dem Plasmid pHS166 (PrT7:6xHis:DEG7S206A (1-3210bp):TerT ) von Schuhmann et al. (2011) transformiert. Das Gesamtprotein aus E. coli wurde aus 1 ml Kultur aufbereitet, die zuvor mit IPTG induziert wurde. Die Zellen wurden bei 8000 g für 1 min pelletiert. Das Pellet wurde in 1x SDS-Ladepuffer resuspendiert und für 10 min bei 96°C erhitzt.
7.3 Gesamtprotein-Extraktion aus A. thaliana
Es wurden 30 mg Blattmaterial eingewogen und in 60 µl Extraktionspuffer (Tab. 12) gemörsert.
Nach Zugabe von 30 µl 3x LDS-Puffer (Tab. 12) wurde erneut gemörsert bis das Pflanzenmaterial gut zerkleinert war. Die Proben wurden kurz gevortext, anschließend 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann bei 95°C für 5 min erhitzt. Nachdem die Proben auf Eis abgekühlt waren, wurden sie bei Raumtemperatur für 10 min bei 25 000g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und 10 µl auf das SDS-Gel geladen.
Tab. 12: Puffer für die Extraktion von Gesamtprotein aus A. thaliana
Extraktionspuffer 3x LDS-Puffer
125 mM Tris-HCl, pH 6.8 1 M Tris pH8.0
100 mM DTT 150 mM DTT
4% (w/v) SDS 20% (v/v) LDS
Complete™ EDTA-freie Proteaseinhibitor Tablette (Roche, Basel, Schweiz)
2% (w/v) Bromphenolblau 30% Glycerol
Material und Methoden
88
7.4 Überexpression von Proteinen in S. cerevisiae
Eine Übernachtkultur wurde in SC-Medium mit Glucose (6,7 g/l Difco Yeast Nitrogen Base, 20 g/l Glucose oder Galaktose, 1,769 g/l Aminosäure-Mix, pH 5.9) bei 30°C angezogen. Am nächsten Tag wurde die Flüssigkultur bei 2300 g für 3 min pelletiert, das Pellet wurde zweifach in sterilem deionisiertem Wasser gewaschen und anschließend in galaktosehaltigem SC-Medium resuspendiert. Die Hefekultur wurde bei 200 rpm und 30°C inkubiert und das Protein überexprimiert.
7.5 Isolierung von Organellen aus A. thaliana
7.5.1 Zellkerne
Nach dem Protokoll von Kato und Jones (2010) wurden Protoplasten hergestellt. 1 g Blattmaterial wurde in 1mm feine Streifen geschnitten und im Exsikkator für 30 min mit 10 ml Verdaulösung (Tab. 13) infiltriert. Es wurde die Zellwände über Nacht bei Raumtemperatur abgebaut. Die Isolierung von Zellkernen aus Protoplasten erfolgte nach Hadlaczky et al. (1983).
Die Protoplasten wurden durch ein 100 µm Nylonnetz filtriert und mit 10 ml W5-Lösung (Tab.
13) aufgefüllt und bei 100 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml W5-Lösung vorsichtig ohne Blasenbildung resuspendiert. Die intakten Protoplasten wurden pelletiert in dem sie für 30 min bei 4°C inkubiert wurden. Das Protoplasten-Pellet wurde in 10 ml GH-Puffer (Tab. 13) aufgenommen und 10 min auf Eis inkubiert. Bevor Triton X-100 mit einer Endkonzentration von 0,1% (v/v) (aus einer 10% (v/v) Stammlösung) zugegeben wurde um die Plasmamembran aufzulösen. Nach Mehrfachem auf- und abpipettieren wurde für 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde bei 1000 g für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mehrfach in GHT-Puffer gewaschen und anschließend in Protein-Extrationspuffer aufgenommen. Cellulase „Onozuka R-10“ von Trichoderma viride (Serva, Heidelberg, Deutschland)
Macerozym R-10 von Rhizopus sp. (Serva, Heidelberg, Deutschland)
7.5.2 Intakte Chloroplasten, Thylakoide und Stroma
Intakte Chloroplasten, Thylakoide und Stroma wurden isoliert wie beschrieben in Galetskiy et al. (2011). A. thaliana Blätter wurden in HS-Puffer (100 mM HEPES pH 8.0, 330 mM Sorbitol) mit einem Ultraturrax (IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) zerkleinert. Das Homogenat wurde anschließend durch ein Nylonnetz filtriert und für 2 min bei 4000 g und 4°C
Material und Methoden zentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig mit einem Pinsel in einem kleinen Volumen HS-Puffer aufgenommen und auf einen Percollgradient (35% (v/v) Percoll in HS-HS-Puffer auf einem 100% (v/v) Percollkissen) geladen und für 9 min bei 2700 g und 4°C zentrifugiert. Die intakten Chloroplasten befinden sich in der Interphase zwischen dem 35% und 100% Percoll und wurden vom 100% Percollkissen abpipettiert. Um Thylakoide und Stroma voneinander zu trennen, wurden die intakten Chloroplasten in HS-Puffer gewaschen und für 2 min bei 2700 g bei 4°C pelletiert. Die intakten Chloroplasten wurden in 0.5x HS-Puffer aufgenommen und mit einem Homogenisator aufgebrochen. Nach der Zentrifugation bei 4000 g für 5 min wurde das Stroma abpipettiert und die pelletierten Membranen (Thylakoide, Envelope) in HS-Puffer aufgenommen.
7.6 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung wurde mit zwei verschiedenen Kits durchgeführt:
BradfordRED Kit (Expedeon, Cambridgeshire, England)
RC DC Protein Assay (Biorad, München, Deutschland)
Es wurde wie im entsprechenden Handbuch beschrieben verfahren, außer das beim RC DC Protein Assay ein weiterer Waschschritt eingefügt wurde. Die Proben und die BSA-Standards wurden nach der Fällung nochmals in 125 µl RC-Reagenz I resuspendiert, gevortext und 1 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann kam es zur Zugabe von 40 µl RC-Reagenz II, erneutes vortexen und eine Zentrifugation für 10 min bei 15 000 g. Erst nach diesem zweiten Waschschritt wurde das Pellet in der Speedvac getrocknet und wie im Handbuch beschrieben weiterverfahren.
Die Proteinbestimmung wurde in Zweifachbestimmung durchgeführt und teilweise wurden die Proben verdünnt mit entsprechendem Puffer eingesetzt.
7.7 SDS-PAGE und Immunoblot Analyse
Nach dem Verfahren von Laemmli (1970) wurde die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Das Sammelgel und Trenngel unterschieden sich hinsichtlich ihres pH-Werts und die Auftrennung der Proteine erfolgt denaturierend. Es wurden 7 bis 15% SDS-Gele verwendet. Das Molekulargewicht der Proteine wurde anhand eines Markers (PageRuler™ Prestained Protein Ladder, ThermoScientific, Deutschland) bestimmt. Die aufgetrennten Proteine wurden mit einer Semidry-Blotting-Apparatur (Biometra, Göttingen, Deutschland) auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF-) Membran (Hybond-P, Roche, Mannheim, Deutschland) transferiert. Die in der Arbeit verwendeten primären Antikörper sind in Tab. 14 aufgelistet. Mit einem Meerettichperoxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (Sigma-Aldrich, Hamburg, Deutschland) wurden die Blots über Chemilumineszenz mit Luminol (Roti®Lumin plus, Roth, Karlsruhe, Deutschland) entwickelt.
Tab. 14: primäre Antikörper
Name Verdünnung Organismus Firma / Publikation α-DEG7Lys202-Gly216 1:500 Kaninchen Agrisera
α-DEG7Lys202-Gly216 gereinigt 1:1000 Kanninchen diese Arbeit
Material und Methoden
90
α-DEG7Glu545-Ser558 1:1000 Kaninchen GenScript (USA) α-DEG7GP 1:1000 Kaninchen Sun et al. (2010)
α-H3 1:5000 Kaninchen Agrisera
α-DEG2 1:500 Kaninchen Haussühl et al. (2001)
α-GFP 1:1000 Maus Roche (Basel, Schweiz)
α-NUCL1 1:5000 Kaninchen Saez-Vasquez et al. (2004)
α-LHCB2 1:5000 Kaninchen Agrisera
α-DEG9 1:1000 Kaninchen Huesgen (2007)
α-RD21 1:2000 Kanninchen Yamada et al. (2001)
α-DEG7Glu545-Ser558 wurde bei GenScript (Piscataway, USA) in Auftrag gegeben (PolyExpress Basic Package, SC1180)
7.8 Heterologe Expression in E. coli
Zur Herstellung von rekombinantem Protein wurden Hitzeschock-kompetente E. coli BL21Star™(DE3) (Tab. 4) mit den Plasmiden aus (Tab. 17) transformiert. Die Starterkulturen wurden auf dem Schüttler in 50 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum über Nacht bei 37°C angezogen. Mit der Starterkultur wurde am nächsten Tag die Literkulturen inokuliert und angezogen. Durch Zugabe von Isopropyl-1-Thio-β-D-Galaktosidase (IPTG) in der exponentiellen Wachstumsphase der Zellen wurde die Überexpression des rekombinanten Proteins induziert. Die Induktionskonzentration, Induktionstemperatur und Induktionsdauer variierte je nach Fusionsprotein (Tab. 15). Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation bei 6000 g für 10 min (Sorvall®RC-5B) pelletiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Pellets wurden bei -20°C aufbewahrt.
Tab. 15: Anzuchtsbedinungen von DEG7 Met1-Gln563 und P5CR
6xHis-DEG7Met1-Gln563 6xHis-P5CR
7.9 Aufschluss von E. coli durch Sonifizierung
Die eingefrorenen Pellets (siehe 7.8) wurden auf Eis aufgetaut. Nach der Zugabe des entsprechenden Lysepuffers (2 ml pro 1 g Zellen) (Tab. 16) und 1 µg/ml Lysoszym (Sigma,
Material und Methoden Taufkirchen, Deutschland) wurde kurz gevortext und die Zellen wurden für 30 min auf Eis inkubiert. Um die Zellen aufzubrechen wurde sechsmal für 10 sec bei 50 Watt auf Eis sonifiziert. Durch Zentrifugation bei 20 000 g für 1 h bei 4°C wurden Zellbruchstücke pelletiert und die löslichen Proteine im Überstand erhalten.
Tab. 16: Lysepuffer für rekombinante Proteine
Lysepuffer für DEG7Met1-Gln563 Lysepuffer für P5CR
50 mM HEPES pH 8.0 50 mM HEPES pH 8.0
Die Aufreinigung der rekombinanten Proteine, die mit 6 Histidinen N-terminal markiert wurden (Tab. 17), erfolgte über eine Nickelaffinitätschromatographie mit einem Äkta™purifier (GE Healthcare, München, Deutschland) unter Verwendung der HisTrap FF crude –Säule (1 ml) von GE Healthcare.
Tab. 17: Plasmide für die Antiserum Aufreinigung
Plasmid Vektor Insert
pHS184 pET151/D-TOPO PrT7:6xHis:DEG7S206A (1-1689bp):TerT7 (Schuhmann et al. 2011)
pP5CR pET151/D-TOPO PrT7:6xHis:P5CR :TerT7 (Giberti et al. 2014)
7.10.1 Aufreinigung von DEG7Met1-Gln563
Das Aufreinigungprogramm von DEG7Met1-Gln563 hat eine Flussrate von 0.5 ml/min und die Fraktionsmenge betrug 1 ml. Nach Äquilibrierung der Säule mit Bindepuffer wurde das Lysat aufgetragen und mit 5 Säulenvolumen (SV, 1 SV = 1 ml) Bindepuffer gewaschen. Anschließend erfolgte ein Glycerolgradient von 0 bis 25% (v/v) wobei 25% (v/v) Glycerol für 5 SV beibehalten wurden um Verunreinigungen mit E. coli Proteinen zu reduzieren. Vor der Elution mit den Imidazolstufen von 25, 50 und 500 mM Imidazol (je 5 SV) wurde die Säule zunächst mit 5 SV Bindepuffer gewaschen. Die Säule wurde am Schluss wieder mit 5 SV Bindepuffer reäqulibriert. Die verwendeten Puffer für die Aufreinigung sind in Tab. 18 aufgeführt.
Tab. 18: Puffer für die Aufreinigung von DEG7Met1-Gln563
Bindepuffer Glycerolpuffer Elutionspuffer 50 mM HEPES pH 8.0 50 mM HEPES pH 8.0 50 mM HEPES pH 8.0
300 mM NaCl 300 mM NaCl 300 mM NaCl
10 mM β-Mercaptoethanol 10 mM β-Mercaptoethanol 10 mM β-Mercaptoethanol
5 mM Imidazol 50% (v/v) Glycerol 500 mM Imidazol
Material und Methoden
92
7.10.2 Aufreinigung von P5CR
Die verwendeten Imidazolstufen zur Aufreinigung von P5CR wurden von Giberti et al. (2014) modifiziert. Die Flussrate betrug 0.5 ml/min und bei der Elution wurden Fraktionen von 1 ml kollektiert. Nach Auftragen des Lysats auf die Säule wurde zunächst mit 5 SV Bindepuffer gewaschen. Die Elution erfolgte über drei Imidazolstufen (40, 60 und 400 mM), wobei jede Stufe 5 SV betrug. Die Reäquilibrierung mit Bindepuffer erfolgte über 5 SV. In Tab. 19 sind die verwendeten Puffer für die Aufreinigung aufgeführt.
Tab. 19: Puffer für die Aufreinigung von P5CR
Bindepuffer Elutionspuffer
Zuerst wurde pro Protein (1.5 mg aufgereinigt) 1 g Cyanogenbromid-aktivierte (CNBr-aktivierte) Sepharose (GE Healthcare, München, Deutschland) in 50 ml 1 mM HCl für eine Stunde gequollen. Über eine gesinterte Glasfritte (Porengröße 3) wurde mittels Vakuum die Salzsäure entfernt und anschließend mit 250 ml 1 mM HCl gewaschen. Die gequollene Sepharose wurde dann in 10-20 ml Kopplungspuffer (Tab. 20) aufgenommen und über das Vakuum wieder entfernt. Die aktivierte Sepharose wurde mit dem aufgereinigten Protein (7.10), das über eine Umpufferungssäule in Kopplungspuffer aufgenommen wurde, vermischt und in einem Falcontube rollend bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Der Kopplungspuffer wurde entfernt und um restliche freie Iminogruppen der CNBr-aktivierte Sepharose abzusättigen, wurden 40 ml 0.2 Glycinpuffer pH 8.0 zu der Sepharose gegeben und erneut für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säulenmatrix wurde anschließend dreimal erst mit 50 ml Kopplungspuffer dann mit 50 ml Acetatpuffer (Tab. 20) abwechselnd gewaschen.
Die Sepharose wurde am Schluss in 5 ml Kopplungspuffer aufgenommen und in Säulen (5 ml) (Quiagen, Venlo, Niederlande) unter Ausschluss von Luftblasen überführt und mit einer Fritte abgedichtet.
Tab. 20: Puffer für die Aufreinigungssäulen
Kopplungspuffer (1l) Acetatpuffer (1l)
0.1 M NaHCO3 0.1 M NaAcetat x 3 H2O
0.5 M NaCl 0.5 M NaCl
pH 8.3 mit NaOH eingestellt pH 4.0 mit Eisessig eingestellt
7.11.2 Reinigung des Antiserums α-DEG7S206
Auf die Säule der negativen Absorption (P5CR-Säule) wurden 5 ml Serum α-DEG7S206
aufgetragen, wobei der Durchlauf viermal auf die Säule aufgetragen wurde. Dieser vierte Durchlauf, der noch die DEG7-Peptidantikörper enthielt, wurde anschließend auf die Säule der
Material und Methoden positiven Absorption (DEG7-Säule) aufgetragen und ebenfalls viermal auf die Säule aufgetragen, damit die DEG7-Peptidantikörper an das DEG7-Antigen der Säule binden konnten.
Die Säule wurde anschließend zweimal mit 5 ml 10 mM Tris/HCl pH 8.0 gewaschen. Vor der Elution wurden 1,5ml Eppendorfgefäße mit 50 µl 1 M Tris/HCl pH 8.0 vorgelegt um den sauren Glycinpuffer der Elution zu puffern damit die Proteine bei dem niedrigen pH nicht denaturieren.
Die DEG7-Peptidantikörper wurden mit 5 ml 50 mM Glycinpuffer pH 2.2 eluiert, wobei pro 1,5 ml Eppendorfgefäß 500 µl Eluat gesammelt wurde und schnellst möglich mit dem vorgelegten Puffer vermischt wurde.
7.11.3 Regeneration der Säulen
Beide Säulen wurden zunächst mit 10 mM Tris/HCl pH 8.0 gewaschen. Als nächstes wurden die Säulen regeneriert, indem zunächst mit Regenerationspuffer 1 dann mit Regenerationspuffer 2 (Tab. 21) gewaschen wurde. Als letztes wurden die Säulen wieder mit Kopplungspuffer äquilibriert und konnten bei 4°C für eine weitere Aufreinigung aufbewahrt werden.
Tab. 21: Regernationspuffer für die Aufreinigungssäulen
Regenerationspuffer 1 Regenerationspuffer 2
0.1 M NaHCO3 0.1 M NaAcetat x 3 H2O
pH 8.3 mit NaOH eingestellt 0.5 M NaCl
pH 4.5 mit Eisessig eingestellt