der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Niedersächsischem Landgestüt Celle
Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Spermienchromatinstruktur beim Hengst
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Heinke Thießen aus Winsen(Aller)
Hannover 2006
Eine Arbeit aus dem Virtuellem Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. – Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski PD Dr. med. vet. Harald Sieme
1. Gutachterin: Apl. – Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski 2. Gutachter: Univ. – Prof. Dr. med. vet Heinrich Bollwein
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05.2006
Marcus und
meiner Mutter
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATUR 2
2.1 Spermienchromatinstruktur 2
2.1.1 Chromatinstruktur bei Spermien 2
2.1.2 Ursachen für eine abnorme Spermienchromatinstruktur 4 2.2 Tests zur Erfassung der DNA/Chromatin Integrität 8 2.2.1 Flowzytometrischer Spermienchromatinstruktur Assay (SCSA) 8 2.2.2 Modifizierter fluoreszenzmikroskopischer Spermienchromatinstruktur Assay
(mfSCSA) 11 2.2.3 Spermienchromatinstruktur in Bezug zur Fertilität 12
3 MATERIALIEN UND METHODEN 15
3.1 Materialien, Chemikalien und Lösungen 15
3.2 Hengste 15
3.3 Gewinnung und Aufbereitung der Ejakulate 16
3.3.1 Gewinnung der Ejakulate 16
3.3.2 Konventionelle spermatologische Untersuchungen 16
3.3.3 Thermoresistenztest 19
3.3.4 Tiefgefrierkonservierung der Samenproben 19
3.4 Methodik des mfSCSAs 20
3.4.1 Protokoll des mfSCSAs 20
3.4.2 Reproduzierbarkeit des Auswertungsverfahrens des mfSCSAs 29 3.4.3 Reproduzierbarkeit des mfSCSAs an einem anderen Ausstrich 29 3.4.4 Methodischer Vergleich zwischen dem mfSCSA und dem SCSA 29
3.5 Einflüsse auf die Ergebnisse des mfSCSA 30 3.5.1 Überprüfung der Haltbarkeit gefärbter Ausstriche 30 3.5.2 Konservierungseinflüsse auf den mfSCSA 30 3.6 Konservierungseinflüsse auf den flowzytometrischen SCSA 32 3.7 Spermienchromatinstruktur von Hengsten im Besamungseinsatz 32
3.7.1 Bezug zum Alter der Hengste 33
3.7.2 Bezug zu konventionellen spermatologischen Parametern 33
3.7.3 Saisonale Einflüsse 33
3.7.4 Bezug zur Fertilität 33
3.8 Statistische Auswertung 34
3.8.1 Analyse der Reproduzierbarkeit des mfSCSAs und des methodischen Vergleichs
(mfSCSA versus SCSA) 34
3.8.2 Analyse der Konservierungseinflüsse 35
3.8.3 Analyse der Saisonalität der untersuchten Ejakulatparameter 35 3.8.4 Analyse der Beziehung verschiedener Merkmale untereinander, sowie zu
Fertilitätsparametern der Hengste 35
3.8.5 Signifikanzlevel für die Irrtumswahrscheinlichkeit 35
4 ERGEBNISSE 36
4.1 Reproduzierbarkeit des Spermienchromatinstatus im mfSCSA 36 4.1.1 Reproduzierbarkeit am selben Ausstrich 36 4.1.2 Reproduzierbarkeit an einem anderen Ausstrich 37
4.1.3 Methoden Vergleich: mfSCSA und SCSA 38
4.2 Einfluss auf die Ergebnisse des mfSCSAs 40
4.2.1 Stabilität der mfSCSA-Färbung 40
4.2.2 Einfluss von Konservierungsverfahren auf den mfSCSA 41 4.3 Einfluss von Konservierungsverfahren auf den flowzytometrischen SCSA 49 4.4 Spermienchromatinstatus in einer Besamungshengst-Population 50
4.4.1 Spermienchromatinstruktur in Abhängigkeit zum Alter 51 4.4.2 Spermienchromatinstruktur im Kontext zu konventionellen spermatologischen
Parametern 52 4.4.3 Untersuchung saisonaler Einflüsse auf die Spermienchromatinstruktur und
konventionelle spermatologische Parameter 55 4.4.4 Beziehung ausgewählter spermatologischer Parameter zu Fertilitätsdaten der
Hengste 60
5 DISKUSSION 62
6 ZUSAMMENFASSUNG 74
7 SUMMARY 77
8 LITERATURVERZEICHNIS 80
9 ANHANG 97
9.1 Abbildungsverzeichnis 97
9.2 Tabellenverzeichnis 98
9.3 Laborbedarf 99
9.4 Reagenzien 101
9.5 Formolzitrat 103
9.6 modifizierter Magermilchverdünner (INRA 82) 103
9.7 Materialien für FARELLY-Färbung 104
9.8 Materialien für den mfSCSA 104
10 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 111
11 DANKSAGUNG 113
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Abk. Abkürzung
AFM Atomic Force Microscope AO Acridin Orange
AOT Acridin Orange Tejada
ASMA Automated Sperm Morphology Analysis αt Alpha t = rote/ rote + grüne Fluoreszenz bidest. Bidestillata
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa
CASA Computerized Sperm Motion Analysis CASY Cell Analyser System
CIS Chromatininstabile Spermien CO2 Kohlendioxid
COMP α t Anzahl von Zellen außerhalb der Hauptpopulation d Tag
d.h. das heißt
DICM Differential Interferenz Kontrast Mikroskopie DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (DNA) ds double stranded
DTT 1,4 Dithiotreit
EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. et alii (und andere)
f. für
Fa. Firma
g Gramm
g/l Gramm pro Liter
h Stunde H+ Wasserstoffionen
Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethan
H2O Wasser
HOS-Test Hypoosmotischer Schwellungstest
Hz Hertz
INRA 82 Magermilchverdünner, siehe Anhang ISO Internationale Normierungsorganisation IVF In vitro Fertilisation
IU International Unit (Internationale Einheit)
kg Kilogramm
LIN Linearität
M Molar
MAS Morphologisch abweichende Spermien
mfSCSA modifizierter fluoreszenzmikroskopischer Spermienchromatin- struktur Assay
mg Milligramm
Mg2+ Magnesiumionen
min Minute
Mio. Millionen ml Milliliter mM Millimolar
mmol Millimol
MMV Magermilchverdünner mOsmol Milliosmol
Mot Motilität (Vorwärtsbewegung + Ortsbewegung) ms Millisekunde
n Anzahl
N2 Stickstoff Na+ Natriumionen NaCitrat Natrium Citrat NaCl Natriumchlorid
NADPH2 Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Dihydrat NaHCO3 Natriumbikarbonat
NaOH Natronlauge
nm Nanometer
NRR Non Return Rate o.g. oben genannte O ortsbeweglich O2 Sauerstoff
p Wahrscheinlichkeit für die Nullhypothese P1 Protamin P1
P2 Protamin P2
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalz- Lösung
pH p: Abk. f. Potenz; H: Abk. f. Wasserstoffionen PI Propidiumiodid
® eingetragenes Warenzeichen
[R] Trächtigkeitsrate pro Rosse
RP Korrelationskoeffizient nach Pearson RS Korrelationskoeffizient nach Spearman
RGB Rot Gelb Blau
RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
ROS radical oxygene species (radikale Sauerstoffspezies) [S] Trächtigkeitsrate pro Saison
s. siehe
SAS Statistical Analysis System
SCSA Spermienchromatinstruktur Assay
SD standard deviation (Standardabweichung) s.g. so genannte
ss single stranded s.u. siehe unten s. Übers. siehe Übersicht
sek Sekunde
SZ Samenzellen
Tab. Tabelle
Temp. Temperatur TG-Sperma Tiefgefriersperma
TIFF Tagged Image File Format TR/Zyk Trächtigkeitsrate pro Zyklus
u. und
U unbeweglich
u.a. unter anderem u.g. unten genannten
U/min Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm/s Mikrometer pro Sekunde V vorwärtsbeweglich
VCL Velocity Curvolinear (Spurgeschwindigkeit)
vgl. vergleiche
vs. versus
VSL Velocity Straight Line (Lineare Geschwindigkeit) X arithmethischer Mittelwert
Z Zentrifugation z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung
Für eine erfolgreiche initiale Befruchtung und Aufrechterhaltung der embryonalen Entwicklung setzten TEJADA et al. (1984), IBRAHIM et al. (1988) und SAKKAS et al.
(2000) ein intakt vorliegendes Spermienchromatin voraus.
Bei der Aufbereitung von Frischsamen und Tiefgefriersperma wird das umgebende Milieu der Samenzellen sehr stark verändert. Das heist, dass es zu Alterationen der Chromatinstruktur oder auch anderer für die Befruchtung wichtiger Systeme kommen kann, da Hengstspermien sehr empfindlich auf Veränderungen des äußeren Milieus reagieren. Die Stabilität des Spermienchromatins wurde erstmals in dem von EVENSEN et al. (1980a) beschriebenen flowzytometrischen Spermien- chromatinstruktur-Assay (SCSA) untersucht. Der SCSA ermittelt die Anfälligkeit der Spermienkern-DNA gegenüber durch Säure induzierter Denaturierung in situ als Maß für die Widerstandsfähigkeit der Chromatinstrukturstabilität.
Eine Alternative stellt der von HELMS et al. (2002) und LOEHMER (2003) beschriebene modifizierte fluoreszenzmikroskopische SCSA (mfSCSA) dar. Die mikroskopische Auswertbarkeit birgt den Vorteil, dass individuelle Spermien parallel auch auf andere Beurteilungskriterien hin untersucht werden können. Bei der Untersuchung von Bullenspermien zeigte LOEHMER (2003), dass der mfSCSA ein praktikabler und reproduzierbarer Test ist. ARDON (2005) stellte fest, dass der mfSCSA im Hinblick auf experimentelle Studien von Bedeutung ist, da selbst eine geringe Anzahl von Spermien analysierbar ist.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Anwendbarkeit des modifizierten fluoreszenzmikroskopischen mfSCSA (HELMS et al. (2002); LOEHMER 2003) zur Erfassung der Chromatinstabilität bei Hengstspermien zu prüfen und gegebenenfalls den Assay für eine Anpassung auf Hengstspermien zu modifizieren. Weiterhin wurden Einflüsse verschiedener spermatologischer Standardparameter, sowie methodische Einflüsse wie unterschiedliche Aufbereitungsverfahren im Rahmen der Spermakonservierung und Lagerungsformen analysiert. Darüber hinaus sollte die Beziehung zwischen der Spermienchromatinstuktur zu Fertilitätsdaten in einer Hengstpopulation untersucht werden.
2 Literatur
2.1 Spermienchromatinstruktur
2.1.1 Chromatinstruktur bei Spermien
Chromatin ist der DNA-Protein-Komplex im Inneren des Zellkerns. Je nach Zyklusstand der Zelle liegt es als Euchromatin (= relativ lockeres Fadenknäuel) oder als Heterochromatin (= relativ fest gepackt) vor. Es besteht aus DNA und basischen Proteinen, den Histonen, sowie aus Nicht-Histon-Proteinen. Während der Entwicklung von Spermatiden zu reifen Spermien werden die lysinreichen Histone durch Protamine ersetzt (SETCHELL 1982).
Histone und Protamine sind Proteine, die für das Ausbilden der Tertiärstruktur der DNA verantwortlich sind. In den kleinen Furchen des DNA-Stranges sind die Protamine in Reihe an die DNA gebunden (s. Abb. 1). Durch einen hohen Anteil an den Aminosäuren Cystein und Arginin besitzen Protamine zahlreiche freie Thiolgruppen (HURET 1986). Durch Oxidation der freien Thiolgruppen zwischen den Cysteinresten kommt es zu inter- und intramolekulär kovalenten Disulfidbrücken. Die Stabilität des Chromatins wird durch die Disulfidbrücken gesichert (BEDFORD u.
CALVIN 1974, HURET 1986).
In Säugetierspermien wurden drei Arten von Protaminen gefunden: Protamin P1, das den größten Anteil an DNA-bindenden Proteinen ausmacht; Protamin P2, das nur bei einigen Spezies vorkommt (z.B. bei Nagetieren, Pferden und Primaten; QUERALT et al. 1995), sehr viel Arginin, jedoch kein Lysin oder Cystein enthält und aufgrund der fehlenden freien Thiolgruppen weniger stabil ist, als die anderen Protamintypen (KUMAROO et al. 1975, JAGER 1990). Die dritte Art von Protaminen sind die Übergangsproteine. Diese überbrücken den Prozess der Histonersetzung (OLIVA u.
DIXON 1991).
Das Protamin P1 hat im Verlauf der Spermiogenese während der Kernkondensation die hauptsächliche Funktion DNA zu binden und zu kondensieren (BALHORN 1982, OLIVA u. DIXON 1991, WARD u. COFFEY 1991). In der letzten Phase der Spermiogenese und sogar noch während des Transportes durch das Hodennetz und den Nebenhoden bis zur Ejakulation erfahren die Thiolgruppen eine ständige Oxidation, wodurch sich die Chromatinstruktur mehrfach verändert (MEISTRICH et al. 1976). Hierbei entstehen Disulfidbrücken (S-S), die dem Chromatin die Dichte und Stabilität in ejakulierten Spermien geben.
Die Ausbildung dieser Disulfidbrücken zwischen benachbarten Protaminen und innerhalb der Protaminmoleküle führt dazu, dass das Chromatin zusätzlich verdichtet wird (BALHORN et al. 1991). Diese Verdichtung erscheint genauso wichtig für die Form und Funktion der Spermien, wie auch für deren rechtzeitige Dekondensation in Verbindung mit der Kernformation (pronuclear Formation); (QUI et al. 1995).
Untersuchungen am Atomic Force Microscope deuten darauf hin, dass die DNA- Domänen im Spermienkern zu Knoten unterschiedlicher Größe gefaltet, bzw.
aufgerollt sind (KOEHLER et al. 1983, ALLEN et al. 1990).
Bei der Befruchtung ist das Protamin P1 verantwortlich für die Lockerung der Spermien-DNA, so dass die Entwicklung der befruchteten Eizelle fortfahren kann.
Folglich ist die eigentliche Funktion von Protamin P1 essentiell für die erfolgreiche Befruchtung der Eizelle (WOUTERS–TYROU et al. 1998) verantwortlich.
Abbildung 1: Helix-Windung der DNA nach Alberts et al. (1990)
2.1.2 Ursachen für eine abnorme Spermienchromatinstruktur
Während der Spermienreifung erhöht sich die Resistenz des Chromatins gegenüber mechanischen und chemischen Einflüssen (MONESI 1962, KIERSZENBAUM u.
TRES 1975). Die DNA wird, z. T. durch Endonukleasen, an bestimmten Stellen getrennt und wieder neu zusammengefügt bis sie ihre endgültige räumliche Struktur erhält (McPHERSON u. LONGO 1993, SAKKAS et al. 1995).
Gen-Mutationen, chromosomale Unregelmäßigkeiten wie auch physiologischer und umweltbedingter Stress können die hoch empfindlichen biochemischen Vorgänge während der Spermienreifung stören. Im Verlauf der Geschlechtsreife entwickelt sich auch die Spermienchromatinstruktur. Während der Phasen der Präpubertät und der Pubertät liegt das Chromatin in instabiler Form vor, welches sich in der Phase der sexuellen Reife und Aktivität zunehmend stabilisiert (ELLIOT 1978, ALMQUIST u.
AMANN 1976, GOGOL et al. 2002). Einen Rückgang der Stabilität des Chromatins mit fortschreitendem Alter wiesen GOGOL et al. (2002) bei Versuchen an Kaninchen nach.
SPANÒ et al. (1998) untersuchten den Einfluss des Alters von Männern auf die Spermaqualität. Bei älteren Männern wurde ein deutlich erhöhter Anteil an chromatininstabilen Spermien festgestellt. Der Prozentsatz chromatininstabiler Spermien lag bei jüngeren Männern um ca. 10 % niedriger. Der gleiche Effekt wurde bereits von KARABINUS et al. (1990) bei der Untersuchung von Bullenspermien festgestellt. Hier zeigte sich ebenfalls eine signifikante Erhöhung der Chromatinschäden in Abhängigkeit zum Alter der Tiere. SPANÒ et al. (1998) diagnostizierten zusätzlich zum Alterseinfluss noch einen negativen Einfluss sexueller Ruhepausen auf die Samenqualtität.
MILLER und BLACKSHAW (1968), SALISBURY und HART (1970) und RODRIGUEZ et al. (1985) führten Versuche an verschiedenen Spezies außerhalb der Decksaison durch und stellten fest, dass trotz einer erhöhten Stabilität des Spermienchromatins die Fruchtbarkeit abnahm. Dieser Effekt wurde auf eine Überreifung der Spermien durch längere Lagerung in den Nebenhoden zurückgeführt. Weiterhin kann eine Erhöhung der Körpertemperatur und/oder der Umgebungstemperatur Spermienchromatinschäden verursachen. Nachgewiesen wurde eine durch
Temperatureinflüsse gestörte Spermatogenese bei fiebrigen Infekten und Kryptorchiden (CREW 1922; GUNN et al.,1942; EVENSON und JOST,. 2000).
Untersuchungen mit exothermer Wärmezufuhr, wie z. B. hohe sommerliche Temperaturen beeinflussten sowohl die Parameter der klassischen Spermatologie als auch die Chromatinstabilität negativ (SAACKE et al.1994, KARABINUS et al.
1997, LOVE et al. 2002).
Bei Versuchen zur Flüssigkonservierung bzw. Kryokonservierung von Spermien bei Pferden wiesen SAMPER et al. (2000) einen negativen Einfluss auf die Spermienchromatinstruktur nach. Hier wurde durch den Einsatz eines Verdünners mit Milchzusatz der Anteil chromatininstabiler Spermien erhöht. EVENSON und JOST (1994) stellten beim Einsatz von Milchverdünner keine Veränderungen der Struktur und der Stabilität des Spermienchromatins an menschlichen Spermien fest.
LOVE et al. beschrieben in neuesten Untersuchungen (2005) negative Einflüsse von Verdünnertyp, Antibiotikumtyp, Lagerungstemperatur, sowie Seminalplasmaanteil auf die Spermienmotitlität und auf die Spermienchromatinstruktur. Bei Lagerung von Spermien fertiler Hengste über einen Zeitraum von 48 Stunden konnte keine signifikante Reduzierung der Motilität der Spermien festgestellt werden. Die Spermienchromatinstruktur destabilisierte sich jedoch nach diesem Zeitraum bedeutsam. Nach 24 Stunden Lagerung bei 5° C. konnte dieser Effekt an den Spermien nicht nachgewiesen werden (LOVE et al. 2005). BLOTTNER et al. (2001) und HAMMADEH et al. (1999) berichten von einer Verschlechterung des Chromatinstatus nach Kryokonservierung, der vor allem bei subfertilen Individuen deutlich wird.
DARZYNKIEWICZ et al. (1997) fanden heraus, dass durch Stress induzierte Chromatinschäden strukturelle Probleme hervorrufen können, die sogar zu einer Apoptose oder Nekrose der Zellen führen können.
Chromatinschäden können u.a. während der Spermiogenese entstehen, wenn die Funktionalität des Enzyms DNA Topoisomerase II (Topo II) nicht, oder nur zum Teil gegeben ist. Topoisomerasen sind Enzyme, die in der Lage sind, DNA-Stränge zu trennen und auch wieder zusammenzufügen. ROCA und MEZQUITA (1989) und McPHERSON und LONGO (1993) entdeckten einen Zusammenhang zwischen hohen Gehalten an Topo II und hohen Anteilen an Strangbrüchen bei einer
verlängerten Spermienreifung. In unreifen männlichen Keimzellen sind Strangbrüche physiologisch und nicht nachteilig, wenn sie vor Komplettierung der Spermiogenese und der Ejakulation durch Topoisomerase II ligiert werden (McPHERSON und LONGO 1993).
Veränderungen in der Chromatinstruktur verbunden mit Infertilität können ebenso von einem abnormen Proteingehalt ausgehen. Nach BALHORN et al. (1991) ersetzen Protamine, die sehr viele Thiol-(Sulfhydryl)-Gruppen enthalten, die Übergangsproteine. KOSOWER et al. (1992) glauben, dass der Prozess des Austauschs von Histonen durch Protamine verantwortlich für fehlerhafte, abnormale Spermien ist. Ein verminderter Gehalt an P 2 kann ebenfalls verantwortlich für eine fehlerhafte Spermienchromatinstruktur sein.
Bei einigen infertilen Männern wurde ein gestörtes Verhältnis von P1 zu P2, begleitet von einem erhöhten Gehalt des P2 Vorläufers festgestellt. Studien von EVENSON et al. (2000), de YEBRA et al. (1998) und SCHLICKER et al. (1994) weisen ebenfalls darauf hin, dass ein Missverhältnis von P1 zu P2 zu Chromatinveränderungen führen kann.
Schäden der Spermienchromatinstruktur werden auch einer abnormen Apoptose (-Degeneration) zugeschrieben. Apoptose, die häufigste Form von Zelltod im Organismus, ist ein physiologischer Prozess, der eine wichtige Rolle in der Keimzellproliferation spielt (SINHA HIKIM et al. 1995; RODRIGUEZ et al. 1997 und PENTIKAINEN et al. 1999). Das charakteristischste Kennzeichen für Apoptose sind Doppelstrangbrüche (GORCZYCA et al. 1993).
Mit Hilfe der Markierung von Zellen mittels Annexin V und durchflusszytometrischer Analyse kann man auf relativ einfache Weise apoptotische Zellen erkennen.
Annexin-V ist ein Ca2+-abhängiges, phospholipidbindendes Protein mit einer hohen Affinität für Phosphatidylserin. In frühen Apoptose-Stadien finden Änderungen der Zellmembran statt, u.a. die Translokation von Phosphatidylserin. Dieses Protein kann somit als empfindliche Sonde für die Phosphatidylserin-Exposition auf der Membranaußenseite (PS; ist normalerweise nur auf der zytoplasmatischen Innenseite der Membran lokalisiert) aller exprimierenden apoptotischen Zellen eingesetzt werden und ist deswegen zur Detektion apoptotischer Zellen in Zellgemischen geeignet. Da nekrotische Zellen durch den Verlust der Membran-
Integrität ebenfalls Annexin binden, allerdings schon über dem Apoptosestadium hinaus nekrotisch sind, empfiehlt sich eine Differenzierung der apoptotischen von nekrotischen Zellen durch die Anwendung eines DNA-Farbstoffes der nur die permeabilisierte Membran nekrotischer Zellen passieren kann z.B. Propidium-Iodid (PI). Die gleichzeitige Anwendung von Annexin-V-Fluos und PI gestattet die Diskriminierung nekrotischer Zellen von apoptotischen Zellen im Annexin-V positiv gefärbten Zellcluster.
Trotz allem können Spermien, die Apoptose-Kennzeichen aufweisen, eine unauffällige Motilität sowie eine physiologische Morphologie besitzen. Apoptose gekennzeichnete Zellen wurden von BARROSSO et al. (2000) in beiden Fraktionen gefunden, d.h. in den Fraktionen mit hoher und geringer Motilität.
OOSTERHUIS et al. (2000) berichteten, dass 20 % der ejakulierten Spermien DNA Strangbrüche und Apoptose-Merkmale zeigen. SAKKAS et al. (1999) fanden im Gegensatz dazu heraus, dass DNA-Strangbrüche und Apoptose-Merkmale in ein und derselben Zelle nicht gleichzeitig auftreten können. EVENSON et al. (2002) unterscheiden ebenfalls sehr streng zwischen Zellen mit DNA-Strangbrüchen und Apoptose positiven Zellen. Strangbrüche sind ihrer Auffassung nach nicht mit apoptotischer Degeneration gleichzusetzen.
BECKMANN und AMES (1997) fanden heraus, dass Reactive oxygen species (ROS) sich auch auf die Funktionen von Spermien auswirken können. ROS sind an wichtigen physiologischen Funktionen beteiligt, wenn sie in „normalen“ Mengen vorhanden sind. In physiologischer Weise vorhandene Mengen an ROS modulieren z. B. Proteinaktivitäten, die für die Vitalfunktionen normaler Spermien notwendig sind.
Ein vermehrtes Vorhandensein von ROS kann durchaus pathologische Auswirkungen haben, welche im Zusammenhang mit Apoptose, abnormaler Funktion der Topoisomerase II Aktivität und auch Nekrose der Zellen diskutiert werden.
Geringgradige Defekte am DNA-Strang können jedoch noch in der Eizelle korrigiert werden (BECKMANN und AMES, 1997).
2.2 Tests zur Erfassung der DNA/Chromatin Integrität
2.2.1 Flowzytometrischer Spermienchromatinstruktur Assay (SCSA)
Der flowzytometrische Spermienchromatinstruktur Assay (SCSA) wurde zuerst von EVENSON et al. (1980a) beschrieben. Untersucht wird in diesem Verfahren die Anfälligkeit der DNA gegenüber Säure- oder Hitzeeinwirkungen in situ. Der flowzytometrische SCSA verspricht eine sehr schnelle, objektive Auswertung der Kernchromatinstruktur von mehreren Tausend Samenzellen pro Samenprobe. Die Samenproben werden für 30 Sekunden einer sauren Lösung (pH 1,2) ausgesetzt, um instabile DNA in situ zu denaturieren. DNA mit normaler Chromatinstruktur denaturiert unter diesen Bedingungen nicht, während Samenzellen subfertiler Säugetiere häufig ein heterogenes DNA–Denaturierungsmuster zeigen. Die DNA–
Denaturierungen werden mittels des fluoreszierenden, metachromatischen Farbstoffs Acridin Orange angefärbt. Wenn Acridin Orange mit doppelsträngiger (ds = double stranded) DNA in Verbindung tritt, kommt es nach Anregung durch Laserlicht zu einer grünen Fluoreszenz. Bei der Bindung an einsträngige (ss = single stranded) DNA fluoresziert der Farbstoff rot (EVENSON et al., 2002).
Bei der Durchflusszytometrie werden suspendierte Spermien einzeln in einem Flüssigkeitsstrom an einem fokussierten Laserstrahl vorbeigeführt. Der Laserstrahl trifft auf die Zellen und liefert die Energie, um grüne und/oder rote Fluoreszenz in jeder der ca. 5000 gemessenen Zellen zu produzieren (Anregung der Zellen mit blauem Laserlicht, 488 nm). Die Intensität der roten und grünen Fluoreszenz wird für jedes einzelne Spermium ermittelt. Im laufenden Verfahren wird anschließend der Anteil der Rotfluoreszenz zum Anteil der Gesamtfluoreszenz (rot plus grün) in Beziehung gesetzt. Dieser berechnete Wert liegt zwischen 0 und 1 und wird als DFI- Wert (DNA-Fragmentation-Index) bezeichnet (EVENSON et al. 2002). Der DFI-Wert ersetzt die aus früheren Publikationen bekannte Variable % COMP αt.
In einem Verteilungshistogramm werden die DFI-Werte der einzelnen Spermien dargestellt. Hierbei werden fünf Populationen unterschieden (siehe Abb. 2 und 3).
Non-detectable-DFI (Low Level): Prozentsatz reifer Samenzellen, mit nichtfeststellbaren Niveaus an Kern-DNA-Fragmentation
Moderate DFI: Prozentsatz Samenzellen mit mäßigem Niveau an Kern-DNA- Fragmenten, gekennzeichnet durch eine mäßige Anfälligkeit zu Säure verursachter Denaturierung
High DFI: Prozentsatz Samenzellen mit hohem Niveau an Kern-DNA- Fragmenten, mit hoher Anfälligkeit gegenüber Säure induzierter Denaturierung
DNA-Fragmentation Index (DFI): Prozentsatz der Samenzellen mit mäßigem und hohem Niveau an Zellkern-Fragmentationen (% Moderate DFI + % High DFI) siehe Abb. 3.
High DNA Stainability (HDS): Das ist der Prozentsatz an Zellen mit unreifem Chromatin. HDS Spermien besitzen eine verminderte Chromatin- kondensation, die zu einer erhöhten DNA Farbempfänglichkeit führt.
Zusätzlich zu den o.g. fünf Hauptpopulationen werden noch die Mittelwerte und Standardabweichungen des DFI, die auf der Analyse aller analysierten Zellen basieren, errechnet. Bei der Auswertung der Histogramme erfolgt die Abgrenzung zwischen niedrigen DFI-Werten zu hohen DFI-Werten subjektiv. Anschließend errechnet die Software den prozentualen Anteil der Spermien mit erhöhten DFI- Werten (DIGRASSIE 2000).
Abbildung 2: Darstellung der verschiedenen Populationen im Verteilungshistogramm modifiziert nach EVENSON et al. 2002).
Abbildung 3: Darstellung der DFI-Werte in einem Verteilungshistogramm (modifiziert nach EVENSON et al. 2002).
2.2.2 Modifizierter fluoreszenzmikroskopischer Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA)
Anstelle der Originalmethode von Evenson et al. (1980a), die die Verwendung eines damals noch sehr kostenaufwendigen Flowzytometers beinhaltete, entwickelten TEJADA et al. (1984) eine vereinfachte mikroskopische Methode des SCSA. Diese vereinfachte Methode wird nach den allgemeinen Prinzipien des SCSA (Säuredenaturierung in situ) und anschließender Färbung mit Acridin Orange (AOT=
Acridine Orange Test) durchgeführt. Die Proben werden mittels eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops ausgewertet. Die Ergebnisse beruhen auf der visuellen Interpretation der Kernfluoreszenz durch die auswertende Person.
KOSOWER et al. (1992) fanden heraus, dass die Acridin Orange Fluoreszenz der Spermienkerne nach Behandlung mit Essigsäure von dem Thiol-Disulfid-Status der Protamine abhängig ist. Sie stellten weiterhin fest, dass eine geringe Konzentration an DTT (Dithiothreitol) Disulfide verringert und Thiole in der zu untersuchenden Probe erhalten bleiben. KVIST (1982) erläuterte, dass das vermehrte Vorhandensein von freien Thiolgruppen durch DTT induziert wird und möglicherweise sogar die Dekondensation von Spermien-Kern-Chromatin aktiviert .
Als einen großen Vorteil gegenüber der konventionellen mikroskopischen Beurteilung bezeichnete TEJADA et al. (1984) die Möglichkeit der gleichzeitigen Auswertung von Chromatinstruktur und Morphologie an identischen Spermien.
ANGELOPOULOS et al. (1998) fanden eine hohe Übereinstimmung zwischen morphologisch normalen Samenzellen, die mittels der Shorr Färbung angefärbt wurden, und den grün definierten Zellen, die mit Acridin Orange angefärbt wurden (AOT). DOBRINSKI et al. (1994) stellten eine Korrelation zwischen rot gefärbten Zellen, piriformen Köpfen und Vakuolen fest. Verschiedene Laboratorien haben die AOT–Technik genutzt, um das Befruchtungspotential von Männern einzuschätzen (IBRAHIM u. PETERSEN 1988, ROUX u. DADOUNE 1989, CLAASSENS et al.
1992). Sie haben signifikante Korrelationen zwischen morphologisch abnormalen Spermien und roter Fluoreszenz (AOT) festgestellt. Es konnte jedoch keine Korrelation zwischen der Motilität und der roten Fluoreszenz festgestellt werden (TEJADA et al. 1984, IBRAHIM u. PETERSEN 1988).
Weiterhin wurde über Probleme, die mit der vereinfachten Methode einhergingen, berichtet, die die Interpretation der nach der Tejada-Methode gefärbten Samenzellen betraf. Undeutliche Fluoreszenz (CLAASSENS et al. 1992), ein zu schnelles Verblassen der Fluoreszenz (DURAN et al. 1998) und differierende Bedingungen bei der Testdurchführung (EVENSON et al. 1980b) wurden hierbei erwähnt.
Ein weiteres Problem stellt nach EVENSON et al. (1999) und EVENSON und JOST (2000) die Oberfläche der Objektträger dar. Aufgrund dessen Konvexität kommt es zu einer inhomogenen Färbung, da sich die Färbelösungen auf dem Objektträger unterschiedlich verteilen. Diese Unebenheiten verhindern eine einheitliche Beurteilung der Proben.
In weiterführenden Studien modifizierten ACEVEDO (2000) und ACEVEDO (2001) die bereits oben aufgeführten Versuche und Methoden. Hierbei traten ebenso Probleme bei der Darstellbarkeit der Spermien durch das zu schnelle Verblassen der Färbung, sowie nicht eindeutige Farbklassifizierungen auf.
LOEHMER (2003) hat auf Grundlage der Arbeiten von HELMS et al. (2002), d.h.
durch Variation des DTT-Gehaltes sowie der Konzentration und Färbedauer des AO, weitere Modifikationen einfließen lassen. Durch diesen mfSCSA (modifizierter fluoreszenzmikroskopischer Spermienchromatinstruktur Assay) konnte die Färbung bei Bullenspermien stabilisiert und computergestützte Ergebnisse evaluiert werden.
BIEGE (2004) etablierte den mfSCSA im Rahmen der spermatologischen Diagnostik beim Hund. In dieser Arbeit wird der mfSCSA als Testverfahren mit hoher Reproduzierbarkeit der Ergebnisse dargestellt. Die gefärbten Präparate konnten selbst nach mehreren Wochen Aufbewahrung ausgewertet werden und zeigten somit eine entsprechende Stabilität des Fluoreszenzfarbstoffes Acridin Orange.
2.2.3 Spermienchromatinstruktur in Bezug zur Fertilität
Eine entscheidende Voraussetzung zur Verbesserung der Fortpflanzung ist die Qualitätskontrolle von Spermien, da ein intakt vorliegendes Spermienchromatin eine wichtige Rolle für die Befruchtung und anschließende Embryonale Entwicklung ist (TEJADA et al. 1984, SAACKE 1994, DARZYNKIEWICZ et al. 1997, SAKKAS und TOMLINSON 2000, EVENSON et al. 2000). Schon 1980 fanden EVENSON et al.
einen Zusammenhang zwischen der Fruchtbarkeit und der Empfänglichkeit von Spermien-DNA gegenüber durch Säure induzierter Denaturierung in situ. Studien an verschiedenen Spezies (Bullen, Mäusen und Menschen) wurden zu diesem Zweck mit Hilfe des SCSA durchgeführt.
Einige Studien haben negative Korrelationen zwischen der Fertilität von Bullen, gemessen an der Non-Return-Rate und den SCSA-Variablen SD, αt, sowie % COMP αt, ergeben (s. Kap. 2.2.1); (KARABINUS et al. 1990).
EVENSON u. KARABINUS (1991) untersuchten mittels SCSA die nachteilige Wirkung von umweltbedingtem Hitzestress auf die Samenqualität von Bullenspermien. Mit dieser Studie sollte herausgefunden werden, ob mit Hilfe des SCSA Schwankungen in der Samenqualität besser bzw. schneller bestimmt werden können als durch herkömmliche Qualitätsparameter. Die Testtiere wurden hinsichtlich der Reaktion auf hohe Umgebungstemperaturen in zwei Gruppen eingeteilt: Responder (Bullen, die in der Vergangenheit in den Sommermonaten Spermaqualitätseinbußen hatten) und Non-Responder (Bullen, die in der Vergangenheit während der Sommermonate keine Spermaqualitätseinbußen hatten).
Die Spermaqualität wurde mittels konventioneller Spermaparameter untersucht.
Bei Kryptorchiden ist der Anteil chromatininstabiler Spermien deutlich erhöht. Diese Erhöhung führt CREW (1922) auf die höhere Umgebungstemperatur der in der Bauchhöhle liegenden Hoden zurück.
KARABINUS et al. (1997) haben demonstriert, dass die Chromatinstabilität von Spermien nach einer 48-stündigen milden thermischen Belastung der Hoden reduziert ist. Die SCSA-Werte korrelierten mit den morphologischen Abweichungen, die sich während der Wärmebelastung zeigten. KARABINUS et al. (1997) fanden eine signifikante Erhöhung des Prozentsatzes COMP αt von Samenproben, die sich vermutlich noch auf dem Transport durch den Nebenhoden zum Zeitpunkt der Hodenerwärmung befanden. Diese Erkenntnis ließ vermuten, dass die Chromatin- Schwankungen schon vor anfänglichen morphologischen Veränderungen in den Spermatozoen auftreten.
LOVE und KENNEY (1999) führten eine ähnliche Studie an Hengsten durch. Hier wurde die Spermienchromatinstruktur mittels SCSA, die Disulfidbrückenbindung mittels Monobromobimane – Assay, sowie der Protamingehalt nach der Technik von
SWIERSTRA et al. (1974) analysiert. Hier konnte an Nebenhodenspermien weder eine Verringerung der Disulfidbrücken, noch eine Veränderung der Chromatinstabilität während der thermischen Belastung festgestellt werden. Auch 10 Tage nach Beendigung der Hodenerwärmung wiesen beide Parameter keine Veränderungen auf. Im Verlauf des Versuchs konnten des weiteren keine Veränderungen an Histonen und Protaminen festgestellt werden. Diese Ergebnisse widersprechen denen von BALHORN et al. (1988) und BACH et al. (1990), die Veränderungen in Histon- und Protamingehalt an Spermien fertiler und infertiler Männer festgestellt haben.
ESTOP et al. (1993) demonstrierten, dass Mäusespermien schon nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur eine instabilere Spermienchro- matinstruktur zeigen. Bei einer 30-minütigen Inkubation von Bullenspermien mit kryoprotektivem Verdünner zeigten KARABINUS et al. (1990) ebenfalls eine erhöhte Empfänglichkeit zur DNA–Denaturierung. KRIENKE (2003) untersuchte den Einfluss der Inkubation bei TG-Sperma von Hengsten. Nach einer 3-stündigen Inkubation bei 37˚ C verdoppelte sich der prozentuale Anteil an chromatininstabilen Spermien.
Hingegen konnten KARABINUS et al. (1997) zwischen inkubierten und nicht inkubierten Spermien keine zunehmende Empfänglichkeit zur DNA–Denaturierung feststellen.
LOEHMER (2003) zieht den Schluss, dass der mfSCSA zur Untersuchung der Stabilität des Spermienchromatins bei Bullenspermien ein reproduzierbarer Test ist und als eigenständiger, fertilitätsrelevanter Parameter angesehen werden kann. In der Studie von LOEHMER (2003) konnten keine signifikanten Verbindungen zu den Parametern der klassischen Spermatologie (Motilität und Plasmamembranintegrität), sowie zu den Formkonstanten aus der Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie gefunden werden.
Bei Untersuchungen der Chromatinstruktur an Hundespermien stellte BIEGE (2004) fest, dass zur Etablierung des mfSCSA als diagnostischer Parameter für die Fertilität weiterführende Untersuchungen notwendig seien.
3 Materialien und Methoden
3.1 Materialien, Chemikalien und Lösungen
Die für die Durchführung der spermatologischen Untersuchungen benötigten Laborgegenstände, sowie die verwendeten Chemikalien, Reagenzien und daraus hergestellte Puffer, Lösungen und Verdünner sind im Anhang aufgeführt.
3.2 Hengste
Für die Untersuchungen standen Hengste vom Niedersächsischen Landgestüt Celle zur Verfügung:
59 Warmbluthengste
6 englische Vollbluthengste 1 Anglo – Araber
Das Alter der Tiere lag zwischen 5 und 25 Jahren.
Die Ejakulatgewinnungen erstreckten sich dabei über den Zeitraum Dezember 2000 bis Juli 2002.
In den Monaten Oktober bis Januar wurden die Hengste regelmäßig dreimal wöchentlich jeweils montags, mittwochs und freitags abgesamt. Von März bis Juli standen die Landbeschäler in regelmäßigem Deckeinsatz. Die Ejakulatgewinnung erfolgte in diesem Zeitraum einmal täglich.
Während der Untersuchungszeiträume waren die Sexualfunktion und das Allgemeinbefinden der Hengste ungestört.
3.3 Gewinnung und Aufbereitung der Ejakulate
3.3.1 Gewinnung der Ejakulate
Die Samengewinnung erfolgte mit der künstlichen Scheide (Modell Hannover) in Anwesenheit einer rossigen Stute und unter Verwendung eines Phantoms als Sprungpartner (Modell „Celle“, KLUG 1990). Die routinemäßige Untersuchung der Ejakulate wurde im Labor der Besamungsstation vorgenommen. Die Beurteilung der Samenqualität erfolgte im Wesentlichen nach der von KRAUSE (1966) für Bullensperma beschriebenen Methode.
3.3.2 Konventionelle spermatologische Untersuchungen
Die konventionellen spermatologischen Untersuchungen umfassten die subjektive Einschätzung der Spermienmotilität sowie die Beurteilung der Spermienmorphologie.
Die Beurteilung der Samenproben erfolgte mit einem Phasenkontrastmikroskop. Die eingesetzten Utensilien (Heiztisch des Mikroskops, Objektträger, Deckgläschen und Kapillarpipetten) wurden zuvor auf 38° C vorgewärmt.
a) Bestimmung der Spermienmotilität
Die mikroskopische Ermittlung der Bewegungsaktivität erfolgte durch Schätzungen der prozentualen Anteile von:
vorwärtsbeweglichen Samenzellen (V), ortsbeweglichen Samenzellen (O) und unbeweglichen Samenzellen (U).
Als ortsbewegliche Samenzellen wurden hierbei diejenigen Samenzellen eingeteilt, die eine Kreisbewegung vollzogen, dessen Radius etwa der Länge eines Spermiums entsprach.
Die Motilität (Mot) wurde durch den prozentualen Anteil vorwärts- und ortsbeweglicher Spermien bestimmt.
Für die Beurteilung diente das Hellfeldverfahren bei 200-facher Vergrößerung. Dazu wurden auf einem vorgewärmten Objektträger drei ca. 2-5 µl große Tropfen der zu beurteilenden Probe aufgetragen. Die Tropfen wurden jeweils mit einem Deckgläschen (18 x 18 mm) bedeckt. Anschließend wurde der arithmetische Mittelwert aus den drei Untersuchungsergebnissen berechnet und als Motilität der Samenprobe protokolliert.
Die Analyse der Motilität wurde an verdünnten Samenproben (50 Mio.
Samenzellen/ml) initial, 0,5 h nach Verdünnung, 24 und 48 Stunden nach Gewinnung der Ejakulate durchgeführt. Als Frischsamenverdünner wurde INRA 82 (PALMER und FAUQUENOT, 1984; MAGISTRINI et al. ,1992) verwendet (s. Anhang).
b) Methode zur Erfassung pathologisch veränderter Samenzellen
Zur Charakterisierung der Spermienmorphologie wurde ein ca. 2-5 µl großer Tropfen Nativsamen, nach Immobilisierung und Fixierung in 0,5-prozentiger Formollösung, auf einem Objektträger ausgestrichen. Die Ausstriche wurden luftgetrocknet und anschließend mit der modifizierten Farrelly-Färbung nach BOERSMA et al. (1996) gefärbt. Die anschließende Auswertung erfolgte bei 1000-facher Vergrößerung unter einem Phasenkontrastmikroskop (Fa. Leitz). Dabei wurden jeweils 200 Spermien nach dem Schema von WEITZE (2000) beurteilt. Für die statistischen Auswertungen wurden:
der prozentuale Anteil an Samenzellen mit morphologisch abweichenden Kopfveränderungen (MAS-Kopf)
sowie der Prozentsatz aller morphologisch abweichender Spermien (MAS) herangezogen.
Aufgrund der kompakteren Kopfform und des wenig ausgeprägten apikalen Randes des Akrosoms von Pferdespermien konnten bei der morphologischen Beurteilung der Samenzellen die Kopfkappenveränderungen nicht berücksichtigt werden. Die berücksichtigten morphologischen Abweichungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Auswertungsschema zur Erfassung der morphologischen Veränderungen (WEITZE, 2000)
I. Kopfkappenveränderungen Abgelöst
In Ablösung Deformiert
Schief Zu klein
Persistierendes Akrosom II. Kopfveränderungen
Kolbenform Lanzenform Spatenform Rund Verjüngt
Schmal Eingeschnürt Zwergkopf Riesenkopf Deformiert III. Halsveränderungen
Halsbruch
Paraxialer Schwanzansatz
Retroaxialer Schwanzansatz Plasmatropfen
IV. Verbindungsstückveränderungen Gebrochen
Doppelt Fibrilär
Axial Deformiert Plasmatropfen V. Haupt- und Endstückveränderungen
Plasmatropfen Schleifenform Aufgerollt
Um den Kopf gerollt Abgeknickt
Rudimentär VI. Doppel- und Mehrfachmissbildungen Doppelkopf mit einem Schwanz
Einköpfiger Zwillingsschwanz Zweiköpfiger Zwillingsschwanz
Einköpfiger Drillingsschwanz Andere
Mehrfachmissbildungen VII. Gesamt
3.3.3 Thermoresistenztest
Für die Durchführung des Thermoresistenztests wurde von jedem Ejakulat eine auf 50 Mio. Samenzellen/ml verdünnte Samenprobe (3 ml) in ein Plastikröhrchen der Firma Sarstedt abgefüllt und in einem Wasserbad bei 41° C inkubiert. Die Motilität der Samenproben ist initial nach Verdünnung und dann in 30-minütigen Abständen bis zum Zeitpunkt der völligen Immobilisation der Samenzellen erfasst und dokumentiert worden.
3.3.4 Tiefgefrierkonservierung der Samenproben
Von den vorverdünnten Ejakulaten (50 x 106 Samenzellen/ml) wurden ca. 80 ml in Zentrifugengläser abgefüllt und 10 Minuten bei einer Gravitationsgeschwindigkeit von 600 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und das Zentrifugat in einem Rüttler (Fa. Bühler, Tübingen) wieder in Suspension gebracht. Zur Resuspension des Zentrifugates wurde dem Samenpellet vorab ca. 3 ml des Endverdünners (INRA 82 + 2 % klarifizierter Eidotter + 2,5 % Glycerol) zugefügt.
Nach Auflösung des Pellets wurde die Dichte mit einer Zählkammer (Thoma „neu“) ausgezählt und das Zentrifugat auf eine endgültige Dichte von 100 Mio. Samenzellen pro Milliliter durch Zugabe des o.g. Tiefgefrierverdünners gebracht. Der verdünnte Samen wurde anschließend in 0,5 ml Pailletten (Fa. Minitüb, Landshut) maschinell abgefüllt („MRS- I“, IMV; L`Aigle Cedex, Frankreich) und diese dann für ca. 60 Minuten im Kühlschrank (+5° C) zwischengelagert (Anpassungszeit). Im Anschluss daran wurden sie mit einem automatisch gesteuerten Einfriergerät („Minidigitcool“, IMV, L`Aigle, Frankreich) mit identischer Kühlrate eingefroren. Das Kühlverfahren vollzog sich von +5° C bis -140° C mit 60° C Absenkung pro Minute. Nach abgeschlossenem Einfrierprozess wurden die Tiefgefrierpailletten in flüssigen Stickstoff umgelagert. Während des Einfrierverfahrens sind die Pailletten in konstantem Abstand und in gleicher Höhe in den Gefrierkammern gelagert worden, um möglichst reproduzierbare Einfrierverläufe zu erreichen (BARON 1986). Die Überwachung des Abkühlverlaufs erfolgt durch einen im Gerät integrierten Schreiber,
der mit einem Temperaturfühler im Inneren einer Referenzprobe verbunden ist. Die im flüssigen Stickstoff (-196° C) gelagerten Pailletten wurden unmittelbar vor der Untersuchung und Färbung für 30 Sekunden in einem 38° C warmen Wasserbad aufgetaut.
3.4 Methodik des mfSCSAs
3.4.1 Protokoll des mfSCSAs
Auf der Basis der fluoreszenzmikroskopischen Arbeiten von DIGRASSIE (2000) und ACEVEDO et al. (2001) entwickelten HELMS et al. (2002), sowie LOEHMER (2003) den fluoreszenmikroskopischen Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA).
Die Auswertung der mfSCSA Ergebnisse erfolgte nach der Methode von Helms et al.
(2002) und LOEHMER (2003) unter Verwendung des Software-Programms analySIS® Version 3.0 (Soft Imaging System GmbH, Münster).
Das Protokoll des mfSCSA ist in mehrere Abschnitte gegliedert:
a) Verwendete Spermien
• Nativ-Sperma
• Nativ-Sperma in flüssigem Stickstoff schockgefroren (die Eppendorfgefäße wurden für 2 Minuten in einem 38° C warmem Wasserbad aufgetaut)
• Nativ-Sperma zentrifugiert, dekantiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren
• verdünnte Frischsamenproben (Verdünner INRA 82)
• Tiefgefrierpailletten (Auftauprozess: 30 Sek. in einem 38° C warmen Wasser- bad)
b) Vorbereitung der Samenproben
Die nativen und die nativ schockgefrorenen Proben (nach o.g. Auftauverfahren) wurden auf 100 Mio. Samenzellen/ml mit 2,9 % Natriumzitratpuffer verdünnt.
Ein Teil der nativen Samenproben wurde erst für 10 Minuten bei 600 g zentrifugiert anschließend dekantiert und schockgefroren.
Von den Frischsamenproben (50 Mio. Samenzellen/ml) sind jeweils 2 ml entnommen, und im Verhältnis 1:4 mit Natriumzitratpuffer 2,9 % versetzt worden. Für die Untersuchung des Tiefgefrierspermas wurden pro Ejakulat zwei Pailletten á 0,5 ml (100 Mio. Samenzellen/ml) aufgetaut und ebenfalls mit Natriumzitratpuffer 2,9%
im Verhältnis 1:4 versetzt worden.
Der weitere Verlauf der Probenverarbeitung war bei allen Proben, wie folgend beschrieben, identisch:
Die Samensuspensionen wurden in Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 2700 g und 20° C für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen, das Pellet mit 2 ml Natriumzitratpuffer 2,9 % resuspendiert und erneut unter o.g.
Bedingungen zentrifugiert. Der „Waschprozess“ wurde dreimal wiederholt.
Beim letzten Waschdurchgang wurde der Überstand bis auf ca. 100 µl abgegossen und erneut resuspendiert. Von dieser Resuspension wurden 50 µl entnommen und auf einem Superfrost®plus Objektträger ausgestrichen. Die Ausstriche wurden mit einem lösungsmittelfreien Stift (Securline®Marker II, Precision Dynamics Corporation, USA) beschriftet und anschließend bei Zimmertemperatur luftgetrocknet (10 Min.).
Von jeder Probe wurden zwei Ausstriche angefertigt.
c) Dekondensation des Spermienchromatins
Die Lösungen zur Dekondensation und Denaturierung des Spermienchromatins sind unter einem Abzug hergestellt worden. Eine Atemschutzmaske und Gummihandschuhe wurden zusätzlich als Schutzmaßnahme getragen.
Im ersten Schritt wurden 0,0386 g 1,4-Dithiothreit (DTT) auf einer Laborwaage abgewogen, in ein Becherglas gegeben und in 50 ml Natriumzitratpuffer (2,9 %) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 5 mmol/l 1,4-Dithiothreit ergab. Im zweiten Schritt wurde DMSO (1 mmol/l) mit Aqua bidest (1,75 mmol/l) gesättigt. Dazu wurden 3550 µl DMSO (50 x 71 µl, entspricht 50 x 1 mmol DMSO) und 1550 µl Aqua
bidest (50 x 1,75 x 18 µl, entspricht 50 x 1,75 mmol Aqua bidest) in einen Erlenmeyerkolben gegeben. Der Anteil DMSO wurde mit dem Anteil Aqua bidest durch Schwenken vermischt. Zwischen den beiden Reagenzien kam es nach Vermischung zu einer exothermen Reaktion. Nach deutlichem Abkühlen des Erlenmeyerkolbens wurde das Gemisch der DTT-Lösung zugegeben und mit dieser vermischt. Die Haltbarkeit der hergestellten Arbeitslösung belief sich dabei auf 24 Stunden.
Die waagerecht gelagerten Objektträger wurden nun jeweils mit 2 ml der Lösung beschichtet.
Nach einer Einwirkzeit von 40 Minuten wurde die Arbeitslösung von den Objektträgern der Reihe nach abgegossen, die überschüssige Lösung mittels eines Becherglases aufgefangen und die einzelnen Objektträger mit Natriumzitratpuffer 2,9 %, der in einer Plastikspritzflasche abgefüllt war, abgespült. Im Anschluss daran wurden die Objektträger für 10 Minuten in eine ebenfalls mit Natriumzitratpuffer 2,9 % gefüllte Färbeküvette zum Spülen gestellt (Pufferspülbad).
Nach dem Pufferspülbad wurden die Objektträger aus der Färbeküvette entnommen und die Rückseite mit Zellstoff abgetupft. Anschließend wurden die Objektträger auf eine saugfähige Unterlage senkrecht aufgestellt, um dann bei Zimmertemperatur für ca. 10 Minuten an der Luft zu trocknen.
d) Säuredenaturierung
Die luftgetrockneten Objektträger wurden für 100 Minuten in eine Färbeküvette mit Carnoy`s Solution (pH-Wert 2) gestellt. Diese Säuredenaturierung erfolgte in einem abgedunkeltem Raum, d.h. ohne direkte Sonneneinstrahlung.
Mit Beginn der Säuredenaturierung durften die Ausstriche keinem UV-Licht mehr ausgesetzt werden.
Nach Ablauf der 100 Minuten wurden die Objektträger aus der Küvette entnommen und unter einem Abzug kurz luftgetrocknet.
e) Acridin Orange Färbung
Das Ansetzen der Färbelösung sowie der Färbevorgang erfolgten in Dunkelheit. Für die Acridin Orange Färbung wurden
40 ml Zitronensäurelösung (gekühlt, +5° C)
2,5 ml Di-Natriumhydrogenphosphat-Lösung (gekühlt, +5° C) und 10 ml Acridin Orange-Stammlösung (gekühlt, +5° C, dunkel gelagert)
in einer gekühlten Färbeküvette gut vermischt. Zur Abkühlung der Färbeküvetten wurden diese 15 Minuten vor Ablauf der Säuredenaturierung in einen Eisschrank gestellt.
Die Ausstriche sind für 14 Minuten in die Färbeküvette gesetzt worden. Nach Ablauf der Färbezeit wurden die Objektträger der Reihe nach der Färbeküvette entnommen und deren Rückseiten mit Zellstoff abgetrocknet. Um überschüssige Farbreste abzuspülen, wurden die Ausstriche anschließend für 8 Minuten in eine Färbeküvette mit Natriumzitratpuffer 2,9 % (gekühlt, +5° C) gestellt. Im Anschluss an das Spülbad wurden die Ausstriche der Küvette entnommen, die Rückseiten der Objektträger mit Zellstoff abgetupft und auf einer saugfähigen Unterlage für 10 Minuten luftgetrocknet.
Die Aufbewahrung der Ausstriche erfolgte in Objektträgerkästen bei +5° C unter Ausschluss von Licht.
f) Auswertung der Ausstriche
Zur Auswertung wurde ein Fluoreszenzmikroskop „Axioskop“ der Fa. Zeiss, Germany verwendet. Es wurde eine 400-fache Vergrößerung (40-er Objektiv), Phase 2 und blaues Laserlicht (490 nm ) benutzt, dabei wurde Licht der Wellenlänge 530 nm (grün
= doppelsträngige DNA), sowie 640 nm (rot = einzelsträngige DNA) emissiert. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einer Digitalkamera (Olympus DP 50) aufgenommen.
Die Kamera wurde mit einem Computer vernetzt, so dass die Bilder über das Software-Programm analySIS® Version 3.0 der Fa. Soft Imaging System GmbH, Deutschland, Münster ausgewertet werden konnten.
Zur Auswertung wurde nur der Bereich zwischen der Mitte und dem Rand der Ausstriche herangezogen. Es wurden ca. 400 Spermien pro Ausstrich analysiert.
g) Festlegung der Grundeinstellungen am Fluoreszenzmikroskop, der Digital- kamera und dem Computersystem zur Standardisierung
Die Grundeinstellungen der Digitalkamera für Fluoreszenzaufnahmen, sowie die Kalibrierung der Olympus Camera DP 50 auf die verschiedenen Objektive des Fluoreszenzmikroskops „Axioskop“ (Zeiss, Germany) wurden von einem Mitarbeiter der Fa. Olympus durchgeführt.
Das digitalisierte fluoreszenzmikroskopische Bild wurde als „LIVE-BILD“ auf dem Monitor des Computers dargestellt und unmittelbar zur Analyse herangezogen (s.
Abb. 4).
Grundeinstellungen:
-Kalibrierung:
Um ein geeichtes „LIVE-BILD“ auf dem Monitor erfassen zu können, musste das Bild der Digitalkamera mit dem Bild des Fluoreszenzmikroskops auf ein Maß gebracht werden. Dieser Vorgang wird als Kalibrierung bezeichnet und muss für jedes einzelne Objektiv (20 er, 40 er und 100 er Objektiv) vorgenommen werden.
-Bildqualitätsparameter:
Die Lichtempfindlichkeit der Digitalkamera für die Fluoreszenzaufnahmen wurde auf ISO 400 eingestellt, bei einer Belichtungszeit von 300 ms. Die Fluoreszenzbilder wurden mit der höchsten Auflösung der Kamera aufgenommen „SUPER HIGH QUALITY“ (2776 x 2074 Pixel) und in einer unkomprimierten „TIFF-Datei“
abgespeichert.
Zur Reduktion von Farbstichen in Echtfarbbildern dient der Bildparameter „Manueller Weißabgleich“. Dieser Parameter besteht aus drei Korrekturfaktoren (Rot, Grün und Blau) die für alle Aufnahmen gleichbleibend eingestellt wurden. Nach Erstellung eines Bildes wurde der Vergrößerungsfaktor in µm gesetzt.
-Klassifizierung definieren: (Erstellung eines Klassifikationsschemas):
Dieser Befehl legt ein Klassifikationsschema fest. Eine Klasse ist ein Wertebereich innerhalb eines Schemas, der durch einen oberen und unteren Grenzwert definiert wird. Zur Auswertung des mfSCSA wurden zwei Klassen definiert:
Klasse 1 beschrieb den Anteil an einsträngiger DNA (ssDNA = single stranded DNA) und wurde durch die Farbe Rot definiert
Klasse 2 bildete den Anteil doppelsträngiger DNA (dsDNA = double stranded DNA) und wurde in der Farbe Grün dargestellt.
-Messung definieren:
Alle im „LIVE-BILD“ dargestellten Partikel wurden auf ihre Klassen- und Partikelzugehörigkeit hin analysiert. Somit war es möglich Spermien innerhalb des detektierten Bildabschnitts zu identifizieren und einer Klasse zuzuordnen. Die Einstellungen für die Messungen der Klassenzugehörigkeit wurden definiert, so dass die rot, bzw. grün dargestellten Spermien der jeweiligen Klasse zugeordnet werden konnten. Die Menge an Spermien der einzelnen Klassen wurde in Prozent angegeben. Für jedes „LIVE-BILD“ wurden die Rot- und Grüngehalte der Klassen, sowie die durchschnittliche Farbsättigung und -intensität bestimmt.
-Detektion definieren:
Diese Programmanweisung dient der Festlegung der für die Detektion wichtigen Kriterien. Um Artefakte auszuschließen wurde eine minimale Anzahl an Pixeln für den zu detektierenden Bildabschnitt festgelegt. Außerdem wurde der Bereich, die Darstellung und die Durchführung der Detektion definiert. Die gefundenen Partikel wurden im Bild-Overlay farbig markiert. Dabei wendete das System die aktuelle Klassifizierung automatisch an. Die Klassifizierung bestimmte bei der Detektion die farbliche Darstellung der Partikel. Die Ergebnisse wurden in Form einer Excel- Tabelle ausgegeben.
-Farbschwellwertdatei erstellen:
Um eine standardisierte Detektion zu ermöglichen, wurden Farbschwellwertdateien erstellt (siehe Anhang). Hierzu wurde durch mindestens eine rote und eine grüne
Zelle ein s.g. Intensitätsprofil angelegt. Das Intensitätsprofil gibt Auskunft über den jeweiligen Rot-, bzw. Grünanteil der erfassten Zellen. Die Erstellung des Intensitätsprofils im digitalisierten Bild wurde abhängig von der Anordnung der Spermien horizontal oder polygonal durchgeführt (s. Abb. 5 und Abb. 6). Unter der Funktion „Farbschwellwerte setzen“ wurden im RGB-Feld für beide Zellpopulationen die Messwerte, d.h. die im Overlay des Intensitätsprofils dargestellten Rot- und Grünanteile, eingegeben. Die Vorschau der Detektion erfolgte dann für alle im digitalisierten Bild erfassten Zellen (s. Abb. 7). Die so erstellten Farbschwellwertdateien wurden anschließend als Standarddateien abgespeichert.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Daten mit drei verschiedenen Farbschwellwertdateien ausgewertet:
mit der „normalen Standarddatei“ für normal gefärbte Ausstriche, bei der die roten Samenzellen einen Farbanteil von 1/3 grün und 2/3 rot aufwiesen und die grünen Samenzellen jeweils zur Hälfte grüne und rote Farbanteile besaßen;
mit der „grünen Standarddatei“ für grünlichere Ausstriche, bei denen die rote Spermienpopulation niedrigere Rotwerte und höhere Grünanteile aufwies und mit der „roten Standarddatei“ für rötliche Ausstriche, bei denen die rote
Population erhöhte Rotanteile besaß.
Die Farbanteile der grünen Samenzellen waren bei den grünlicheren und bei den rötlicheren Ausstrichen unverändert, d.h. jeweils zur Hälfte grün und rot (siehe optimale Ausstriche). Die zur Detektion des digitalisierten Bildes nötige Datei wurde aufgerufen und die Detektion durchgeführt. Die gefundenen Partikel erschienen im Bild-Overlay farbig markiert, beziffert und wurden als Klassenergebnisse in einer Tabelle ausgewiesen. Die Klassenergebnisse konnten daraufhin direkt in eine Excel- Tabelle übertragen werden.
Abbildung 4: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: mfSCSA-Fluoreszenz-Live-Bild (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)
Abbildung 5: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: horizontales Farbintensitätsprofil (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)
Abbildung 6: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: polygonales Farbintensitätsprofil (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)
Abbildung 7: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: detektiertes Fluoreszenz-Live-Bild mit digitalem Overlay (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)
3.4.2 Reproduzierbarkeit des Auswertungsverfahrens des mfSCSAs
Zur Überprüfung der Zuverlässigkeit der Messwerte des mfSCSAs wurden 32 Ausstriche von Nativ-Sperma-Proben unterschiedlicher Hengste doppelt ausgewertet. Dazu wurden die Sperma-Proben nummeriert und später als Blindproben gemessen. Um einen zeitlichen Einfluss ausschließen zu können, wurden die Untersuchungen an den einzelnen Proben jeweils direkt nacheinander durchgeführt.
3.4.3 Reproduzierbarkeit des mfSCSAs an einem anderen Ausstrich
In diesem Versuchsabschnitt wurden 64 Ausstriche von 32 Ejakulaten durch Blindmessungen ausgewertet. Die Ejakulate wurden an zwei unterschiedlichen Tagen in zwei voneinander unabhängigen Färbedurchgängen gefärbt und anschließend ausgewertet. Es wurde nativ schockgefrorenes Sperma verwendet.
3.4.4 Methodischer Vergleich zwischen dem mfSCSA und dem SCSA
Hier wurde untersucht, ob die Ergebnisse des mfSCSAs mit den Ergebnissen des von EVENSON et al. (1980a) entwickelten flowzytometrischen SCSA korrelieren.
Die durchflusszytometrischen Untersuchungen zur Bestimmung der Chromatinstruktur (SCSA) wurden an 42 Ejakulaten von 36 Hengsten ermittelt. Die Vergleichsanalysen erfolgten jeweils an einem im Split-Sample-Verfahren hergestellten Aliquot von nativ schockgefrorenen Samenproben. Durchgeführt wurden die flowzytometrischen Analysen im Rahmen der Dissertation von KRIENKE (2003) an der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilian-Universität München.
Für diese Untersuchungen wurde ein Flowzytometer FACScanTM der Fa. Becton Dickinson verwendet. Die Auswertung der SCSA-Daten erfolgte mit dem Software- Programm DAS Version 4.40 (BEISKER 1994). Die Geräteeinstellungen, sowie die Probenaufbereitungen und Messungen erfolgten nach der bei EVENSON und JOST (2000) beschriebenen Methode.
Es wurden die Filter Fl 1 für die grüne Fluoreszenz und Fl 3 für die rote Fluoreszenz eingesetzt. Zu Beginn der Messreihe und nach jeder zehnten Probe wurde eine Referenzprobe gemessen. Analysiert wurden insgesamt 10.000 Spermien pro Samenprobe.
3.5 Einflüsse auf die Ergebnisse des mfSCSA
3.5.1 Überprüfung der Haltbarkeit gefärbter Ausstriche
Um die Haltbarkeit der nach dem mfSCSA-Protokoll gefärbtem Ausstriche zu überprüfen, wurden 32 Proben analysiert, über einen Zeitraum von sechs Monaten unter Lichtausschluss bei 5° C gelagert und anschließend einer zweiten Analyse unterzogen.
3.5.2 Konservierungseinflüsse auf den mfSCSA
a) Schockgefrierung:
Es wurde der Einfluss des Schockgefrierens auf die Stabilität der Spermienchromatinstruktur an 32 Ejakulaten von 32 Hengsten untersucht. Die nativ und nativ schockgefrorenen Proben wurden wie unter Kapitel 3.4.1 vorbereitet und ausgewertet.
b) Weitere Konservierungsverfahren:
Hier wurde die Chromatinstabilität in Nativsperma-, verdünnten Frischsamen- und in Tiefgefrierspermaproben anhand von 10 Ejakulaten von 10 Warmbluthengsten beurteilt.
Für die Analyse des Einflusses der Zentrifugation von Nativsamen auf den Spermienchromatinstatus wurde 1 ml des Nativsamens in ein Eppendorfgefäß gefüllt, verschlossen, beschriftet und in flüssigem Stickstoff bei -196° C schockgefroren (hierfür standen neun Ejakulate von neun Hengsten zur Verfügung). Eine weitere Nativsamenprobe wurde für 10 Minuten bei 600 g zentrifugiert, der Überstand vorsichtig dekantiert und das Pellet resuspendiert. Diese Probe wurde anschließend ebenfalls in einem Eppendorfgefäß in flüssigem Stickstoff schockgefroren (hierfür standen zehn Ejakulate von zehn Hengsten zur Verfügung).
Um herauszufinden, ob die Verdünnung der Ejakulate mit Frischsamenverdünner (INRA 82), sowie die Lagerung der verdünnten Samenproben (Aufbewahrung über 48 Stunden bei +5° C.) einen Einfluss auf die Chromatinstruktur haben, sind von den o.g. Ejakulaten drei verschiedene Frischsamenproben untersucht worden. Von jedem verdünnten Ejakulat wurde eine erste Probe von 2 ml Volumen nach 0,5 Stunden entnommen und wie unter Punkt 3.4.1 erläutert, gewaschen und anschließend nach dem mfSCSA-Protokoll gefärbt und ausgewertet.
Es wurde jeweils ein Aliquot von 6 ml der verdünnten Ejakulate in je ein Sarstedt- Plastikröhrchen abgefüllt, beschriftet und bei Kühlschranktemperatur (+5° C) aufbewahrt. An diesen Proben wurde nach 24 Stunden (2. Probe) und nach 48 Stunden (3. Probe) der Spermienchromatinstatus untersucht. Die Durchführung des mfSCSA erfolgte nach dem unter Kapitel 3.4.1 beschriebenen Schema. Der Rest der verdünnten Samenproben wurde im Rahmen der Kryokonservierung nach dem Routineprotokoll des Niedersächsischen Landgestüts Celle, wie unter Kapitel 3.3.4 dargestellt, in Tiefgefrierpailletten abgefüllt und in zwei Gruppen gegliedert:
die erste Gruppe wurde nach einer Anpassungszeit von 0,5 Stunden bei 5°C maschinell eingefroren und
die zweite Gruppe wurde nach einer Anpassungszeit von 3 Stunden bei 5°C ebenfalls maschinell eingefroren.
Die hergestellten TG-Pailletten wurden bis zum Zeitpunkt der Analyse in flüssigem Stickstoff gelagert.
3.6 Konservierungseinflüsse auf den flowzytometrischen SCSA
Um einen möglichen Einfluss verschiedener Konservierungsverfahren auf die Ergebnisse des SCSAs zu untersuchen wurden 10 Ejakulate von 10 Hengsten im Split-Sample-Verfahren flowzytometrisch analysiert. Die durchflusszytometrischen Untersuchungen wurden ebenfalls im Rahmen der Dissertation von KRIENKE (2003) an der Ludwig-Maximilian-Universität München erbracht. Die Bestimmung der Chromatinstruktur wurde an nativ schockgefrorenen Proben, nativ zentrifugierten schockgefrorenen Proben, verdünntem Frischsamen (nach 24 Stunden und nach 48 Stunden Aufbewahrung), sowie an TG-Sperma durchgeführt.
3.7 Spermienchromatinstruktur von Hengsten im Besamungseinsatz
In diesem Untersuchungsabschnitt wurden 150 Ejakulate von 50 Hengsten (jeweils drei Ejakulate pro Hengst), die im Besamungseinsatz tätig waren, untersucht. Die Ejakulatgewinnung für die Untersuchungen fanden zu drei verschiedenen Jahreszeiten statt (Dezember, März und Juli), so dass von jedem Hengst drei saisonal unterschiedliche Samenproben vorlagen. Anhand dieser Proben wurden neben der Erhebung des Chromatinstatus (SCSA) noch weitere spermatologische Parameter erfasst und analysiert:
die Bewegungsaktivität (Motilität) zu verschiedenen Zeiten (initial, d.h. 0,5 h nach Verdünnung, nach 24 und nach 48 h Lagerung bei 5° C)
die Spermienmorphologie (phasenkontrastmikroskopische Beurteilung)
die Thermoresistenz (Inkubation der Frischsamenproben bei 41° C im Wasserbad)
sowie verschiedene Fruchtbarkeitsparameter der Hengste
3.7.1 Bezug zum Alter der Hengste
Aus den drei zu unterschiedlichen Jahreszeiten gewonnenen Ejakulaten der 50 Hengste wurde der Mittelwert des prozentualen Anteils chromatininstabiler Spermien berechnet. Dieser Mittelwert wurde mit dem Alter der Hengste in Beziehung gesetzt.
Zusätzlich wurden zwei Extremgruppen untersucht: Gruppe 1 beinhaltete die 10 % jüngsten Hengste und die Gruppe 2 die 10 % Ältesten.
3.7.2 Bezug zu konventionellen spermatologischen Parametern
In diesem Abschnitt wurde die Beziehung zwischen der Chromatinstabilität und den standardspermatologischen Parametern untersucht. Hierzu wurden die Einzelergebnisse der Motilitätsbestimmungen, der morphologischen Untersuchungen und des Thermoresistenztests der zu unterschiedlichen Jahreszeiten gewonnenen Ejakulate gemittelt und gegen die Mittelwerte der Chromatinstabilität aufgetragen.
3.7.3 Saisonale Einflüsse
Die saisonalen Einflüsse auf die Ejakulate der 50 Deckhengste wurden anhand der Parameter Spermienchromatinstatus, Motilität, Morphologie und Thermoresistenztest bestimmt. Es wurde für jeden Parameter ein Mittelwert aller Besamungshengste (n = 50) für die Monate Dezember, März und Juli berechnet. Zur Erkennung saisonaler Einflüsse wurden diese Mittelwerte miteinander verglichen.
3.7.4 Bezug zur Fertilität
Die Ergebnisse der Spermienchromatinstruktur-Analysen wurden mit den untersuchten Fertilitätsparametern der Hengste, Trächtigkeitsrate pro Rosse, Trächtigkeitsrate pro Saison, Abfohlrate, sowie lebend registrierter Fohlen in Bezug gesetzt. Ebenfalls wurden die standardspermatologischen Ejakulatparameter, sowie der Thermoresistenztest in Bezug zu den genannten Fertilitätsparametern gesetzt.
3.8 Statistische Auswertung
Die statistischen Analysen der Versuchsergebnisse wurden im Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit Hilfe des Softwareprogramms SAS® (Statistical Analysis System) Version V 8.3 durchgeführt.
3.8.1 Analyse der Reproduzierbarkeit des mfSCSAs und des methodischen Vergleichs (mfSCSA versus SCSA)
Um die Reproduzierbarkeit des mfSCSA am selben und an einem anderen Ausstrich, der in einem weiteren Durchgang gefärbt wurde, zu analysieren, wurde der Korrelationskoeffizient nach Spearman bestimmt.
Es wurden folgende Einflüsse auf die Spermienchromatinstruktur über die Errechnung des arithmetischen Mittelwertes (SAS-Prozedur MEANS) und anschließendem WILCOXON-Test miteinander verglichen:
die Aufbereitung der Samenproben,
die Anpassungszeiten beim Kühlverfahren und verschiedene Konservierungsverfahren.
Zusätzlich wurde eine Varianzanalyse durchgeführt, bei der die Rangkorrelationen nach Spearman (nicht normalverteilte Werte) und nach Pearson (normalverteilte Werte) berechnet wurden.
Bei dem methodischen Vergleich der Ergebnisse des mfSCSA und des SCSA erfolgte zunächst die Berechnung der Verteilung der Daten auf Basis der Doppelproben. Bei nicht normalverteilten Daten wurde in der anschließenden Varianzanalyse die Rangkorrelation mit der SAS-Prozedur CORR unter Berücksichtigung des Korrelationskoeffizienten nach Spearman ermittelt. Im Gegensatz dazu wurde bei normalverteilten Daten der Korrelationskoeffizient nach Pearson verwendet.
3.8.2 Analyse der Konservierungseinflüsse
Der Einfluss unterschiedlicher Konservierungsverfahren wurde durch die Erhebung der Mittelwerte der Paardifferenzen auf Null (SAS-Prozedur MEANS) mit dem Wilcoxon-Test überprüft. Zusätzlich wurden die Rangkorrelationen nach Spearman und Pearson durch eine Varianzanalyse errechnet.
3.8.3 Analyse der Saisonalität der untersuchten Ejakulatparameter
Um die Unterschiede der einzelnen Ejakulatparameter zu den verschiedenen Jahreszeiten zu ermitteln, wurden zunächst die arithmetischen Mittelwerte der untersuchten Merkmale zu den verschiedenen Jahreszeiten mit der SAS-Prozedur PROC MEANS errechnet. Die Mittelwerte von Dezember, März und Juli wurden dann anhand eines Paardifferenzentests nach Wilcoxon verglichen.
3.8.4 Analyse der Beziehung verschiedener Merkmale untereinander, sowie zu Fertilitätsparametern der Hengste
Zur Bestimmung der Zusammenhänge zwischen den einzelnen Samenparametern untereinander und zu den Fertilitätsdaten der Hengste, wurde die Korrelationsanalyse nach Spearman durchgeführt.
3.8.5 Signifikanzlevel für die Irrtumswahrscheinlichkeit
Für die gesamte Arbeit galt der Wert von p ≤ 0,05 als signifikanter Grenzwert für die Wahrscheinlichkeit der Nullhypothese.
Neben dieser Angabe wurde ein weiterer Wert von p ≤ 0,001 benutzt, der den Grenzwert einer hoch signifikanten Irrtumswahrscheinlichkeit angab.
4 Ergebnisse
4.1 Reproduzierbarkeit des Spermienchromatinstatus im mfSCSA
Um die Reproduzierbarkeit des mfSCSA zu analysieren, wurden 32 Ejakulate von 32 Hengsten gewonnen. Der Chromatinstatus der Samenzellen wurde anhand von Mehrfachmessungen untersucht. Dazu wurden 96 Ausstriche (drei Ausstriche je Ejakulat) angefertigt und nach dem mfSCSA-Protokoll gefärbt und ausgewertet (s.
Kapitel 3.4.1).
4.1.1 Reproduzierbarkeit am selben Ausstrich
Es wurden 32 Ausstriche von den oben angegebenen nativen Samenproben der 32 Hengste durch wiederholte „Blindmessungen“ ausgewertet. Die erste Auswertung der Ausstriche mittels des mfSCSA fand unmittelbar nach dem Färbedurchgang statt.
Der Mittelwert des prozentualen Anteils chromatininstabiler Spermien (CIS) lag bei 10,9 % mit einer Standardabweichung von 6,1%. Im Rahmen einer zweiten Blindmessung wurden die selben Ausstriche erneut ausgewertet. Hier betrug der Mittelwert 9,8 % chromatininstabiler Spermien mit einer Standardabweichung von 5,7%. Wie in Abbildung 8 dargestellt, war die Korrelation der ersten Messung mit der zweiten Messung hoch signifikant (RS = 0,89 und p ≤ 0,001). Die Mittelwerte unterschieden sich nicht signifikant (p ≥ 0,05).
