3 Materialien und Methoden
3.4 Methodik des mfSCSAs
3.4.1 Protokoll des mfSCSAs
Auf der Basis der fluoreszenzmikroskopischen Arbeiten von DIGRASSIE (2000) und ACEVEDO et al. (2001) entwickelten HELMS et al. (2002), sowie LOEHMER (2003) den fluoreszenmikroskopischen Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA).
Die Auswertung der mfSCSA Ergebnisse erfolgte nach der Methode von Helms et al.
(2002) und LOEHMER (2003) unter Verwendung des Software-Programms analySIS® Version 3.0 (Soft Imaging System GmbH, Münster).
Das Protokoll des mfSCSA ist in mehrere Abschnitte gegliedert:
a) Verwendete Spermien
• Nativ-Sperma
• Nativ-Sperma in flüssigem Stickstoff schockgefroren (die Eppendorfgefäße wurden für 2 Minuten in einem 38° C warmem Wasserbad aufgetaut)
• Nativ-Sperma zentrifugiert, dekantiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren
• verdünnte Frischsamenproben (Verdünner INRA 82)
• Tiefgefrierpailletten (Auftauprozess: 30 Sek. in einem 38° C warmen Wasser-bad)
b) Vorbereitung der Samenproben
Die nativen und die nativ schockgefrorenen Proben (nach o.g. Auftauverfahren) wurden auf 100 Mio. Samenzellen/ml mit 2,9 % Natriumzitratpuffer verdünnt.
Ein Teil der nativen Samenproben wurde erst für 10 Minuten bei 600 g zentrifugiert anschließend dekantiert und schockgefroren.
Von den Frischsamenproben (50 Mio. Samenzellen/ml) sind jeweils 2 ml entnommen, und im Verhältnis 1:4 mit Natriumzitratpuffer 2,9 % versetzt worden. Für die Untersuchung des Tiefgefrierspermas wurden pro Ejakulat zwei Pailletten á 0,5 ml (100 Mio. Samenzellen/ml) aufgetaut und ebenfalls mit Natriumzitratpuffer 2,9%
im Verhältnis 1:4 versetzt worden.
Der weitere Verlauf der Probenverarbeitung war bei allen Proben, wie folgend beschrieben, identisch:
Die Samensuspensionen wurden in Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 2700 g und 20° C für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen, das Pellet mit 2 ml Natriumzitratpuffer 2,9 % resuspendiert und erneut unter o.g.
Bedingungen zentrifugiert. Der „Waschprozess“ wurde dreimal wiederholt.
Beim letzten Waschdurchgang wurde der Überstand bis auf ca. 100 µl abgegossen und erneut resuspendiert. Von dieser Resuspension wurden 50 µl entnommen und auf einem Superfrost®plus Objektträger ausgestrichen. Die Ausstriche wurden mit einem lösungsmittelfreien Stift (Securline®Marker II, Precision Dynamics Corporation, USA) beschriftet und anschließend bei Zimmertemperatur luftgetrocknet (10 Min.).
Von jeder Probe wurden zwei Ausstriche angefertigt.
c) Dekondensation des Spermienchromatins
Die Lösungen zur Dekondensation und Denaturierung des Spermienchromatins sind unter einem Abzug hergestellt worden. Eine Atemschutzmaske und Gummihandschuhe wurden zusätzlich als Schutzmaßnahme getragen.
Im ersten Schritt wurden 0,0386 g 1,4-Dithiothreit (DTT) auf einer Laborwaage abgewogen, in ein Becherglas gegeben und in 50 ml Natriumzitratpuffer (2,9 %) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 5 mmol/l 1,4-Dithiothreit ergab. Im zweiten Schritt wurde DMSO (1 mmol/l) mit Aqua bidest (1,75 mmol/l) gesättigt. Dazu wurden 3550 µl DMSO (50 x 71 µl, entspricht 50 x 1 mmol DMSO) und 1550 µl Aqua
bidest (50 x 1,75 x 18 µl, entspricht 50 x 1,75 mmol Aqua bidest) in einen Erlenmeyerkolben gegeben. Der Anteil DMSO wurde mit dem Anteil Aqua bidest durch Schwenken vermischt. Zwischen den beiden Reagenzien kam es nach Vermischung zu einer exothermen Reaktion. Nach deutlichem Abkühlen des Erlenmeyerkolbens wurde das Gemisch der DTT-Lösung zugegeben und mit dieser vermischt. Die Haltbarkeit der hergestellten Arbeitslösung belief sich dabei auf 24 Stunden.
Die waagerecht gelagerten Objektträger wurden nun jeweils mit 2 ml der Lösung beschichtet.
Nach einer Einwirkzeit von 40 Minuten wurde die Arbeitslösung von den Objektträgern der Reihe nach abgegossen, die überschüssige Lösung mittels eines Becherglases aufgefangen und die einzelnen Objektträger mit Natriumzitratpuffer 2,9 %, der in einer Plastikspritzflasche abgefüllt war, abgespült. Im Anschluss daran wurden die Objektträger für 10 Minuten in eine ebenfalls mit Natriumzitratpuffer 2,9 % gefüllte Färbeküvette zum Spülen gestellt (Pufferspülbad).
Nach dem Pufferspülbad wurden die Objektträger aus der Färbeküvette entnommen und die Rückseite mit Zellstoff abgetupft. Anschließend wurden die Objektträger auf eine saugfähige Unterlage senkrecht aufgestellt, um dann bei Zimmertemperatur für ca. 10 Minuten an der Luft zu trocknen.
d) Säuredenaturierung
Die luftgetrockneten Objektträger wurden für 100 Minuten in eine Färbeküvette mit Carnoy`s Solution (pH-Wert 2) gestellt. Diese Säuredenaturierung erfolgte in einem abgedunkeltem Raum, d.h. ohne direkte Sonneneinstrahlung.
Mit Beginn der Säuredenaturierung durften die Ausstriche keinem UV-Licht mehr ausgesetzt werden.
Nach Ablauf der 100 Minuten wurden die Objektträger aus der Küvette entnommen und unter einem Abzug kurz luftgetrocknet.
e) Acridin Orange Färbung
Das Ansetzen der Färbelösung sowie der Färbevorgang erfolgten in Dunkelheit. Für die Acridin Orange Färbung wurden
40 ml Zitronensäurelösung (gekühlt, +5° C)
2,5 ml Di-Natriumhydrogenphosphat-Lösung (gekühlt, +5° C) und 10 ml Acridin Orange-Stammlösung (gekühlt, +5° C, dunkel gelagert)
in einer gekühlten Färbeküvette gut vermischt. Zur Abkühlung der Färbeküvetten wurden diese 15 Minuten vor Ablauf der Säuredenaturierung in einen Eisschrank gestellt.
Die Ausstriche sind für 14 Minuten in die Färbeküvette gesetzt worden. Nach Ablauf der Färbezeit wurden die Objektträger der Reihe nach der Färbeküvette entnommen und deren Rückseiten mit Zellstoff abgetrocknet. Um überschüssige Farbreste abzuspülen, wurden die Ausstriche anschließend für 8 Minuten in eine Färbeküvette mit Natriumzitratpuffer 2,9 % (gekühlt, +5° C) gestellt. Im Anschluss an das Spülbad wurden die Ausstriche der Küvette entnommen, die Rückseiten der Objektträger mit Zellstoff abgetupft und auf einer saugfähigen Unterlage für 10 Minuten luftgetrocknet.
Die Aufbewahrung der Ausstriche erfolgte in Objektträgerkästen bei +5° C unter Ausschluss von Licht.
f) Auswertung der Ausstriche
Zur Auswertung wurde ein Fluoreszenzmikroskop „Axioskop“ der Fa. Zeiss, Germany verwendet. Es wurde eine 400-fache Vergrößerung (40-er Objektiv), Phase 2 und blaues Laserlicht (490 nm ) benutzt, dabei wurde Licht der Wellenlänge 530 nm (grün
= doppelsträngige DNA), sowie 640 nm (rot = einzelsträngige DNA) emissiert. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einer Digitalkamera (Olympus DP 50) aufgenommen.
Die Kamera wurde mit einem Computer vernetzt, so dass die Bilder über das Software-Programm analySIS® Version 3.0 der Fa. Soft Imaging System GmbH, Deutschland, Münster ausgewertet werden konnten.
Zur Auswertung wurde nur der Bereich zwischen der Mitte und dem Rand der Ausstriche herangezogen. Es wurden ca. 400 Spermien pro Ausstrich analysiert.
g) Festlegung der Grundeinstellungen am Fluoreszenzmikroskop, der Digital-kamera und dem Computersystem zur Standardisierung
Die Grundeinstellungen der Digitalkamera für Fluoreszenzaufnahmen, sowie die Kalibrierung der Olympus Camera DP 50 auf die verschiedenen Objektive des Fluoreszenzmikroskops „Axioskop“ (Zeiss, Germany) wurden von einem Mitarbeiter der Fa. Olympus durchgeführt.
Das digitalisierte fluoreszenzmikroskopische Bild wurde als „LIVE-BILD“ auf dem Monitor des Computers dargestellt und unmittelbar zur Analyse herangezogen (s.
Abb. 4).
Grundeinstellungen:
-Kalibrierung:
Um ein geeichtes „LIVE-BILD“ auf dem Monitor erfassen zu können, musste das Bild der Digitalkamera mit dem Bild des Fluoreszenzmikroskops auf ein Maß gebracht werden. Dieser Vorgang wird als Kalibrierung bezeichnet und muss für jedes einzelne Objektiv (20 er, 40 er und 100 er Objektiv) vorgenommen werden.
-Bildqualitätsparameter:
Die Lichtempfindlichkeit der Digitalkamera für die Fluoreszenzaufnahmen wurde auf ISO 400 eingestellt, bei einer Belichtungszeit von 300 ms. Die Fluoreszenzbilder wurden mit der höchsten Auflösung der Kamera aufgenommen „SUPER HIGH QUALITY“ (2776 x 2074 Pixel) und in einer unkomprimierten „TIFF-Datei“
abgespeichert.
Zur Reduktion von Farbstichen in Echtfarbbildern dient der Bildparameter „Manueller Weißabgleich“. Dieser Parameter besteht aus drei Korrekturfaktoren (Rot, Grün und Blau) die für alle Aufnahmen gleichbleibend eingestellt wurden. Nach Erstellung eines Bildes wurde der Vergrößerungsfaktor in µm gesetzt.
-Klassifizierung definieren: (Erstellung eines Klassifikationsschemas):
Dieser Befehl legt ein Klassifikationsschema fest. Eine Klasse ist ein Wertebereich innerhalb eines Schemas, der durch einen oberen und unteren Grenzwert definiert wird. Zur Auswertung des mfSCSA wurden zwei Klassen definiert:
Klasse 1 beschrieb den Anteil an einsträngiger DNA (ssDNA = single stranded DNA) und wurde durch die Farbe Rot definiert
Klasse 2 bildete den Anteil doppelsträngiger DNA (dsDNA = double stranded DNA) und wurde in der Farbe Grün dargestellt.
-Messung definieren:
Alle im „LIVE-BILD“ dargestellten Partikel wurden auf ihre Klassen- und Partikelzugehörigkeit hin analysiert. Somit war es möglich Spermien innerhalb des detektierten Bildabschnitts zu identifizieren und einer Klasse zuzuordnen. Die Einstellungen für die Messungen der Klassenzugehörigkeit wurden definiert, so dass die rot, bzw. grün dargestellten Spermien der jeweiligen Klasse zugeordnet werden konnten. Die Menge an Spermien der einzelnen Klassen wurde in Prozent angegeben. Für jedes „LIVE-BILD“ wurden die Rot- und Grüngehalte der Klassen, sowie die durchschnittliche Farbsättigung und -intensität bestimmt.
-Detektion definieren:
Diese Programmanweisung dient der Festlegung der für die Detektion wichtigen Kriterien. Um Artefakte auszuschließen wurde eine minimale Anzahl an Pixeln für den zu detektierenden Bildabschnitt festgelegt. Außerdem wurde der Bereich, die Darstellung und die Durchführung der Detektion definiert. Die gefundenen Partikel wurden im Bild-Overlay farbig markiert. Dabei wendete das System die aktuelle Klassifizierung automatisch an. Die Klassifizierung bestimmte bei der Detektion die farbliche Darstellung der Partikel. Die Ergebnisse wurden in Form einer Excel-Tabelle ausgegeben.
-Farbschwellwertdatei erstellen:
Um eine standardisierte Detektion zu ermöglichen, wurden Farbschwellwertdateien erstellt (siehe Anhang). Hierzu wurde durch mindestens eine rote und eine grüne
Zelle ein s.g. Intensitätsprofil angelegt. Das Intensitätsprofil gibt Auskunft über den jeweiligen Rot-, bzw. Grünanteil der erfassten Zellen. Die Erstellung des Intensitätsprofils im digitalisierten Bild wurde abhängig von der Anordnung der Spermien horizontal oder polygonal durchgeführt (s. Abb. 5 und Abb. 6). Unter der Funktion „Farbschwellwerte setzen“ wurden im RGB-Feld für beide Zellpopulationen die Messwerte, d.h. die im Overlay des Intensitätsprofils dargestellten Rot- und Grünanteile, eingegeben. Die Vorschau der Detektion erfolgte dann für alle im digitalisierten Bild erfassten Zellen (s. Abb. 7). Die so erstellten Farbschwellwertdateien wurden anschließend als Standarddateien abgespeichert.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Daten mit drei verschiedenen Farbschwellwertdateien ausgewertet:
mit der „normalen Standarddatei“ für normal gefärbte Ausstriche, bei der die roten Samenzellen einen Farbanteil von 1/3 grün und 2/3 rot aufwiesen und die grünen Samenzellen jeweils zur Hälfte grüne und rote Farbanteile besaßen;
mit der „grünen Standarddatei“ für grünlichere Ausstriche, bei denen die rote Spermienpopulation niedrigere Rotwerte und höhere Grünanteile aufwies und mit der „roten Standarddatei“ für rötliche Ausstriche, bei denen die rote
Population erhöhte Rotanteile besaß.
Die Farbanteile der grünen Samenzellen waren bei den grünlicheren und bei den rötlicheren Ausstrichen unverändert, d.h. jeweils zur Hälfte grün und rot (siehe optimale Ausstriche). Die zur Detektion des digitalisierten Bildes nötige Datei wurde aufgerufen und die Detektion durchgeführt. Die gefundenen Partikel erschienen im Bild-Overlay farbig markiert, beziffert und wurden als Klassenergebnisse in einer Tabelle ausgewiesen. Die Klassenergebnisse konnten daraufhin direkt in eine Excel-Tabelle übertragen werden.
Abbildung 4: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: mfSCSA-Fluoreszenz-Live-Bild (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)
Abbildung 5: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: horizontales Farbintensitätsprofil (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)
Abbildung 6: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: polygonales Farbintensitätsprofil (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)
Abbildung 7: Computerisierte Auswertung des mfSCSA unter Verwendung des analySIS® Programms Version 3.0: detektiertes Fluoreszenz-Live-Bild mit digitalem Overlay (grüne Spermien = chromatinstabil, rote Spermien = chromatininstabil)