3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN
L. monocytogenes EGD wt in der Lunge nach i.t. Applikation
4.9 Histologische Beurteilung
Histologische Präparate wurden angefertigt, um einerseits durch Listerien verursachte entzündliche Veränderungen der Lunge beurteilen zu können und andererseits v.a. die Lokalisation der Bakterien im Lungengewebe zu bestimmen.
Die Beurteilung pathohistologischer Veränderungen des Lungengewebes erfolgte an HE-gefärbten Paraffinschnitten und wurde für die Versuche ‚Methodischer Vergleich von Applikationstechniken’ und ‚Frühe Organdissemination’ gezeigt (s. dort).
Mit Hilfe der Gramfärbung und immunhistochemischer Einfachfärbungen wurden Infektionsdosen bestimmt, bei denen Listerien in hoher Dichte in der Lunge vorlagen (> 106 KBE), so dass die Lokalisation einzelner Keime gut bestimmbar war.
Der Nachweis von intrazellulären Listerien in Epithelzellen gelang mit den gewählten Infektionsdosen und Untersuchungszeitpunkten nur vereinzelt. Auf eine quantitative Auswertung der histologischen Präparate wurde daher verzichtet. Im folgenden Abschnitt werden repräsentative Färbungen der Lunge der Maus nach i.t. Infektion dargestellt.
4.9.1 Gramfärbungen
Die Färbung diente der Einschätzung der Keimdichte im Lungengewebe nach der i.t.
Infektion sowie der Lokalisation der Listerien in der Gewebeübersicht (Abb. 23).
Die grampositiven Listerien erscheinen nach der Färbung dunkelviolett, die mit Eosin gegengefärbten Zellen des Lungengewebes rosarot. Lichtmikroskopisch lassen sich Listerien ab einer 400-fachen Vergrößerung darstellen, so dass die Keime mit einer maximal 1000-fachen Primärvergrößerung deutlich erkennbar sind. Aussagen über eine mögliche intrazelluläre Lokalisation lassen sich mittels der Gramfärbung jedoch nicht treffen.
Abb. 23: Lungenhistologien nach Gramfärbung mit einer Infektionsdosis von 6,0 x 108 KBE L. monocytogenes EGD wt (Pfeile: Listerien; Lu: Alveolar- oder Bronchiallumen; Ep: Epithel;
Balken 5 µm).
A) Peripheres Alveolargewebe mit zahlreichen Bakterien, welche sowohl frei in den Alveolen als auch in Kontakt mit Alveolarepithelzellen liegen (30 min p.i.; Gefrierschnitt). B) Alveole gefüllt mit Listerien, z.T. im Alveolarlumen, z.T. in Akkumulation mit Mukus adhäsiv an der Alveolarwand (1 h p.i.; Paraffinschnitt). C) Bronchialepithel mit adhäsiven Listerien, die überwiegend als Cluster an den Epithelzellen haften (30 min p.i.; Paraffinschnitt).
D) Längsschnitt durch einen Bronchus; Listerien liegen frei im Bronchiallumen, adhäsiv an der Bronchialwand und peribronchiolär (30 min p.i.; Paraffinschnitt). E) Querschnitt durch Bronchialepithel mit adhäsiven Listerien (30 min p.i.; Gefrierschnitt). F) Listeriencluster in Adhäsion zu Alveolarepithel (30 min p.i.; Gefrierschnitt).
4.9.2 Fluoreszenzmikroskopie
Durch immunhistochemische Fluoreszenzfärbungen konnten Listerien, Makrophagen und Epithelzellen der Lunge dargestellt werden. Einfachfärbungen der Listerien mit FITC dienten der Beurteilung der Dichte der Bakterien im Präparat. Die färberische Darstellung der Bakterien im grünen Fluoreszenzkanal zeigte eine recht starke Autofluoreszenz des Gewebes, durch die auch die Mikroanatomie der Lunge erkennbar war (Abb. 24). Abbildung 24 A zeigt eine Übersicht über Lungengewebe mit einem zentral liegenden Bronchus. Zu einem frühen Untersuchungszeitpunkt (hier: 1 h) waren sowohl im Alveolargewebe (Abb. 24 B) als auch im Bereich des Bronchialepithels (Abb. 24 C) zahlreiche Listerien nachweisbar. Die Bakterien wurden einzeln oder in Clustern liegend gesehen. Mehrfach traten Keimansammlungen im Lumen von Atemwegen in Akkumulation mit Mukus auf (Abb. 24 A, Pfeil). Im Alveolargewebe waren 1 h p.i. lokal deutlich begrenzte, nahezu kreisförmige Listeriencluster nachweisbar (Abb. 24 B). Die Form dieser Keimansammlungen lässt auf eine erfolgte Phagozytose durch Alveolarmakrophagen schließen.
Durch eine Oberflächenfärbung des Zytokeratins von Epithelzellen ließen sich deren Zellgrenzen darstellen (Abb. 25). Doppelfärbungen gegen Zytokeratin und Bakterien sollten die Lage der Keime zu den Zellen definieren. Die Aussagekraft dieser Färbungen war durch die angesprochene Autofluoreszenz des Gewebes nur sehr eingeschränkt möglich. Auf eine Darstellung dieser Färbungen wurde deshalb verzichtet.
Durch Färbung von Listerien und Makrophagen ließ sich die Ko-Lokalisation der Bakterien und der phagozytierenden Zellen darstellen (Abb. 26). Die Mehrheit der Keime wurde peribronchiolär nachgewiesen. Vor allem in der Umgebung von Listerienclustern wurden vermehrt Alveolarmakrophagen nachgewiesen.
Abb. 24: Immunhistochemisch gefärbtes Lungengewebe der Maus 1 h p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. (Br: Bronchus; Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel).
Darstellung der Listerien mit FITC (grün). Bakterienansammlungen mit Pfeilen markiert . A) Übersicht über Lungengewebe. Im zentral liegenden Bronchus findet sich eine große Ansammlung von Listerien. Eine scheinbare Mehrschichtigkeit des Bronchialepithels ist bedingt durch die Schnittführung im Präparat (Balken 50 µm). B) Alveolargewebe mit zahlreichen Listerienclustern (Balken 20 µm). C) Anschnitt eines Bronchus, in dessen Epithelschicht zahlreiche Listerien zu sehen sind (Balken 20 µm).
Abb. 25: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung von Bronchial- (A) und Trachealepithel (B) der Maus nach Zytokeratinfärbung mit Cy 3 (rot). Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel.
A) Epithel zweier Bronchien (Balken 50 µm). B) Epithel der Trachea (Balken 10 µm).
Abb. 26: Immunhistochemisch gefärbtes Lungengewebe der Maus 1 d p.i. mit 2,5 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP.
Zweifachfärbung gegen Makrophagen und Listerien (Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel; Balken 50 µm). A). Eingerahmt wurden zwei peribronchioläre Listeriencluster markiert, in deren Umgebung sich zahlreiche Alveolarmakrophagen angesammelt haben. B) Einfachfärbung gegen Listerien mit FITC (grün). C) Einfachfärbung gegen Makrophagen mit Cy 3 (rot).
4.9.3 Konfokale Lasermikroskopie
Bei den gezeigten Bildern handelt es sich um Dreifachfärbungen von Listerien-infiziertem Lungengewebe. Die Fluoreszenzen der einzelnen Antikörper wurden durch die jeweiligen Laser des konfokalen Mikroskops gescant und die Einzelfärbungen digital übereinander projiziert. Wurden Bakterien mit FITC (grün) und Zytokeratin mit Cy 5 (blau) gefärbt, so kam es zu einer Doppelbindung an den Primärantikörper gegen Listerien, der in einer türkisgrünen Färbung (FITC + Cy 5) der Bakterien resultierte. Da die Präparate bei der konfokalen Lasertechnik schichtartig durchgemustert werden können, erlauben die Färbungen eine Beurteilung der Lokalisation der Listerien sowohl zu den Epithelzellen als auch zu den Makrophagen. Dies gilt besonders für Präparate mit einer Schnittdicke von 35 µm (Abb. 27 C). Die Visualisierung solcher Präparate ist als dreidimensionale Imagedateien möglich (s. beiliegende CD-ROM).
Übersichtsaufnahmen der Lunge zeigten kurze Zeit nach der Applikation (2 h p.i.) eine Verteilung der Bakterien über das gesamte Lungengewebe (Abb. 27 A). Wie schon bei der Fluoreszenzmikroskopie wurden im Lumen größerer Luftwege dem Epithel anhaftende Listeriencluster gesehen (Abb. 27 A, Pfeil). Bei stärkerer Vergrößerung war eine überwiegend peribronchioläre Lokalisation der Bakterien erkennbar (Abb. 27 B). Wiederum wurden zahlreiche Alveolarmakrophagen peribronchiolär, d.h. in der Nähe der Listerien detektiert (Abb. 27 C). In Gewebeschnitten von 35 µm konnten vereinzelt intraepitheliale Listerien in Zellen des Bronchialepithels nachgewiesen werden (Abb. 27 D, Pfeile). Eine sichere Identifizierung intraepithelialer Bakterien erlaubte die dreidimensionale Darstellung solcher dicken Gewebeschnitte (CD-ROM). Um eine mögliche Aktinpolymerisierung intrazellulärer Listerien sichtbar zu machen, wurden 35 µm dicke Gefrierschnitte mit Phalloidin gefärbt. Es konnten jedoch keine Aktinschweife nachgewiesen werden, weshalb auf die Darstellung verzichtet wurde.
Abb. 27: Konfokale Lasermikroskopie dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 2 h nach der i.t. Infektion mit 3,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt.
A) Übersicht über Lungengewebe mit zentral liegendem Bronchus und Listeriencluster (Balken 50 µm). B) Bronchus mit peribronchiolär liegenden Listerien (Balken 10 µm).
Färbung der Epithelzellen mit Cy 5 (blau), Makrophagen mit Cy 3 (rot) und Listerien mit FITC + Cy 5 (türkisgrün). (Pfeile: Listerien; Br: Bronchus; Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel)
Abb. 27 C: Konfokale Lasermikroskopie dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 2 h nach der i.t. Infektion mit 3,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt.
Bronchus mit peribronchiolär liegenden Listerien, in deren Nähe sich zahlreiche Makrophagen angesammelt haben (Pfeile: Listerien; Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel; Balken 20 µm). Färbung der Epithelzellen mit Cy 5 (blau), Makrophagen mit Cy 3 (rot) und Listerien mit FITC + Cy 5 (türkisgrün).
Abb. 27 D: Konfokale Lasermikroskopie dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 2 h nach der i.t. Infektion mit 3,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Intrazelluläre Listerien wurden mit Pfeilen markiert.
Bronchialepithel mit intrazellulär liegenden Listerien (Pfeile: Listerien; Lu: Bronchiallumen;
Ep: Epithel; Balken 10 µm, Schnittdicke des Präparates 35 µm). Listerien wurden Cy 3 (rot), Epithelzellen Cy 5 (blau) und Makrophagen FITC (grün, nicht sichtbar) gefärbt.
CD-ROM: Dreidimensionale Imagedateien dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 1 h p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt.
A) Bronchus mit intraepithelial und peribronchiolär liegenden Listerien. B) Alveolargewebe mit zahlreichen Listerien und Alveolarmakrophagen. C) Alveolargewebe. Listerien mit direktem Epithelkontakt mit Pfeilen markiert. Aktivierte Alveolarmakrophagen sind unmittelbar benachbart der Bakterien aufzufinden. D) Bronchialepithel mit intrazellulärem Bakterium (Pfeil) und peribronchiolären Makrophagen. Färbung der Epithelzellen mit Cy 5 (blau), Makrophagen mit Cy 3 (rot) und Listerien mit FITC + Cy 5 (türkisgrün); Schnittdicke der Präparate 35 µm.
4.9.4 REM
Ebenso wie die konfokale Lasermikroskopie erlaubt die REM eine räumliche Darstellung der Präparate und eignet sich somit zu Beurteilung der Lokalisation von Listerien im Lungengewebe.
In den REM-Präparaten wurden häufig Listeriencluster in Adhäsion an Epithelzellen des Respirationstrakts nachgewiesen. Solche Anlagerungen fanden sich sowohl an Alveolarepithelzellen (Abb. 28 A, B, C, D) als auch an den zilientragenden Epithelzellen der großen Luftwege (Abb. 28 E, F).
Die Bakterien lagen dabei oft in Vertiefungen oder Schleimhautfalten (Abb. 28 A, B).
Im Bereich der Anlagerung von Bakterien war die Lungenoberfläche durch Auflagerung von entzündlichem Fibrin verändert (Abb. 28 C, D). Eine Invasion der Listerien in Epithelzellen oder die Phagozytose durch Alveolarmakrophagen wurde in den REM-Präparaten nicht nachgewiesen.
Abb. 28: REM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus 30 min nach i.t. Infektion mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt.
A) Listeriencluster (Pfeil) in Adhäsion zu einer Alveolarwand (Balken 2 µm). B) Eine Gruppe von Listerien (Pfeil) scheint in die Falte einer Alveolarwand einzuwandern (Balken 1 µm).
Inset: alveoläre Lungenarchitektur (Balken 50 µm).
Abb. 28: REM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus 30 min nach i.t. Infektion mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt.
C) Listerien (Pfeile) in Adhäsion zu einer Alveolarwand (Al), deren Oberfläche stellenweise zerstört bzw. durch Fibrinauflagerungen (Fi) verändert ist. Direkt neben dem Bakteriencluster ragen Erythrozyten (Er) aus einer eröffneten Kapillare (Balken 2 µm). D) Listerien (Pfeile) in Adhäsion zu einer Alveolarwand mit Fibrinbelägen (Balken 1 µm).
Abb. 28: REM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus 30 min nach i.t. Infektion mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt.
E) und F) Listerien (Pfeile) in Adhäsion zu den Zilien (Zi) des respiratorischen Epithels eines kleinen Bronchus, mit typischerweise zahlreichen Clarazellen (Cl) (E: Balken 5 µm; F: Balken 2 µm). Inset: Auskleidung eines kleinen Bronchus mit zilientragendem, respiratorischen Epithel mit zahlreichen, sich mehr oder weniger ins Lumen des Luftweges vorwölbenden Clarazellen (Balken 20 µm).
4.9.5 TEM
Die starken Vergrößerungen in der TEM ermöglichen die Beurteilung der Lokalisation der Listerien im Lungengewebe. Da sich mit den ultradünngeschnittenen Präparaten (80 nm) nur sehr kleine Bereiche der murinen Lunge erfassen lassen, wurden Semidünnschnitte (0,5 µm) angefertigt, um in den Präparaten eine bessere Orientierung zu erlangen. Auch die Auswahl der Gewebebereiche, die als Ultradünnschnitte aufgearbeitet werden sollten, erfolgte anhand der Semidünnschnitte. In den Ultradünnschnitten waren besonders Zellgrenzen, Phagozytose und bakterielle Adhäsion darstellbar.
In den TEM-Präparaten wurde die Mehrzahl der Listerien in den Alveolarräumen nachgewiesen (Abb. 29 A, B). Hier wurden auch proliferierende Bakterien gesehen.
Partiell wurden Listerien in Adhäsion zum Alveolarepithel gesehen, die die Oberfläche der Epithelzellen mikroanatomisch zu verändern schienen (Abb. 29 A).
Listerien traten selten in Kapillaren des Alveolargewebes auf (Abb. 29 C, D).
Zahlreiche Bakterien waren dagegen von Makrophagen phagozytiert worden (Abb.
29 E, F). Die überwiegende Anzahl phagozytoseaktiver Makrophagen hatte dabei mehrere Listerien aufgenommen. Es wurden bis zu 20 Bakterien in einer Fresszelle gezählt. Zwischen Bakterienwand und Membran des Phagosoms war jeweils ein deutlicher Spaltraum (Halo) zu erkennen. Als weiterer Befund wurde die Proliferation phagozytierter Listerien in den Makrophagen gesehen (Abb. 29 F). Häufig wurden auch sezernierende Clarazellen der murinen Lunge in den Präparaten beobachtet (Abb. 29 G, H). Die teilweise elektronendichten Granula dieser Zellen (Abb. 29 H) waren von intrazellulären Listerien trotz starker Primärvergrößerungen (16.000-fach) nicht eindeutig zu differenzieren.
Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion.
A) Listerien im Alveolarraum 24 h p.i. mit 1,8 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491 A + pERL3-CMVGFP (Balken 1 µm). Stellenweise besitzt die Bakterienwand direkten Kontakt zum Alveolarepithel (Pfeile; Al: Alveolarzelle; Ba: Basalmembran; Nu:
Zellkern). Inset: Übersicht des alveolären Raums mit mehreren Bakterien 72h p.i. mit 5,4 x 105 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP (Balken 1 µm).
B) Intraalveoläre Listerien (Pfeile) 30 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Die Bakterien liegen in einer Alveole, die mit verschiedenen Surfactantformen (Su) gefüllt ist (Ba: Basalmembran Alveolarepithelzelle; Balken 2 µm).
Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion.
C) Kapillare mit zwei Erythrozyten (Er) und einem intraluminal proliferierenden Bakterium 10 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Im Alveolarraum liegen zwei weitere Listerien (Pfeile) ohne Epithelkontakt (Balken 2 µm). D) Kapillare mit Erythrozyt (Er) und intraluminalem, proliferierenden Bakterium (Pfeil) 10 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt (Ba: Basalmembran von Alveolar- und Endothelzellen; Ka:
Kapillarlumen; Lu: Alveolarlumen; Balken 2 µm).
Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion.
E) Alveolarmakrophage (Nu: Zellkern; Za: Zellausstülpungen) mit phagozytierten Listerien 30 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Der Spaltraum zwischen Bakterienwand und Membran der Phagosomen ist deutlich zu erkennen (Pfeile). Das unterhalb des Makrophagen gelegene Alveolarepithel zeigt eine Diskontinuität der Zelloberflächen (Pfeile) und damit die lokale Zerstörung der epithelialen Barriere (Balken 2 µm). F) Alveolarmakrophage (Nu: Zellkern; Ve: Vesikel) mit phagozytierten Listerien 10 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt (Balken 2 µm). Die Freßzelle besitzt zahlreiche Zellausstülpungen (Za) und beginnt mit diesen ein weiteres Bakterium zu umschliessen (Pfeil). Zwei bereits phagozytierte Bakterien zeigen intrazelluläre Proliferation (Pfeile).
e
Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion.
G) Clarazelle (Cl, Nu: Zellkern) zwischen zilientragenden Zellen (Zi) des respiratorischen Epithels 24 h p.i. mit 1,8 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP. Die weißen Pfeile markieren elektronendichte Granula der Zelle, der schwarze Pfeil eine Listerie (Balken 1 µm). H) Elektronendichter Einschluss einer Clarazelle 10 min p.i.
mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt (Balken 2 µm). Die Zelle besitzt weitere, deutlich weniger elektronendichte Granula (Pfeile). Oberhalb des Einschlusses sind Zilien des respiratorischen Epithels angeschnitten.
5 DISKUSSION
Mit der Identifizierung des CFTR-Gens wurde die genetische Ursache der cystischen Fibrose (CF) gefunden (KEREM et al. 1989; RIORDAN et al., 1989; ROMMENS et al., 1989). Fortschritte in der molekulargenetischen Technik stärkten die Hoffnung, mit der somatischen Gentherapie bald über die Möglichkeit zur Heilung schwerer monogenischer Erkrankungen wie der CF zu verfügen (WEST u. RODMAN, 2001).
Aufgrund der Sequenzierung des murinen Cftr-Gens konnten verschiedene gentechnisch modifizierte Mausstämme generiert werden, die zumindest einen Teil der humanen CF modellierten (GRUBB u. BOUCHER, 1999). Trotz Entwicklung und Erprobung zahlreicher viraler und nicht-viraler Vektoren blieben die erwarteten Erfolge mit der somatischen Gentherapie jedoch aus, so dass derzeit an der Verbesserung vorhandener und der Suche neuer Vektoren gearbeitet wird (PILEWSKI, 2002). Wie der Einsatz von Bakterien bei der DNA-Vakzinierung gezeigt hat, können diese Organismen Expressionsplasmide in Wirtszellen einschleusen und so eine langfristige Immunität gegen Krankheitserreger oder Tumoren induzieren (GURUNATHAN et al., 2000b; WEISS, 2003). Der Gedanke, bakterielle Vektoren für die somatische Gentherapie zu entwickeln, lag demnach nahe.
Die murine Infektion mit L. monocytogenes stellt eines der bestuntersuchten Modelle für zelluläre Immunität und Pathogenitätsmechanismen intrazellulärer Bakterien dar (COSSART u. MENGAUD, 1989; SHEN et al., 1998). Der Lebenszyklus des Bakteriums zeigt eine interzelluläre Ausbreitung, die sowohl die Immunantwort des Wirtsorganismus umgehen als auch die Infektion tiefer liegender Zellschichten ermöglichen könnte (TILNEY u. PORTNOY, 1989). Ausgehend von diesen Eigenschaften des Erregers wurden attenuierte Stämme generiert und ihre Fähigkeit zur Transfektion eukaryotischer Zellen untersucht (HENSE et al., 2001). Die viel versprechenden in vitro-Transfektionsergebnisse des Stammes L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP (KRUSCH et al., 2002) ließen in vivo-Untersuchungen im Tiermodell sinnvoll erscheinen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines pulmonalen Infektionsmodells in der Maus mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP und mit dem Wildtypstamm L. monocytogenes EGD. Da dieses Modell hinsichtlich der Eignung der Bakterien als Vektoren für eine somatische Gentherapie der CF untersucht werden sollte, wurde besonderes Augenmerk auf die zelluläre Lokalisation der Listerien in der Lunge gerichtet. Zur Charakterisierung des pulmonalen Listerien-Infektionsmodells wurden Mausinzuchtstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6 verwendet, die eine unterschiedliche Suszeptibilität für L. monocytogenes besitzen.