Die histologischen Befunde der i.t. Listerieninfektion

Die Frage der Lokalisation der Listerien in der Lunge ist entscheidend für die Eignung des Bakteriums als Vektor für eine somatische Gentherapie (WEISS u.

KRUSCH, 2001). Diese Einsatzmöglichkeit setzt voraus, dass die fakultativ intrazellulären Listerien (FARBER u. PETERKIN, 1991) in Epithelzellen der Lunge eindringen können. DREVETS et al. (1995) zeigten, dass die Aufnahme von Listerien in nicht-phagozytierende Zellen über Internaline vermittelt wird. Je nach Art der Wirtszelle spielen verschiedene Internaline für die Bakterieninvasion eine Rolle (DRAMSI et al. 1995; DRAMSI et al., 1997; GAILLARD et al., 1991; MENGAUD et al., 1996). Die Infektion der Lunge mit Listerien wurde bisher nur experimentell erzeugt (LEFFORD et al., 1978; TRUITT u. MACKANESS, 1971; MUNDER et al., 2002), und es existierten für dieses murine Infektionsmodell keine Kenntnisse, ob es in der Lunge zu einer direkten, d.h. über Internaline vermittelten Invasion der Listerien in Zellen des respiratorischen Epithels kommt. Außerdem wäre die bakterielle Invasion pulmonaler Epithelzellen durch infizierte Makrophagen vorstellbar, wenn es zu einem indirekten interzellulären Spreading käme, wie es DREVETS et al. (1995) und GEDDE et al. (2000) für humane Enterozyten und murine Makrophagen beschrieben. In dieser Arbeit sollte deshalb die Lokalisation von L. monocytogenes EGD und eines attenuierten Listerienstamms in der Lunge der Maus nach i.t. Applikation untersucht werden. Ein breites Spektrum histologischer Methoden diente zum Nachweis entzündungsbedingter

pathohistologischer Veränderungen des Lungengewebes und der Einschätzung der Keimdichte in den infizierten Lungen.

5.6.1 Pathohistologische Veränderungen des Lungengewebes

TRUITT und MACKANESS (1971) zeigten nach aerogener Infektion 12 h p.i.

geringgradige und 24 h p.i massive Läsionen der Lunge, die sie als entzündliche Herde - aus Alveolarmakrophagen und Listerien bestehend - beschrieben. In dieser Arbeit wurden erste geringgradige Infiltrationen der Lunge mit inflammatorischen Zellen wie Alveolarmakrophagen und neutrophilen Granulozyten ab 8 h nach i.t.

Infektion mit L. monocytogenes nachgewiesen (Abb. 22). Zahl und Größe dieser Infiltrate nahm im Verlauf der ersten 24 h p.i. zu. Die pathohistologisch beobachteten Entzündungszeichen wurden überwiegend peribronchiolär und perivaskulär detektiert und zeigten eine positive Korrelation zur Infektionsdosis (Abb. 10). Mäuse mit hohen Keimzahlen zeigten eine massive Infiltration inflammatorischer Zellen, die sich in einer Pneumonie-ähnlichen Entzündung darstellte. Die Ausprägung der Entzündung war unabhängig davon, ob die Infektion mit dem Wildtypstamm oder dem attenuierten Listerienstamm erfolgte. Für die Verwendung als Genvektor stellt die inflammatorische Reaktion des Wirts eine unerwünschte Nebenwirkung dar, die es zu vermeiden gilt (FLOTTE u. LAUBE, 2001). Die histologische Auswertung der HE-Färbungen unterstreicht daher die Bedeutung der frühen Termination der Listerieninfektion (s. Kap. 5.5).

5.6.2 Der allgemeine Nachweis von Listerien im histologischen Präparat

Die Gramfärbung wird zur Differenzierung grampositiver und gramnegativer Bakterien verwendet (BURCK, 1988). In der vorliegenden Arbeit wurde sie modifiziert (s. Kap. 3.2.6.1), so dass durch die Kontrastfärbung des Gewebes mit Eosin eine Abschätzung der Menge und der Lokalisation der grampositiven Listerien möglich

war (Abb. 23). Ebenso wie die Gramfärbung diente auch die Fluoreszenz-Einfachfärbung gegen Listerien (Abb. 24) der Auswahl geeigneter Präparate für die konfokale Laser- bzw. die Elektronenmikroskopie. Weder die Gram- noch die Fluoreszenz-Einfachfärbung ermöglichten eine Bestimmung der genauen Lokalisation der Listerien im Epithel. Die gezeigten Einfachfärbungen lassen durch Dichte und Anordnung von Bakterien lediglich eine erfolgte Phagozytose vermuten (Abb. 24 B).

5.6.3 Die Differenzierung intrazellulärer Listerien

Fluoreszenz-Doppelfärbungen gegen Listerien und Atemwegsepithel sollten Aufschluss geben über eine intrazelluläre Lokalisation der Bakterien in Epithelzellen, die mit einer Färbung ihres Zytokeratins dargestellt wurden (Kap. 4.9.2). Die Autofluoreszenz des Lungengewebes in den gewählten Fluoreszenzkanälen erschwerte die Bewertung dieser Präparate jedoch stark. Zur Bestimmung intrazellulärer Listerien wurden deshalb die konfokale Lasermikroskopie und die Elektronenmikroskopie herangezogen (s.unten).

Nach einer parenteralen Listerieninfektion werden in der Maus über 90% der zirkulierenden Bakterien durch mononukleäre Phagozyten eliminiert (EBE et al., 1999). Die Phagozytose durch aktivierte Makrophagen stellt einen bedeutsamen Teil der zellulär dominierten Immunantwort des Wirtsorganismus gegen die Listerieninfektion dar (UNANUE, 1997b). Durch Fluoreszenz-Doppelfärbungen gegen Listerien und Makrophagen wurde in dieser Arbeit die Phagozytose der i.t.

applizierten Keime durch Alveolarmakrophagen untersucht. Durch Interferenz der Fluoreszenzfarben FITC und Cy 3 konnte die Ansammlung von Makrophagen in unmittelbarer Nähe einzeln oder als Cluster auftretender Listerien nachgewiesen werden (Abb. 26). Diese Akkumulation von Bakterien und aktivierten Makrophagen wurde auch in Präparaten der konfokalen Lasermikroskopie beobachtet (Abb. 27 C;

CD-ROM, B, C). Die konfokale Lasermikroskopie ermöglichte zugleich in Dreifachfärbungen die Darstellung von Listerien, Epithelzellen und Makrophagen. Da

bei diesen komplexen Färbungen zwei der sekundären Antikörper dieselbe Wirtsspezifität aufwiesen (s. Tab. 12 B) und an den Primärantikörper gegen Listerien banden, erscheinen die Bakterien in den Färbungen türkisgrün. Mit der Möglichkeit, Präparate in der konfokalen Lasermikroskopie dreidimensional darzustellen, gelang vereinzelt der Nachweis intrazellulärer Bakterien in Zellen des Bronchialepithels (Abb. 27 D, CD-ROM D). Es muss jedoch eingeräumt werden, dass diese Nachweise singuläre Ereignisse waren, die sich weder mit der REM noch mit der TEM wiederholen ließen. Eine prädispositionierende Schädigung der Zellen beispielsweise durch eine mechanische Schädigung bei der Applikation, die eine bakterielle Invasion erst ermöglichte, kann dabei nicht ausgeschlossen werden.

Die von TILNEY und PORTNOY (1989) beschriebene Aktinpolymerisierung, mit der sich Listerien in Wirtszellen fortbewegen können, wurde in verschiedenen Arbeiten elektronenmikroskopisch oder mit der konfokalen Lasermikroskopie gezeigt (DABIRI et al. 1990; DREVETS et al., 1995; GEDDE et al., 2000; GUZMAN et al., 1995;

TILNEY u. PORTNOY 1989; VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001). In dieser Arbeit konnten in Färbungen Listerien-infizierten Lungengewebes mit Phalloidin-Alexa jedoch keine der typischen Kometenschweife detektiert werden, wie sie DABIRI et al.

(1990) in Makrophagen, GUZMAN et al. (1995) in dendritischen Zellen der Maus und MARQUIS et al. (1995) in humanen Epithelzellen beobachteten. Bei den angeführten Arbeiten handelt es sich allerdings um Zellkulturstudien und nicht um den Nachweis eines interzellulären Spreadings in vivo, wie es in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde.

Die in der Fluoreszenz- und der konfokalen Lasermikroskopie beobachtete Akkumulation von Bakterien und Alveolarmakrophagen konnte durch die TEM als Phagozytose der Listerien verifiziert werden (Abb. 29 E, F). Die in den Phagosomen der Makrophagen nachgewiesenen Bakterien waren zwar durch einen Halo gekennzeichnet, keine der Vakuolen wies dagegen eine doppelte Membran auf, wie sie nach einem interzellulären Spreading auftritt (GEDDE et al., 2000). Auch die von TILNEY und PORTNOY (1989) beschriebenen Protrusionen, die die Listerien im Verlauf dieser Ausbreitung zwischen den Zellen induzieren und die COSSART und

KOCKS (1994) und COSSART und LECUIT (1998) nachwiesen, wurden in eigenen histologischen Präparaten nicht detektiert.

Die Adhäsion von Listerien zum respiratorischen Epithel wurde dagegen sowohl in der Raster- als auch in der TEM in nachgewiesen (Abb. 28 A, B; Abb. 29 A). REM-Präparate zeigten die Bakterien dabei häufig in Vertiefungen oder Schleimhautfalten liegend. Da vergleichbare Erscheinungen bei einer Bakterienadhäsion in der Literatur nicht beschrieben wurden, blieb unklar, ob die Anheftung an den beschriebenen Stellen erleichtert war oder ob erst die Anlagerung der Bakterien die Bildung solcher Einstülpungen induzierte.

Die Zelloberfläche von Epithelzellen schien sich durch die Adhäsion der Listerien mikroanatomisch zu verändern (Abb. 29 A). COSSART und LECUIT (1998) zeigten ähnliche Adhäsionserscheinungen zwischen Listerien und eukaryotischen Zellen, ohne die Zellen jedoch genauer zu spezifizieren. Eine tatsächliche Invasion der Listerien, die TILNEY und PORTNOY (1989) als Folge der Adhäsion beschrieben und wie sie VAZQUEZ-BOLAND et al. (2001) in Epithelzellen rasterelektronenmikroskopisch darstellten, konnte jedoch nicht beobachtet werden.

Das Auftreten von Listerien in Kapillaren des Alveolarepithels wurde in geringem Maß nachgewiesen (Abb. 29 C, D). Die ultradünngeschnittenen Präparate erlaubten keine Aussage über die Unversehrtheit der Gefäße, dennoch wurde es als wahrscheinlich angesehen, dass Listerien in der Lage sind, aktiv in Alveolarkapillaren einzudringen. Diese These wird gestützt durch die Betrachtung der Keimzahlen zur Organdissemination aus der Lunge und die Beschreibung der Invasion des Gefäßsystems nach Applikation von Listerien über die gastrointestinale Infektionsroute oder durch aerogene Infektion (BRACEGIRDLE et al., 1994;

DANIELS et al., 2000). Auch von der humanen Listeriose ist bekannt, dass die Ausbreitung der Erreger über Blut- und Lymphweg erfolgt (PRON et al., 1998).

Clarazellen treten in den unteren Atemwegen der Maus mit einer über 50%igen Häufigkeit auf (GRUBB u. BOUCHER, 1999) und wurden in den elektronenmikroskopischen Präparaten entsprechend oft gesehen (Abb. 28 E, F;

Abb. 29 G, H). Als sezernierende Zellen besitzen sie zahlreiche Granula unterschiedlicher Elektronendichte. Schwierigkeiten bereitete teilweise die

Differenzierung möglicherweise intrazellulärer Listerien und elektronendichter Granula der Clarazellen (Abb. 29 G, H). Da diesen elektronendichten ‚Einschlüssen’

jedoch der typische Halo zwischen Bakterienwand und Phagosomenmembran fehlte, wurden sie letztlich nie als Listerien bewertet.

Ein wichtiger Befund der histologischen Untersuchungen ist die massive Phagozytose der Listerien durch Alveolarmakrophagen. Trotz beobachteter Proliferation in Makrophagen gelang es den Bakterien - im Gegensatz zu dem für Makrophagen von TILNEY u. PORTNOY (1989) beschriebenen interzellulären Spreading - jedoch nicht, aus den Phagozyten zu entkommen.

5.7 Der quantitative Nachweis von Listerien in Epithelzellen der