Die Hintergrundstämme der im ZTL erzeugten congenen Cftrtm1Hgu-Stämme wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Suszeptibilität gegenüber bakteriellen Infektionen ausgewählt (AUTENRIETH et al., 1994; BUTLER 1973; CHIODINI u. BUERGELT, 1993; MORISSETTE et al., 1995; PLANT u. GLYNN, 1974; ROBSON u. VAS, 1972;
SADARANGANI et al., 1980; TANAKA et al., 1994).
2.6.1 BALB/c
Der Albinostamm ist seit 1913 etabliert und gehört zu den am häufigsten eingesetzten Inzuchtstämmen. BALB/c-Substämme zeichnen sich durch eine hohe Fruchtbarkeit aus und haben unter konventionellen Haltungsbedingungen eine mittlere Lebensdauer (weibliche Tiere im Mittel 575 Tage, STORER, 1966). Die Mäuse sind suszeptibel für eine Reihe von Infektionserregern, so z.B. für S. typhimurium (PLANT u. GLYNN, 1974), Mycobacterium paratuberculosis (CHIODINI u. BUERGELT, 1993) und Yersinia enterocolitica (AUTENRIETH et al., 1994). Resistent zeigen sich Mäuse dieses Stammes dagegen gegen Helicobacter pylori (MÄHLER et al., 2002) und Pseudomonas aeruginosa (MORISSETTE et al., 1995).
2.6.2 DBA/2
Der Stamm DBA wurde 1909 von Little wegen seiner Fellfarbe (milchkaffeefarben) abgegrenzt und ist damit der älteste Mausinzuchtstamm überhaupt. Zwischen 1929 und 1930 wurden die beiden Substämme DBA/1 und DBA/2 geschaffen, die in so zahlreichen Genorten polymorph sind, dass man eher von verschiedenen Stämmen als von Substämmen sprechen kann (FESTING, 1999). DBA/2-Mäuse zeigen in konventioneller Haltung eine lange Lebensdauer (im Mittel 714 Tage für weibliche
Tiere, STORER, 1966). Die Mäuse sind resistent gegenüber Infektionen mit Helicobacter pylori (MÄHLER et al., 2002), suszeptibel dagegen für S. typhimurium (PLANT u. GLYNN, 1974) und Pseudomonas aeruginosa (MORISSETTE et al., 1995). Die Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa sind durch eine hohe Mortalität gekennzeichnet.
2.6.3 C57BL/6
Der Substamm ging schon vor 1937 aus dem 1921 entstandenen Stamm C57BL (schwarz, Little und Lathrop) hervor. C57BL/6 ist heute der am häufigsten eingesetzte Inzuchtstamm der Welt und der genetische Hintergrundstamm zahlreicher congener Stämme. C57BL/6-Mäuse besitzen eine hohe Lebensdauer (750 Tage für weibliche Tiere, ROWLATT et al., 1976), sie zeigen allerdings eine hohe Bereitschaft zu Aggressivität und Kannibalismus (BUTLER, 1973). Suszeptibel sind C57BL/6-Mäuse für Infektionen mit S. typhimurium (ROBSON u. VAS, 1972) und Mycobacterium paratuberculosis (TANAKA et al., 1994). Sie zeigen sich dagegen resistent gegen Infektionen mit Yersinia enterocolitica (AUTENRIETH et al., 1994), Helicobacter pylori (MÄHLER et al., 2002) und besitzen auch eine sehr hohe Resistenz gegenüber Listeria monocytogenes (s. Kap. 2.6.4).
Als Vorteil für die Nachahmung der pulmonalen Erkrankung der humanen CF wäre die Empfänglichkeit gegen CF-typische Erreger wie Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia anzusehen (DAVIDSON et al., 1995; RATJEN u. DÖRING 2003; TÜMMLER u.
KIEWITZ, 1999). Da in der vorliegenden Arbeit die Eignung des grampositiven Bakteriums L. monocytogenes als Vektor einer möglichen somatischen Gentherapie für die CF im Infektionsmodell Maus untersucht werden soll, ist die Suszeptibilität der Mausstämme für diesen Erreger hier von besonderer Bedeutung (s. Kap. 2.6.4).
2.6.4 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes
Die Infektion der Maus mit L. monocytogenes gilt als gut untersuchtes Modell der Pathogenese intrazellulärer Erreger und der Regulation zellulärer Immunität (CZUPRYNSKI et al., 2003; MACKANESS, 1962; MANDEL u. CHEERS, 1980;
MILON, 1997). In Abhängigkeit von ihrem genetischen Hintergrund unterscheidet man bei Mausstämmen zwei grundsätzlich unterschiedliche Immunreaktionen auf eine parenterale Listerieninfektion, die als „frühe Resistenz“ und „frühe Suszeptibilität“ beurteilt werden (CZUPRYNSKI u. BROWN, 1986; MILON, 1997).
Zwischen resistenten und suszeptiblen Stämmen wurden Unterschiede in der LD50
und in den Keimzahlen von Leber und Milz um den Faktor 100 nachgewiesen (CHEERS u. MCKENZIE 1978; CZUPRYNSKI et al. 2003; KONGSHAVN 1986;
SADARANGANI et al., 1980).
Die murine systemische Listerieninfektion ist durch ein Überleben der Erreger in Makrophagen und Hepatozyten gekennzeichnet (ZHAN et al., 1998). Bereits sehr früh im Infektionsverlauf kommt es zu einer Makrophagen-Akkumulation in der Leber, wobei es sich bei den Makrophagen vorwiegend um unreife, sich rasch teilende phagozytäre Blutmonozyten handelt (STEVENSON et al., 1981). Diese durch die zelluläre Immunantwort gekennzeichnete frühe Phase, noch vor dem Auftreten sensibilisierter T-Zellen, ist entscheidend für den weiteren Infektionsverlauf (SADARANGANI et al., 1980; STEVENSON et al., 1981). Infizierte Makrophagen aktivieren natürliche Killerzellen und induzieren die primäre Immunantwort (UNANUE, 1997a). Die T-Zellantwort beinhaltet sowohl die Aktivierung von CD4+- als auch von CD8+-T-Zellen, die beide eine protektive Immunität vermitteln (LADEL et al., 1994). Dass die Immunantwort gegen L. monocytogenes zellulär und nicht humoral vermittelt ist, belegen Untersuchungen, die zeigen, dass eine Immunisierung sowohl resistenter als auch suszeptibler Mäuse durch Verabreichung sensibilisierter T-Zellen, nicht aber durch Antikörper möglich ist (CHEERS et al., 1978). Das Schlüsselzytokin der Aktivierung naiver T-Zellen zu Th 1-Helfer-Zellen ist das von den infizierten Makrophagen produzierte IL 12 (UNANUE, 1997a). Die Th
1-Helfer-Zellen ihrerseits produzieren INF γ und IL 2, die wiederum neue Makrophagen zu bakterizider Aktivität stimulieren (MACKANESS, 1969; UNANUE, 1997a).
Der Unterschied der genetisch bedingten Suszeptibilität wird bereits in den ersten 48h der Infektion deutlich (CHEERS et al. 1978; MACKANESS 1969 SADARANGANI et al., 1980; STEVENSON et al., 1981). Resistente Stämme zeigen den beschriebenen massiven Einstrom von Makrophagen und Entzündungsmediatoren (INF γ, TNF α, IL 1, IL 6 und IL 12, UNANUE, 1997a), während es bei suszeptiblen Stämmen zur Proliferation der Erreger in Leber und Milz kommt, in Abhängigkeit von der Infektionsdosis (> 104 KBE; STEVENSON et al., 1981) gefolgt von Bakteriämie und schließlich dem Tod der Tiere. Die Qualität der frühen zellulären Immunantwort ist dabei v.a. durch folgende Parameter gekennzeichnet (CHEERS u. MCKENZIE 1978; KONGSHAVN u. SKAMENE 1984;
SADARANGANI et al., 1980):
• die Größe des Reservoirs unreifer phagozytotischer Monozyten
• die Geschwindigkeit ihrer Mobilisierung und Reifung
• die Effizienz ihrer Phagozytose- und bakteriziden Aktivität
Untersuchungen, in denen das Knochenmark und damit das Reservoir des mononukleären phagozytotischen Systems durch Bestrahlung zerstört wurde, zeigen eine Aufhebung der natürlichen Resistenz, während die Keimzahlen suszeptibler Stämme sich nicht veränderten (SADARANGANI et al., 1980).
Die angenommene genetische Ursache der Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes wurde durch Rückkreuzungsstudien zwischen resistenten und suszeptiblen Stämmen untersucht (CHEERS u. MCKENZIE, 1978; KONGSHAVN, 1986 SKAMENE et al., 1979) und als MHC-unabhängiges, autosomales und unvollständig dominant exprimiertes Listeria resistance (Lsr1)-Gen bzw. Gencluster mit dem Hc-Lokus von Chromosom 2 beschrieben (CHEERS u. MCKENZIE, 1978;
SADARANGANI et al., 1980; SKAMENE et al., 1979; STEVENSON et al., 1981).
Neben der Rückführung der frühen zellvermittelten Immunität auf ein MHC-unabhängiges Gen gibt es jedoch auch Anzeichen, dass zumindest die später erfolgende T-zellvermittelte Immunantwort MHC-kontrolliert ist (KONGSHAVN, 1986). So beginnt die T-zellvermittelte Immunantwort in resistenten Stämmen etwa
24 – 48 h früher als in suszeptiblen (CHEERS et al., 1978; KONGSHAVN, 1986). Die Beobachtung, dass Listerien-resistente Mausstämme den MHC-Haplotyp H 2b und Listerien-suszeptible Stämme den Haplotyp H 2a oder H 2d besitzen, unterstützt diese Vermutung (KONGSHAVN, 1986; SKAMENE et al., 1979; STEVENSON et al., 1981). Tabelle 4 beschreibt die Suszeptibilität der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Stämme unter Angabe ihres MHC-Haplotyps.
Die meisten Untersuchungen des murinen Listerien-Infektionsmodells wurden als parenterale, d.h. i.p oder i.v. induzierte Infektionen durchgeführt. Die natürliche Listerieninfektion erfolgt jedoch meist oral, so dass der Gastrointestinaltrakt bzw. die Darmmukosa die natürliche Eintrittspforte der Erreger darstellt (CZUPRYNSKI et al., 2003; DANIELS et al., 2000). Beim Menschen erfolgt der Eintritt in die Enterozyten über die Inl A-vermittelte Bindung an das Adhäsionsprotein E-Cadherin (MENGAUD et al., 1996). Wie bereits beschrieben (s. Kap. 2.4.1) sind Listerien nicht in der Lage, das murine E-Cadherin als Rezeptor zu erkennen, da dieses eine andere Aminosäuresequenz besitzt (LECUIT et al., 1999). Darmepithelzellen gentechnisch modifizierter Mäuse, die humanes E-Cadherin exprimieren, können dagegen von Listerien infiziert werden (FINLAY, 2001; LECUIT et al., 2001). Diese natürliche Resistenz der Maus gegen eine orale Infektion mit Listerien galt es demnach mit dem Ziel der Nachahmung der natürlichen Listerieninfektion des Menschen zu überwinden (CZUPRYNSKI et al., 2003; FINLAY, 2001). In einem Ligated Loop-Modell des Ileums der Ratte disseminierten 0,01% Listerien innerhalb von 15 min nach Applikation von 109 KBE in mesenteriale Lymphknoten, Leber und Milz (PRON et al., 1998). Das Überwinden der Darmschranke erfolgte unabhängig vom lymphatischen Gewebe der Peyerschen Platten, wo jedoch eine vermehrte Replikation der Keime gesehen wurde. Auch Untersuchungen in der Maus wiesen darauf hin, dass Listerien im Gegensatz z.B. zu Salmonellen oder Shigellen keine bestimmte Zellart für ihren Eintritt in die Darmmukosa benötigen (DANIELS et al., 2000). Die Geschwindigkeit, mit der die Listerien auch hier in Leber und Milz nachgewiesen werden konnten, spricht für eine direkte Dissemination über das Blut und nicht für den Umweg über phagozytierende Makrophagen. Obwohl der zelluläre Mechanismus, mit dem Listerien die Darmschranke der Maus überwinden, noch nicht
geklärt ist, belegen die Untersuchungen, dass eine gastrointestinale Listerieninfektion durch eine entsprechend hohe Infektionsdosis (≤ 109 KBE) möglich ist. Neuere Untersuchungen konnten zeigen, dass die durch den Hc-Lokus auf Chromosom 2 vermittelte natürliche Resistenz bzw. Suszeptibilität von Mausstämmen gegen eine parenterale Listerieninfektion entsprechend auch eine gastrointestinale Infektion mit L. monocytogenes reguliert (CZUPRYNSKI et al., 2003).
Tab. 4: Suszeptibilitäten der verwendeten Mausinzuchtstämme unter Angabe ihres MHC-Haplotyps (Lsr1r: resistent, Lsr1s: suszeptibel).
Mausstamm Lsr1-Allel MHC-Haplotyp Referenzen
BALB/c Lsr1s H 2d
DBA/2 Lsr1s H 2d
C57BL/6 Lsr1r H 2b
CHEERS u.
MCKENZIE, 1978;
CHEERS et al., 1978; KONGSHAVN, 1986; MANDEL u.
CHEERS, 1980;
SKAMENE u.
KONGSHAVN, 1979;
SKAMENE et al., 1979