Methodischer Vergleich von Applikationstechniken für die Lunge

Durch den Vergleich der vier Applikationstechniken sollte die am besten geeignete Methode bestimmt werden, mit der eine pulmonale Listerieninfektion in der Lunge der Maus erzeugt werden kann.

Nur bei der Tracheotomie handelt es sich um einen operativen Eingriff am Versuchstier und damit um eine invasive Technik. Die übrigen Methoden stellen jeweils eine nicht invasive, topische Applikation der Keime dar.

Die Effizienz einer jeweiligen Technik wurde über die Keimzahlen beurteilt, die nach einer Stunde in der linken Lunge detektiert werden konnten (Abb. 8). Dabei wurden annähernd gleich hohe Keimzahlen bei der i.t. sichtkontrollierten Instillation und der Tracheotomie gefunden. Die KBE in den Lungen nach nasaler Applikation und blinder Instillation waren dagegen deutlich niedriger. Da die bei den verschiedenen Techniken verwendeten Infektionsdosen Unterschiede aufwiesen, wurde zur besseren Vergleichbarkeit der Keimzahlen deren prozentualer Anteil an der Infektionsdosis bestimmt (Abb. 9). Die relativ höchsten Keimzahlen erhielt man mit der Tracheotomie (ca. 25%), mit der i.t. sichtkontrollierten Instillation ließen sich noch ca. 10% der Infektionsdosis in der linken Lunge nachweisen. Mit der nasalen Applikation und der blinden Instillation waren weniger als 5% der Infektionsdosis nachweisbar.

Anhand der Streuung der Keimzahlen in den Lungen innerhalb der Versuchsgruppen wurde die Reproduzierbarkeit der Methode bewertet (Abb. 8). Sowohl bei der blinden (1 h p.i.) als auch bei der nasalen Applikation (1 h p.i. und 24 h p.i.) gab es Tiere, bei denen überhaupt keine Keime in der Lunge nachgewiesen werden konnten (Abb. 8).

Bei beiden Techniken kam es zu einer großen Streuung der Werte innerhalb der Versuchsgruppen, wie Abbildung 8, C und D (nasale Applikation: 1 h p.i., blinde Instillation 24 h p.i.) zeigen.

Um eine extrapulmonale Kontamination zu beurteilen, wurden die Keimzahlen in der Milz betrachtet. Mit keiner der Methoden konnten 1 h p.i. Keime in der Milz nachgewiesen werden (Abb. 8). Zumindest bei den Tieren, die nasal bzw. mit der blinden Applikation infiziert wurden und in deren Lungen keine Keime nachgewiesen werden konnten, muss jedoch von einer extrapulmonalen Kontamination ausgegangen werden. Die höchsten Keimzahlen in der Milz nach 24 h wurden bei der blinden Instillation gefunden, was die Annahme einer extrapulmonalen Kontamination 1h p.i. unterstützt (Abb. 8 C) . Bei der Tracheotomie waren die Milzen 24 h p.i. nahezu steril (Abb. 8 B).

Die Tiere wurden bis ca. 1 h nach Erwachen aus der Narkose und am folgenden Tag wiederum ca. 1 h bis zum Töten beobachtet. Bei den tracheotomierten Tieren fielen im Käfig eine eingeschränkte Mobilität und ein gesträubtes Fell auf, die Tiere der anderen Gruppen zeigten kein auffälliges Verhalten.

Histopathologische Veränderungen des Lungengewebes wurden durch die Auswertung von HE-gefärbten Paraffinschnitten beurteilt (Abb. 10). Von der rechten Lunge jedes infizierten Tieres wurde ein Schnitt jeweils eines Lungenlappens für die Färbung verwendet. Die gefärbten Präparate wurden auf entzündliche Veränderungen durchgemustert.

Mit keiner der Methoden waren 1 h p.i. Veränderungen in der Lunge nachweisbar, 24 h p.i. wurden v.a. peribronchioläre und perivaskuläre Infiltrate bei allen Methoden gefunden (Abb. 10). Entsprechend der starken Schwankungen der Keimzahlen in der Lunge nach der nasalen Applikation waren auch die histopathologischen Veränderungen sehr unterschiedlich (Abb. 10 C, Inset). Die stärksten Infiltrate neutrophiler Granulozyten und mononukleärer Entzündungszellen wurden bei den tracheotomierten Tieren gefunden (Abb. 10 B, Inset).

0

Abb. 8: Vergleich der Keimzahlen in der linken Lunge und der Milz 1 h bzw. 24 h p.i. nach Applikation der Keime mit verschiedenen Techniken. Aufgetragen sind die KBE von L. monocytogenes EGD wt pro Organ (n = 5).

A) i.t. sichtkontrollierte Instillation (Infektionsdosis 4,5 x 10⁴ KBE), B) Tracheotomie (Infektionsdosis 3,3 x 10⁴ KBE), C) blinde Instillation (Infektionsdosis 5,1 x 10⁴ KBE), D) nasale Applikation (Infektionsdosis 5,1 x 10⁴ KBE).

■ linke Lunge 1h p.i., ▲ Milz 1h p.i., □ linke Lunge 24h p.i., ∆ Milz 24h p.i.

0 10 20 30

%

40

*

Abb. 9: Prozentualer Methodikvergleich 1 h p.i.

Aufgetragen ist der Anteil der Infektionsdosis in Prozent, der 1 h p.i. durch Keimzahlbestimmung in der linken Lunge nachgewiesen werden konnte. Die Werte sind Mittelwerte ± SF (n = 5).

i.t., sichtkontrollierte Instillation, Tracheotomie, blinde Instillation, nasale Applikation

Abb. 10: Histopathologische Veränderungen 24 h p.i in den Lungen von Mäusen, die mit L. monocytogenes EGD wt infiziert wurden, im Vergleich zu einer nicht-infizierten Kontrolllunge (Balken 200 µm).

A) I.t. sichtkontrollierte Instillation: peribronchioläre Infiltration mit Entzündungszellen (Infektionsdosis 4,5 x 10⁴ KBE). B) Tracheotomie: Inflammatorische Infiltrate, im Inset multifokale, Pneumonie-ähnliche Infiltrationen (Infektionsdosis 3,3 x 10⁴ KBE). C) Nasale Applikation: schwach und stark (Inset) ausgeprägte Inflammation (Infektionsdosis 5,1 x 10⁴ KBE). D) Blinde Instillation: keine sichtbare Inflammation bei einem Tier, dessen Lunge 24 h p.i. nahezu steril war (Infektionsdosis 5,1 x 10⁴ KBE). E) Nicht-infizierte Kontrolle einer Lunge, der i.t. sichtkontrolliert 30 µl PBS appliziert wurden.

4.2 Rechts-Links-Verteilung in der Lunge nach i.t. Instillation

Die makroskopische Betrachtung der Farbstoff-instillierten Lunge zeigte eine annähernd symmetrische Verteilung des Trypanblau auf die rechte und linke Lungenhälfte (Abb. 11). Diese Verteilung erfolgte entlang der Luftwege, soweit dies Schnitte entlang der Bronchien der einzelnen Lungenlappen zu zeigen vermochten.

Abb. 11: Lunge einer Maus mit 50 µl Trypanblau-Lösung instilliert, ex situ von ihrer zwerchfellswärtigen Seite (linke Lunge 1, rechte Lunge: Lobus cranialis 2, Lobus medius 3, Lobus caudalis 4 und Lobus accessorius 5).

Bei den mit Listerien-Suspension instillierten Tieren wurde innerhalb der Gruppen (1 h bzw. 24 h) eine unterschiedliche Verteilung der Keime beobachtet (Abb. 12). So zeigten einige Tiere höhere Keimzahlen in der linken Lunge (1 h: Tier 1 und 3; 24 h:

Tier 2, 3 und 4), bei anderen wurden höhere Keimzahlen in der rechten Lunge gefunden (1 h: Tier 2, 6 und 7; 24 h: Tier 5) und bei einigen waren die Keimzahlen in der rechten und linken Lunge nahezu gleich (1 h: Tier 4 und 5; 24 h: Tier 1).

Nach 24 h hatten sich die Keimzahlen in den Lungen etwa um den Faktor 30 vervielfacht. Trotz der Schwankungen innerhalb der Gruppen, erwiesen sich die zu einem Untersuchungszeitpunkt in den linken bzw. rechten Lungen gefundenen Keimzahlen, als nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 13).

Für die folgenden Versuchsreihen wurde daher bestimmt, die linke Lunge zur Keimzahlbestimmung und die rechte Lunge zur histologischen Präparation zu nutzen.

Abb. 12: Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge 1 h (A) und 24 h (B) nach i.t.

Instillation. Aufgetragen sind die KBE pro Organ (A: n = 7; B: n = 5, Infektionsdosis 3,4 x 10⁴ KBE). ^{Tier 1, Tier 2, Tier 3, Tier 4, Tier 5, Tier 6, Tier 7}

Abb. 13: Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge 1 h bzw. 24 h nach i.t.

Instillation. Aufgetragen sind die KBE pro Organ (1 h: n = 7, 24 h: n = 5). Die Werte sind Mittelwerte ± SF. 1h 24h

0.00

4.3 Vergleich von i.g. und i.t. Listerieninfektion

Durch Vergleiche der Ausbreitung der Keime nach i.g. bzw. i.t. Applikation sollte die Eigenschaft der Lunge als ein die Dissemination begrenzendes Kompartiment beurteilt werden. Außerdem sollte die Entwicklung der Keimzahlen in der Lunge nach i.g. Applikation untersucht werden.

Bei keinem der i.g. infizierten Tiere waren während bzw. nach der Applikation Auffälligkeiten in der Atmung zu beobachten, die auf eine partielle oder teilweise Applikation der Bakteriensuspension in die Lunge schließen liessen.

Bei der i.g. Applikation ließen sich 2 h p.i. bei zwei Tieren keine Keime in der Lunge nachweisen, bei den übrigen vier Tieren wurden zu diesem frühen Zeitpunkt 1,2 ± 0,8 x 10³ KBE detektiert (Abb. 14 A). Es bestand ein signifikanter Unterschied zu den Keimzahlen, die in den Lungen der i.t. infizierten Tiere (7,9 ± 1,9 x 10³ KBE) nachgewiesen wurden.

An Tag 1 p.i. zeigte von den i.g. infizierten Tieren lediglich ein Tier eine Besiedelung der Lunge mit Listerien, die übrigen Tiere waren hier steril. Die i.t. infizierten Mäuse wiesen einen allmählichen Anstieg der Listerienzahlen in der Lunge im Versuchszeitraum auf, die Keimzahlen 2 h p.i entsprachen dabei in etwa der Infektionsdosis. Bei den i.g. infizierten Tieren konnten erst an Tag 4 p.i. Listerien bei allen Tieren der Versuchsgruppe in der Lunge nachgewiesen werden. Die Werte der Keimzahlen zeigten im Vergleich zu den i.t. infizierten Mäusen jedoch eine sehr viel höhere Varianzbreite (i.t.: 1,2 ± 0,1 x 10⁷ KBE, i.g.: 6,5 ± 5,7 x 10⁵ KBE).

Die Infektionskinetiken von Milz (Abb. 14 B) und Leber (Abb. 14 C) wiesen für beide Applikationstechniken einen allmählichen Anstieg der Keimzahlen im Versuchszeitraum auf. Eine Besiedlung mit Listerien wurde bei allen Tieren wiederum für beide Applikationstechniken sowohl für die Milz als auch für die Leber ab Tag 1 p.i. beobachtet.

Im Gehirn konnten Listerien nach i.t. Infektion bei vier Tieren an Tag 1 p.i.

nachgewiesen werden, bei der i.g. Infektion wurden hier erst an Tag 4 p.i. Keime detektiert (Abb. 14 D). Alle Tiere wiesen vier Tage p.i. Listerien im Gehirn auf, unabhängig von der Infektionsart.

10⁰

Abb. 14, A und B: Keimzahlen in den Organen Lunge (A) und, Milz (B), als Einzelwertdarstellung mit Mittelwerten (——) 2 h, 1 d und 4 d p.i. nach i.g. bzw. i.t.

Applikation von L. monocytogenes EGD wt (n = 6). Die Infektionsdosis betrug 3,6 x 10⁸ KBE für die i.g. Applikation ( ) und 7,3 x 10³ KBEfür die i.t. Applikation (■).

*

*

*

10⁰

Abb. 14, C und D: Keimzahlen in den Organen Leber (C) und Gehirn (D) als Einzelwertdarstellung mit Mittelwerten (——) 2 h, 1 d und 4 d p.i. nach i.g. bzw. i.t.

Applikation von L. monocytogenes EGD wt (n = 6). Die Infektionsdosis betrug 3,6 x 10⁸ KBE für die i.g. Applikation ( ) und 7,3 x 10³ KBEfür die i.t. Applikation (■).

4.4 Suszeptibilität der Maustämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6 für die i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD

Die Inzuchtstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6J zeigen eine unterschiedliche Suszeptibilität gegenüber einer parenteralen Infektion mit L. monocytogenes (s. Kap. 2.6.4). Ob sich diese charakteristische Empfänglichkeit bzw. Resistenz der drei Mausstämme gegen den Erreger nach einer lokalen, nämlich der i.t. Infektion ebenso darstellt, sollte in diesem Versuch untersucht werden.

Neben Keimzahlbestimmungen in Lunge, Milz, Leber und Gehirn dienten auch Veränderungen des KGWs, der Rektaltemperatur und des Allgemeinbefindens der Tiere als Untersuchungsparameter.

Keimzahlbestimmung

Zwischen den Keimzahlen der Lungen der Mausstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6J an Tag 1 p.i. mit L. monocytogenes EGD wt wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet (Abb. 15 A). Auch in den übrigen untersuchten Organen Milz, Leber und Gehirn waren zu diesem Zeitpunkt keine signifikanten Unterschiede nachweisbar (Abb. 15 B, C, D).

Bereits an Tag 4 p.i. wurde jedoch ein signifikantes Absinken der Keimzahlen in Lunge, Milz und Leber bei den C57BL/6J-Mäusen deutlich (Abb. 15 A, B, C). Im Gehirn war dagegen keine unterschiedliche Entwicklung der Keimzahlen zu beobachten (Abb. 15 D). An Tag 6 p.i. waren bereits alle BALB/c- und bis auf ein Tier auch die DBA/2-Mäuse an der Infektion gestorben bzw. moribunde Tiere getötet worden (s. auch Allgemeinbefinden, KGW und Rektaltemperatur). Bis zum Ende des Beobachtungszeitraums an Tag 14 p.i. hatten lediglich die C57BL/6J-Tiere überlebt, die C57BL/6J-Tiere der BALB/c- und DBA/2-Vergleichsgruppen waren an den Tagen 4, 5 und 6 p.i. gestorben bzw. getötet worden. Die letzte DBA/2-Maus starb an Tag 9 p.i.

10⁰

Abb. 15, A und B: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in Lunge (A) und Milz (B). Dargestellt sind die Werte der einzelnen Tiere mit Mittelwerten (—) der Gruppen an 1 d, 4 d, 7 d und 14 d nach i.t. Infektion mit 4,2 x 10³ KBE L. monocytogenes EGD wt (n = 5).

BALB/c, DBA/2, C57BL/6J

10⁰

Abb. 15, C und D: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in Leber (C) und Gehirn (D). Dargestellt sind die Werte der einzelnen Tiere mit Mittelwerten (—) der Gruppen an 1 d, 4 d, 7 d und 14 d nach i.t. Infektion mit 4,2 x 10³ KBE L. monocytogenes EGD wt

Messung der rektalen Körpertemperatur

Veränderungen der Körpertemperatur spielen bei Infektionen eine wichtige Rolle.

Die Bestimmung der rektalen Temperatur kann deshalb mit zur Charakterisierung des Infektionsverlaufs beitragen.

Bei den BALB/c-Mäusen lag der Mittelwert für die gesunden Tiere bei 37,3 ± 0,1°C, bei den DBA/2-Mäusen bei 37,2 ± 1,0°C und bei den C57BL/6J-Mäusen bei 37,0 ± 1,0°C (Abb. 16). Bei den BALB/c- und den DBA/2-Tieren kam es jeweils an Tag 3 p.i. zu einer nicht signifikanten, jedoch tendenziell erkennbaren Temperaturerhöhung (Abb. 16 A, B). Daraufhin fiel die Rektaltemperatur bei den BALB/c-Mäusen kontinuierlich bis unter 26,0 °C ab (Abb. 16 A), bevor die Tiere an der Infektion verstarben bzw. getötet wurden. Die DBA/2-Mäuse zeigten zwischen Tag 3 und Tag 5 p.i einen Abfall der Körpertemperatur, dem eine geringgradige Temperaturerhöhung an Tag 6 p.i. folgte (Abb. 16 B, nicht signifikant). Dann setzte auch bei diesen Tieren ein Absinken der Körpertemperatur bis zum Tode ein. Bei den C57BL/6J-Mäusen kam es dagegen zu keiner signifikanten Änderung der Körpertemperatur während der Infektion (Abb. 16 C).

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Abb. 16: Änderungen der rektalen Körpertemperatur bei den Mausstämmen BALB/c (A), DBA/2 (B), C57BL/6J (C) nach i.t. Infektion mit 4,2 x 10³ KBEL. monocytogenes EGD wt.

Aufgetragen sind die Mittelwerte in [°C] ± SF (n = 5), die von den Tieren über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg einmal täglich ermittelt wurden.

BALB/c, DBA/2, C57BL/6J

*

*

†

†

Messung des KGWs

Eine eingeschränkte Futteraufnahme und der daraus folgende Verlust von KGW können Anzeichen einer systemischen Infektion eines Organismus sein und deshalb Auskunft über seine Suszeptibilität dem Infektionserreger gegenüber geben.

Die Ausgangsgewichte der gesunden Tiere lagen für die BALB/c-Mäuse bei 20,1

± 0,1 g, bei den DBA/2-Mäusen bei 19,6 ± 0,3 g und bei den C57BL/6J-Mäusen bei 19,3 ± 0,2 g (Abb. 17). Bei den BALB/c- und DBA-Tieren war ab Tag 2 p.i. ein signifikanter Abfall des KGWs zu verzeichnen (Abb.17 A, B), welcher sich kontinuierlich bis zum Tod der Tiere durch die Infektion fortsetzte. Im Gegensatz dazu kam es bei den C57BL/6J-Mäusen zu einem geringgradigen Verlust des KGWs (Abb. 17 C, nicht signifikant) bis Tag 7p.i. Anschließend erfolgte - vom Ausgangsgewicht ausgehend - eine signifikante Gewichtszunahme bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes.

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Abb. 17: Änderungen des KGWs bei den Mausstämmen BALB/c (A), DBA/2 (B), C57BL/6J (C) nach i.t. Infektion mit 4,2 x 10³ KBE L. monocytogenes EGD wt. Aufgetragen sind die Mittelwerte in [g] ± SF (n = 5), die von den Tieren über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg einmal täglich ermittelt wurden.

BALB/c, DBA/2, C57BL/6J

*

†

†

*

Beurteilung des Allgemeinzustandes

Die Bewertung des Allgemeinzustandes der Mäuse anhand des selbstentwickelten Beurteilungsschemas (Kap. 3.2.6) erfolgte ebenfalls zur Charakterisierung der Suszeptibilität der Mausstämme gegen eine i.t. Infektion mit L. monocytogenes. Die Beurteilung wurde zwei Tage vor der Infektion begonnen und einmal täglich durchgeführt (Abb. 18). Die drei Ausgangswerte, die so vor der Infektion der Tiere bestimmt wurden, zeigten für alle drei Mausstämme ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Dieses blieb an Tag 1 p.i. bei allen Tieren bestehen. Bereits an Tag 2 p.i. setzte bei den BALB/c- und den DBA/2-Mäusen eine Verschlechterung des Allgemeinbefindens ein, welche kontinuierlich anstieg, bis an Tag 7 p.i. alle BALB/c-Tiere und an Tag 9 p.i. auch das letzte DBA/2-Tier gestorben waren bzw. getötet werden mussten. Die C57BL/6-Mäuse zeigten dagegen über den gesamten Beobachtungszeitraum ein ungestörtes Allgemeinbefinden.

Abb. 18: Darstellung des Allgemeinzustandes der Mausstämme BALB/c, DBA/2, und C57BL/6J nach i.t. Infektion mit 4,2 x 10³ KBE L. monocytogenes EGD wt.

Die Säulen stellen Mittelwerte ± SF (n = 5) dar, die auf der Basis des selbstentwickelten Scores zur Beurteilung des Allgemeinzustandes fußen. Die Parameter des Beurteilungsschemas wurden über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg einmal täglich ermittelt.

B A L B /c , D B A /2 , C 5 7 B L /6 J

4.5 Suszeptibilität für L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP

Nach Untersuchung der Suszeptibilität der Mausstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6J für L. monocytogenes EGD, sollte die Empfänglichkeit bzw. Resistenz dieser Stämme auch für den attenuierten Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A +pERL3-CMVGFP bestimmt werden.

In den Lungen der BALB/c- und C57BL/6J-Tiere waren während der ersten vier Tage p.i. annähernd gleichmäßige Keimzahlen (zwischen 10⁵ - 10⁶ KBE/Lunge) zu beobachten (Abb. 19 A). Die Keimzahlen der DBA/2-Tiere stiegen dagegen weiter an bis 4,1 x 10⁷ ± 9,6 x 10⁶ KBE/Lunge (Abb. 19 A, nicht signifikant).

Maximale Keimzahlen der Lungen wurden bei allen drei Stämmen an Tag 4 p.i.

bestimmt. Am Ende des Versuchs waren bei allen drei Stämmen die Keimzahlen in den Lungen gesunken, während die BALB/c-Tiere alle Keime eliminiert hatten, waren bei den DBA/2- und C57BL/6J-Tieren bei jeweils einem Tier weiterhin Keime nachweisbar (Abb. 19 A).

Im Vergleich zu den Lungen zeigten Milzen und Lebern der Tiere (Abb. 19 B, C) eine sehr ähnliche Organkinetik. Die KBE stiegen über Tag 1 bis Tag 4 p.i. an, und waren am Ende des Beobachtungszeitraums wieder gesunken. Bei den BALB/c-Mäusen waren beide Organe an Tag 14 p.i. steril, während die DBA/2- und die C57BL/6J-Tiere zu Versuchsende weiterhin Listerien in den Organen aufwiesen. Das Maximum an Keimzahlen in Milzen und Lebern wurde bei den DBA/2-Mäusen an Tag 4 p.i. bestimmt (7,3 x 10⁶ ± 6,0 x 10⁵ KBE/Milz und 5,1 x

10⁷ ± 1,2 x 10⁶ KBE/Leber). Generell wurden höhere Keimzahlen in den Lebern

als in den Milzen gefunden.

Ähnliche Organkinetiken wie in Milzen und Lebern wiesen auch die Gehirne der Tiere auf (Abb. 19 D). Hier blieben die Keimzahlen insgesamt jedoch sehr viel niedriger (zwischen 10³ - 10⁵ KBE/Gehirn). Übereinstimmend mit den Befunden aus Milzen und Lebern wurden bei den DBA/2-Mäusen mit 1,8 x 10⁵ ± 5,5 x 10⁴ KBE/Gehirn an Tag 4 p.i. die höchsten Keimzahlen gefunden. Eine Sterilität der Gehirne zum Ende des Versuches wiesen nur die DBA/2-Tiere auf, bei BALB/c- und C57BL/6J-Tieren waren noch Listerien nachweisbar.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Abb. 19, A und B: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in den Organen Lunge (A) und Milz (B) nach i.t. Infektion mit 2,5 x 10⁶ KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A +pERL3-CMVGFP.

Aufgetragen sind die Mittelwerte der KBE ± SF pro Organ (n = 3), die von den Tieren zu den Zeitpunkten Tag 1, 4 und 14 p.i. ermittelt wurden.

BALB/c, DBA/2, C57BL/6J

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Abb. 19, C und D: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in den Organen Leber (C) und Gehirn (D) nach i.t. Infektion mit 2,5 x 10⁶ KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A +pERL3-CMVGFP.

Aufgetragen sind die Mittelwerte der KBE ± SF pro Organ (n = 3), die von den Tieren zu den Zeitpunkten Tag 1, 4 und 14 p.i. ermittelt wurden.

BALB/c, DBA/2, C57BL/6J

4.6 Dosis-Zeit-Beziehungen der i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP

Durch die Infektion von BALB/c-Mäusen mit unterschiedlichen Dosen des Stamms L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP sollten in vier Versuchsreihen der Infektionsverlauf nach i.t. Infektion und die Pathogenität des attenuierten Bakteriums untersucht werden.

In den Lungen der Tiere aller vier Versuchsreihen wurden in den ersten vier Tagen p.i. mehr oder weniger stabile Keimzahlen gefunden, so dass die Kurven in dieser Phase der Infektion einem Plateau glichen (Abb. 20 A). Ab Tag 4 p.i. nahmen die Keimzahlen in der Lunge bei allen Tieren ab. In drei Versuchsreihen (I: 5,4 x 10⁵ KBE; III: 1,8 x 10⁶ KBE und IV: 4,2 x 10⁷ KBE) eliminierten die Tiere die Listerien dabei vollständig aus der Lunge. Lediglich bei den in Versuchsreihe II (8,9 x 10⁵ KBE) infizierten Mäusen war ein Tier, in dessen Lunge nach 14 Tagen p.i. weiterhin Listerien nachgewiesen wurden (2,9 x 10³ KBE).

Wie die Abbildungen 20 B und C zeigen, wiesen Milz und Leber ähnliche Kinetiken auf. Das Maximum der Keimzahlen wurde in beiden Organen jeweils zwischen Tag 2 und Tag 4 p.i. erreicht. Ab Tag 4 p.i. reduzierten sich auch die Keimzahlen in Milz und Leber, wobei die meisten Tiere die Keime aus beiden Organen zu eliminieren vermochten. Geringe Keimzahlen blieben in den Milzen der Tiere aus Versuchsreihe II (4,0 x ± 0,5 x 10¹ KBE), einem Tier der Versuchsreihe III (8,0 x 10¹ KBE) und in den Lebern der Tiere aus Versuchsreihe II (8,0 x ± 4,6 x 10¹ KBE) zurück.

In den vier Versuchsreihen zeigten die Keimzahlen der Gehirne starke Schwankungen und lagen allgemein deutlich niedriger als in den übrigen Organen (Abb. 20 D). Die höchsten Keimzahlen wurden hier von Tieren der Versuchsreihe III an Tag 4 p.i. erreicht (6,5 ± 2,6 x 10³ KBE). Bei der überwiegenden Mehrheit der Mäuse blieben die Gehirne insgesamt steril (Tab. 14). Bei den Tieren aller Versuchsreihen wurden die Listerien bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes an Tag 14 p.i. aus den Gehirnen eliminiert.

In Versuchsreihe III starb ein Tier an Tag 6 p.i. und in Versuchsreihe IV starben zwei Tiere an Tag 5 p.i. mit jeweils hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden.

Trotz Unterschieden in den Infektionsdosen um den Faktor 10² konnten im Verlauf der Infektionen in den vier durchgeführten Versuchsreihen keine dosisspezifischen Unterschiede nachgewiesen werden.

Insgesamt war in den ersten 18 h p.i. eine geringe Keimbelastung der untersuchten Organe Milz, Leber (zwischen 10² – 10³ KBE) und Gehirn (ca. 10¹ KBE) nachweisbar.

Tab.14: Anzahl der Mäuse je Versuchsreihe, in deren Gehirn sich Listerien nachweisen ließen (n = 16 Tiere pro Versuchsreihe).

Versuchsreihe I II III IV

Infektionsdosis KBE L.m. EGD hly W491A + pERL3-CMVGFP

5,4 x 10⁵ 8,9 x 10⁵ 1,8 x 10⁶ 4,2 x 10⁷

Mäuse mit infizierten Gehirnen 2 4 6 9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Abb. 20, A und B: Keimzahlen in den Organen Lunge (A) und Milz (B) nach i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP. Die Tiere wurden mit Dosen von 5,4 x 10⁵ KBE (Versuchsreihe I), 8,9 x 10⁵ KBE (Versuchsreihe II), 1,8 x 10⁶ KBE (Versuchsreihe III) und 4,2 x 10⁷ KBE (Versuchsreihe IV) infiziert. Aufgetragen sind die Mittelwerte ± SF der KBE pro Organ (n = 3) zu den Zeitpunkten Tag 0 (1h), 1, 2, 3, 4 und 14 p.i.

Versuchsreihe I, Versuchsreihe II, Versuchsreihe III, Versuchsreihe IV

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Abb. 20, C und D: Keimzahlen in den Organen Leber (C) und Gehirn (D) nach i.t.

Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP. Die Tiere wurden mit Dosen von 5,4 x 10⁵ KBE (Versuchsreihe I), 8,9 x 10⁵ KBE (Versuchsreihe II), 1,8 x 10⁶ KBE (Versuchsreihe III) und 4,2 x 10⁷ KBE (Versuchsreihe IV) infiziert. Aufgetragen sind die Mittelwerte ± SF der KBE pro Organ (n = 3), zu den Zeitpunkten Tag 0 (1h), 1, 2, 3, 4 und 14 p.i.

Versuchsreihe I, Versuchsreihe II, Versuchsreihe III, Versuchsreihe IV

Im Dokument Untersuchung der murinen, pulmonalen Infektion mit Listeria monocytogenes im Hinblick auf eine mögliche Eignung des Bakteriums als Vektor für die somatische Gentherapie der Cystischen Fibrose (Seite 101-126)