Untersuchung der murinen, pulmonalen Infektion mit Listeria monocytogenes im Hinblick auf eine mögliche Eignung des Bakteriums als Vektor für
die somatische Gentherapie der Cystischen Fibrose
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Antje Munder aus Remscheid
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H.J. Hedrich
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.J. Hedrich 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2003
Die Dissertation wurde aus Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft, He1058/2-3, gefördert und erhielt finanzielle Unterstützung der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig, an der ein Teil der experimentellen Arbeit durchgeführt wurde.
Für meine Familie
und im Andenken an meinen Sohn Lennard
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 13
2 LITERATURÜBERSICHT 15
2.1 Cystische Fibrose (CF) 15
2.1.1 Pathogenese der pulmonalen Erkrankung der CF 17 2.1.2 CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) 18
2.1.3 Murines Cftr 20
2.2 Mausmodelle für die CF 21
2.3 Ansätze zur Gentherapie der CF 25
2.3.1 Die Lunge als Zielorgan der Gentherapie für die CF 25 2.3.2 Vektormodelle für die Gentherapie der CF 27
2.3.3 Virale Vektoren 29
2.3.3.1 Adenoviren 30
2.3.3.2 Adenoassoziierte Viren 31
2.3.3.3 Retroviren 32
2.3.4 Nicht-virale Vektoren 33
2.3.4.1 Kationische Liposomen 35
2.3.4.2 Kationische Polymere 35
2.3.4.3 Nackte Plasmid-DNA 36
2.4 Bakterien in der Gentherapie 37
2.4.1 Salmonella typhimurium 39
2.4.2 Salmonella typhi 41
2.4.3 Shigella flexneri 42
2.4.4 Escherichia coli 42
2.5 Listeria 43
2.5.1 Infektionszyklus und Virulenzfaktoren von L. monocytogenes 44
2.5.2 Listeriose 49
2.5.3 Attenuierte Mutanten von L. monocytogenes 52
2.5.4 L. monocytogenes-vermittelter Gentransfer 53 2.6 Murine Suszeptibilität gegenüber Infektionserregern 56
2.6.1 BALB/c 56
2.6.2 DBA/2J 56
2.6.3 C57BL/6 57
2.6.4 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes 58
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 62
3.1 Material 62
3.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 62
3.1.2 Geräte und Laborgegenstände 67
3.1.3 Versuchstiere 69
3.1.3.1 Mäuse 69
3.1.3.2 Haltung der Mäuse 69
3.1.3.3 Kaninchen 70
3.1.4 L. monocytogenes-Stämme 72
3.1.5 Kulturmedien 72
3.2 Methoden 73
3.2.1 Herstellen der Inokulationssuspension 73
3.2.1.1 Titration einer Wachstumskurve von L. monocytogenes 75
3.2.2 Narkose der Versuchstiere 76
3.2.3 Applikationsmethoden 76
3.2.3.1 Intratracheale (i.t.) Applikation 76
3.2.3.2 Blinde Instillation 77
3.2.3.3 Tracheotomie 77
3.2.3.4 Nasale Applikation 77
3.2.3.5 Intragastrische (i.g.) Applikation 77
3.2.4 Messung der Rektaltemperatur 78
3.2.5 Messung des Körpergewichts (KGW) 79
3.2.6 Beurteilung des Allgemeinzustandes 79
3.2.7 Versuchsaufbau 82 3.2.7.1 Methodischer Vergleich von Applikationstechniken 84
3.2.7.2 Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge
nach i.t. Infektion 84
3.2.7.3 Vergleich von i.g. und i.t. Listerieninfektion 85 3.2.7.4 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes EGD wt 86 3.2.7.5 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes EGD
hlyW491A + pERL3-CMVGFP 87 3.2.7.6 Dosis-Zeit-Beziehungen der i.t. Infektion mit
L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP 87
3.2.7.7 Frühe Organdissemination 88
3.2.7.8 Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von
L. monocytogenes EGD wt in der Lunge nach i.t. Applikation 88
3.2.8 Sektion und Organentnahme 89
3.2.9 Keimzahlbestimmung in den Organen 90
3.2.10 Histologie 91
3.2.10.1 Paraffinschnitte 91
3.2.10.2 Gefrierschnitte 92
3.2.10.3 Präparation für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) 93 3.2.10.4 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 93
3.2.11 Mikroskopie 95
3.2.11.1 Lichtmikroskopie 95
3.2.11.2 Fluoreszenzmikroskopie und konfokale Lasermikroskopie 96
3.2.11.3 REM 98
3.2.11.4 TEM 99
3.2.12 Statistische Auswertung 100
4 ERGEBNISSE 101
4.1 Methodischer Vergleich von Applikationstechniken
für die Lunge 101
4.2 Rechts-Links-Verteilung in der Lunge nach i.t. Instillation 106
4.3 Vergleich von i.g. und i.t. Listerieninfektion 108 4.4 Suszeptibilität der Maustämme BALB/c, DBA/2 und
C57BL/6 für die i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD 111 4.5 Suszeptibilität für L. monocytogenes EGD
hlyW491A + pERL3-CMVGFP 119
4.6 Dosis-Zeit-Beziehungen der i.t. Infektion mit
L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP 122
4.7 Frühe Organdissemination 126
4.8 Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von L. monocytogenes EGD wt in der Lunge
nach i.t. Applikation 129
4.9 Histologische Beurteilung 131
4.9.1 Gramfärbungen 131
4.9.2 Fluoreszenzmikroskopie 132
4.9.3 Konfokale Lasermikroskopie 137
4.9.4 REM 141
4.9.5 TEM 142
5 DISKUSSION 150
5.1 Das intratracheale Infektionsmodell 151
5.1.1 Die i.t. sichtkontrollierte Instillation 151 5.1.2 Die Verteilung der Listerien in der Lunge nach i.t. Instillation 155 5.2 Vergleich der Keimsituation in der Lunge nach i.g.
und i.t. Infektion 157
5.3 Suszeptibilität von BALB/c-, DBA/2- und C57BL/6-Mäusen
gegen L. monocytogenes EGD wt und L. monocytogenes
EGD hlyW491 A + pERL3-CMVGFP 159
5.4 Infektionsverlauf und Pathogenität des attenuierten Stamms L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-
CMVGFP nach i.t. Infektion in der Maus 162 5.5 Frühe Ausbreitung der attenuierten Listerien nach
i.t. Infektion 165
5.6 Die histologischen Befunde der i.t. Listerieninfektion 166 5.6.1 Pathohistologische Veränderungen des Lungengewebes 167 5.6.2 Der allgemeine Nachweis von Listerien im histologischen
Präparat 168
5.6.3 Die Differenzierung intrazellulärer Listerien 169 5.7 Der quantitative Nachweis von Listerien in Epithelzellen
der murinen Lunge 171
5.8 Der Versuchsansatz 172
5.9 Ausblick 175
6 ZUSAMMENFASSUNG 176 7 SUMMARY 178
8 LITERATURVERZEICHNIS 180
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
α alpha
AAV Adenoassoziierte Viren
Abb. Abbildung Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser
ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise ca. cirka
cAMP zyklisches (cyclo-) Adenosinmonophosphat
CF Cystische Fibrose
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (human)
Cftr Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (murin)
cGMP zyklisches (cyclo-) Guaninmonophosphat
CH Schweiz
CHO Chinese Hamster Ovary
cm Zentimeter Cy3 Indocarbocyanin Cy5 Indodicarbocyanin d Tag
D Deutschland
d.h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli
et al. und andere
FITC Fluoreszein-Isothiocyanat γ gamma
GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung
GenTG Gentechnikgesetz
GenTSV Gentechniksicherheitsverordnung
GFP grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein) gg. gegen
h Stunde
HE Hämatoxylin-Eosin hly Listeriolysin-Gen
i.d.R. in der Regel
IE Internationale Einheit
i.g. intragastrisch IL Interleukin i.n. intranasal INF Interferon Inl Internalin i.p. intraperitoneal i.t. intratracheal i.v. intravenös
IVC einzeln ventilierter Käfig (individually ventilated cage) Kap. Kapitel
KBE koloniebildende Einheiten
kbp Kilobasenpaare kDa Kilodalton KGW Körpergewicht l Liter
LD50 Letale Dosis von 50% für der Versuchstiere LLO Listeriolysin
L. monocytogenes Listeria monocytogenes
L.m. Listeria monocytogenes
µg Mikrogramm µl Mikroliter MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
min Minuten mind. mindestens mm Millimeter mmol Millimol
mRNA Boten (messenger) Ribonukleinsäure NL Niederlande nm Nanometer
OD optische Dichte
PBS Phosphat gepufferte Salzlösung
PD Potentialdifferenz
p.i. post infectionem
rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) REM Rasterelektronenmikroskopie RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur s Sekunden s. siehe s.c. subkutan SF Standardfehler S. typhi Salmonella typhi
S. typhimurium Salmonella typhimurium S. flexneri Shigella flexneri
S2 Sicherheitsstufe 2 nach GenTG
TEM Transmissionselektronenmikroskopie TNF Tumornekrosefaktor
u.U. unter Umständen
v.a. vor allem
vgl. vergleiche
wt Wildtyp
z.B. zum Beispiel
ZTL Zentrales Tierlabor
1 EINLEITUNG
Bei der Cystischen Fibrose handelt es sich um eine schwere monogene Erbkrankheit, der häufigsten in der kaukasischen Bevölkerung. Trotz Fortschritten in der Therapie und einer Verlängerung der Lebenszeit der Patienten bis ins Erwachsenenalter ist die Krankheit bis heute unheilbar. Als Ende der 80er Jahre erste Ansätze für Gentherapien geschaffen wurden, stand die CF aufgrund der Häufigkeit ihres Auftretens und der Schwere der Erkrankung immer im Fokus einer solchen Therapie. Anfänglich große Hoffnungen in schnelle Heilungsmöglichkeiten durch Gentherapie haben sich bisher nicht erfüllt, obwohl zwischenzeitlich zahlreiche potentielle Genvektoren untersucht wurden. Als virale Vektoren dienten Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren. Bei den nicht-viralen Vektoren wurden nackte DNA, Liposomen und Molekularkonjugate untersucht. Neben in vivo Experimenten wurden seit 1993 auch klinische Studien durchgeführt, die Ergebnisse blieben jedoch bis heute unbefriedigend. Neben einer mangelnden Effizienz der Transfektion, die auch durch eine nur kurze Expression des transfizierten Gens ausgedrückt wurde, traten Probleme wie die vektorinduzierte Immunantwort des Wirtes und mangelnder Zielzelltropismus der Vektoren auf. Außer einer Verbesserung der vorhandenen Vektoren wurde deshalb auch nach neuartigen Gentransfersystemen gesucht. Da Bakterien zur DNA-Vakzinierung bereits erfolgreich eingesetzt wurden, fokussierte man nun das Interesse auf ihre mögliche Eignung als Genfähren (WEISS u. KRUSCH, 2001).
Nach Erfolg versprechenden in vitro Studien (KRUSCH et al., 2002) untersucht die vorliegende Arbeit das grampositive Bakterium Listeria (L.) monocytogenes nun in vivo auf seine Eignung als Vektor für eine somatische Gentherapie. Es wurden dabei der Wildtypstamm L. monocytogenes EGD und ein attenuierter Listerienstamm, der in vitro gute Transfektionsergebnisse zeigte, verglichen. Als Tiermodell diente die Maus, wobei etablierte Mausinzuchtstämme verwendet wurden, auf deren genetischem Hintergrund im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover gentechnisch modifizierte CF-Mäuse gezüchtet werden.
Die Arbeit konzentriert sich besonders auf die Fragestellung, ob L. monocytogenes nach topischer Applikation in die Lunge der Maus intrazellulär nachgewiesen werden kann und wenn ja, in welchen Zellen. Um diese Problemstellung bearbeiten zu können, wurde zunächst ein intratracheales Infektionsmodell entwickelt (MUNDER et al., 2002) und die experimentelle pulmonale Listerieninfektion der Mäuse durch verschiedene Dosis-Zeitbeziehungen charakterisiert. Neben der Beschreibung des Infektionsverlaufs durch die Parameter Organkeimzahlen, Allgemeinbefinden, Körpergewicht und Rektaltemperatur wurden mit verschiedenen histologischen Techniken Präparate Listerien-infizierter Lungen angefertigt, die unter den Kriterien Entzündungsreaktionen der Lunge und Dichte und Lokalisation der Keime im Lungengewebe beurteilt wurden.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Cystische Fibrose (CF)
Bei der CF handelt es sich um eine monogene autosomal rezessiv vererbte Funktionsstörung, die durch eine generalisierte Dysfunktion exokriner Drüsen bedingt wird. Mit einer Frequenz von einem heterozygoten Träger auf ca. 20 Menschen ist die CF die häufigste schwere Stoffwechselerkrankung der kaukasischen Rasse. Die Inzidenz der klinischen Erkrankung liegt bei etwa einem Krankheitsfall auf 2500 Geburten (DAVIS et al., 1996). Die Krankheit wurde bereits 1938 beschrieben und erhielt ihren Namen aufgrund der beobachteten cystischen Pankreasfibrose (ANDERSEN, 1938). In den frühen 80er Jahren wurde der pathophysiologische Defekt der CF als Fehlregulation eines cAMP-gesteuerten Chlorid (Cl)-Kanals definiert (KNOWLES et al., 1981; KNOWLES et al., 1983), 1985 wurde der Defekt auf Chromosom 7 lokalisiert (TSUI et al., 1985). 1989 wurde schließlich das verantwortliche Gen identifiziert (KEREM et al., 1989; RIORDAN et al., 1989;
ROMMENS et al., 1989) und sein Produkt als Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) bezeichnet. Seither wurden über 1000 krankheitsauslösende Mutationen identifiziert (CYSTIC FIBROSIS GENETIC ANALYSIS CONSORTIUM, 2003), von denen mit annähernd 70 % die häufigste die F508del ist. Es handelt sich dabei um eine In-frame-Deletion, die den Verlust der Aminosäure Phenylalanin an Position 508 verursacht (DAVIS et al., 1996). Von den übrigen Mutationen kommen nur noch G542X, G551D, W1282X, N1303K und R553X in > 1% der Krankheitsfälle vor (CYSTIC FIBROSIS FOUNDATION, 2003;
GALLATI, 2001). Die Mutationen bedingen das Fehlen oder eine Fehlfunktion bzw.
Verlagerung des cAMP-gesteuerten CFTR-Kanals, was eine eingeschränkte Cl- Leitfähigkeit der Zellmembran und damit den gestörten transepithelialen Elektrolyt- und Flüssigkeitstransport zur Folge hat.
Mit dem Wissen über die genetischen Grundlagen der CF begann auch die Suche nach neuen, kausalen Therapieansätzen, wie z.B. der somatischen Gentherapie.
Gleichzeitig wurde durch die Verbesserung konventioneller und Einführung neuer symptomatischer Therapien und ein verbessertes Krankheitsmanagement die Lebenserwartung der CF-Patienten deutlich erhöht (DAVIS et al., 1996). In Europa lag der Überlebensmedian 1940 bei einem Jahr, 1960 bei 10 Jahren, 1997 bei 32 Jahren (in Deutschland bei 29,6 Jahren, HAUBER et al., 2001). Neuere Zahlen belegen einen weiteren Anstieg der Lebenserwartung (CYSTIC FIBROSIS FOUNDATION, 2003; HAUBER et al., 2001). Die Diagnose CF wird gestellt, wenn bei einem Patienten die Cl-Konzentration im Schweiß > 60 mmol/l liegt und gleichzeitig eine chronische pulmonale Erkrankung oder eine Pankreasinsuffizienz oder beides vorliegt oder ein CF-Fall in der nahen Verwandtschaft bekannt ist (EICHLER et al., 2001; ROSENSTEIN u. CUTTING, 1998). Ein abnormer Schweiß- Test stellt zusammen mit Lungen- und Pankreas-Erkrankung die „diagnostische Trias“ der klassischen CF dar (DAVIS u. DI SANT'AGNESE, 1984). Es gibt jedoch atypische Formen, die nur durch eines dieser Merkmale charakterisiert sein können (DAVIS et al., 1996; DAVIS et al., 1980). Eine Genotypisierung, wie sie für die häufigsten Mutationen möglich ist, kann die Diagnose ebenso absichern, wie die Messung der nasalen, transepithelialen Potentialdifferenz (PD) oder die Messung der Cl-Leitfähigkeit einer Rektumbiopsie (Intestinal Current Measurement) (DEQUEKER et al., 2000; KNOWLES et al., 1981). Da es sich bei der CF um eine systemische Veränderung der sezernierenden Zellen aller exokrinen Drüsen handelt, sind sowohl Respirations- und Gastrointestinaltrakt als auch exokrines Pankreas, hepatobiliäres System und die Fortpflanzungsorgane betroffen. Im Vordergrund der CF stehen aber die pulmonalen und gastrointestinalen Symptome, wobei meistens die pulmonale Erkrankung prägend für den Krankheitsverlauf ist, da sie die Todesursache von über 90% der Patienten darstellt (DAVIS et al., 1996). Symptome der pulmonalen Erkrankung der CF sind die Verlegung der Atemwege durch zähen Schleim, chronische bakterielle Infektionen, Entzündungsreaktionen, wie Bronchitis, Peribronchitis und Pneumonie und schließlich der Verlust der Lungenfunktion (EICHLER et al., 2001; PSCHYREMBEL, 1993; ROBINSON, 2001). Da die Lunge das Zielorgan der somatischen Gentherapie darstellt, soll im Folgenden die Entwicklung der pulmonalen Erkrankung der CF kurz umrissen werden.
2.1.1 Pathogenese der pulmonalen Erkrankung der CF
Obwohl die Erkrankung der Lunge die Ursache der Mortalität in den meisten CF- Fällen darstellt, werden intrauterin bzw. kurz nach der Geburt noch keine pathologischen Auffälligkeiten festgestellt (STURGESS u. IMRIE, 1982;
ARMSTRONG et al., 1995). Die Aufweitung der Ausführungsgänge der submukösen Drüsen durch Hypersekretion und Sekretansammlung tritt als erster histopathologischer Befund noch vor Infektionen der Atemwege auf. Auch ohne infektiöse Stimuli kommt es im Respirationstrakt zu Entzündungsreaktionen (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999; ZAHM et al., 1997).
Die Drüsenzellen der submukösen Drüsen besitzen mehr CFTR-mRNA als die Epithelzellen (KALIN et al., 1999; AEBI et al., 2001), so dass in diesen Drüsen bereits im frühen Krankheitsstadium Veränderungen durch das Fehlen oder die Dysfunktion des CFTR-Kanals nachgewiesen werden. Der eingeschränkte Transport von Cl-Ionen und Flüssigkeit führt zur Sekreteindickung und damit zur Störung der mukoziliären Clearance. Diese Clearance bezeichnet den Abtransport von Bronchialsekret und inhalierten Partikeln durch das zilientragende respiratorische Epithel und ist neben dem Husten der wichtigste Selbstreinigungsmechanismus der Lunge. Die pathophysiologischen Verhältnisse in der CF-Lunge begünstigen die bakterielle Kolonisation, die mukoziliäre Clearance wird weiter beeinträchtigt, und es kommt zu erneuten Infektionen (Abb. 1).
Die beschriebene Schwächung der mechanischen Abwehr des Respirationstraktes hat die Besiedlung mit vorwiegend opportunistischen Keimen eines erstaunlicherweise kleinen Spektrums zur Folge: Staphylococcus aureus, nicht bekapselte Haemophilus influenzae, mukoide Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia und Stenotrophomonas maltophilia (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999; RATJEN u. DÖRING, 2003; GOVAN u. DERETIC, 1996). Als natürlicher Bewohner der Nasenschleimhaut verursacht Staphylococcus aureus oft die ersten Infektionen der CF-Lunge im frühen Kindesalter und ist durch ansteigende Antibiotikaresistenzen zunehmend schwer zu bekämpfen (DAVIS et al., 1996;
TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999).
Später im Krankheitsverlauf kommt es zur Besiedlung mit Pseudomonas aeruginosa (GOVAN u. DERETIC, 1996). Da Pseudomonas aeruginosa chemotherapeutisch kaum zu eliminieren ist, wird dabei häufig die lebenslange Kolonisation durch einen einzigen Klon des Erregers beobachtet (GOVAN u. DERETIC, 1996; ROMLING et al., 1994; TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Infektionen mit Burkholderia cepacia werden nur bei wenigen heranwachsenden oder erwachsenen CF-Patienten gefunden, wobei chronische Infektionen in etwa einem Drittel der Fälle zu einer dramatischen Verschlechterung des Krankheitsverlaufs führen.
Abb. 1: Pathophysiologische Kaskade der pulmonalen Erkrankung der CF (nach DAVIS et al., 1996). Erläuterung im Text.
2.1.2 CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)
1989 wurde auf Chromosom 7 an Position q31 das 250 kbp große und 27 Exone umfassende CFTR-Gen identifiziert (BUCHWALD et al., 1989; KEREM et al., 1989;
ROMMENS et al., 1989; RIORDAN et al., 1989). Das Produkt des CFTR-Gens stellt einen aus 1480 Aminosäuren bestehenden, apikalen Kanal dar, der durch cAMP
reguliert wird (ANDERSON et al., 1991c, BEAR et al., 1991; FRIZZELL, 1995).
Strukturell kann das Protein als funktionelles Dimer angesehen werden (Abb. 2), wobei jede Hälfte eine membranumfassende Domäne (MSD1, MSD2) aus jeweils sechs transmembranen Segmenten (Abb.2, als graue Zylinder dargestellt) und eine ATP-spaltende Nukleotid-bindende Domäne (NBD1, NBD2) besitzt, die Sequenzhomologien zur sogenannten ATP-binding Cassette (ABC) aufweisen (SHEPPARD u. WELSH, 1999; AKABAS, 2000; DEVIDAS u. GUGGINO, 1997;
RIORDAN, 1993; RIORDAN et al., 1989). Wegen der Anordnung seiner äußeren hydrophoben transmembranen und inneren hydrophilen Domänen wird CFTR zur Superfamilie der ABC-Transporter gezählt. Die hydrophilen NBDs sind hoch konserviert und werden auch als Walker A- und Walker B-Motive, die bei CFTR funktionell nicht äquivalent sind, bezeichnet. Zwischen den beiden MSD/NBD- Motiven befindet sich eine große Domäne mit vielen geladenen Aminosäureresten, die von Exon 13 kodiert wird und die man als regulatorische oder R-Domäne bezeichnet. Die R-Domäne besitzt zahlreiche Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase A (PKA, Abb. 2) und Proteinkinase C und eine cGMP-abhängige Proteinkinase. Von den Funktionen der CFTR-Domänen bestehen heute folgende Vorstellungen (ANDERSON et al., 1991a; ANDERSON et al., 1991b; FRIZZELL, 1995; HWANG et al., 1994; RICH et al., 1991; SHEPPARD et al., 1993):
1. Die MSD-Domänen bilden die Cl-selektive Membranpore des Kanals.
2. Die Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase A bedingt eine Phosphorylierung der R-Domäne und damit eine Öffnung des Kanals.
3. Die Dephosphorylierung durch Spaltung von energiereichen Nukleosid- triphosphaten, wie ATP, an den NBD-Domänen schließt den Kanal.
Öffnen und Schließen des CFTR-Kanals ist eng an das Gleichgewicht der Aktivität von Proteinkinasen und Phosphatasen und an die intrazellulären ATP-Spiegel gekoppelt. Cl-Ionen strömen passiv entlang des zwischen Innen- und Außenseite der Zellmembran bestehenden elektrochemischen Gradienten durch den CFTR- Kanal. Die Kontrolle des Ionenflusses erfolgt durch den Öffnungszustand des Kanals.
Neben seiner Funktion als Cl-Kanal reguliert CFTR weitere Ionenkanäle und Transportproteine (AKABAS, 2000). Es ist bisher noch unklar, ob diese
Regulationsmechanismen direkt oder indirekt durch andere Proteine vermittelt werden. Obwohl heute eine recht genaue Vorstellung von CFTR als Cl-Kanal in seiner Struktur und Funktion existiert, bedarf vor allem das Zusammenspiel von CFTR mit anderen Kanälen - und damit auch zellulärer Regulationsmechanismen epithelialer Transportvorgänge und deren Pathophysiologie - weiterer Untersuchung.
Abb. 2: Struktur der Domänen des CFTR-Proteins (nach SHEPPARD u. WELSH, 1999).
CFTR besitzt eine symmetrische Struktur mit fünf Untereinheiten: Zwei transmembrane Domänen (MSD1, MSD2), die ihrerseits aus je sechs, die Plasmamembran durchdringenden Segmenten bestehen; NBD1 und NBD2, die als Nukleotid-bindende Domänen jeweils auf die transmembranen Domänen folgen; die regulatorische Domäne R und PKA als cAMP- abhängige Proteinkinase.
2.1.2 Murines Cftr
1991 wurden Klonierung und Sequenzierung des dem humanen CFTR-Gen entsprechenden murinen Gens Cftr von TATA et al. (1991) und YORIFUJI et al.
(1991) beschrieben. Die cDNA der Maus hatte dabei eine Länge von über 6,3 kbp (vgl. Mensch: 6,5 kbp, RIORDAN et al., 1989) und codierte für ein 1476 Aminosäuren großes Protein (vgl. Mensch: 1480 Aminosäuren, Kap. 2.1.2). Humanes und murines CFTR sind in über 78% ihrer Aminosäurensequenzen homolog. Die Sequenzen der transmembranen Domänen und der Nukleotid-bindenden Domänen entsprechen sich
sogar in über 80% (TATA et al., 1991; YORIFUJI et al., 1991). Auch Bereiche, in denen beim Menschen Deletionsmutationen gefunden wurden, wurden bei der Maus übereinstimmend beschrieben. Besondere Bedeutung kommt hier der Aminosäure Phenylalanin an Position 508 zu, der die häufigste menschliche Mutation F508del zugrunde liegt (KELLEY et al., 1992; TATA et al., 1991; YORIFUJI et al., 1991).
Murines Cftr wird in Darm, Lunge, Magen, Nieren und Speicheldrüsen exprimiert, im Gegensatz zum humanen CFTR jedoch nur in geringem Maße in Leber und Pankreas (KELLEY et al., 1992). Der Genort des murinen Cftr lokalisiert zentromernah auf Chromosom 6 in einem konservativen Chromosomensegment, welches seine Entsprechung, einschließlich benachbarter Gene, beim Menschen auf Chromosom 7 findet (KELLEY et al., 1992; SIEGEL et al., 1992).
Da bei der Maus keine spontanen Mutationen des Cftr-Gens bekannt sind, wurden durch zielgerichtete Mutagenese verschiedene Mausmodelle für die cystische Fibrose generiert (Kap. 2.2).
2.2 Mausmodelle für die CF
Seit der Klonierung und Sequenzierung des murinen Cftr-Gens (s. Kap. 2.1.2) sind durch zielgerichtete Mutagenese zahlreiche Cftr-Mausmodelle entstanden (s. Tab. 1;
GRUBB u. BOUCHER, 1999). Die meisten dieser Mutanten zeigen als Homozygote massive pathologische Veränderungen des Gastrointestinaltrakts und eine dadurch bedingte, stark verkürzte Lebensdauer (SNOUWAERT et al., 1995; TEBBUTT, 1995). Die bei der humanen cystischen Fibrose häufig dominierende pulmonale Erkrankung (s. Kap. 2.1.1) wird bei den wenigsten CF-Modellen beschrieben. Der Grund liegt wahrscheinlich in der geringen Lebenserwartung der Mäuse oder in ihrer Fähigkeit, alternative Cl-Kanäle im respiratorischen Epithel zu nutzen (KENT et al., 1997; LARBIG et al., 2002; SNOUWAERT et al., 1992; SNOUWAERT et al., 1995;
TEBBUTT, 1995). Tabelle 1 stellt einige wichtige Mausmodelle der cystischen Fibrose vor.
Tab. 1: Übersicht einiger Mausmodelle der CF mit Beschreibung der Mutationen und der bestimmenden Organpathologie.
Stamm Art der Mutation
Phänotyp bzw. Pathologie Stamm-
beschreibung Cftrtm1Unc In-frame-
Stopcodon in Exon 10 (Knockout)
• deutlich verkürzte Lebensdauer
• Wachstumshemmung und vermindertes KGW
• ungestörte Fertilität
• überwiegend Darmpathologie (Ileus)
• kaum Lungenpathologie
SNOUWAERT et al., 1995
Cftrtm1Cam In-frame- Stopcodon in Exon 10 (Knockout)
• deutlich verkürzte Lebensdauer
• Wachstumshemmung und vermindertes KGW
• überwiegend Darmpathologie
• kaum Lungenpathologie (kein Cftr in der Trachea bei Tieren < 30 g nachweisbar, Tiere > 30 g normale Level)
RATCLIFF et al., 1993
Cftrtm1Bay Duplikation in Exon 3 (Knockin)
• verkürzte Lebensdauer
• Wachstumshemmung
• überwiegend Darmpathologie (Ileus)
• Keine Funktionsstörung von Leber, Respirationstrakt oder Gonaden
• Störungen der PD in Darm und Trachea
O'NEAL et al., 1993
CftrTgHm1G551D G551D (homologe Rekombi- nation)
• Lebensdauer: 70% überleben Absatzalter
• Wachstumshemmung
• Darmpathologie (entspricht G551D- Patienten)
• Peritonitis, Entzündungen der Gallenblase
• ungestörte Fertilität
• kaum Lungenpathologie (nasale PD erhöht; Akkumulation eosinen Materials)
• Mutanten besitzen etwa 4% Wildtyp-Cftr
DELANEY et al., 1996
Es wurden eine Reihe weiterer CF-Mutanten generiert, darunter auch solche, die die F508del-Mutation tragen (GRUBB u. BOUCHER, 1999). Auch wenn einige dieser beschriebenen Stämme eine schwächere Darmsymptomatik zeigen, weist doch keiner eine pulmonale Erkrankung auf, die der des Menschen vergleichbar wäre.
Ein gentechnisch modifizierter Mausstamm mit phenotypisch schwächeren Krankheitssymptomen und v.a. respiratorischen Symptomen ist die Cftrtm1Hgu-Maus (DORIN et al., 1992a; DORIN et al., 1992b). Der Stamm wird seit 1994 im ZTL der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet. In den Infektionsexperimenten der vorliegenden Arbeit wurden die Hintergrundstämme der congenen Stämme der Cftrtm1Hgu-Maus (s. unten) verwendet, deshalb soll diese Mutante hier ausführlicher beschrieben werden.
Bei der Knockin-Mutation der Cftrtm1Hgu-Maus handelt es sich um die Insertion des CFTR-Vektors plus eines 3,5 kbp großen HindIII-Fragments in Intron 9 und Exon 10, wodurch es zu einer partiellen Verdopplung der Gensequenzen kommt.
Phenotypisch ist die Cftrtm1Hgu-Maus wie folgt charakterisiert:
• Lebensdauer: bis auf wenige Ausnahmen erreichen die Mäuse das Absatzalter, 90% ein adultes Alter (DORIN, 1995).
• Retardierung von Wachstum und Entwicklung des KGWs wird nicht beobachtet.
• Gastrointestinaltrakt: Seltenes Auftreten von Mekoniumileus, geringgradige Dilatation des Dickdarms mit erhöhter Mukusansammlung, Aufweitung von Drüsenzellen v.a. in den Darmkrypten.
• Keine Funktionsstörung der Bauchspeicheldrüse oder der Gonaden.
• Respirationstrakt: Erhöhung der nasalen PD, erhöhte Spiegel von Surfactant- Phospholipiden in der bronchoalveolären Lavage, gestörte mukoziliäre Clearance, teilweise pulmonale Atelektasen, generell aber bei spezifiziert- pathogen-freier Haltung keine Lungenaffektionen (BERNHARD et al., 2001;
LARBIG et al., 2002)
• Bakterielle Suszeptibilität: Nach aerogener Infektion mit Staphylococcus aureus und Burkholderia cepacia zeigten Cftrtm1Hgu-Mäuse im Vergleich zu
Kontrolltieren eine signifikant höhere Empfänglichkeit (DAVIDSON et al., 1995).
• Unterschiede in den Messungen der nasalen und der rektalen PD zu normalen Mäusen weisen auf den elektrophysiologischen Basisdefekt des gestörten Ionentransports hin. Der cAMP-vermittelte Cl-Transport im Darm ist um 30% vermindert, in der Trachea und nasalem Gewebe um 50% (SMITH et al., 1995).
Eine molekulare Analyse der Cftrtm1Hgu-Maus ergab, dass die partielle Verdopplung von DNA-Sequenzen, zu der es bei der Insertion des Transgens kommt, offensichtlich zu einem Exon-Skipping und aberrierendem Spleißen führt. Die Tiere sind in der Lage, einen geringen Anteil wildtypischer Cftr-mRNA zu produzieren (DORIN et al., 1994; LARBIG et al., 2002). Die Cftrtm1Hgu-Maus stellt demnach mit ihrer, im Vergleich zu anderen CF-Mäusen, längeren Lebensdauer und den abgeschwächten gastrointestinalen Symptomen, der Störungen in Surfactant- Homöostase und mukoziliärer Clearance und der Suszeptibilität gegen CF-typische Infektionserreger ein probates Modell zur Erforschung der CF-Lungenkrankheit dar (BERNHARD et al., 2001; DAVIDSON et al., 1995; DORIN et al., 1994; LARBIG et al., 2002).
Da die 1994 in Hannover erhaltenen Founder-Tiere einen segregierenden genetischen Hintergrund (C57BL/6, 129Sv, MF1, DORIN et al., 1992a; LARBIG et al., 2002) besaßen, wurden zunächst vier von diesen Tieren ausgehende Stämme etabliert und ingezüchtet (CF/1 - CF/4). Außerdem wurden durch Rückkreuzen auf die etablierten Inzuchtstämme BALB/c, DBA/2J und C57BL/6J drei Cftrtm1Hgu- congene Stämme erzeugt (DORSCH u. HEDRICH, persönliche Mitteilung). Die Integration des Cftrtm1Hgu-Gens in das Cftr-Gen der gezüchteten Tiere wird durch Southernblot-Analysen und die Expression von aberrant und korrekt gespleißtem Cftr durch Realtime-PCR kontrolliert (TÜMMLER, DORSCH u. HEDRICH, persönliche Mitteilung).
2.3 Ansätze zur Gentherapie der CF
Mit dem Fortschritt in der molekulargenetischen Forschung und der daraus resultierenden Option, genetisches Material in Zellen transferieren zu können, eröffneten sich Anfang der neunziger Jahre erstmals Möglichkeiten zur somatischen Gentherapie (COLLINS, 1992). Zur Zeit gibt es weltweit 636 gentherapeutische klinische Studien, unter denen die CF mit derzeit 30 Studien vertreten ist (WILEY, 2003). Die zunächst scheinbar leichte Zugänglichkeit der Atemwege und die durch ihre pulmonale Erkrankung verursachte hohe Morbidität und Mortalität machten die CF zur Modellerkrankung und die Lunge zum Zielorgan der Gentherapie (FLOTTE u.
LAUBE, 2001; PILEWSKI, 2002; WEST u. RODMAN, 2001).
ANDERSON (1998) unterscheidet drei Ansätze einer somatische Gentherapie:
• ex vivo: Körperzellen werden außerhalb des Organismus mit einem Vektor inkubiert, erfolgreich transfizierte Zellen werden wieder in den Organismus eingeschleust (übliche Vorgehensweise für Blutzellen).
• in situ: Der Vektor wird direkt in das betroffene Gewebe eingebracht (z. B. bei der Infusion von Adenoviren in Trachea oder Bronchien von CF-Patienten, oder bei der Injektion rekombinanter Tumorzellen, denen das Gen für ein Zytokin oder Toxin transferiert wurde).
• in vivo: Vektoren können direkt in den Blutstrom appliziert werden und transfizieren bei Erreichen der Zielzellen die rekombinante Erbinformation (bisher noch nicht realisiert).
2.3.1 Die Lunge als Zielorgan der Gentherapie für die CF
Da die respiratorischen Manifestationen den Krankheitsverlauf der CF entscheidend bestimmen, stellt die Lunge das Zielorgan der somatischen Gentherapie dar (ANDERSON, 1998). Auf zellulärer Ebene werden neben den Zilien tragenden Zellen des respiratorischen Epithels auch die serösen Zellen der submukösen Drüsen als Zielzellen für eine funktionelle Korrektur der Elektrolytstörung definiert (BALS et al.,
2001), da in diesen Zellarten CFTR-Expression nachgewiesen wurde (KALIN et al., 1999).
Die Epithelzellen von CF-Patienten besitzen nur begrenzt die Fähigkeit, Cl-Ionenzu sezernieren, absorbieren jedoch in hohem Maße Na+-Ionen und Flüssigkeit (KNOWLES et al., 1995b) und weisen damit alle Merkmale eines gestörten Ionentransports durch CFTR-Mangel auf. In Untersuchungen an Zellkulturen aus einschichtigem, respiratorischen CF-Epithel wurde gezeigt, dass 6 - 10% der Zellen, die funktionelles CFTR exprimieren, ausreichend für eine Korrektur des Cl- Transports sind (JOHNSON et al., 1992). Um einen Na+-Transport in physiologischer Höhe zu erreichen, mussten adenovirale Vektoren dagegen nahezu 100% der Zellen transfizieren (JOHNSON et al., 1995). Der Grad, der mittels Gentherapie zur Korrektur verschiedener CFTR-Funktionen erreicht werden muss, ist demnach unterschiedlich. Da es sich bei den apikalen Zellen des respiratorischen Epithels um ausdifferenzierte Zellen mit begrenzter Lebensdauer handelt (etwa 120 Tage, WARBURTON et al., 1998), würde selbst eine vollständige Expression funktionellen CFTRs in diesen Zellen den pathophysiologischen Defekt nicht dauerhaft korrigieren.
Um langfristig von Nutzen zu sein, müsste der Gentransfer entsprechend wiederholt werden, oder es müssten Stammzellen, wie basale Zellen des mehrschichtigen Epithels der Bronchien, erreicht werden.
Besonders hohe CFTR-Level exprimieren die serösen Zellen der submukösen Drüsen (ENGELHARDT et al., 1992; KALIN et al., 1999). Die Hypertrophie dieser Drüsen gehört zu den frühen strukturellen Veränderungen der CF-Lungenkrankheit (STURGESS u. IMRIE, 1982). Der pathologisch veränderte Flüssigkeits- und Ionentransport der Drüsen trägt zur Ansammlung des zähen Schleims bei, der für das Krankheitsbild charakteristisch ist (JIANG et al., 1997; YAMAYA et al., 1991). Da Mäusen die submukösen Drüsen in Bronchien und in Trachea fehlen, zeigen gentechnisch modifizierte Tiere, denen murines Cftr fehlt, deutlich weniger Lungensymptome als CF-Patienten (CLARKE et al., 1992; SNOUWAERT et al., 1995). Dies unterstreicht die Bedeutung der CFTR-Expression der serösen Drüsenzellen des Menschen. Ebenso wie die basalen Vorläuferzellen des Epithels sind auch die Drüsenzellen durch Verzweigungen der Drüsenazini für apikal
angreifende Vektoren schwer erreichbar. In bisherigen klinischen Studien zum CF- Gentransfer erfolgte eine topische Applikation des viralen oder nicht-viralen Vektors (BALS et al., 2001).
2.3.2 Vektormodelle für die Gentherapie der CF
Mittlerweile ist die anfängliche Euphorie darüber, mit der Gentherapie ein Instrument zur Heilung einer großen Anzahl menschlicher Krankheiten zur Hand zu haben, der Erkenntnis gewichen, dass bis heute, abgesehen von Berichten vereinzelter Patienten (CAVAZZANA-CALVO et al., 2000), kein Protokoll existiert, nach dem eine Krankheit mittels Gentherapie zuverlässig geheilt werden kann (ANDERSON, 1998;
PILEWSKI, 2002; WEST u. RODMAN, 2001). Offensichtlich sind die Abwehrmechanismen sehr wirkungsvoll, die der menschliche Organismus gegen Angriffe von außen, wozu auch die Einschleusung von Fremd-DNA in das eigene Genom gehört, entwickelt hat (ANDERSON, 1998). Bisher veröffentlichte klinische Studien zeigen daher nur eine geringe Effizienz des Gentransfers, häufig begleitet von heftigen Enzündungsreaktionen des Wirtsorganismus (BOUCHER et al., 1994;
CRYSTAL et al., 1994; NOONE et al., 2000; REIX et al., 2002).
FLOTTE und LAUBE (2001) beschreiben einen idealen Genvektor folgendermaßen:
• Ausreichende Trägerkapazität: Neben der Information des therapeutischen Gens müssen regulatorische Sequenzen, Voraussetzung für eine kontrollierte und effiziente Expression des therapeutischen Gens, eingefügt werden.
• Effizienz und Spezifität des Gentransfers: Um den Defekt der cystischen Fibrose zu korrigieren, müssen Zielzellen in ausreichendem Maß transfiziert werden, darüber hinaus muss das Targeting des Vektors für die Zielzellen spezifisch sein.
• Immunogenität: Weder eine humorale noch eine zelluläre Immunantwort des Wirts darf induziert werden, da neutralisierende Antikörper die wiederholte Applikation des Vektors unwirksam machen, während eine zelluläre
Immunantwort transfizierte Zellen angreifen würde. Im optimalen Fall sollte der Vektor keinerlei inflammatorische Reaktion des Wirts hervorrufen.
• Sicherheit: Der Vektor darf zu keiner Zeit eine Gefahr für den Wirtsorganismus darstellen, auch dann nicht, wenn er in bereits entzündetes Gewebe (CF- Lunge) mit anderen prädispositionierenden Faktoren appliziert wird. Auch bei der Herstellung des Vektors darf es keine Sicherheitsrisiken geben.
• Ausreichende Dauer der Genexpression: Für die langzeitige Expression, wie bei der cystischen Fibrose notwendig, muss der Vektor das therapeutische Gen entweder in das Chromatin der Zielzelle einschleusen oder ein Episom in deren Zellkern generieren, welches sicher repliziert und an Tochterzellen weitergegeben wird.
• Möglichkeit zur wiederholten Applikation: Ist keine langzeitige Expression des therapeutischen Gens gewährleistet, muss der Vektor wiederholt sicher applizierbar sein.
Bei den gegenwärtigen Vektoren unterscheidet man zwischen viralen und nicht- viralen Vektoren. Zahlreiche Viren stellen potentielle Vektoren für den Gentransfer in das Atemwegsepithel dar (BALS et al., 2001). Die Entwicklung von adeno-, adenoassoziierten und retroviralen Vektoren ist am weitesten fortgeschritten, deshalb sollen diese im folgenden Abschnitt besprochen werden. Bei den nicht-viralen Vektoren existieren Ansätze mit kationischen Liposomen, kationischen Polymeren und nackter Plasmid-DNA. Die überwiegende Anzahl klinischer Studien befasst sich mit viralen Vektoren (etwa 75%, WILEY, 2003), da diese im allgemeinen einen wirkungsvolleren Gentransfer versprechen. Doch die viralen Vektoren besitzen auch Nachteile wie geringe Trägerkapazität, hohe Immunogenität und das Restrisiko einer Infektion. Dagegen bieten die u.U. weniger effizienten nicht-viralen Vektoren eine größere Kapazität für das Transgen, eine kaum induzierte Immunantwort des Wirts und mehr Sicherheit.
2.3.3 Virale Vektoren
Viren haben im Laufe der Evolution die Fähigkeit entwickelt, Wirtszellen zu infizieren und diese durch die Expression viraler Gene zur Produktion neuer Viren zu benutzen (BALS et al., 2001). Die Befürworter viraler Vektoren argumentieren daher, dass Viren ideale Genfähren darstellten, während ihre Gegner auf die potenten Abwehrmöglichkeiten des menschlichen Organismus gegenüber Viren hinweisen (FLOTTE u. LAUBE, 2001).
Der virale Zyklus wird grob in die Prozesse der Adsorption und Penetration und nachfolgende Replikation des Virus in der Wirtszelle unterteilt. Hierbei wird das virale Genom in die Zelle eingeschleust und in der sich anschließenden frühen Expressionsphase produziert die Wirtszelle virale regulatorische Proteine. Darauf folgt die Spätphase, in der das Virusgenom repliziert wird, Strukturgene exprimiert werden und der Aufbau neuer Viruspartikel erfolgt. Die Phase der Replikation sollte in der Gentherapie unterdrückt werden, da der Vektor nach der Transfektion der Zielzelle, d.h. Infektion und Einbau des Transgens in das Wirtszellgenom, seine Aufgabe erfüllt hat. Tabelle 2 stellt die Vor- und Nachteile der am weitesten entwickelten viralen Vektoren dar.
Tab. 2: Übersicht viraler Genvektoren, die in vorklinischen oder klinischen Untersuchungen zum Transfer von CFTR-cDNA verwendet werden (―: nicht vorhanden, +: geringgradig, +++: hochgradig; nach ALBELDA et al., 2000).
Virus Größe des
Transgens (kbp)
Infektion nicht- replizierender Zellen
Dauer der Expression
Immunantwort
Adenovirus 7 - 8 + transient +++
Adenoassoziiertes Virus
4,5 + Langzeit +
Retrovirus < 8 ― Langzeit +
Lentivirus < 8 + Langzeit +
2.3.3.1 Adenoviren
Die ersten Vektoren, die in vivo für den Gentransfer in die Lunge zum Einsatz kamen, waren Adenoviren (CRYSTAL et al., 1994; ROSENFELD et al., 1991;
ROSENFELD et al., 1992). Die weite Verbreitung des primären Rezeptors, des Coxsackie und Adenovirus Rezeptor (CAR), ermöglicht diesen doppelsträngigen DNA-Viren, ein breites Spektrum an Zellen im Wirtsorganismus zu infizieren, dazu gehören auch die Zellen des respiratorischen Epithels (BARNETT et al., 2002). Eine Infektion des Atemtrakts geht natürlicherweise mit Erkältungssymptomen einher (WEST u. RODMAN, 2001). Das 36 kbp große Genom der Wildtyp-Adenoviren besteht aus Genen, die in der frühen Phase der Infektion wichtig sind, und aus Genen, die erst in der Replikationsphase abgelesen werden und für virale Strukturproteine codieren (BALS et al., 2001). Bei adenoviralen Vektoren der ersten Generation wurde der Beginn der viralen Replikation gehemmt (FISHER et al., 1996;
HARVEY et al., 2001). Durch Deletion der Genregion, welche die DNA-Replikation anschaltet, gewann man zusätzlich Platz für die therapeutische Geninformation. Die Mehrzahl der Studien mit diesen ersten Vektoren zeigten einen recht effektiven Gentransfer, die Dosierung der Vektoren war jedoch durch massive Entzündungsreaktionen beschränkt (CRYSTAL et al., 1994; HARVEY et al., 2001).
Die Immunantwort gegen die Vektoren der ersten Generation bestand aus einer unspezifischen Immunreaktion und aus einer zellvermittelten Immunreaktion, die gegen verbliebene Virusproteine gerichtet war, sowie einer humoralen Immunreaktion, die sich gegen Kapsid-Proteine des rekombinanten Virus richtete (YANG et al., 1994; YANG et al., 1996; YEI et al., 1994). Die Entzündungsreaktion schränkte die transgene Expression ein und war potentiell schädigend für den Wirt (REIX et al., 2002).
In Vektoren der zweiten Generation wurden zusätzliche Deletionen vorgenommen, um die Vektor-induzierte Immunantwort abzuschwächen (YANG et al., 1996). Diese Vektoren zeichneten sich durch längere Aktivität und eine schwächere zellvermittelte Immunantwort aus (FLOTTE u. LAUBE, 2001). Derzeit wird an der Entwicklung adenoviraler Vektoren gearbeitet, die keine viralen Gene mehr besitzen (Gutless oder delta-adenovirale Vektoren), diese sollen wiederum eine verlängerte
Aktivitätsdauer und eine größere Trägerkapazität (bis zu 35 kbp) besitzen und die Immunantwort minimieren (FISHER et al., 1996; MORRAL et al., 1999). Trotz dieser Verbesserungen der adenoviralen Vektoren bleibt das Problem der humoralen Immunantwort, deren neutralisierende Antikörper gegen Kapsid-Proteine des Virus gerichtet sind, bestehen. Neben dem adaptiven Immunsystem stehen weitere Schutzmechanismen des Respirationstraktes wie Alveolarmakrophagen (WORGALL et al., 1997) und die mukoziliäre Clearance einem effizienten Gentransfer entgegen.
Strategien, den Gentransfer zu verbessern, sehen daher beispielsweise eine Immunsuppression nach der Vektorgabe vor (ANDERSON, 1998; STEIN et al., 1998). Ein weiteres Problem der adenoviralen Vektoren ist die Lokalisation des CAR.
Der Rezeptor findet sich überwiegend auf der basolateralen Seite des polarisierten respiratorischen Epithels, so dass die lokale Vektorapplikation, z.B. über nasale Applikation oder Inhalation, nur in geringem Maße zur Transfektion von Zellen führt (KNOWLES et al. 1995a; PICKLES et al. 2000; WALTERS et al., 1999). Adenoviren sind in der Lage, sowohl sich teilende als auch nicht-teilende Zellen zu infizieren (ANDERSON, 1998). Kurz nach der Transfektion ist die Expression des rekombinanten Gens deshalb hoch. Ein Großteil der viralen DNA verbleibt jedoch episomal, so dass es durch Zellproliferation zu einem Verdünnungseffekt der transfizierten Zellen und schlussendlich nur zu einer transienten Expression kommt (ZABNER et al., 1993). Einer wiederholten Vektorapplikation steht jedoch die bereits erwähnte starke Immunantwort des Wirts entgegen (KAPLAN et al., 1996).
2.3.3.2 Adenoassozierte Viren (AAV)
AAV sind nicht mit Adenoviren verwandt, sondern gehören zu den apathogenen humanen Parvoviren (BUELER, 1999). Sie benötigen jedoch Adeno- bzw.
Herpesviren als obligate Helfer für ihre in vivo-Replikation. Auch bei den AAV handelt es sich um DNA-Viren, ihr Genom ist jedoch im Vergleich zu den Adenoviren sehr klein (4,7 kbp, FLOTTE, 2001). In Abwesenheit eines Helfervirus integriert das Virus spezifisch in Chromosom 19 des Menschen (WEST u. RODMAN, 2001), wo es bei Infektion durch das Helfervirus aktiviert wird. Das Genom der AAV besteht aus
Inverted Terminal Repeats (ITR) an den Enden des DNA-Strangs, dazwischen liegen die Gene, die für Integration, Replikation und Kapsid-Proteine kodieren (BALS et al., 2001). AAV-Vektoren werden erzeugt, indem diese viralen Gene deletiert werden und das Transgen zwischen die ITRs eingefügt wird. Durch den Verlust der viralen Gene vermag das Virus jedoch auch nicht länger spezifisch zu integrieren, so dass es zu einer zufälligen Integration oder der Ausbildung episomaler DNA kommt (WEST u. RODMAN, 2001). Aufgrund der geringen Kapazität des Vektors ist es kaum möglich, zusätzlich zur therapeutischen Geninformation regulierende Promotorsequenzen einzufügen, was die effiziente Expression mindert (FLOTTE et al., 1993b). Dennoch zeigen AAV-Vektoren in vitro hohe Transfektionsraten und eine langfristige Expression (FLOTTE et al., 1994). Auch in vivo konnte eine teilweise effiziente Transfektion ohne nennenswerte Immunreaktion des Wirtes oder gar Toxizität gezeigt werden (BUELER, 1999; FLOTTE et al., 1993a). Erste klinische Studien an CF-Patienten wiesen eine teilweise Korrektur des elektrophysiologischen Defekts über mehrere Wochen nach (WAGNER et al., 1998). AAV-Vektoren sind demnach - mit einigen Einschränkungen, wie der geringen Vektorgröße und der limitierten Fähigkeit, das apikale Epithel zu transfizieren - ein relativ sicheres und ausbaufähiges Vektorsystem.
2.3.3.3 Retroviren
Retroviren sind teilweise onkogen und besitzen das Enzym reverse Transkriptase, welches nach dem Eindringen in die Wirtszelle das RNA-Virengenom in DNA umkopiert, welche dann durch eine Integrase in das Wirtgenom integriert wird (ROLLE u. MAYR, 1993, S. 377). Die Fähigkeit der Viren, ihre Information in das Wirtsgenom zu integrieren und so eine chronische, vom Wirtsorganismus meist gut tolerierte Infektion zu etablieren, macht bei der Infektion von Atemwegsstammzellen eine wiederholte Applikation überflüssig. Durch Deletion viraler Gene können Retroviren eine Trägerkapazität für Fremd-DNA von bis zu 8 kbp erhalten (ALBELDA et al., 2000).
Für den Gentransfer in die Lunge haben Retroviren begrenzten Einsatz gefunden, da sie für Infektion und Integration replizierende Zellen benötigen und der den Zelleintritt vermittelnde Rezeptor wenig im respiratorischen Epithel exprimiert wird (ALBELDA et al. 2000; DRUMM et al. 1990; GUNZBURG et al., 1996). Andere physikalische Faktoren wie die apikale Glycokalix und die Surfactant-Produktion des Epithels hemmen den in vivo-Gentransfer zusätzlich und verringern die Bedeutung dieses Vektorsystems für die CF-Gentherapie (WANG et al., 2002).
Im Gegensatz zu herkömmlichen Retroviren sind Lentiviren, zu denen auch das humane Immundefizienz Virus (HIV) gehört, in der Lage, auch nicht replizierende Zellen zu infizieren und ihr Genom zu integrieren (JOHNSON 2001; WANG et al., 2000). Diesen Vorteilen stehen die Nachteile einer niedrigen Transfektionsrate des Atemwegsepithels, die starke Barrierefunktion der apikalen Membran (JOHNSON, 2001) und Sicherheitsbedenken gegenüber möglicher Rückmutationen zum Wildtyp- Virus gegenüber. Hinzu kommt, dass die Integration des Virusgenoms ein spontanes Ereignis ist, mit dem Risiko, körpereigene Tumorsuppressorgene ab- bzw. Onkogene anzuschalten.
2.3.4 Nicht-virale Vektoren
Obwohl nicht-virale Vektoren nur begrenzt in Zielzellen aufgenommen werden und diese das Transgen meist nur vorübergehend exprimieren, stellen nicht-virale Vektoren den sichersten Ansatz einer somatischen Gentherapie dar. Hinzu kommt, dass die Größe der zu transferierenden DNA nicht in dem Maße beschränkt ist, wie bei viralen Vektoren. Da auch die Introns eines Gens zur Regulation seiner Expression beitragen (WILLIAMS et al., 2003), gewinnt die Transferkapazität zunehmend an Bedeutung. Benötigte Plasmid-DNA kann einfach und in großem Umfang in Bakterien hergestellt werden, wobei bakteriell produzierte CpG-Motive (Dinukleotidsequenzen, in denen Guanin auf Cytosin folgt) nicht methyliert sind und im Wirt eine Zytokin-vermittelte Entzündungsreaktion induzieren (KRIEG, 1999).
Dieser bei DNA-Vakzinierung willkommene Effekt ist in der somatischen Gentherapie
unerwünscht. Die wiederholte Verabreichung von Plasmid-DNA ist dennoch möglich, da die Immunantwort zum einen unspezifisch verläuft und außerdem durch ausreichende Zeitintervalle zwischen den Applikationen (evtl. in Kombination mit Immunsuppressiva) vermindert werden kann. Die Reduktion der CpG-Motive in der Plasmid-DNA trägt ebenfalls zur Herabsetzung der Immunantwort bei (YEW et al., 2000). Vor- und Nachteile der am weitesten entwickelten nicht-viralen Vektoren sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tab.3: Übersicht nicht-viraler Genvektoren, von denen bisher erst die kationischen Liposomen in klinischen Studien zum Einsatz kamen (+: geringgradig, ++: mittelgradig, +++:
hochgradig; nach ZIADY et al., 2003).
Vektor in vivo- Degra- dation
Effizienz in replizierenden Zellen
Effizienz in nicht- replizierenden Zellen und in vivo
Immun- antwort
Zellspezifität
Kationische Liposome
geschützt, wenn komplexiert
+++ + ++ (CpG-
induziert)
Promotor- abhängig
Kationische Polymere
geschützt, wenn komplexiert
+++: wenn Rezeptor- vermittelt + - ++: wenn nicht Rezeptor- vermittelt
+++ + +++: wenn
Rezeptor- vermittelt+ - ++: wenn nicht Rezeptor- vermittelt Nackte
Plasmid- DNA
hoch empfindlich
+ + + (CpG-
induziert, in hohen Dosen)
Promotor- abhängig
2.3.4.1 Kationische Liposomen
Von den nicht-viralen Vektoren sind bisher nur die kationischen Liposomen in klinischen Studien getestet worden (ALBELDA et al., 2000; BRAGONZI u. CONESE, 2002). Liposome sind Komplexe aus Lipiden und DNA (FLOTTE u. LAUBE, 2001).
Sie sind einfach synthetisierbar, können in Größe und Zusammensetzung unterschiedlich gestaltet werden und sind kaum toxisch (BALS et al., 2001). Die überwiegend kationisch geladenen Lipide bilden mit der polyanionisch geladenen DNA kleine, virusähnliche Partikel, die mit der Wirtszellmembran fusionieren und deren Aufnahme in die Zellen gegenüber nackter DNA um ein Vielfaches gesteigert ist (BALS et al., 2001; FLOTTE u. LAUBE, 2001). Nach Aufnahme in die Zelle durch Endozytose wird ein großer Anteil der aufgenommenen DNA in lysosomalen Vesikeln zerstört, und nur ein Bruchteil gelangt in episomaler Form in den Zellkern, wo er transient exprimiert wird. Dieser Mechanismus erklärt die geringe Transfektionsrate und Effizienz kationischer Liposomen (BRAGONZI u. CONESE, 2002). Verneblungsexperimente im CF-Mausmodell zeigten eine teilweise Korrektur des elektrophysiologischen Defekts (ALTON et al., 1993; DORIN et al., 1996;
EASTMAN et al., 1997), welche ebenfalls bei der Verabreichung kationischer Liposomen an CF-Patienten nachgewiesen werden konnte (BRAGONZI u. CONESE, 2002; CAPLEN et al., 1995; PORTEOUS et al., 1997). Obwohl diese Studien eine Immunreaktion der Empfänger nicht nachwiesen bzw. diese nicht berichteten, gibt es andere Untersuchungen, in denen nach Applikation kationischer Liposomen deutliche dosisabhängige Entzündungsreaktionen beobachtet wurden (SCHEULE et al., 1997; YEW et al., 1999). Als Ursache dieser Zytotoxizität der kationischen Liposomen wird die unmethylierte Plasmid-DNA vermutet (s. Kap. 2.3.4).
2.3.4.2 Kationische Polymere
Wie bei den kationischen Lipiden führt auch die Komplexierung der cDNA mit kationischen Polymeren zu einer DNA-Kondensation, und die resultierende positive Ladung des Komplexes erlaubt dessen Aufnahme in die Zelle durch Endozytose
(BALS et al., 2001). Die Freisetzung der DNA im Zytoplasma erfolgt vermutlich durch osmotische Schwellung und schließlich das Platzen der Endosomen (BALS et al., 1999; BOUSSIF et al., 1995).
Im Gegensatz zu den kationischen Liposomen sind Polymere eher in der Lage, in Anwesenheit von Surfactant stabil zu bleiben und die mukosale Barriere des Atemtrakts zu überwinden (BRAGONZI u. CONESE, 2002). Mit dem Polymer Polyethylenimin wurde in vivo ein effizienter, wenn auch transienter Gentransfer nachgewiesen.
Eine Weiterentwicklung der kationischen Polymere stellt deren Targeting auf spezifische Rezeptoren dar (RUDOLPH et al., 2002; ZIADY et al., 2002). Solcherart Rezeptor-vermittelter Gentransfer zeigte im Tiermodell Genexpression mit teilweiser Korrektur des elektrophysiologischen Defekts und länger anhaltend als bei der alleinigen Verwendung kationischer Polymere. Die Effizienz kationischer Polymere wurde in klinischen Studien bisher nicht überprüft.
2.3.4.3 Nackte Plasmid-DNA
Obwohl der Mechanismus des Zelleintritts ungeklärt ist, wurde in vivo nach direkter Applikation nackter DNA in das Zielgewebe, eine wirksame Transfektion der Zellen nachgewiesen (WOLFF et al., 1992; ZIADY et al., 2003). Ohne komplexierende Agenzien ist nackte DNA extra- und intrazellulär empfindlich für Degradation. Je größer die Plasmid-DNA, desto unbeweglicher ist sie im Zytosol, sodass ihre Aufnahme in den Kern stark beschränkt wird (LUKACS et al., 2000). Dennoch wiesen klinische Studien, in denen nackte Plasmid-DNA als Kontrolle für liposomalen Gentransfer diente, im Vergleich zu diesem gleich gute bzw. bessere Transfektionsergebnisse auf (ALTON et al., 1993; KNOWLES et al., 1995a). Trotz dieser Befunde bleibt nackte Plasmid-DNA bisher ein noch instabiles Vektorsystem, welches hohe Dosen des Vektors und unterstützende Maßnahmen benötigt (ZIADY et al., 2003).
2.4 Bakterien in der Gentherapie
Bakterien sind in der Lage, Plasmide sowohl zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien (CHARPENTIER et al., 1999; TRIEU-CUOT et al., 1993) als auch zwischen Bakterien und Hefen auszutauschen (HEINEMANN u. SPRAGUE, 1989). In der Erzeugung rekombinanter Pflanzen wird der Bakterien-vermittelte Gentransfer seit mehr als zehn Jahren kommerziell genutzt (LESSL u. LANKA, 1994). Da invasive Bakterien offenbar auch in der Lage sind, eukaryotische Expressionsplasmide in Wirbeltierzellen einzuschleusen (DIETRICH et al., 1998;
SIZEMORE et al., 1995), war der direkte in vivo- und in vitro-Transfer von Plasmid- DNA in Wirtszellen nur ein weiterer Schritt dieser Entwicklung.
Der ursprüngliche Gedanke zu Bakterien-vermitteltem Plasmid-Gentransfer war, dass bakterielle Vektoren in die Zielzellen eindringen, weil diese entweder phagozytotisch sind oder Phagozytose durch die Bakterien induziert wird (WEISS u.
KRUSCH, 2001). In den Zielzellen werden die Bakterien aus dem Phagosom freigesetzt, was entweder durch bakterieneigene oder rekombinante Virulenzfaktoren, die von anderen Erregern in die Bakterien eingeschleust wurden, vermittelt wird. Schließlich kommt es im Zytosol der Zielzellen zur Lyse. Diese wird beispielsweise dadurch ausgelöst, dass auxotrophe Mutanten verwendet werden, die metabolisch attenuiert sind, d.h. sie benötigen Substanzen, die nicht von der Wirtszelle substituiert werden. Alternativ können ein autolytischer Prozess induziert oder geeignete Antibiotika verwendet werden (WEISS, 2003; WEISS u. KRUSCH, 2001). Durch die Lyse des bakteriellen Trägers wird das Expressionsplasmid freigesetzt, in den Zellkern transferiert und exprimiert.
Als gezeigt wurde, dass Salmonella typhimurium, ein Erreger, der im phagozytotischen Vesikel verbleibt, dennoch in der Lage ist, in vitro Expressionsplasmide in Makrophagen zu transferieren (DARJI et al., 1997), musste diese Grundidee überdacht werden.
Prinzipiell bestehen nach WEISS und KRUSCH (2001) zwei Einsatzmöglichkeiten für den Bakterien-vermittelten Gentransfer: DNA-Vakzinierung oder Gentherapie. Ziel der DNA-Vakzinierung ist es, ein Expressionsplasmid in die Zelle einzuschleusen,
welches entweder für das Antigen eines Krankheitserregers oder eines Tumorantigens kodiert (WEISS, 2003). Durch die Synthese des Antigens wird im Wirt eine Immunantwort gegen Pathogene oder Tumoren induziert. So sollen durch die Bakterien-vermittelte DNA-Vakzinierung auch Pathogene bekämpft werden können, für die derzeit keine herkömmlichen Impfstoffe existieren, wie Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium malariae und das humane Immundefizienzvirus (GURUNATHAN et al., 2000a; SEDER u. GURUNATHAN, 1999). Eine erfolgreiche DNA-Vakzinierung soll eine langfristige, sowohl zellvermittelte als auch humorale Immunität vermitteln. ANGELAKOPOULOS et al. (2002) führten eine Pilotstudie mit adulten Probanden durch, denen attenuierte Listerien oral verabreicht wurden.
Partiell konnten dabei, ohne dass gravierende Krankheitserscheinungen durch die bakterielle Infektion auftraten, sowohl eine zellvermittelte als auch eine humorale Immunantwort beobachtet werden, die den Einsatz attenuierter Listerien als DNA- Vektoren sinnvoll erscheinen ließen.
Ein weiteres Ziel ist es, die mukosale als die einfachste Art der Verabreichung, d.h.
entweder die orale oder nasale Applikation der Vakzine, zu ermöglichen (WEISS, 2003). DIETRICH et al. (2000) und WEISS und KRUSCH (2001) sehen zusätzliche Vorteile, die bakterielle Genvektoren für die DNA-Vakzinierung erbringen könnten:
• Bakterien dringen im Allgemeinen über die Schleimhautpforte in den Organismus ein, was eine mukosale Verabreichung der Vakzine erleichtert.
• Viele Bakterien infizieren Zellen des Immunsystems, das antigene Transgen würde entsprechend dort exprimiert, wo die Immunreaktion induziert werden soll.
• Teile der bakteriellen Zellwand oder nicht-methylierte bakterielle DNA sind immunstimulierend und könnten wie Adjuvanzien wirken (s. Kap. 2.3.4).
• Der bakterielle Vektor und das Antigen tragende Expressionsplasmid stellen voneinander getrennte Einheiten dar, die entsprechend getrennt voneinander modifiziert werden können.
• Bakterien können günstig vermehrt, einfach gehandhabt und durch Antibiose gut kontrolliert werden. Außerdem ist die Trägerkapazität ihrer
Expressionsplasmide praktisch unbegrenzt, so dass auch Mehrfachimpfstoffe technisch möglich wären.
Grundsätzlich unterscheidet man zwischen Bakterien, die durch eigene oder rekombinante Virulenzfaktoren aus einem Phagosom in das Zytosol der Wirtszelle freigesetzt werden (S. flexneri, L. monocytogenes, E. coli) und solchen, die im Phagosom abgetötet werden und deren Expressionsplasmide auf noch ungeklärtem Wege ins Zytosol gelangen (DIETRICH et al., 2000; WEISS u. KRUSCH, 2001).
Aufgrund ihrer Eigenschaften schlagen WEISS und KRUSCH (2001) Bakterien auch als Vektoren für die Gentherapie vor:
• Gute Kontrolle durch Antibiotika.
• Die Zellspezifität mancher Bakterien kann zum gezielten Gentransfer in bestimmten Geweben beitragen und der Eintritt der Erreger über die Schleimhautbarriere erleichtert ihre Verabreichung.
• Einige Bakterien sind in der Lage, sich interzellulär auszubreiten, was u.U.
auch zur Transfektion von Zellen führt, die für nicht-replizierende Vektoren unerreichbar bleiben.
• Die große Trägerkapazität bakterieller Plasmide erlaubt auch große Transgene und entsprechende regulatorische Sequenzen zu transfizieren.
• Eine vektorspezifische Immunreaktion kann durch frühes Abtöten der Erreger unterdrückt werden.
Im Folgenden werden einige Beispiele Bakterien-vermittelten Gentransfers dargestellt.
2.4.1 Salmonella typhimurium
Bei S. typhimurium handelt es sich um einen für die Maus pathogenen Serovar, der durch Untersuchungen attenuierter Stämme im natürlichen Wirt zum Modellorganismus des Bakterien-vermittelten Gentransfers wurde (WEISS, 2003).
Zuerst konnte in der Maus nach einmaliger, oraler Applikation von attenuierten S. typhimurium (rekombinant verändert mit einem Plasmid, das für die Gene hly und
actA, zwei Virulenzfaktoren von L. monocytogenes, codiert) sowohl eine humorale, wie eine zellvermittelte Immunantwort gegen diese Antigene induziert werden (DARJI et al., 1997). Mit Transformanten, die das Listeriolysin-Gen hly trugen, konnte den Mäusen sogar eine protektive Immunität gegen eine letale Infektion mit L. monocytogenes vermittelt werden (DARJI et al., 1997; DARJI et al., 2000). XIANG et al. (2000) beobachteten in Mäusen mit murinen Melanomen Wachstumshemmung und Abstoßung der Tumoren, nachdem diese mit attenuierten Salmonellen, die ein Expressionsplasmid mit Tumorepitopen trugen, transfiziert wurden. Offensichtlich konnte die Toleranz des Immunsystems gegen Tumorantigene durch den Gentransfer aufgehoben werden. MEI et al. (2002) wiesen allerdings auf die Bedeutung einer optimalen therapeutischen Dosis für derlei Erfolge hin.
Beim Vergleich der Immunantworten nach nasaler und oraler Applikation von DNA- Vakzinen auf der Basis von S. typhimurium, war eine wiederholte nasale Applikation notwendig, um in der Milz eine T-Zell-Antwort zu induzieren, die bereits nach einmaliger oraler Applikation erfolgte (DARJI et al., 2000). Auch das Auftreten von Antikörpern war von dem Ort der Applikation beeinflusst. Die langfristige Antigenpräsentation nach einmaliger oraler Applikation war Ursache für die wirksame Induktion einer T-zellvermittelten Immunantwort (DARJI et al., 2000; WEISS u.
KRUSCH, 2001).
Für den Mechanismus des S. typhimurium-vermittelten Gentransfers existiert die Vorstellung, dass die Bakterien nach oraler Applikation die Darmschranke über M- Zellen passieren, um dann phagozytierende Zellen der Peyerschen Platten, wie Makrophagen und dendritische Zellen, zu infizieren (WEISS u. KRUSCH, 2001).
Nach der Lyse der Bakterien wird das Transgen direkt von diesen Zellen exprimiert (Antigenpräsentation durch MHC I-Moleküle). Gleichzeitig können die Salmonellen in Makrophagen Apoptose induzieren, was zu einer starken Antigenpräsentation durch dendritische Zellen führt, die apoptotische Makrophagen phagozytiert haben (Antigenpräsentation durch MHC II-Moleküle).
Mittlerweile existieren Modelle zum S. typhimurium-vermittelten Gentransfer für Infektionsmodelle (WOO et al., 2001) ebenso wie für Tumormodelle (JAIN, 2001;
MEI et al. 2002; XIANG et al., 2000). Neben der DNA-Vakzinierung wurden
Salmonellen auch gentherapeutisch bei Interferon (IFN) γ-defizienten Mäusen eingesetzt (PAGLIA et al., 2000). Knockout-Mäuse mit diesem monogenetischen Defekt sterben normalerweise an einer Infektion mit attenuierten S. typhimurium, die rekombinanten Bakterien trugen jedoch ein Expressionsplasmid mit dem Gen des murinen INF γ. Der Transfer des Gens führte zur Reparatur des Defekts in den murinen Makrophagen, so dass die Mäuse die Infektion überlebten. Um die Effizienz des Salmonellen-vermittelten Gentransfers zu erhöhen, wurde in attenuierte Stämme von S. typhimurium das hly-Gen von L. monocytogenes eingeschleust, das für den Virulenzfaktor LLO kodiert, welcher die Zerstörung der phagosomalen Wand vermittelt (GENTSCHEV et al., 1995). So konnte in primären Makrophagen die Antigenexpression nach Ko-Infektion mit LLO-sezernierenden Salmonellen und Salmonellen, die ein für Ovalbumin codierendes Plasmid trugen, erhöht werden (CATIC et al., 1999). Eine ähnliche Verbesserung in der Expression von GFP als Reportergen wurde bei Mäusen gefunden, denen oral S. typhimurium appliziert wurde, welche neben dem GFP-Expressionsplasmid auch LLO exprimierten (GENTSCHEV et al., 2001). Die generierte Fähigkeit der Salmonellen, dem Phagosom zu entweichen, stellt demnach einen Vorteil für den Bakterien-vermittelten Gentransfer dar (WEISS u. KRUSCH, 2001).
2.4.2 Salmonella typhi
Durch die Entwicklung von Impfstoffen gegen den Erreger des Typhus beim Menschen stehen attenuierte Stämme von S. typhi zur Verfügung (GERMANIER u.
FUER, 1975). S. typhi ist nicht pathogen in der Maus, weshalb für dieses Tiermodell nur die nasale oder intraperitoneale Applikation in Frage kommt (WEISS u.
KRUSCH, 2001). Attenuierte Salmonellen wurden zur Immunisierung von Mäusen gegen das Masernvirus, das humane Immundefizienzvirus und gegen Tetanustoxin verwendet (FENNELLY et al., 1999; SHATA et al., 2000), wobei die Tiere eine durch zytotoxische T-Zellen charakterisierte Immunantwort zeigten bzw. mit der Produktion spezifischer Antikörper reagierten. Bei der Immunisierung mit Tetanustoxin konnte gezeigt werden, dass mehr Antikörper produziert wurden, wenn das Antigen unter
der Kontrolle eines eukaryotischen Promotors stand als unter der eines prokaryotischen. Dies spricht für die Effizienz des Bakterien-vermittelten Gentransfers bei der Verwendung eukaryotischer, regulatorischer Sequenzen.
2.4.3 Shigella flexneri
Shigellen sind die Erreger akuter Darminfektionen des Menschen (ROLLE u. MAYR, 1993, S. 625), und S. flexneri gehört zu den ersten Bakterien, für die Bakterien- vermittelter Gentransfer untersucht wurde (COURVALIN et al., 1995; SIZEMORE et al., 1995). Die verwendeten Stämme besitzen entweder Defekte in der Zellwandsynthese oder sind auxotroph für die Synthese bestimmter Aminosäuren.
Da Mäuse und Meerschweinchen für S. typhi und S. flexneri nicht suszeptibel sind, wurde eine nasale oder konjunktivale Applikation gewählt, um das Potential von S. flexneri für den Bakterien-vermittelten Gentransfer zu überprüfen (FENNELLY et al., 1999; NORIEGA, et al. 1996). Nach Immunisierung, z.B. mit dem Reportergen für β-Galaktosidase oder Antigenen des Masernvirus, wurde sowohl zellvermittelte Immunität als auch eine mäßige Antikörperproduktion beobachtet (SIZEMORE et al., 1997). Im Gegensatz zu S. typhi zeigte S. flexneri nach nasaler Applikation jedoch von der Lunge ausgehend kein Disseminationsverhalten.
2.4.4 Escherichia coli
Colibakterien gehören natürlicherweise nicht zu den invasiven mikrobiellen Pathogenen. Durch Einschleusen eines S. flexneri-eigenen Virulenzplasmids erhielt der Laborstamm E. coli K 12 jedoch nicht nur die Fähigkeit, in Wirtszellen einzudringen, sondern zusätzlich dem Phagosom der Wirtszelle zu entkommen (COURVALIN et al., 1995). In einer Folgestudie wurde eine E. coli K 12-Mutante mit dem Invasin von Yersinia pseudotuberculosis erzeugt. Obwohl die Bakterien im Phagosom verblieben, konnte der Transfer des Plasmids durch das Reporterprotein
