Thermoresistenztest in Korrelation zu den Fertilitätsparametern

Die Korrelation der Ergebnisse des Thermoresistenztest zu dem Fertilitätsparameter lebend registrierter Fohlen und der Trächtigkeitsrate pro Rosse, ergaben einen signifikanten Zusammenhang (p ≤ 0,05). Zu den anderen unten aufgeführten Fertilitätsparametern konnte keine signifikante Korrelation errechnet werden, wobei der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman mit R^S = 0,25 zur Abfohlrate nur geringfügig unter der Signifikanzgrenze lag (p = 0,09). Die errechneten Rang-korrelationskoeffizienten sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Korrelation zwischen den Ergebnissen des Thermoresistenztest und den Fertilitätsdaten

R^S = Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman

p = Irrtumswahrscheinlichkeit

5 Diskussion

Langjährige Beobachtungen in der Pferdezucht haben gezeigt, dass trotz unauffälliger spermatologischer Standardparameter nicht unbedingt auf eine erfolgreiche Befruchtung geschlossen werden kann (GRAHAM u. FOOTE 1987, KASA u. THWAITES 1992, FOOTE et al. 1986, BAMBA u. ADAMS 1990).

Der von EVENSON et al. (1980a) entwickelte Spermienchromatinstruktur Assay (SCSA) testet die Integrität der Chromatinstruktur der Spermien. Es wird in situ die Spermienchromatinstruktur durch Säurebehandlung denaturiert. Die Anfälligkeit der Spermien zur Säuredenaturierung wurde bei verschiedenen Spezies (Maus, Mensch und Rind) in Bezug zu verminderter Fertilität gesetzt.

Um die Spermienchromatinstruktur mikroskopisch beurteilen zu können, entwickelten TEJADA et al. (1984), KOSOWER et al. (1992), ACEVEDO (2001), ACEVEDO (2000) sowie ACEVEDO et al. (2001) eine Modifikation der Methode von EVENSON et al. (1980b). Ein erheblicher Vorteil bei der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung liegt in der Möglichkeit individuelle Spermien beurteilen zu können.

Außerdem können parallel zu dem Kriterium Fluoreszenz auch bestimmte morphologische Abweichungen untersucht werden.

Die vorliegende Studie hatte das Ziel, den kürzlich etablierten fluoreszenz-mikroskopisch modifizierten Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA) mit digitaler Imageanalyse (HELMS et al., 2002, LOEHMER, 2003), der auf dem fluoreszenzmikroskopischen SCSA von ACEVEDO (2000) basiert, bei der Spezies Pferd zu testen. Darüber hinaus galt es, den Spermienchromatinstatus in einer Population von Zuchthengsten zu erfassen und in Relation zu spermatologischen Standardparametern zu setzen. Die Prüfung eines Zusammenhanges zwischen der Chromatinstabilität und der Fertilität der verwendeten Hengste war ebenfalls Gegenstand der Untersuchungen.

Überprüfung des mfSCSAs auf Anwendbarkeit bei Hengstspermien:

In der vorliegenden Studie wurden zunächst die Kriterien nach OVERSTREET (1984) und MATSON (1997) an einen geeigneten Test im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit des mfSCSA geprüft.

In vorausgegangenen Untersuchungen, die sich mit der fluoreszenzmikroskopischen Modifizierung des SCSAs befassten, stellte sich vor allem die subjektive Klassifizierung der Rot-/Grünpopulation als Problem dar. Ausschlaggebend für diese Problematik war der für das menschliche Auge visuell schwer erfassbare Farbwechsel von Grün nach Rot (CLAASSENS et al. 1992, DURAN et al. 1998).

Mit Hilfe der computergestützten Analyse der Ausstriche durch das analySIS^® 3.0 Programm konnte dieser subjektive Einflussfaktor umgangen werden und eine eindeutige Klassifizierung der Spermien erfolgen.

In den Arbeiten von DURAN et al. (1998), ACEVEDO (2000) sowie ACEVEDO et al.

(2001) stellte das schnelle Verblassen der Ausstriche ein erhebliches Problem bei der Auswertung dar. Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen zeigte eine sechsmonatige Lagerung der gefärbten Ausstriche bei 5° C und unter Ausschluss von Sonnenlicht jedoch keinen Einfluss auf die Fluoreszenz. Ausschlaggebend für die Farbstabilität ist vermutlich die Verwendung von DMSO und DTT. Durch die Kombination dieser beiden Reagenzien wird der Zustand der freien Thiolgruppen nach der Dekondensation langfristig stabilisiert. Die Überprüfung des Chromatinstatus bei gefärbten Ausstrichen konnte somit zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen, ohne dass das Ergebnis verfälscht wurde. Zu diesem Resultat kommt auch BIEGE (2004) bei der Analyse von Rüdenspermien.

Eine weitere Unzulänglichkeit der mikroskopischen Objektträgermethode, die von EVENSON et al. (1999, 2002) beschrieben wurde, bestand in der ungleichmäßigen Anfärbbarkeit der einzelnen Ausstriche. Bei der Durchführung des mfSCSA wurde dieses Problem der inhomogenen Färbung stellenweise ebenfalls beobachtet (LOEHMER 2003). Dieser Fehler konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch umgangen werden, indem hochwertige Objektträger (Superfrost^®plus) verwendet

wurden und nur die Bereiche zwischen Mitte und Rand des Objektträgers zur Auswertung herangezogen wurden. In diesem Bereich stellte sich die Färbung homogen dar und führte zu reproduzierbaren Ergebnissen.

Im Hinblick auf die Praktikabilität des mfSCSAs wurde eine Vergleichsstudie zu dem flowzytometrischen Test (SCSA) angefertigt. Die hochsignifikante Korrelation zwischen den beiden Methoden (R^s = 0,78, p ≤ 0,05) bei nativ schockgefrorenen Samenproben wies ebenfalls darauf hin, dass der mfSCSA zur Bestimmung des Prozentsatzes chromatininstabiler Hengstspermien ein aussagekräftiger Assay ist.

Nach Meinung von EVENSON et al. (2002) sind die Ergebnisse der mikroskopischen und der flowzytometrischen Methode nur bei Samenproben mit einem Prozentsatz chromatininstabiler Spermien < 20 % vergleichbar. Der im Rahmen der vorliegenden Studie durchgeführte Methodenvergleich bei 42 Hengstejakulaten beinhaltete 11 Proben mit einem über 20 Prozent liegenden Anteil chromatininstabiler Spermien.

Bei der Untersuchung dieser Proben konnte ebenfalls nur eine mittelgradige Korrelation errechnet werden.

Einflüsse auf die Ergebnisse des mfSCSAs

Zur Überprüfung der Stabilität der mfSCSA-Färbung, wurde der Chromatinstatus in bereits gefärbten Nativ-Sperma-Ausstrichen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Die Ergebnisse der frisch gefärbten Ausstriche unterschieden sich nicht signifikant von den Ergebnissen nach sechsmonatiger Lagerung. BIEGE (2004) untersuchte ebenfalls die Aufbewahrungsmöglichkeit gefärbter Ausstriche. Hier stellte die Lagerung gefärbter Ausstriche von Rüdenspermien über einen Zeitraum von vier Wochen kein Problem dar. Die erste und zweite Auswertung ergaben annähernd identische Ergebnisse. Im Hinblick auf die Praktikabilität des mfSCSAs ist dies von Bedeutung, da die Auswertung gefärbter Ausstriche innerhalb eines großen Zeitfensters erfolgen kann.

Weiterhin wurde die Praktikabilität des mfSCSAs anhand verschiedener Konservierungsmöglichkeiten überprüft. Die vergleichende Betrachtung der Spermienchromatinstabilität zwischen Nativ-Sperma und nativ schockgefrorenem Sperma wies keinen Einfluss auf die Spermienchromatinstruktur auf. Die

Untersuchung des Spermienchromatinstatus von nativ und nativ zentrifugierten schockgefrorenen Proben ergab ebenfalls keinen signifikanten Unterschied. Hieraus ist abzuleiten, dass in flüssigem Stickstoff konservierte Nativsamenproben von Vorteil sind, da sie zu einem beliebigen Zeitpunkt weiterverarbeitet werden können.

LOEHMER (2003) und BIEGE (2004) kommen diesbezüglich in ihren Untersuchungen mit Bullen- bzw. Rüdenspermien zu gegensätzlichen Ergebnissen.

Bei ihnen liegt der Prozentsatz chromatininstabiler Spermien in schockgefrorenem Sperma signifikant unterhalb von dem nicht schockgefrorenem Nativsperma. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind kongruent zu den Ergebnissen der Arbeit von ELLINGTON et al. (1998), die ebenfalls keinen Einfluss der Schockgefrierung auf den Spermienchromatinstatus von nativen humanen Ejakulaten feststellen konnten.

Im Versuchsabschnitt „Verdünnung und Aufbewahrung über 48 Stunden“ wurde im Zeitverlauf ein abnehmender Mittelwert an chromatininstabilen Spermien festgestellt.

Die Ergebnisse der verdünnten Frischsamenproben (Aufbewahrung über 0,5 Stunden bei Raumtemperatur) korrelierten mit den Ergebnissen der Nativproben, jedoch lieferten die halbstündigen verdünnten Frischsamenproben im Schnitt niedrigere Werte an chromatininstabilen Spermien. Bei Lagerung der verdünnten Frischsamenproben über einen Zeitraum von 24 Stunden sank der Prozentsatz an chromatininstabilen Spermien weiterhin signifikant. Der mittlere prozentuale Anteil chromatininstabiler Spermien lag nach 0,5 Stunden bei 8,9 % und nach 24 Stunden bei 3,3 %. Der mittlere Prozentsatz chromatininstabiler Spermien nach Aufbewahrung über 48 Stunden unterschied sich nicht signifikant von dem Prozentsatz der 24 Stunden gelagerten Proben. Die Ergebnisse der TG-Sperma-Proben korrelierten signifkant mit den Ergebnissen der nativ schockgefrorenen Proben, jedoch kam es auch bei diesen Proben zu einer signifikanten Abnahme des mittleren Prozentsatzes chromatininstabiler Spermien. Die Anpassungszeit der Tiefgefrierpailletten hatte keinen nennenswerten Einfluss auf die Spermienchromatinstruktur.

Es scheint, dass die Aufbewahrungsdauer der verdünnten Proben ein methodisches Problem des mfSCSAs darstellt. Ebenso zeichnet sich ab, dass die Art des Verdünners eine Beeinflussung der Spermienchromatinstruktur zur Folge hat. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Studie sollten keine konservierten

Frischsamenproben bzw. TG-Sperma-Proben zur Diagnostik des Spermienchromatinzustandes im mfSCSA verwendet werden. Aus den Resultaten dieses Versuchsabschnittes ist abzuleiten, dass zur Diagnostik des Spermienchromatinstatus mit dem mfSCSA nur natives Sperma verwendet werden sollte, welches zuvor auch schockgefroren bei -196˚ C gelagert werden kann.

Einflüsse auf den flowzytometrischen SCSA

Um herauszufinden, ob verschiedene Konservierungsmethoden einen Einfluss auf den Spermienchromatinstatus im SCSA haben, wurden Samenproben von 10 Hengsten flowzytometrisch untersucht. Es war kein Unterschied zwischen nativ schockgefrorenen Proben und TG-Proben feststellbar. Auch eine Anpassungszeit der Pailletten bei 5 ° C über drei Stunden vor dem Tiefgefrieren hatte keinen Einfluss auf die Spermienchromatinstruktur. Die konservierten Frischsamenproben, die nach 24 und 48 Stunden analysiert wurden, hatten jedoch signifikant höhere Werte an chromatininstabilen Spermien im Vergleich zu den Nativproben. Es ist hier jedoch nicht klar zu unterscheiden, ob die Zunahme an DFI-Spermien bei gelagertem Frischsamen auf einen Lagerungs- oder ein Verdünnereinfluss beruht. SAMPER et al. (2000) berichteten ebenfalls über einen Einfluss von Verdünnermedien auf die Chromatinstruktur beim Pferd. Hier wurde durch den Einsatz eines Verdünners mit Milchzusatz der Anteil chromatinstabiler Spermien erhöht. Im Gegensatz dazu wiesen LOVE et al. (2002) bei Hengstspermien keinen Einfluss durch Verdünnung sowie Lagerung über 24 Stunden bei 5° C nach. Bei subfertilen Hengsten konnte jedoch schon nach einer Lagerungszeit von 20 bis 31 Stunden eine Abnahme der Chromatinstabilität verzeichnet werden.

KARABINUS et al. (1990) konnten beim Rind eine Beeinflussung des Chromatinstatus feststellen. Durch Zusatz von Milch im Gegensatz zu Eigelb wurde eine Zunahme des Anteils chromatininstabiler Spermien nach dem Auftauen bewirkt.

Auch SENGER et al. 1983 und SCHENK et al. 1987 berichteten über einen Verlust der Chromatinstabilität bei Verwendung eines Milch-Verdünners, der beim Einsatz eines Eidotter-Verdünners nicht auftrat. Der negative Einfluss der Milch bzw. ein

protektiver Effekt des Eidotters auf die Spermienchromatinstruktur ist ebenfalls Gegenstand der Studie von KARABINUS et al. (1991).

LOVE et al. (2005) untersuchten bei fertilen Hengsten zusätzlich den Einfluss verschieden hoher Seminalplasmaanteile. Hengste mit hohen Anteilen zeigten eine erhöhte Anfälligkeit zur Säuredenaturierung im flowzytometrischem Spemien-chromatinstruktur Assay.

Einfluss der Saisonalität auf die Spermienchromatinstruktur und konventionelle Samenparameter

In der vorliegenden Arbeit fiel der mittlere Prozentsatz chromatininstabiler Spermien der nativ schockgefrorenen Proben, im Verlauf der Jahreszeit deutlich ab:

Der Dezemberwert war signifikant höher als der Frühjahrs- bzw. Sommerwert.

Ähnliche Resultate lieferte die Studie von SPANÒ et al. (1998). Hier konnte anhand von Untersuchungen an humanen Spermien ein unerklärlicher jahreszeitlich signifikanter Einfluss auf die Spermienchromatinstruktur evaluiert werden. Die von SPANÒ et al. (1998) untersuchten Ejakulate aus Herbst und Winter wiesen deutlich höhere DNA-Fragmentation-Indices auf, als Ejakulate aus den Frühjahrsmonaten.

Beim Hengst wäre dieser jahreszeitliche Unterschied durch die vorhergehende Deckpause (August bis Dezember) oder durch saisonale Einflüsse auf die Spermaqualität erklärbar.

KRIENKE (2003) untersuchte den jahreszeitlichen Einfluss bei Tiefgefriersperma von Equiden und konnte keine signifikante Beziehung der Spermienchromatinstruktur zu den verschiedenen Jahreszeiten herstellen. Dies änderte sich durch Inkubation der aufgetauten Samenproben über drei Stunden bei 37° C. Nach diesem Prozess war der Prozentsatz chromatininstabiler Spermien der Frühjahrsproben signifikant höher als bei den Winterproben. Eine Studie von EVENSON et al. (1999), die sich auf die Untersuchung von Tiefgefriersperma von Männern direkt nach dem Auftauen fokussierte, erbrachte vergleichbare Ergebnisse, d.h. hier konnte ebenfalls kein saisonaler Einfluss auf den Chromatinstatus dokumentiert werden.

Die in der vorliegenden Studie durchgeführten Untersuchungen zur Saisonalität der konventionellen spermatologischen Ejakulatparameter, sowie der Thermoresistenz erbrachten folgende Ergebnisse:

Bei der Untersuchung der initialen Motilitäten der Ejakulate konnte kein saisonaler Einfluss erhoben werden. Dieses Ergebnis spiegelt sich in den Daten von PICKETT et al. (1975), CLAY et al. (1987) und PICKETT (1993) wieder, die ebenfalls keinen saisonalen Effekt auf die Bewegungsaktivität equiner Spermien feststellen konnten.

Im Gegensatz dazu wiesen die hier untersuchten Halteproben nach 24 Stunden Aufbewahrung bei 5° C einen signifikanten Unterschied zwischen den Winter- und Frühjahrsproben, wie auch zwischen den Winter- und Sommerproben auf. Die Bewegungsaktivität der 24 Stunden Proben im Sommer war deutlich und hoch signifikant niedriger als die der Winterproben. Die Motilität der Halteproben war nach 48 h Lagerung bei 5° C zwischen den untersuchten Jahreszeiten hoch signifikant unterschiedlich.

Mit Beginn der Decksaison konnten HOFFMANN und LANDECK (1999) einen Anstieg der Motilität bei Hengstspermien feststellen, die sie auf den hormonellen Einfluss des Testosterons zurückführen. Im Einklang dazu stehen die in der vorliegenden Studie ermittelten Ergebnisse. Die Untersuchungen der Motilitäten der 48 Stunden Proben lieferten vergleichbare Ergebnisse. Bei den initial untersuchten Motilitäten und den 24 Stunden-Halteproben konnte kein signifikanter Anstieg der Motilitäten dokumentiert werden.

Neben Motilitätsparametern werden im Hinblick auf saisonale Einflüsse auch morphologische Veränderungen an Spermien kontrovers diskutiert. BLOTTNER et al.

(2001) berichten über keinen Einfluss einer Deckpause auf den Anteil morphologisch veränderter Spermien. Im Gegensatz dazu führten PICKETT et al. (1975) den im Winter erhöhten Anteil morphologisch veränderter Spermien auf die veränderte Zusammensetzung des Seminalplasmas während der Deckpause zurück.

In der vorliegenden Studie stieg der prozentuale Anteil an Spermien mit Kopfveränderungen von Dezember bis März, bzw. Juli an. Jedoch konnten bei dem prozentualen Anteil an Spermien mit Kopfveränderungen saisonal keine signifikanten saisonalen Unterschiede festgestellt werden. Bei dem Anteil gesamtmorphologisch abweichender Spermien war ein signifikanter Unterschied zwischen den März- und

den Winterproben vorhanden. Der Vergleich der Juli- und Dezember-Ejakulate lag knapp oberhalb der Signifikanzgrenze. Die Forschungsergebnisse aus der Beurteilung der Gesamtheit morphologisch veränderter Spermien, brachte konforme Ergebnisse zu PICKETT et al. (1975).

Der Thermoresistenztest, der als zusätzliche Spermienfunktionsprüfung herangezogen wurde, lieferte ergänzende Erkenntnisse zu den Motilitäten der Ejakulate. Die im Rahmen dieses Tests in Bezug zur Saisonalität erfassten Daten zeigten, dass der Sommerwert signifikant niedriger war, als der Winter- und der Frühjahrswert. Zwischen den Frühjahrs- und Winterdaten hingegen bestand kein signifikanter Unterschied. Bei der Betrachtung des Rückgangs des prozentualen Mittelwertes der initialen Motilität vom Winter zum Sommer zeichnen sich hier Parallelen zu den Ergebnissen des Thermoresistenztests ab.

Bei der Betrachtung der arithmetischen Mittelwerte aus den drei Jahreszeiten ergaben sich folgende Zusammenhänge zwischen der Spermienchromatinstruktur und konventionellen spermatologischen Parametern. Der Mittelwert der initialen Motilität, als auch der Mittelwert des prozentualen Anteils morphologisch intakter Samenzellen, korrelierten negativ mit dem Prozentsatz chromatininstabiler Spermien im Nativ-Sperma.

KENNEY et al. (1995) kamen zu dem Ergebnis, dass zwischen der Vorwärtsmotilität und dem Anteil chromatininstabiler Spermien eine negative signifikante Beziehung vorhanden ist. Auch bei Bullen- und Humanspermien konnte eine Beziehung des Anteils morphologischer Veränderungen sowie der Motilität auf die Spermienchromatinstruktur aufgezeigt werden (EVENSON und KARABINUS, 1991;

GUENIAT VON COURROUX 1988). Im Gegensatz dazu konnte LOEHMER (2003) lediglich eine schwache Korrelation zu dem Anteil der Spermien mit sekundären Schwanzveränderungen finden. Zur Motilität konnte in ihrer Studie keine Korrelation gefunden werden. Untersuchungen an caninen Spermien zeigten signifikante Beziehungen zwischen der Vorwärtsmotilität und dem Gesamtanteil morphologisch abweichender Spermien (BIEGE 2004). Positive signifikante Korrelationen zwischen der Spermienmorphologie und dem Anteil chromatininstabiler Spermien konnten ebenfalls bei der Katze beschrieben werden (PENFOLD et al. 2003). TEJADA et al.

(1984) und EVENSON und KARABINUS (1991) stellten eine positive Korrelation der

abweichenden Kopfmorphologie zu dem Anteil chromatininstabiler Spermien dar.

Widersprüchliche Ergebnisse dazu lieferten Untersuchungen an Mäusen (BALLACHEY et al. 1986), beim Rind (HAMMADEH et al. 1996) und beim Menschen (SPANÒ et al. 2000). Diese Autoren konnten keine Wechselbeziehungen zwischen Samenqualitätsparametern und der Spermienchromatinstruktur verzeichnen.

Spermienchromatinstatus sowie selektierte konventionelle Spermienparameter in Bezug zur Fertilität

Eine Reihe von Studien diskutieren verschiedene Methoden, um die Fertilität von Hengsten genauer beurteilen zu können. Dabei zeigt sich oft die Problematik der limitierten Anzahl von untersuchten Hengsten, sowie der geringen Anzahl Stuten, die den einzelnen Hengsten zugeführt wurden. Darüber hinaus resultiert aus der nicht genormten Durchführung der verschiedenen Tests ein erheblicher Einflussfaktor, so dass die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zum Teil nicht gegeben ist.

Drei Faktorenkomplexe sind bestimmend für das Besamungsresultat:

Fertilität des männlichen Tieres, Fertilität des weiblichen Tieres und

äußere Einflüsse, wie z.B.: Alter der Tiere, Umweltbedingungen, Management (AMANN und HAMMERSTEDT 2002).

Eine Beziehung zwischen einzelnen spermatologischen Qualitätskriterien und den Befruchtungsresultaten ist daher oft schwer nachweisbar. Dafür ist auch die Tatsache verantwortlich, dass im Besamungseinsatz üblicherweise hohe Spermienzahlen verwendet werden. Hohe Spermienzahlen können bestimmte Spermienschäden kompensieren, so dass diese sich nicht in einer verminderten Befruchtungsleistung zeigen. Typischerweise gelten Spermienchromatinschäden als nicht-kompensierbare Spermienmängel, da - wie bis vor kurzem vermutet wurde – chromatindefekte Spermien mit ungestörter Motilität und Morphologie in der Lage sind, die Eizelle zu erreichen und sie zu befruchten. Folge ist eine erhöhte frühembryonale Mortalität (STOLLA 1984, SAACKE et al. 1988).

Neueren Ergebnissen zufolge sind chromatindefekte Spermien in ihrer Fähigkeit sich an das Oviduktepithel zu binden und somit an der Etablierung des funktionellen Spermienreservoirs teilzuhaben, reduziert. Die Chancen, die Eizelle zu erreichen und zu befruchten sind für diese Spermien demzufolge vermindert (ARDON 2005).

Zahlreiche Autoren kommen zu dem Ergebnis, dass das konzentrierte Auftreten chromatindefekter Spermien in einem Ejakulat ursächlich für eine Reduzierung der Fruchtbarkeit ist (EVENSON et al. 1980a, TEJADA et al. 1984, IBRAHIM et al. 1988, BALLACHEY et al. 1988).

Um den Zusammenhang des Spermienchromatinstatus und der Befruchtungs-fähigkeit der in der vorliegenden Studie verwendeten Hengste zu prüfen, wurden verschiedene Fertilitätsdaten herangezogen. Es ließ sich eine signifikante negative Korrelation (R= -0,3) zwischen der Chromatinstabilität und der Trächtigkeitsrate pro Saison ermitteln.

Einige wissenschaftliche Studien stellen die Spermienchromatinstruktur aufgrund der kaum nachweisbaren Korrelation zur konventionellen Spermatologie als unabhängigen und prognostisch wertvollen Fertilitätsparameter dar (SPANÒ et al., 1998; EVENSON et al., 1999; LARSON et al., 2000). LOVE und KENNEY,(1998) sowie LOVE (2005) dokumentieren den negativen Zusammenhang zwischen Fertilität und Spermienchromatinstruktur beim Hengst.

Unter den konventionellen spermatologischen Parametern ließ sich lediglich eine Beziehung zwischen den Ergebnissen des Thermoresistenztests und der Fertilität ermitteln. Eine Erweiterung des spermatologischen Untersuchungsspektrums über die Motilität und Morphologie hinaus ist daher für eine verbesserte Fertilitätsprognose von Zuchthengsten indiziert.

Der mittlere Prozentsatz an DFI-Spermien in den nativ schockgefrorenen Proben dieser Studie lag bei 12,6 %, bei einer vergleichsweisen hohen interindividuellen Variabiltät von 3 bis 37 % DFI. Damit liegen die DFI-Werte von Hengsten auf einem höheren und variableren Niveau als die von stärker auf Fruchtbarkeit selektierten Bullen (LOEHMER, 2003) und Ebern (VOLKER, 2004).

SPANÒ et al. (1998) konnten zusätzlich eine Beziehung zwischen dem Alter von Männern und dem Chromatinstatus ihrer Spermien feststellen. Eine Abhängigkeit zum Alter der Tiere wiesen ebenso KARABINUS et al. (1990) in einer Studie bei

Bullen nach. Untersuchungen von KRIENKE (2003) an Tiefgefriersamenproben von Hengsten, kamen zu gleichartigen Ergebnissen. Hier wurde eine mittlere Korrelation zwischen dem DNA-Fragmentation-Index (DFI)-Mittelwert und dem Alter beschrieben. Hinsichtlich des Alters der Hengste war in dieser Studie kein Zusammenhang zum Chromatinstatus sichtbar.

Schlussfolgerung

Anhand der vorliegenden Ergebnisse lassen sich folgende Schlussfolgerungen für die Anwendbarkeit des mfSCSAs bei Hengstspermien ziehen:

Der mfSCSA erfüllt alle Anforderungen an einen reproduzierbaren Test zur Untersuchung der Stabilität der Hengstspermien-DNA gegenüber saurer Denaturierung in situ.

Für die Durchführung des mfSCSAs kann natives oder nativ, schockgefrorenes (-196˚ C) Hengstsperma verwendet werden. Verdünnte Frischsamenproben und TG-Proben sind für die Diagnostik mit dem mfSCSA nicht geeignet.

Der mfSCSA führt zu vergleichbaren Ergebnissen wie die flowzytometrische Methode bei der Verwendung von Nativ-Sperma (DFI < 20 %).

Im Gegensatz zum SCSA können beim mfSCSA einzelne Spermien individuell beurteilt werden, wobei der mögliche Einfluss der Färbung auf die Formabweichungen der Spermien zu berücksichtigen ist.

Weiterhin wird geschlussfolgert, dass:

Im flowzytometrischem SCSA nativ schockgefrorenes und TG-Sperma vergleichbare Ergebnisse liefern.

Der Anteil chromatininstabiler Spermien war im Winter signifikant höher als im Frühjahr und im Sommer.

Es bestand ein statistisch relevanter Zusammenhang zwischen der initialen Motilität sowie der morphologischen Abweichungen und der Spermienchromatinstruktur.

Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil chromatininstabiler Spermien und den von den Hengsten erzielten Trächtigkeitsraten pro Saison.

Die Ergebnisse des SCSAs haben fertilitätsprognostisches Potenzial. Die Genauigkeit der Fertilitätsprognose ist vermutlich steigerbar, wenn gleichzeitig andere spermatologische Parameter, unter Einbezug der modernen flowzytometrischen Möglichkeiten, berücksichtigt werden. Ferner wäre die Untersuchung der Variabilität des Chromatinstatus zwischen Ejakulaten individueller Hengste aufschlussreich.

6 Zusammenfassung

Heinke Thießen

Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Spermienchromatinstruktur beim Hengst

Ziel dieser Arbeit war es, den modifizierten fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA, HELMS et al., 2002, LOEHMER, 2003) für Hengstspermien zu testen. Hierzu wurden methodische Einflüsse auf den mfSCSA und Beziehungen der Spermienchromatinstruktur zu ausgewählten Parametern der konventionellen Spermatologie sowie zur Fertilität untersucht.

Diese Arbeit gliedert sich in verschiedene Teilbereiche:

Die Reproduzierbarkeit des mfSCSA wurde durch doppelte Auswertung von 32 Proben und zweimaliger Durchführung des mfSCSAs an identischen

Die Reproduzierbarkeit des mfSCSA wurde durch doppelte Auswertung von 32 Proben und zweimaliger Durchführung des mfSCSAs an identischen

Im Dokument Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Spermienchromatinstruktur beim Hengst (Seite 73-115)