Aufreinigung des Antiserums α-DEG7 Lys202-Gly216 über positive und negative

Mit einer Aufreinigung des Antiserums kann versucht werden unspezifische Signale zu reduzieren und die Spezifität für DEG7 zu erhöhen. Die Aufreinigung des Antiserums hat das Ziel das detektierte Protein bei 120 kDa in Wildtyp-Zellkernen durch die Abwesenheit im Zellkernextrakt einer ∆deg7-Pflanze als DEG7 nachzuweisen indem u.a. der Antikörper, der vermutlich mit einem weiteren kernlokalisierten Protein bei 120 kDa reagiert, zu entfernen.

Darüber hinaus würde ein funktionierender Antikörper ermöglichen putative Substrate von DEG7 beispielsweise durch Co-Immunopräzipitation zu identifizieren. Bevor das Antiserum aufgereinigt wurde, wurde noch abgeschätzt ob das Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216 nur die Antigensequenz in DEG7 oder auch in den anderen A. thaliana Deg-Proteasen erkennen würde.

Bedenkt man nämlich, dass die Region um das katalytische Serin in der Proteasedomäne in den Deg-Proteasen aus A. thaliana konserviert ist, kann vermutet werden, dass das Antiserum nicht nur DEG7 sondern auch weitere Deg-Proteasen erkennt. Diese Bedenken konnten nach Vergleich der Region durch ein Alignment mit dem Programm TCoffee um das katalytische Serin von den sechzehn Deg-Proteasen abgeschwächt werden. Über eine BLAST-Suche wurde des Weiteren ermittelt ob das Antigen um das katalytische Serin206 von DEG7 im Proteom von A.thaliana weitere Proteine vorhersagt. Es wurden zwar Proteine gefunden, die in ihrer Sequenz einige aufeinanderfolgende Aminosäuren der Antigensequenz besitzen, sie sind aber hinsichtlich ihres Molekulargewichts um einiges kleiner als DEG7. Es wurde daraufhin entschieden eine Aufreinigung des Antiserums zu versuchen.

Zur Aufreinigung des Antiserums mussten zunächst zwei Antigene, DEG7Met1-Gln563 und P5CR, über eine Nickelaffinitätschromatographie aufgereinigt und an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose gebunden werden. Die Aufreinigung des Rohserums α-DEG7Lys202-Gly216 erfolgte nach dem Prinzip der negativen und positiven Adsorption. Die P5CR-Säule sollte durch negative Adsorption Antikörper, die gegen Proteinabschnitte, die aufgrund des Überexpressionskonstrukts entstanden sind, an die Säule binden und das Antiserum

α-Ergebnisse und Diskussion DEG7Lys202-Gly216 von ihnen befreit werden. Die DEG7-Peptidantikörper verlassen bei der negativen Adsorption die P5CR-Säule im Durchfluss und wurden anschließend durch positive Adsorption an die Säule, die das Antigen DEG7Met1-Gln563 enthält, gebunden. Weitere unspezifische Antikörper werden auf diese Weise von den DEG7-Peptidantikörpern getrennt und verlassen die DEG7Met1-Gln563-Säule im Durchfluss. Durch Erniedrigung des pHs werden schließlich die DEG7-Peptidantikörper von der Säule eluiert (Abb. 20).

Abb. 20: Schematische Darstellung der Antiserum Aufreinigung

Die Aufreinigung erfolgte über eine negative und positive Adsorption (schwarz: Antikörper gegen Proteinabschnitte, die aufgrund des Überexpressionskonstrukts entstanden sind; rot: unspezifische Antikörper; grün: DEG7Lys202-Gly216 -Antikörper)

3.1.1 Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563

Um das Rohserum α-DEG7Lys202-Gly216 aufreinigen zu können, war es zunächst notwendig ein geeignetes DEG7-Antigen heterolog in E. coli zu exprimieren und über eine Nickelaffinitätschromatographie aufzureinigen. Das Orginal-Antigen, das zur Immunisierung des Kanninchens verwendet wurde, ist bei Agrisera verblieben. Es wurde als Antigen DEG7 Met1-Gln563 (ca. 65 kDa) gewählt, da bereits ein Protokoll zum Erhalt dieses aufgereinigten rekombinanten Proteins vorhanden war (modifiziert aus Schuhmann et al. (2011)). DEG7 Met1-Gln563 anstelle des Orginalpeptids bei der Antiserum Aufreinigung zu verwenden, hat noch den Vorteil, dass das Antigen in seiner natürlichen Proteinumgebung präsentiert wird. Der DEG7-Peptidantikörper erkennt die Aminosäuren um das katalytische Serin206 in der N-terminalen aktiven Proteasedomäne, wodurch es ausreichend war die N-terminalen 563 As von DEG7, die die Proteasedomäne enthalten, zu verwenden. Das an die Säule der Nickelaffinitäts-chromatographie gebundene DEG7Met1-Gln563 eluierte bei einer Imidazolkonzentration von 25 mM, was durch den Anstieg der Absorption bei 280 nm auf ungefähr 2500 mAU im Chromatogramm ersichtlich wurde (Abb. 21 (A)). Im Coomassie-gefärbten SDS-Gel dieser beiden Elutionsfraktionen mit 2500 mAU (Spuren 27/28) wurde DEG7Met1-Gln563 bei 65 kDa deutlich ersichtlich (Abb. 21 (B)). Die Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563 für die

Ergebnisse und Diskussion

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Antiserum Aufreinigung erfolgte mit geringen Verunreinigungen durch E. coli Proteine, die vermutlich aufgrund eines hohen Gehalts an Histidinresten mit ähnlicher Affinität an die Säule gebunden waren und deshalb mit DEG7Met1-Gln563 koeluierten.

Abb. 21: Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563 für die Antiserum-Aufreinigung

(A)Chromatogramm der Nickelaffinitätschromatographie zur Aufreinigung von DEG7Met1-Gln563 (blau=Absorption bei 280nm [mAU]). (B) Coomassie-gefärbtes 10% SDS-Gel der Aufreinigung von DEG7Met1-Gln563 (65 kDa) (P: Pellet;

L: lösliche Proteinfraktion; 3: Durchfluss; 15: 25% Glycerol-Eluat; 27/28: Elutionsfraktionen bei 25mM Imidazol)

3.1.2 Aufreinigung von Pyrrolin-5-Carboxylatreduktase (P5CR) für die negative Adsorption

Für die Antiserum Aufreinigung wurde ein weiteres Protein, P5CR, aufgereinigt, das für die negative Adsorption eingesetzt werden sollte. Das Gen P5CR (At5g14800) liegt im identischen Vektor kloniert vor wie DEG7Met1-Gln563 (Tab. 17). Durch die negative Adsorption sollte erreicht werden, dass das Antiserum von Antikörpern, die gegen Proteinabschnitte, die aufgrund des Überexpressionskonstrukts entstanden sind, sowie gegen His-reiche E. coli-Proteine oder die Sepharose-Matrix gerichtet sind, befreit werden. Die Aufreinigung von P5CR über eine Nickelaffinitätschromatographie wurde von Giberti et al. (2014) modifiziert. P5CR (32.5 kDa) weist eine hohe Affinität zur Säule auf und wird erst mit 400 mM Imidazol quantitativ von der Säule eluiert (Abb. 22 (A)). Die Elution von P5CR erfolgte nach zwei Imidazolstufen, die

Ergebnisse und Diskussion zunächst histidinreiche E. coli Proteine bei 40 und 60 mM Imidazol von der Säule eluieren sollten um einen ähnlichen Reinheitsgrad wie bei der Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563

zu erhalten. Im Coomassie-gefärbten SDS-Gel (Abb. 22 (B)) ist zu erkennen, das eine erhebliche Menge an P5CR bereits mit 60 mM Imidazol von der Säule eluierte (Spuren 9/10), aber noch mehr Verunreinigungen aufwies als die beiden Fraktionen bei der Elution mit 400 mM Imidazol (Spuren18/19). Die größte Konzentration an P5CR eluierte in den Elutionsfraktionen 18 und 19 (400 mM Imidazol), wo es auch zu einem deutlichen Anstieg der Absorption bei 280 nm kam und ein Gipfel bei ~800 mAU erreicht wurde.

Abb. 22: Aufreinigung von P5CR für die Antiserum Aufreinigung von α-DEG7Lys202-Gly216

(A) Chromatogramm der Aufreinigung von P5CR über eine Nickelaffinitätschromatographie (blau: Absorption bei 280 nm [mAU]), (B) Coomassie-gefärbtes 14% SDS-Gel der Aufreinigung von P5CR (32.5 kDa) (P:Pellet; L:

lösliche Proteinfraktion; 3: Durchfluss; 9/10: Elutionsfraktionen bei 60 mM Imidazol; 18/19: Elutionsfraktionen bei 400 mM Imidazol)

3.2 Die Aufreinigung des Antiserums α-DEG7Lys202-Gly216 führte zu einer