Isolierte Wildtyp-Zellkerne weisen natürlich vorkommendes DEG7 auf

2. Lokalisierung von DEG7 durch Zellfraktionierung

2.3 Isolierte Wildtyp-Zellkerne weisen natürlich vorkommendes DEG7 auf

Weitere Versuche sollten die direkte Immunodetektion von DEG7 ermöglichen und die Lokalisierung im Zellkernextrakt von Wildtyp-Pflanzen zweifelsfrei klären, nachdem DEG7 bisher nur als stark exprimiertes GFP-Fusionsprotein im Zellkern nachgewiesen (Abb. 9 und Abb. 15) und die veröffentlichte Lokalisierung von DEG7 im Stroma durch Immunoblot-Analyse in dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte (Abb. 17). Hierfür wurden Zellkerne aus Wildtyp-Pflanzen isoliert und eine Proteinkonzentrationsreihe des Proteinextrakts (2,5; 5 und 7,5 µg / Gelspur) aufgetragen. Durch Verlängerung des Transfers sollte erreicht werden, dass

Ergebnisse und Diskussion

die Proteine effizienter auf die PVDF-Membran übertragen werden. Anschließend wurden die PVDF-Membranen mit beiden DEG7-Antiseren (α-DEG7GP, α-DEG7Lys202-Gly216) analysiert (Abb. 18). Mit beiden Antiseren wurde ein Signal bei 120 kDa, dem errechneten Molekulargewicht von DEG7, beobachtet. Mit α-DEG7GP Antiserum wird eine Zunahme der Intensität des Signals mit steigender Proteinkonzentration sichtbar, während mit α-DEG7 Lys202-Gly216 das Signal bei einer Proteinextraktkonzentration von 5 µg / Gelspur optimal zu sehen ist.

Abb. 18: In Wildtyp-Zellkernen wurde natürlich vorkommendes DEG7 lokalisiert

Immunoblots einer Proteinkonzentrationsreihe des Proteinextrakts (2,5; 5 und 7,5 µg / Gelspur) isolierter Wildtyp-Zellkerne, die mit zwei DEG7-Antiseren (α-DEG7_GP, α-DEG7Lys202-Gly216) analysiert wurden. Bei 120 kDa wurde vermutlich das natürlich vorkommende DEG7 durch beide Antiseren erkannt. Bei den Signalen von ~45 und

~100 kDa, die durch beide Antiseren erhalten wurden, handelt es sich vermutlich um DEG7-Abbauprodukte.

Zwei weitere Proteine wurden jeweils von den Antiseren erkannt, wobei mit einem Protein bei 50 kDa nur das Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216 reagierte. Es ist möglich, dass es sich bei den beiden Proteinen um Abbauprodukte von DEG7 handelt, da sie durch beide Antiseren sichtbar wurden. Es ist unwahrscheinlich, dass die beiden Abbauprodukte durch Spaltung des DEG7-Gesamtproteins entstanden sind, da das größere Abbauprodukt ein Molekulargewicht von ungefähr 100 kDa und das Kleinere etwa 45 kDa groß ist und somit das errechnete Molekulargewicht von DEG7 überschritten würde. Außerdem müssten beide Abbauprodukte die Proteinsequenz um das katalytische Serin206 der aktiven Proteasendomäne enthalten, um durch das α-DEG7Lys202-Gly216 erkannt zu werden. Wären beides Fragmente einer einzigen Spaltung würde nur eines der beiden Spaltprodukte die Sequenz um das Serin206 aufweisen und wäre durch α-DEG7Lys202-Gly216 auffindbar. Die Lokalisierung von DEG7-GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie und Immunoblot Analyse im Zellkern (Abb. 9 und Abb. 15) kann durch den biochemischen Nachweis eines Signals bei 120 kDa, was dem Molekulargewicht des natürlich vorkommenden DEG7 entspricht, mit zwei DEG7-Antiseren in A. thaliana Zellkernen (Abb. 18) höchstwahrscheinlich bestätigt werden und DEG7 als ein Artefakt im Zellkern immer mehr ausgeschlossen werden.

Ergebnisse und Diskussion 2.4 DEG7 wird reduziert in Zellkernen von ∆deg7-Mutanten exprimiert

Die Detektion von überexprimiertem DEG7-GFP (147 kDa) in Zellkernen (Abb. 15) sowie die Entkräftung der publizierten Lokalisierung von DEG7 im Stroma (Abb. 17) durch Immunoblot-Analyse sind deutliche Hinweise für die Lokalisierung von DEG7 im Zellkern. Des Weiteren wurde ein Protein bei dem errechneten Molekulargewicht von DEG7 (120 kDa) in Zellkernen, die aus Wildtyp-Pflanzen isoliert wurden, mit beiden Antiseren (α-DEG7GP, α-DEG7Lys202-Gly216) detektiert (Abb. 18). Das Signal bei 120 kDa sollte nun als nächstes als DEG7-spezifisch identifiziert werden. Hierfür wurde die ∆deg7-1 T-DNA Insertionslinie zu Hilfe genommen (siehe Kapitel 5.1). Fehlt das Signal bei 120 kDa in isolierten Zellkernen der ∆deg7-1-Mutante kann das detektierte Protein zweifelsfrei als DEG7 identifiziert werden. Es wurden hierfür Zellkerne aus Wildtyp- und ∆deg7-1-Pflanzen isoliert. Die Immunblots wurden mit den Antiseren α-DEG7GP und α-DEG7Lys202-Gly216 analysiert (Abb. 19). Die Isolierung und Immunoblot-Analyse wurde dreimal durchgeführt (A-C). Proteine mit 120 kDa (Abb. 18) wurde mit dem α-DEG7GP Antiserum in Wildtyp-Zellkernen dreimal detektiert (Abb. 19 (A+B)).

Jedoch wurde nicht nur in Kernextrakten aus Wildtyp-Pflanzen sondern auch in ∆deg7-1-Kernextrakten ein Protein mit 120 kDa detektiert. Es wurde aber eine deutliche Abnahme der Intensität des Signals bei 120 kDa in Kernextrakten aus ∆deg7-1-Pflanzen festgestellt. Das α-DEG7Lys202-Gly216 Antiserum reagierte dieses Mal weder im Kernextrakt von Wildtyp-Pflanzen noch von ∆deg7-1-Mutanten (A+B) mit Proteinen bei 120 kDa. Die Unzuverlässigkeit des α-DEG7Lys202-Gly216 Antiserums wurde in bisherigen Experimenten bereits beobachtet. Bei der Isolierung der Zellkerne in Abb. 19 (C) wurde Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in den Isolierungs-Puffern zugegeben. PMSF inhibiert die proteolytische Aktivität von Serinproteasen und verhindert somit auch eine mögliche Autoproteolyse von DEG7. Beide Antiseren reagierten mit einem Protein bei 120 kDa im isolierten Wildtyp-Zellkernextrakt. Dieses Mal zeigte das α-DEG7GP Antiserum kein Signal im Kernextrakt aus ∆deg7-1-Mutanten, während mit dem α-DEG7Lys202-Gly216 Antiserum noch ein schwaches Signal bei 120 kDa erahnt werden kann (Abb.

19 (C)). Um auszuschließen, dass es beim Abernten der ∆deg7-1-Samen zur Untermischung von einzelnen Wildtyp-Samen kam, was das schwache Signal in den isolierten ∆deg7-1-Zellkernen erklären würde (Abb. 19 (C)), wurde der verwendete ∆deg7-1-Pflanzenrasen überprüft. Hierfür wurde aus mehreren Pflanzen des ∆deg7-1-Rasens DNA isoliert und anschließend mit PCR auf das Vorhandensein des DEG7-Gens untersucht (Daten nicht gezeigt).

In der PCR wurde DEG7 nicht amplifiziert, wodurch belegt werden konnte, dass die verwendete

∆deg7-1-Samencharge sehr wahrscheinlich frei von Wildtyp-Samen war. Die schwache Bande bei 120 kDa im Zellkernextrakt der ∆deg7-1-Mutante ist also dadurch nicht begründbar. In den drei unabhängigen Experimenten wurden in Proteinextrakten aus ∆deg7-1-Zellkernen zwar ein Protein mit 120 kDa detektiert, die Intensität des Signals war jedoch deutlich schwächer als bei den korrespondierenden Proben aus Wildtyp-Pflanzen. Es kann anhand der RT-PCR der ∆deg7-1-Mutante in Kapitel 5.1 weitestgehend ausgeschlossen werden, dass die Expression von DEG7 in der ∆deg7-1-Mutante nur reprimiert wurde. Deshalb ist es wahrscheinlicher, dass die Seren ein zweites kernlokalisiertes Protein, das ungefähr 120 kDa groß ist, erkennen.

Ergebnisse und Diskussion

Abb. 19: Reduzierte Expression von DEG7 im Proteinextrakt von isolierten ∆deg7-Zellkernen Es wurden dreimal Zellkerne aus Wildtyp- und ∆deg7-1-Pflanzen isoliert (A-C). Das SDS-Gel in A wurde mit 5µg Protein und in B+C mit 10µg Protein pro Spur beladen. Die Immunoblot-Analyse mit beiden Antiseren ergab, dass das Signal bei 120 kDa im Wildtyp-Zellkernextrakt hinsichtlich der Intensität im Proteinextrakt von Zellkernen der

∆deg7-1-Mutante abnimmt und somit mit DEG7 in Verbindung gebracht werden kann. Die Antiseren reagieren vermutlich mit einem weiteren Zellkern-Protein von 120 kDa. Vermutlich wird von den Antiseren ein verkürztes DEG7-Produkt erkannt, das bis zur Insertionsstelle noch abgelesen wird (grüner Kasten, 39.6kDa), schematisch dargestellt in (D). Bei dem Protein bei 25 kDa, dass von beiden Antiseren detektiert wird (blauer Kasten), handelt es sich um ein nicht identifiziertes Protein. Ein weiteres unspezifisches Signal wird vom α-DEG7GP Antiserum im Zellkernextrakt von Wildtyp-Pflanzen bei 55 kDa detektiert (roter Kasten).

Ergebnisse und Diskussion Neben dem Protein bei 120 kDa reagieren beide Antiseren mit zahlreichen anderen Proteinen.

Die Proteine, die vom α-DEG7GP Antiserum erkannt werden, sind in allen drei Immunoblots identisch (Abb. 19 (A-C)). Es gibt ein Signal bei 55 kDa, das ausschließlich im Proteinextrakt von isolierten Wildtyp-Zellkernen vorkommt (rot) und ein Signal bei 25 kDa, das nur in der Zellkernfraktion aus ∆deg7-1-Mutanten erkannt wird (blau), wobei auch mit dem α-DEG7 Lys202-Gly216 Antiserum ein Protein bei 25 kDa detektiert wird, aber nicht nur in der Fraktion der isolierten ∆deg7-1-Zellkernen sondern auch in Wildtyp-Zellkernen (blau). Es gibt aber keine ersichtliche Verbindung der rot und blau markierten Proteine zu DEG7. Bei dem grün markierten Signal, das im Zellkernproteinextrakt aus ∆deg7-1-Pflanzen sowohl vom α-DEG7GP

Antiserum als auch vom α-DEG7Lys202-Gly216 Antiserum erkannt wurde (Abb. 19 (A+B)), handelt es sich um zwei Proteine mit Größen von ~39 und 45 kDa. Je nach Auftrennung wurden die beiden Proteine getrennt sichtbar. Das Protein mit 45 kDa wurde auch im Zellkernextrakt von Wildtyp-Pflanzen detektiert, während das Protein mit 39 kDa nur im Zellkernextrakt von

∆deg7-1-Mutanten vorkommt. Bei dem Signal mit 39 kDa handelt es sich möglicherweise um ein C-terminal verkürztes DEG7, das noch bis zur T-DNA Insertionsstelle im Exon 11 translatiert wird. Die errechnete Größe dieses C-terminal verkürzten DEG7 wäre 39,6 kDa, was dem Signal entspricht (Abb. 19 (D)). Da dieses Protein nur im Knockout vorkommt und mit beiden Antiseren erkannt wird, ist es zwar spekulativ aber durchaus denkbar, dass es sich um ein verkürztes DEG7-Produkt handelt. Würde es sich um das verkürzte DEG7 handeln, lässt sicher weiter ableiten, dass die funktionale KLS vor der Insertionsstelle liegen muss, da es immer noch im Zellkernextrakt identifiziert wurde. Es wäre darüber hinaus vorstellbar, dass das verkürzte DEG7 noch aktiv ist, da sowohl die aktive Proteasedomäne als auch eine PDZ-Domäne enthalten sind. In Kapitel 5.5 wurde jedoch gezeigt, dass nach Auslösen des programmierten Zelltods durch das Mycotoxin Fumonisin B1 die ∆deg7-1-Mutante im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen eine bessere Überlebensrate aufweist. Die Funktion von DEG7 in den ∆deg7-1-Pflanzen wird also nicht mehr erfüllt und auch nicht durch das verkürzte DEG7 ersetzt. Es spricht des Weiteren gegen ein aktives verkürztes DEG7, dass DEG-Proteasen oftmals erst als Oligomere aktiv werden und DEG7 trimerisiert über die C-terminal degenerierte Proteasedomäne, die im verkürzten DEG7 fehlt.

Allgemein ist festzustellen, dass das Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216 mit vielen unspezifischen Proteinen reagiert. Es ist nicht gelungen, im Proteinextrakt von isolierten ∆deg7-1-Zellkernen die Abwesenheit des Signals bei 120 kDa aufzuzeigen sondern nur eine Abnahme der Intensität, da das Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216 vermutlich mit einem weiteren kernlokalisierten Protein von 120 kDa reagiert. Es besteht deshalb die Möglichkeit das Antiserum aufzureinigen um u.a.

den Antikörper, der mit dem kernlokalisierten Protein von 120 kDa reagiert, zu entfernen.

Ergebnisse und Diskussion

3. Versuche zum Erhalt eines spezifischen DEG7-Antikörpers

In diesem Teil der Arbeit sollte versucht werden, einen für DEG7 in A. thaliana spezifischen Antikörper zu erhalten. Es ist nämlich in Kapitel 2 nicht ausreichend gelungen, die Lokalisierung von DEG7 im Zellkern mittels Immunoblot-Analyse nachzuweisen. Es konnte zwar gezeigt werden, dass DEG7 mit GFP markiert und überexprimiert im Zellkern lokalisiert ist sowie, dass natives DEG7 nicht im Stroma nachweisbar ist, wohingegen bei ähnlicher Proteinmenge in Zellkernen ein Protein mit 120 kDa detektiert werden konnte. Das detektierte Protein bei 120 kDa, das in isolierten Wildtyp-Zellkernen vom Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216

erkannt wird, wurde in Zellkernen aus ∆deg7-Mutanten noch immer schwach detektiert. Das α-DEG7Lys202-Gly216 Antiserum reagiert vermutlich neben DEG7 mit einem weiteren kernlokalisierten Protein bei 120 kDa und erkennt weitere kleinere unspezifische Proteine. Das Antiserum sollte deshalb optimiert und von diesen Antikörpern befreit werden.

3.1 Aufreinigung des Antiserums α-DEG7Lys202-Gly216 über positive und negative Adsorption

Mit einer Aufreinigung des Antiserums kann versucht werden unspezifische Signale zu reduzieren und die Spezifität für DEG7 zu erhöhen. Die Aufreinigung des Antiserums hat das Ziel das detektierte Protein bei 120 kDa in Wildtyp-Zellkernen durch die Abwesenheit im Zellkernextrakt einer ∆deg7-Pflanze als DEG7 nachzuweisen indem u.a. der Antikörper, der vermutlich mit einem weiteren kernlokalisierten Protein bei 120 kDa reagiert, zu entfernen.

Darüber hinaus würde ein funktionierender Antikörper ermöglichen putative Substrate von DEG7 beispielsweise durch Co-Immunopräzipitation zu identifizieren. Bevor das Antiserum aufgereinigt wurde, wurde noch abgeschätzt ob das Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216 nur die Antigensequenz in DEG7 oder auch in den anderen A. thaliana Deg-Proteasen erkennen würde.

Bedenkt man nämlich, dass die Region um das katalytische Serin in der Proteasedomäne in den Deg-Proteasen aus A. thaliana konserviert ist, kann vermutet werden, dass das Antiserum nicht nur DEG7 sondern auch weitere Deg-Proteasen erkennt. Diese Bedenken konnten nach Vergleich der Region durch ein Alignment mit dem Programm TCoffee um das katalytische Serin von den sechzehn Deg-Proteasen abgeschwächt werden. Über eine BLAST-Suche wurde des Weiteren ermittelt ob das Antigen um das katalytische Serin206 von DEG7 im Proteom von A.thaliana weitere Proteine vorhersagt. Es wurden zwar Proteine gefunden, die in ihrer Sequenz einige aufeinanderfolgende Aminosäuren der Antigensequenz besitzen, sie sind aber hinsichtlich ihres Molekulargewichts um einiges kleiner als DEG7. Es wurde daraufhin entschieden eine Aufreinigung des Antiserums zu versuchen.

Zur Aufreinigung des Antiserums mussten zunächst zwei Antigene, DEG7Met1-Gln563 und P5CR, über eine Nickelaffinitätschromatographie aufgereinigt und an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose gebunden werden. Die Aufreinigung des Rohserums α-DEG7Lys202-Gly216 erfolgte nach dem Prinzip der negativen und positiven Adsorption. Die P5CR-Säule sollte durch negative Adsorption Antikörper, die gegen Proteinabschnitte, die aufgrund des Überexpressionskonstrukts entstanden sind, an die Säule binden und das Antiserum

α-Ergebnisse und Diskussion DEG7Lys202-Gly216 von ihnen befreit werden. Die DEG7-Peptidantikörper verlassen bei der negativen Adsorption die P5CR-Säule im Durchfluss und wurden anschließend durch positive Adsorption an die Säule, die das Antigen DEG7Met1-Gln563 enthält, gebunden. Weitere unspezifische Antikörper werden auf diese Weise von den DEG7-Peptidantikörpern getrennt und verlassen die DEG7Met1-Gln563-Säule im Durchfluss. Durch Erniedrigung des pHs werden schließlich die DEG7-Peptidantikörper von der Säule eluiert (Abb. 20).

Abb. 20: Schematische Darstellung der Antiserum Aufreinigung

Die Aufreinigung erfolgte über eine negative und positive Adsorption (schwarz: Antikörper gegen Proteinabschnitte, die aufgrund des Überexpressionskonstrukts entstanden sind; rot: unspezifische Antikörper; grün: DEG7Lys202-Gly216 -Antikörper)

3.1.1 Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563

Um das Rohserum α-DEG7Lys202-Gly216 aufreinigen zu können, war es zunächst notwendig ein geeignetes DEG7-Antigen heterolog in E. coli zu exprimieren und über eine Nickelaffinitätschromatographie aufzureinigen. Das Orginal-Antigen, das zur Immunisierung des Kanninchens verwendet wurde, ist bei Agrisera verblieben. Es wurde als Antigen DEG7 Met1-Gln563 (ca. 65 kDa) gewählt, da bereits ein Protokoll zum Erhalt dieses aufgereinigten rekombinanten Proteins vorhanden war (modifiziert aus Schuhmann et al. (2011)). DEG7 Met1-Gln563 anstelle des Orginalpeptids bei der Antiserum Aufreinigung zu verwenden, hat noch den Vorteil, dass das Antigen in seiner natürlichen Proteinumgebung präsentiert wird. Der DEG7-Peptidantikörper erkennt die Aminosäuren um das katalytische Serin206 in der N-terminalen aktiven Proteasedomäne, wodurch es ausreichend war die N-terminalen 563 As von DEG7, die die Proteasedomäne enthalten, zu verwenden. Das an die Säule der Nickelaffinitäts-chromatographie gebundene DEG7Met1-Gln563 eluierte bei einer Imidazolkonzentration von 25 mM, was durch den Anstieg der Absorption bei 280 nm auf ungefähr 2500 mAU im Chromatogramm ersichtlich wurde (Abb. 21 (A)). Im Coomassie-gefärbten SDS-Gel dieser beiden Elutionsfraktionen mit 2500 mAU (Spuren 27/28) wurde DEG7Met1-Gln563 bei 65 kDa deutlich ersichtlich (Abb. 21 (B)). Die Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563 für die

Ergebnisse und Diskussion

Antiserum Aufreinigung erfolgte mit geringen Verunreinigungen durch E. coli Proteine, die vermutlich aufgrund eines hohen Gehalts an Histidinresten mit ähnlicher Affinität an die Säule gebunden waren und deshalb mit DEG7Met1-Gln563 koeluierten.

Abb. 21: Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563 für die Antiserum-Aufreinigung

(A)Chromatogramm der Nickelaffinitätschromatographie zur Aufreinigung von DEG7Met1-Gln563 (blau=Absorption bei 280nm [mAU]). (B) Coomassie-gefärbtes 10% SDS-Gel der Aufreinigung von DEG7Met1-Gln563 (65 kDa) (P: Pellet;

L: lösliche Proteinfraktion; 3: Durchfluss; 15: 25% Glycerol-Eluat; 27/28: Elutionsfraktionen bei 25mM Imidazol)

3.1.2 Aufreinigung von Pyrrolin-5-Carboxylatreduktase (P5CR) für die negative Adsorption

Für die Antiserum Aufreinigung wurde ein weiteres Protein, P5CR, aufgereinigt, das für die negative Adsorption eingesetzt werden sollte. Das Gen P5CR (At5g14800) liegt im identischen Vektor kloniert vor wie DEG7Met1-Gln563 (Tab. 17). Durch die negative Adsorption sollte erreicht werden, dass das Antiserum von Antikörpern, die gegen Proteinabschnitte, die aufgrund des Überexpressionskonstrukts entstanden sind, sowie gegen His-reiche E. coli-Proteine oder die Sepharose-Matrix gerichtet sind, befreit werden. Die Aufreinigung von P5CR über eine Nickelaffinitätschromatographie wurde von Giberti et al. (2014) modifiziert. P5CR (32.5 kDa) weist eine hohe Affinität zur Säule auf und wird erst mit 400 mM Imidazol quantitativ von der Säule eluiert (Abb. 22 (A)). Die Elution von P5CR erfolgte nach zwei Imidazolstufen, die

Ergebnisse und Diskussion zunächst histidinreiche E. coli Proteine bei 40 und 60 mM Imidazol von der Säule eluieren sollten um einen ähnlichen Reinheitsgrad wie bei der Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563

zu erhalten. Im Coomassie-gefärbten SDS-Gel (Abb. 22 (B)) ist zu erkennen, das eine erhebliche Menge an P5CR bereits mit 60 mM Imidazol von der Säule eluierte (Spuren 9/10), aber noch mehr Verunreinigungen aufwies als die beiden Fraktionen bei der Elution mit 400 mM Imidazol (Spuren18/19). Die größte Konzentration an P5CR eluierte in den Elutionsfraktionen 18 und 19 (400 mM Imidazol), wo es auch zu einem deutlichen Anstieg der Absorption bei 280 nm kam und ein Gipfel bei ~800 mAU erreicht wurde.

Abb. 22: Aufreinigung von P5CR für die Antiserum Aufreinigung von α-DEG7Lys202-Gly216

(A) Chromatogramm der Aufreinigung von P5CR über eine Nickelaffinitätschromatographie (blau: Absorption bei 280 nm [mAU]), (B) Coomassie-gefärbtes 14% SDS-Gel der Aufreinigung von P5CR (32.5 kDa) (P:Pellet; L:

lösliche Proteinfraktion; 3: Durchfluss; 9/10: Elutionsfraktionen bei 60 mM Imidazol; 18/19: Elutionsfraktionen bei 400 mM Imidazol)

3.2 Die Aufreinigung des Antiserums α-DEG7Lys202-Gly216 führte zu einer Verbesserung der Sensitivität und Spezifität für DEG7

Der aufgereinigte Peptidantikörper α-DEG7Lys202-Gly216 wurde nach der Aufreinigung aus dem Rohserum über Immunoblot-Analyse mit isolierten Zellkernen aus Wildtyp-Pflanzen und

Ergebnisse und Diskussion

∆deg7-Pflanzen hinsichtlich seiner Sensitivität und Spezifität für DEG7 überprüft (Abb. 23 (A)) und die Detektionsgrenze anhand bekannter Mengen an rekombinantem DEG7 (Met1-Asp1070) ermittelt (Abb. 23 (B)). Die Konzentration an rekombinantem DEG7 im Gesamtproteinextrakt von E. coli wurde anhand eines SDS-Gels abgeschätzt, das bekannte Mengen des Rinderserumalbumins (BSA) enthielt (Daten nicht gezeigt). Die Detektionsgrenze des Rohserums α-DEG7Lys202-Gly216 für heterolog exprimiertes DEG7 in E. coli Gesamtprotein liegt bei ungefähr 12,5 ng (Abb. 23 (B)). Das Rohserum reagiert im E. coli Gesamtprotein mit zahlreichen weiteren Proteinen, die sich auch im Bereich des Molekulargewichts des rekombinanten DEG7 befinden. Nach der Antiserum Aufreinigung zeigte sich, dass sich die Detektionsgrenze des aufgereinigten α-DEG7Lys202-Gly216 auf 2,5 ng rekombinantes DEG7 reduziert hat und somit die Sensitivität erhöht wurde (Abb. 23 (B)). Da die Expositionszeiten der beiden Immunoblots ähnlich war, kann festgestellt werden, dass es durch die Aufreinigung des Antiserums gelungen ist, die Detektionsgrenze herabzusetzen d.h. DEG7 wird bereits bei niedrigerer Anzahl an DEG7-Molekülen pro Membranfläche erkannt. Dies ist hilfreich, da DEG7 vermutlich gering exprimiert vorliegt, wodurch die Detektion im Immunoblot erschwert wird. Des Weiteren wurde erreicht, dass unspezifische Antikörper aus dem Rohserum entfernt wurden und dadurch die Detektion unspezifischer Proteine reduziert werden konnte.

Abb. 23: Die Antiserum Aufreinigung von α-DEG7Lys202-Gly216 führt zu einer verbesserten Spezifität und Sensitivität für DEG7

(A) Immunoblot von Zellkernisolaten aus Wildtyp- und ∆deg7-Pflanzen wurden mit dem aufgereinigten α-DEG7Lys202-Gly216 analysiert. Eine Verbesserung der Spezifität für DEG7 konnte erreicht werden, es werden jedoch weiterhin unspezifische Proteine detektiert. Es ist weiterhin nicht mit Sicherheit festzustellen, dass es sich bei den beiden Signalen bei 130 kDa um die DEG7 Spleißvarianten α und β handelt. (5 µg/ Gelspur) (B) Immunoblot mit Gesamtprotein aus E. coli, die DEG7 heterolog exprimieren. Die Immunoblots wurden mit dem Rohserum und dem aufgereinigten α-DEG7Lys202-Gly216 analysiert. Es wurde ersichtlich, dass die Detektionsgrenze für DEG7 verbessert werden konnte sowie die Detektion von unspezifischen Proteinen reduziert werden konnte. (ng rekombinantes DEG7 / Gelspur)

Als nächstes wurde das aufgereinigte Antiserum α-DEG7Lys202-Gly216 auf seine Spezifität für natürlich vorkommendes DEG7 aus A. thaliana überprüft (Abb. 23 (A)). Im Zellkernisolat aus Wildtyp-Pflanzen (Abb. 23 (A)) wurde u.a. ein Signal oberhalb von 130 kDa detektiert und ein

Ergebnisse und Diskussion erheblich schwächeres Signal, das etwa 5 kDa kleiner ist. Das Signal bei 130 kDa ist im Zellkernisolat von ∆deg7-Mutanten fast nicht mehr zu erkennen und das kleinere Signal nicht mehr vorhanden. Die Vermutung, dass es eine Verbindung zwischen den beiden Proteinen und DEG7 gibt, bleibt bestehen. Es könnte sich um die beiden DEG7 Spleißvarianten handeln, denn die kleinere Spleißvariante DEG7β ist berechnet ungefähr 3 kDa kleiner. Der mRNA-Level von DEG7β ist in der Zelle kleiner als von DEG7α (Hund 2010), was mit den Bandenintensitäten im Wildtyp-Zellkernisolat im Immunoblot in Abb. 23 (A) einhergehen würde. In dieser Arbeit wurde bereits über GFP-Fluoreszenz gezeigt, dass beide Spleißvarianten von DEG7 im Zellkern

Im Dokument Lokalisierung und physiologische Charakterisierung der Serinprotease DEG7 in Arabidopsis thaliana (Seite 43-0)