(Leiter: Prof. Dr. med. Krug)
des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin
Einfluß von porcinem Surfactant auf die Expression von T-Zell Zytokinen nach segmentaler Allergenprovokation bei
allergischen Asthmatikern
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Andreas Hagenberg aus Berlin
Hannover 2005
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 10.07.2006
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Norbert Krug
Referent: Prof. Dr. Reinhold Förster
Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Andreas Schapowal
Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2006
Promotionsausschußmitglieder: Prof. Dr. Alexander Kapp
Prof. Dr. Burkhard Wippermann
Priv.-Doz. Dr. Stefan Kubicka
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1 Asthma bronchiale... 1
1.1.1 Pathophysiologie ... 1
1.1.2 Bedeutung der T-Zell Zytokine ... 3
1.2 Bedeutung des pulmonalen Surfactant beim Asthma bronchiale... 5
1.2.1 Zusammensetzung, Aufbau und Funktion des Surfactantfilms... 5
1.2.2 Surfactantdysfunktionen beim Asthma bronchiale... 8
1.2.3 Therapeutische Ansätze durch Surfactantsubstitution... 9
1.3 Fragestellung ... 10
2. Methoden... 12
2.1 Studiendesign ... 12
2.2 Probanden ... 13
2.2.1 Ein- und Ausschlußkriterien... 13
2.2.2 Voruntersuchung ... 14
2.3 Surfactantpräparate... 17
2.4 Endobronchiale segmentale Allergenprovokation ... 18
2.4.1 Prinzip der segmentalen Allergenprovokation ... 18
2.4.2 Durchführung der Surfactantbehandlung und Allergenprovokation ... 19
2.5 Intrazelluläre Zytokindetektion ... 20
2.5.1 Prinzip der intrazellulären Zytokinfärbung ... 20
2.5.2 Durchführung der intrazellulären Zytokindetektion... 21
2.6 Detektion der Zytokine IFN-γ, IL-5, IL-9 in der BAL... 24
2.7 Statistik ... 25
3. Ergebnisse ... 27
3.1 Klinische Parameter... 27
3.2 BAL-Rücklauf (Recovery) ... 28
3.3 Differentialzellbild der BAL ... 28
3.4 T-Zell Subpopulationen... 32
3.5 Intrazelluläre Zytokinproduktion von T-Lymphozyten... 33
3.5.1 CD4+ T-Lymphozyten ... 33
3.5.2 CD8+ T-Lymphozyten ... 33
3.6 Zytokinkonzentrationen in der BAL ... 37
4. Diskussion... 40
5. Zusammenfassung ... 47
6. Literaturverzeichnis ... 49
7. Anhang... 58
7.1 Lebenslauf ... 58
7.2 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 ... 59
7.3 Publikationen ... 60
7.4 Danksagung ... 61
1. Einleitung
1.1 Asthma bronchiale
1.1.1 Pathophysiologie
Asthma bronchiale ist eine häufige Erkrankung im Kindes- und Erwachsenenalter mit einer zunehmenden Prävalenz insbesondere in der westlichen Welt (1,2). Aus heutiger Sicht ist das Asthma bronchiale eine chronische Entzündungsreaktion der Bronchien, bei der eosinophilen Granulozyten und T-Lymphozyten eine zentrale Rolle zukommt.
Lymphozyten sind beim immunologisch Gesunden für die Ausprägung einer angepaßten Immunantwort auf exogene Stimuli verantwortlich. Diese Reaktionen des Immunsystems sind üblicherweise selbstlimitierend und hinterlassen keine bleibenden Schäden. Die Lymphozyten lassen sich in zwei verschiedene Untergruppen einteilen, die der B- und die der T-Lymphozyten, wobei die letztere aus CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxischen T-Zellen besteht. Die CD8+ T-Zellen interagieren mit MHC Klasse I Molekülen, über die prozessierte, endogene Antigene präsentiert werden. Wenn ihnen dabei von einer Zelle ein Antigen präsentiert wird, auf das sie spezialisiert sind, können sie die betreffende Zelle direkt zerstören. Damit sind die CD8+ T-Zellen die Akteure der zellgetragenen Immunantwort, die sie durch Sekretion von Botenstoffen zusätzlich beeinflussen können.
Die CD4+ T-Lymphozyten spielen durch Beeinflussung der antikörperproduzierenden B-Zellen eine zentrale Rolle bei der humoralen Abwehr. Sie erkennen fremde Antigene, z.B. über die Bronchialschleimhaut aufgenommene Allergene, die von spezialisierten, antigenpräsentierenden Zellen, hier meist dendritischen Zellen, über MHC Klasse II Moleküle präsentiert werden. Diese Antigenpräsentation, bei der zusätzlich eine Reihe akzessorischer Signale nötig sind, löst eine selektive Aktivierung der antigenspezifischen T-Helferzellen aus (3). Daraufhin sind diese Zellen in der Lage, Botenstoffe, sogenannte Zytokine, zu sezernieren, welche die weitere Immunreaktion steuern (siehe Abbildung 1).
Es wurden zwei distinkte T-Helfer-Subklassen mit einem bestimmten Zytokinspektrum beschrieben (4): Th1-Zellen produzieren IFN-γ und IL-2, Th2-Zellen u.a. IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13. Die Th2 Zytokine sind beim Menschen für die allergische Entzündung von besonderer Bedeutung, da sie, neben vielen anderen Effekten, sowohl die IgE-Produktion erhöhen, als auch den Einstrom von eosinophilen Granulozyten in die Bronchial- schleimhaut verstärken, was beides zentrale Befunde beim Asthma sind. Die chronische
Atemwegsentzündung des allergischen Asthma bronchiale wird von aktivierten T-Helfer- zellen aufrechterhalten (5,6). Das nach dem initialen Allergenkontakt unter dem Th2 Einfluß vermehrt gebildete allergenspezifische IgE bindet an den hochaffinen IgE-Rezeptor der Mastzellen. Ein erneuter Allergenkontakt führt dann über eine Quervernetzung der IgE-Rezeptoren durch das IgE-gebundene Allergen zu einer Mastzelldegranulation. Während dieser asthmatischen Sofortreaktion werden zahlreiche Mediatoren (u.a. Histamin und Leukotriene) freigesetzt, die zu den Symptomen des akuten Asthmaanfalls mit Hyperkrinie, Bronchospasmus und Schleimhautödem führen.
Abbildung 1: Allergische Entzündung beim Asthma bronchiale
Abkürzungen: Th: T-Helferzelle; DZ: dendritische Zelle; Eo: eosinophiler Granulozyt; MZ: Mastzelle; B: B-Lymphozyt;
Ez: Epithelzelle; IL: Interleukin
Eine in den asthmatischen Atemwegen sehr zahlreich auftretende Effektorzelle ist der eosinophile Granulozyt (Eosinophiler). Sowohl bei symptomatischen, als auch bei asymptomatischen Asthmatikern kann eine erhöhte Anzahl Eosinophiler und ihrer Produkte gefunden werden. Diese Produkte (basische Proteine, Sauerstoffradikale, etc.) haben eine proinflammatorische und eine epithelschädigende Wirkung. Diese kann zur
MZ
Histamin Leukotriene IL-5
IL-4 IL-9 IL-13
IgE DZ
Th Th2 Eo
B IL-4
akuter Asthmaanfall -Bronchospasmus- -Schleimhautödem- chronisches Asthma -Gewebezerstörung- Allergen
Th0
Basische Proteine Sauerstoffradikale Lipidmediatoren Allergen
Th1 IFN-γ Ez
vollständigen Ablösung des Epithelverbandes führen (7), wodurch die subepithelialen Nervenendigungen freigelegt werden. Sie sind nunmehr empfindlicher gegenüber einer Vielzahl inhalativer Stimuli, was zur Ausbildung der für das Asthma typischen bronchialen Hyperreaktivität führt (8,9). Die Eosinophilie wird einerseits von einer erhöhten Menge an im Blut zirkulierenden Vorläuferzellen unterhalten, andererseits ist die Apoptoserate in den Atemwegen vermindert. An beiden Effekten scheint IL-5 beteiligt zu sein, da es die Differenzierung der Eosinophilenvorläufer beschleunigt und in der Lage ist, die Überlebenszeit der Eosinophilen zu verlängern (10).
Die chronische eosinophile Entzündung zusammen mit den wiederholten akuten Asthmaanfällen löst dauerhafte, strukturelle Veränderungen der Atemwege aus. Neben den schon erwähnten Epithelschäden bildet sich unter dem Einfluß profibrotischer Zytokine eine subepitheliale Fibrose mit Basalmembranverdickung aus. Die glatten Muskelzellen der Bronchien hypertrophieren; bei schwerem Asthma ist zusätzlich eine Gefäßproliferation zu beobachten. Daraus resultieren eine größere Wandstärke mit einem kleineren Atemwegslumen, was die asthmatische Obstruktion verstärkt (11,12).
1.1.2 Bedeutung der T-Zell Zytokine
IFN-γ ist ein Th1 Zytokin. Es wird bei allergischen Asthmatikern von einem geringeren Prozentsatz der T-Zellen produziert als bei Kontrollprobanden (13,14). Diese verminderte Th1 Zytokinexpression und insbesondere ein verminderter Th1 zu Th2 Quotient sind typisch für die allergische Entzündung. Die Th1 Zytokine scheinen aber nicht als ausschließliche Gegenspieler von den Th2 Zytokinen zu fungieren, da sie selbst teilweise proinflammatorische Eigenschaften besitzen. So konnte im Tiermodell durch Th1 Zellen eine Schleimhauteosinophilie in der Lunge ausgelöst werden (15). Auch einige IL-13 vermittelte Effekte, z.B. die vermehrte Expression von MHC Klasse II Molekülen auf Zellen der Atemwege, wurden durch IFN-γ verstärkt, wohingegen die Eosinophilie in der BAL abgeschwächt wurde (16). In anderen Studien im Tiermodell konnte die Eosinophilie in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit nach Allergenprovokation durch IFN-γ unterdrückt werden (15,17). Auch die bronchiale Hyperreagibilität konnte durch IFN-γ im Tiermodell unterdrückt werden, allerdings nur durch eine einwöchige Behandlung. Eine Behandlung für vier Wochen blieb wirkungslos, was sich möglicherweise durch die zwiespältige Wirkung von IFN-γ erklären läßt, zwar die allergische Entzündung abschwächen, aber auch proinflammatorisch wirken zu können (18).
IL-5 ist ein Th2 Zytokin das selektiv eosinophile Granulozyten aktiviert und deren Apoptose unterdrückt (19). Es ist mitverantwortlich für die auftretenden Gewebeschäden (20). IL-5 wirkt spezifisch, da nur Eosinophile und die selteneren basophilen Granulozyten einen IL-5 Rezeptor exprimieren (10). IL-5 ist ebenfalls für Wachstum und Reifung der Eosinophilen im Knochenmark verantwortlich. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, daß monoklonale Antikörper gegen IL-5 eine allergische Reaktion der Lunge hemmen können, wobei interessanterweise die Unterdrückung der Eosinophilie mit geringeren Mengen gelang, als für die Unterdrückung der Hyperreagibilität nötig waren (21). Auch beim Menschen konnte mit monoklonalem Anti-IL-5 die Eosinophilie im Blut unterdrückt werden. Die bronchiale Hyperreagibilität konnte indes nicht beeinflußt werden (22), wobei aus methodischen Gründen mit dieser Studie ein Einfluß von IL-5 und den eosinophilen Granulozyten auf die bronchiale Hyperreagibilität nicht ausgeschlossen werden konnte (23). Beim Menschen korreliert die Konzentration von IL-5 in der BAL Flüssigkeit mit dem Schweregrad der eosinophilen Entzündungsreaktion (24) und es konnte eine Korrelation zwischen der Menge der Zellen in der BAL, die mRNA für IL-5 exprimieren, und sowohl der Stärke der Obstruktion (FEV1), als auch der bronchokonstriktorischen Reaktion auf Metacholin gefunden werden (25). Bei der Behandlung des Asthmas mit Glukokortikoiden sinkt der IL-5 Spiegel im Serum (26,27), was gut zu den in vitro Experimenten paßt, die für Glukokortikoide einen hemmenden Effekt auf Genexpression und Ausschüttung von IL-5 (28) und eine Verkürzung der Lebensspanne der Eosinophilen durch vermehrte Apoptose (29,30) gezeigt haben.
IL-9 wurde ursprünglich als T-Zell- und Mastzellwachstumsfaktor identifiziert. Da es insbesondere von Th2 Zellen gebildet wird, hat es mittlerweile als Th2 Zytokin Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Neben seiner Fähigkeit das Wachstum aktivierter T-Zellen zu verstärken und das Wachstum und die Differenzierung von Mastzellen zu fördern, erhöht es die IgE-Produktion (5). Zusätzlich wird durch IL-9 die Schleim- produktion in den Bronchien angeregt. Auch auf genetischer Ebene konnte eine Korrelation zwischen dem IL-9 Genlocus und Atopie mit IgE Erhöhung und bronchialer Hyperreagibilität gefunden werden (31). Das humane IL-9 Gen liegt in dem Th2 Zytokinkluster auf Chromosom 5, wo u.a. auch IL-3, IL-4, IL-5 kodiert sind (32-34). Nach in vitro Daten wird IL-9 hauptsächlich von Th2 Lymphozyten produziert (35). Weitere IL-9 sezernierende Zellen sind Mastzellen und Eosinophile (36).
In der T-Helferzellentwicklung und damit in einer sehr frühen Phase der Allergieent- wicklung, hat IL-9 einen wichtigen Einfluß, da es auf Th2 Zellen apoptoseunterdrückend
wirkt (37) und im Thymus die Anzahl der reifen T-Zellen erhöht (38). Im Mausmodell führte eine in der Lunge erhöhte IL-9 Expression zu einer T-Zellinfiltration, verbunden mit bronchialer Hyperreagibilität (39).
Auch beim Menschen konnte eine erhöhte IL-9-Aktivität in Bronchialschleimhautbiopsien sowohl auf dem Protein-, als auch auf dem mRNA- Niveau gefunden werden, die nur bei Asthmatikern, nicht aber bei Kontrollprobanden oder Patienten mit anderen Lungenkrankheiten zu finden war (40).
1.2 Bedeutung des pulmonalen Surfactant beim Asthma bronchiale
1.2.1 Zusammensetzung, Aufbau und Funktion des Surfactantfilms
Das Wort Surfactant leitet sich von surface active agent ab und bezeichnet ein in den Alveolen gebildetes oberflächenaktives Substanzgemisch. Es ist in der Lage, die Oberflächenspannung des alveolären Flüssigkeitsfilmes zu reduzieren. Hauptbestandteil mit 90 % sind Lipide. Proteine machen mit 10 % nur einen geringen Anteil aus, sind funktionell aber bedeutend. Die Lipide ihrerseits bestehen zu 90 % aus verschiedenen Phospholipiden. Den mit 80 % größten Teil der Phospholipidfraktion stellt Phosphatidyl- cholin (PC), wobei das Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), das knapp 50 % des Gesamtsurfactants ausmacht, der mengenmäßig wichtigste Vertreter ist (41).
Die Phospholipide sind amphipathische Moleküle mit einem hydrophilen und einem lipophilen Ende. Das hydrophile Ende wird durch veresterte Alkoholgruppen gebildet, das lipophile durch Fettsäureketten. Diese amphipathischen Phospholipide lagern sich aus energetischen Gründen bevorzugt in die Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche ein, wobei das hydrophile Ende in Richtung Flüssigkeit, das lipophile in Richtung Luft orientiert ist. Auf diese Weise bildet sich an der Oberfläche des in den Atemwegen befindlichen Flüssigkeitsfilms eine Schicht aus Phospholipiden, die die Oberflächenspannung und damit die aufzubringende Arbeit zur Vergrößerung der Oberfläche bei der Inspiration erheblich reduziert.
Die Proteine im Surfactant sind zum größten Teil kontaminierende Serumproteine, von dem 10 %igen Anteil der Proteine entfallen 8 % auf Serumproteine und 2 % auf surfactant- spezifische Proteine. Diese surfactantspezifischen Proteine sind für die Surfactantfunktion äußerst wichtig, da diese Proteine nicht nur die Oberflächenaktivität deutlich verbessern, sondern auch an der Surfactant Synthese- und Metabolismusregulation und an
Abwehrfunktionen beteiligt sind. Es gibt vier surfactantspezifische Proteine, die mit den Buchstaben A bis D bezeichnet werden, die Surfactantproteine (SP-) A und D sind hydrophil, B und C sind hydrophob. Die hydrophilen Proteine SP-A und SP-D haben eher eine regulative und immunmodulierende Bedeutung, wohingegen die lipophilen Proteine SP-B und SP-C eher für die oberflächenaktiven Eigenschaften des Surfactants wichtig sind.
Der Ort der alveolären Surfactantsynthese ist der Typ-II-Pneumozyt. Zusätzlich findet auch in den Atemwegen z. B. in den Clara-Zellen Surfactantsynthese und -sekretion statt.
Der Typ-II-Pneumozyt gibt das synthetisierte Surfactant über merokrine Sekretion in den Flüssigkeitsfilm ab. Dort nimmt es zunächst die Form von tubulärem Myelin, einer gitterartigen Struktur, die das Hauptreservoir für das intraalveoläre Surfactant ist, an, woraus durch Adsorption von Phospholipiden in die alveoläre Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche die oberflächenaktive Surfactantschicht entsteht. Diese oberflächenaktive Grenzschicht ist nicht, wie lange geglaubt, ein Monolayer, sondern zeigt einen polymorphen, multilamellären Aufbau (42). Daraus resultierte das Konzept des oberflächenassoziierten Surfactantreservoirs, das sowohl im Rahmen der de novo Synthese, als auch durch Kompression des Surfactantfilms bei Exspiration entsteht. Aus diesem Reservoir findet während der Inspiration die Adsorption von Phospholipiden in die sich vergrößernde Grenzschicht statt. Die Phospholipide, die sich in diesem Surfactantreservoir direkt unterhalb der Grenzschicht befinden, sind vermutlich in Bilayern organisiert.
In durch bronchoalveoläre Lavage gewonnenem Surfactantmaterial können verschiedene Aggregatformen beobachtet werden, die den unterschiedlichen metabolischen Stadien entsprechen. Unter anderem werden große, multilamelläre Aggregate gefunden, die dem Surfactantreservoir entstammen und oberflächenaktiv sind, im Gegensatz zu kleinen, leichten, unilamellären Vesikeln, die dem katabolen Schenkel zuzuordnen und oberflächeninaktiv sind (43).
Die Reduktion der Oberflächenspannung ist die zentrale Aufgabe des Surfactants, da ohne sie die Retraktionskräfte des alveolären Flüssigkeitsfilmes die Alveolen kollabieren ließen und eine Atmung unmöglich würde. Surfactant kann die Oberflächenspannung auf bis zu einem Zehntel des Wertes ohne seine Anwesenheit herabsetzen und so die Retraktionskräfte die auf die Lunge zusätzlich zu ihren elastischen Fasern wirken auf ein Maß reduzieren, bei dem die Atemwege offengehalten werden. Zusätzlich besitzt Surfactant die Eigenschaft, die Oberflächenspannung dynamisch in Abhängigkeit vom alveolären Radius zu verändern. Die Wichtigkeit dieser Eigenschaft wird bei Betrachtung
des Laplace´schen Gesetztes deutlich. Nach diesem Gesetz verhält sich der intraalveoläre Druck proportional zur Oberflächenspannung und umgekehrt proportional zum Radius der Alveole. Bei konstanter Oberflächenspannung würde also in den kleineren Alveolen ein höherer Druck herrschen, was ein Entleeren in die größeren Alveolen und den Kollaps der kleineren Alveolen zur Folge hätte. Nur die Eigenschaft des Surfactants, bei sinkendem Alveolardurchmesser und damit sinkender Größe der Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche die Oberflächenspannung weiter zu reduzieren, ermöglicht die Stabilisierung von Alveolen unterschiedlicher Größe. Dieses Verhalten des Surfactants läßt sich mit dem Modell des oberflächenassoziierten Surfactantreservoirs erklären, nach dem bei Kompression der Grenzschicht vorwiegend nicht-DPPC-Moleküle aus der Grenzschicht herausgedrückt werden, die Grenzschicht also DPPCreicher wird und damit die Oberflächenspannung effizienter senkt. Ein reiner DPPC-Film, wie er bei Exspiration annähernd entsteht, ist in der Lage auch nach Beendigung der Kompression in Endexspiration über eine lange Zeit niedrige Oberflächenspannungen zu gewährleisten, da er mit einer Phasenübergangs- temperatur von 41,5°C bei Körpertemperatur als festes Wachs vorliegt und damit nur sehr langsam ein Molekülverlust und die Einstellung eines Äquilibriums mit Wiederauftreten von nicht-DPPC-Molekülen stattfindet (44).
Surfactantprotein B ist ein Schlüsselprotein für die Bildung eines optimal funktionsfähigen und stabilen Surfactantfilms (45). Das angeborene Fehlen von SP-B führt über schwere Lungenfunktionsstörungen zum Lungenversagen (46), was die vitale Bedeutung dieses Proteins demonstriert.
Surfactantprotein C ist zusammen mit SP-B an der Bildung und Stabilisierung der alveolären Surfactant-Grenzschicht beteiligt. Während SP-B eine wirksamere Senkung der Oberflächenspannung bewirkt, hat SP-C einen größeren Einfluß auf die Adsorption der Phospholipide in die alveoläre Grenzschicht (47).
Eine weitere wichtige Aufgabe von Surfactant ist seine Abwehrfunktion. Surfactant unterstützt unspezifische Abwehrvorgänge, kann die Funktion von Alveolarmakrophagen und Granulozyten verändern und besitzt immunmodulierende Wirkung auf Lymphozyten;
die Surfactantproteine A und D können bestimmte Erreger und Allergene direkt binden.
Die Lipidfraktion dient der unspezifischen Abwehr durch ihre Barrierefunktion gegen Anheften und Eindringen von Mikroorganismen. Auf Granulozyten und ihre Fähigkeit Sauerstoffradikale zu bilden (48) wirkt sie wie auch auf die Migration und Chemokinese von Alveolarmakrophagen hemmend (49). Die Phagozytose von Streptokokkus
pneumoniae durch Alveolarmakrophagen wird durch Surfactantphospholipide konzentrationsabhängig inhibiert, sowohl in Anwesenheit, als auch in Abwesenheit von SP-A (50).
1.2.2 Surfactantdysfunktionen beim Asthma bronchiale
Für etliche Lungenkrankheiten sind heutzutage Veränderungen in Zusammensetzung und Funktion des Surfactants bekannt. Auch beim Asthma scheinen solche Veränderungen Verlauf und klinisches Erscheinungsbild mit zu beeinflussen, bisher ist aber nur eine begrenzte Anzahl an Studien hierzu durchgeführt worden. Bei Asthmatikern konnte eine Erniedrigung des DPPC-Anteils im Sputum gezeigt werden, in der BAL war der DPPC- Anteil jedoch unverändert (51). Interessanterweise korrelierten der DPPC-Anteil im Sputum und das FEV1. In einer anderen Studie wurde bei Asthmatikern eine niedrige Oberflächenaktivität von Sputumproben beschrieben, was auf eine Funktionsstörung des Surfactants in den Atemwegen hindeutet (52). Auch durch BAL gewonnene Proben, die im Gegensatz zu Sputumproben hauptsächlich alveoläres Material enthalten, wiesen bei Asthmatikern nach segmentaler Allergenprovokation eine erniedrigte Oberflächenaktivität auf (53,54). In einer dieser Studien konnte in den BAL Proben keine Änderung in der Zusammensetzung der surfactantspezifischen PC Species gefunden werden (53). Der Quotient aus kleinen, oberflächeninaktiven und großen, oberflächenaktiven Aggregaten war jedoch erhöht, was einen beschleunigten Umsatz vermuten läßt. Insbesondere jedoch war bei den Asthmatikern nach Allergenprovokation in beiden Studien der Proteingehalt der BAL Proben deutlich erhöht (53,54) und auch serumtypische Phospholipide fanden sich vermehrt (53). Die Proteine dürften zum großen Teil Serumproteine sein, die bei der allergischen Entzündung vermehrt ins Atemwegslumen gelangen. Da für zahlreiche Proteine eine Inhibition der Surfactantfunktion beschrieben ist und die Funktionsstörung nach Entfernung wasserlöslicher Bestandteile rückläufig war, ist die Funktionsstörung wahrscheinlich auf Proteininhibition zurückzuführen. Der typische obstruktive Befund beim Asthma mit erhöhtem Atemwegswiderstand und erhöhtem Residualvolumen wird durch Kontraktion der glatten Muskulatur, Schleimhautödem und Hyperkrinie erklärt. Die oben erwähnten Untersuchungen legen nahe, daß die Surfactantdysfunktion, insbesondere beim akuten Asthmaanfall, zum vorübergehenden Verschluß terminaler Atemwege führt und so zusätzlich zur Obstruktion beiträgt.
1.2.3 Therapeutische Ansätze durch Surfactantsubstitution
Da beim Asthma bronchiale eine Surfactantdysfunktion vorhanden ist, die vermutlich eine pathophysiologische Rolle spielt, ist versucht worden, durch Verbesserung der Surfactantfunktion einen therapeutischen Nutzen zu erzielen. Dafür wurde in Studien im Tiermodell und bereits in ersten Studien am Menschen die Möglichkeit der exogenen Surfactantsubstitution zur Modulation des Asthmas untersucht.
Die Gabe von Surfactant konnte bei Meerschweinchen die durch Provokation mit Allergen ausgelöste Bronchokonstriktion verhindern (55). Ebenfalls bei Meerschweinchen konnte durch die Gabe eines Surfactantextraktes aus Kälberlungen die Beeinträchtigung von Lungenfunktion und Blutgaswerten (pO2 und pCO2) durch Allergenprovokation verringert werden (56). Auch die immunologisch interessanten Surfactantproteine A und D sind bereits im Tiermodell getestet worden. Die Behandlung von Mäusen mit SP-A und SP-D konnte die allergische Entzündung der Atemwege vermindern. Auf der Zytokinebene kam es zu einer Verschiebung in Richtung Th1 (57,58).
Am Menschen wurde bei akuten Asthmaanfällen durch Inhalation von Surfactant eine Verbesserung der Lungenfunktion erreicht (59). Bei asthmatischen Kindern zeigte Surfactantinhalation (Alveofact®) allerdings keine Wirkung auf die durch Histamin ausgelöste Obstruktion (60). Dagegen konnte die Inhalation von Surfactant als trockenes Pulver (Pumactant®) die allergische Sofortreaktion bei allergischen Asthmatikern unterdrücken, die Spätreaktion blieb jedoch unbeeinflußt (61). Obwohl diese Studien zum Teil positive Effekte auf die Lungenfunktion zeigten, ist insbesondere der Einfluß einer Surfactantbehandlung auf die allergische Entzündungsreaktion bisher nicht untersucht worden.
1.3 Fragestellung
Beim Asthma bronchiale wurden Surfactantdysfunktionen beobachtet, die möglicherweise die Atemwegsobstruktion mit verursachen. Dies gab Anlaß, die Wirkung einer Surfactanttherapie in vivo zu untersuchen, mit dem Ziel eine neue therapeutische Option zu eröffnen. Bisher sind nur wenige Studien publiziert worden, die teilweise eine antiobstruktive Wirkung von inhaliertem Surfactant zeigen. Auf die allergische Entzündung der Atemwege beim allergischen Asthma bronchiale scheint Surfactant durch seine immunmodulatorischen Eigenschaften Einfluß zu haben. Diese immunmodu- latorischen Eigenschaften sind bereits im Tiermodell und auf ihre Wirkung an humanen Zellen in vitro untersucht worden und lassen einen hemmenden Effekt auf die allergische Entzündung vermuten. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die Frage, wie die Vorbehandlung eines Lungensegments mit dem Surfactantpräparat Curosurf® die aller- gische Entzündung nach Allergenprovokation beeinflußt. Curosurf® ist ein porcines Surfactantpräparat, das die Oberflächenspannung wirksam reduziert und bereits für die Behandlung von ARDS und IRDS (adult-/ infant respiratory distress syndrome) zugelassen ist. Um die oben gestellte Frage beantworten zu können, müssen geeignete Parameter zur Bestimmung der Ausprägung der allergischen Entzündung gewählt werden.
Die allergische Entzündung der Atemwege beim Asthma bronchiale ist durch eine Erhöhung der Leukozytenzahl und charakteristische Veränderungen der relativen Verteilungen der Leukozytenpopulationen in den Atemwegen gekennzeichnet. Nach einer Allergenprovokation sind diese Veränderungen, z. B. eine Eosinophilie, auch in bronchoalveolärer Spülflüssigkeit nachzuweisen. Deshalb wurde die prozentuale Verteilung der Zellen in der BAL Flüssigkeit und ihre absolute Anzahl zur Beurteilung der Schwere der allergischen Reaktion herangezogen.
Bei Initiierung und Aufrechterhaltung der allergischen Entzündung spielt die Zytokinsekretion von aktivierten T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle. Insbesondere die Th2 Zytokine nehmen eine Schlüsselposition bei der Steuerung der allergischen Reaktion ein. IL-5 gilt als maßgeblicher Auslöser der Atemwegsinfiltration mit eosinophilen Granulozyten. IL-9 als weiteres Th2 Zytokin wirkt auf das Wachstum von aktivierten T-Zellen stimulierend und erhöht die IgE Produktion. Trotz interessanter Ergebnisse aus in vitro Experimenten und Tiermodellen ist über das Auftreten von IL-9 bei Asthmatikern in vivo bisher nur wenig bekannt. Die Balance von Th1 und Th2 Zytokinen gibt Aufschluß über die Schwere der allergischen Entzündung und ist daher ein sinnvoller
Parameter um den therapeutischen Einfluß des Surfactant auf die allergische Entzündung zu untersuchen.
Um den Einfluß einer Surfactantbehandlung auf die allergische Entzündung zu untersuchen, sollen folgende Fragen in der vorliegenden Arbeit beantwortet werden:
• Wie wird durch segmentale Vorbehandlung mit Surfactant die Gesamtzellzahl und die prozentuale Verteilung der Zellen, insbesondere der eosinophilen Granulozyten, in der Lavageflüssigkeit nach segmentaler Allergenprovokation beeinflußt?
• Wie ändert sich durch segmentale Vorbehandlung mit Surfactant die intrazelluläre Expression des Th1 Zytokins IFN-γ und der Th2 Zytokine IL-5 und IL-9 durch CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten auf Einzelzellniveau nach segmentaler Allergen- provokation?
• Wie ändern sich durch segmentale Vorbehandlung mit Surfactant die Konzentrationen des Th1 Zytokins IFN-γ und der Th2 Zytokine IL-5 und IL-9 in der BAL nach segmentaler Allergenprovokation?
2. Methoden
2.1 Studiendesign
Zur Klärung der Fragestellung wurde ein Kollektiv von 16 Probanden mit leichtem allergischem Asthma bronchiale und 5 gesunde Kontrollprobanden untersucht. Die Auslösung und Untersuchung der allergischen Reaktion erfolgte mit der Methode der endobronchialen segmentalen Allergenprovokation. Dabei wurde am ersten Tag in einem Lungensegment eine bronchoalveoläre Lavage zur Bestimmung des Ausgangszustandes vorgenommen. Bei 10 allergischen Asthmatikern und bei den 5 Kontrollprobanden wurde dann ein Lungensegment mit Allergenlösung, wobei physiologische Kochsalzlösung als Trägerflüssigkeit für das Allergen diente, ein weiteres nach zuvor erfolgter Surfactantgabe mit Allergenlösung und zur Kontrolle ein Segment des kontralateralen Lungenflügels mit physiologischer Kochsalzlösung provoziert. Nach 24 Stunden wurde in allen drei provozierten Segmenten je eine Lavage durchgeführt. So konnte sowohl die unspezifische Reaktion auf den Eingriff mit Applikation von Kochsalzlösung abgeschätzt, als auch die allergische Reaktion und ihre Beeinflussung durch vorherige Surfactantapplikation untersucht werden.
Um den alleinigen Einfluß von Surfactant auf die Lunge beobachten zu können, wurde bei einer Surfactantkontrollgruppe aus 6 allergischen Asthmatikern statt der Allergenlösung nur Surfactant instilliert. Diese Gruppe erhielt also in einem Lungensegment nur eine Surfactantgabe, wurde in einem weiteren Segment mit Allergenlösung nach vorheriger
Abbildung 2: Provokationsschema
10 Asthmatiker & NaCl+
5 Kontrollprobanden: Allergen Surfactantkontroll-
gruppe (n=6): Surfactant
Surfactant + Allergen
Kochsalzlösung
Basallavage
Surfactantgabe und in einem Segment des kontralateralen Lungenflügels mit Kochsalzlösung provoziert.
In der durch die Lavage gewonnenen Spülflüssigkeit wurde die Gesamtzahl der enthaltenen Zellen bestimmt und ein Differentialzellbild erstellt. Die intrazelluläre Zytokinproduktion der T-Zellen wurde durchflußzytometrisch und mittels ELISA die Zytokinkonzentration im zellfreien Überstand der Lavageflüssigkeit untersucht. Für die durchflußzytometrische Untersuchung der durch die Lavage gewonnen Zellen wurde eine Oberflächenfärbung für CD4 und CD8 und eine intrazelluläre Zytokinfärbung für IFN-γ, IL-5 und IL-9 vorgenommen. So konnte die Zytokinproduktion den T-Zellsubpopulationen auf Einzelzellniveau zugeordnet werden. Die Zytokindetektion mittels ELISA im zellfreien Überstand erfolgte ebenfalls für das Th1-Zytokin IFN-γ und die Th2-Zytokine IL-5 und IL-9.
2.2 Probanden
Das Probandenkollektiv setzte sich aus allergischen Asthmatikern und gesunden Kontrollprobanden zusammen. Es wurden 21 Probanden in die Studie aufgenommen, davon 5 Kontrollprobanden und 16 allergische Asthmatiker.
Alle Probanden wurden sorgfältig aufgeklärt und nahmen nach schriftlicher Einverständniserklärung an der Studie teil, die durch die Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt wurde.
2.2.1 Ein- und Ausschlußkriterien
Ein guter Allgemeinzustand und keine systemischen Erkrankungen oder Erkrankungen einzelner Organsysteme waren die grundsätzliche Bedingung zur Teilnahme an der Studie für das gesamte Probandenkollektiv, wie auch die Infektfreiheit der Atemwege innerhalb von vier Wochen vor der Bronchoskopie.
Für die Probanden mit allergischem Asthma galten folgende Einschlußkriterien:
• leichtes allergisches Asthma mit variabler und reversibler Obstruktion der Atemwege
• seit mindestens vier Wochen vor Bronchoskopie keine Einnahme von systemischen oder inhalativen Steroiden oder Teilnahme an einer Hyposensibilisierungstherapie
• keine Einnahme anderer Medikamente innerhalb von 4 Wochen vor Bronchoskopie
• Untersuchung der saisonalen Asthmatiker außerhalb der Saison
• positiver Prick-Hauttest (Mindestdurchmesser der Quaddel: 3 mm) bei den Allergenen Dermatophagoides pteronyssinus oder gemischte Gräserpollen
• Nichtraucher seit mindestens 12 Monaten
• FEV1 vor Bronchoskopie > 70 % des Normalwertes
Für die Normalprobanden galten folgende Einschlußkriterien:
• negative Anamnese bezüglich Allergie und Asthma
• negativer Prick-Hauttest bei allen getesteten Allergenen (Quaddeldurchmesser < 3 mm)
• Ausschluß einer bronchialen Hyperreagibilität durch Abfall des FEV1 um 20 % im Metacholinbelastungstest erst nach einer Metacholinkonzentration > 8 mg/ml
• Nichtraucher seit mindestens 12 Monaten
• Gesamt-IgE im Serum < 100 kU/l
• FEV1 vor Bronchoskopie > 70 % des Normalwertes
2.2.2 Voruntersuchung
1. Anamneseerhebung und körperliche Untersuchung
Eine ausführliche Anamneseerhebung diente der Feststellung von Alter, Größe und Gewicht und der näheren Spezifizierung der Symptome des Asthma bronchiale durch Feststellung von Triggerfaktoren, bekannten Allergien, zeitlichem Auftreten, Symptomhäufigkeit, nächtlichen Symptomen und Einschränkung der Belastbarkeit.
Es wurden die derzeitige Medikation, Vorerkrankungen, die Familienanamnese und die Gewohnheiten bezüglich des Konsumes von Alkohol, Nikotin und anderen Drogen erfragt.
Im Rahmen einer körperlichen Untersuchung wurden Blutdruck, Herzfrequenz, Atemfrequenz, sowie Auskultationsbefunde von Herz und Lunge erhoben.
2. Pricktest
Im Rahmen eines Prick-Hauttests wurden folgende Allergene getestet:
Gräsermischung, Roggen, Frühblühermix, Beifuß, Spitzwegerich, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Hundehaare, Katzenhaare, Federmix, Alternaria alternata und Cladosporium herbarum.
Der Befund wurde 15 Minuten nach Einstich mit einer Pricklanzette anhand der Quaddelbildung auf der Haut der Unterarme der Probanden erhoben. Ein positiver Befund lag bei einem Quaddeldurchmesser von mindestens 3 mm vor.
Als Kontrollen wurden 0,9 % - Kochsalzlösung und Histamin eingesetzt.
3. Spirometrie
Die Lungenfunktionsparameter (forciertes exspiratorisches Volumen (FEV1) und forcierte Vitalkapazität (FVC)) wurden im Rahmen einer Spirometrie erhoben.
4. Laborparameter
Innerhalb von sieben Tagen vor Bronchoskopie wurde den Probanden Blut entnommen, um das Blutbild, die Gerinnungswerte und das Gesamt-IgE im Serum zu bestimmen.
5. Metacholinbelastungstest
Die Probanden inhalierten Metacholinlösungen (Metacholinchlorid in NaCl 0,9 %) in aufsteigenden Konzentrationen von 0,04 mg/ml – 10,67 mg/ml.
Die Inhalation erfolgte über einen elektronischen Vernebler (ZAN 200 ProvAir II). Jeweils 2 Minuten nach Inhalation einer Konzentrationsstufe wurde das FEV1 spirometrisch gemessen und mit dem Ausgangswert nach Inhalation von 0,9 % Kochsalzlösung verglichen.
Bei einem Abfall des FEV1 um mehr als 20 % des Ausgangswertes oder starken Symptomen wurde die Untersuchung beendet und die Probanden inhalierten Salbutamol.
Der PC20 (provocative concentration), die Metacholinkonzentration, die zu einem Abfall des FEV1 um 20 % des Ausgangswertes führt, wurde durch Extrapolation im semilogarithmischen Maßstab errechnet.
Tabelle 1: Probandendaten
Probanden Alter Geschlecht FEV1 PC20 IgE Allergien Prov.
Allergen (% pred.) (mg/ml) kU/Liter (pos. Pricktest) SQ-E Kontroll- 20 M 115 >8 8 - Dp 1000 probanden 18 M 114 >8 9 - Dp 1000
26 W 123 >8 14 - gp 1000
23 M 115 >8 26 - Dp 1000
22 W 113 >8 15 - gp 1000
Median 22 2W/3M 115 >8 14 - (Min.-Max.) (18-26) (113-123) (8-26)
Asthmatiker 22 M 118 >8 28 gp,ro,fr,b,s,Dp,Df,h Dp 1000 23 W 105 >8 27 gp,ro,Dp,Df,h,k Dp 1000
25 W 105 >8 305 gp,ro,fr,b,s,Dp gp 10
18 M 88 0.54 249 gp,ro,fr,b,Dp,Df,h,k,f gp 1000 33 M 114 >8 502 gp,ro,Df gp 1000 29 W 106 0.15 214 gp,ro,fr,b,s,Df,h,k gp 1000 25 W 100 2.90 112 Dp,Df,h,k Dp 1000 25 M 90 4.18 77 gp,ro,b,h,k gp 1000
23 M 79 0.18 210 gp,ro,Dp,Df,h,k gp 1000 33 M 102 0.95 180 gp,ro,fr,Dp,Df,h,k,f Dp 1000 27 M 109 1.83 833 gp,ro,Dp,Df,h,f Dp 1000 24 M 117 2.18 368 gp,ro,fr,b,s,Df,h,k gp 1000
24 M 103 >8 228 gp,ro,fr,b,s,Dp,h,k gp 100
19 M 109 >8 920 gp,ro,fr,b gp 1000 29 W 97 <0.10 49 fr,Dp,Df,h,k Dp 1000 19 M 111 2.28 382 s,Dp,Df,h,k Dp 1000 Median 24.5 5W/11M 105 2.59** 221**
(Min.-Max.) (18-33) (79-118) (0.10- >8) (27-920)
** p<0,01 im Vergleich zu den Kontrollprobanden Sex: Geschlecht, W=weiblich, M=männlich
FEV1 (%): Forciertes Exspiratorisches Volumen in Prozent vom Sollwert PC20: Metacholinkonz., die einen Abfall des FEV1 um 20% bewirkt IgE: Serum-IgE gemessen in kU (Kilounits) pro Liter
Allergien: gp: Gräserpollen, ro: Roggen, fr: Frühblüher, b: Beifuß, s: Spitzwegerich, Dp: D. pteronyssinus, Df: D. farinae, h: Hundehaare, k: Katzenhaare, f: Feder-Mix
Prov. Allergen: Allergen, das in der angegebenen Menge (SQ-Einheiten) in 10ml NaCl 0,9% zur segmentalen Provokation verwendet wurde
SQ-Einheit: Standardisierte Qualität, korreliert mit dem Gehalt an Majorallergenen
2.3 Surfactantpräparate
Zur Zeit sind verschiedene kommerzielle Surfactantpräparate im Handel, die eine Arzneimittelzulassung für die Therapie am Menschen haben. Sie werden zur Behandlung des ARDS und des IRDS eingesetzt. Drei häufig verwendete Präparate sind Alveofact®, Curosurf® und Survanta®. Diese Präparate unterscheiden sich in ihrer Herkunft und Zusammensetzung. Alveofact® ist aus Lungenspülungen von Rinderlungen durch Lipidextraktion und Präzipitation gewonnen. Curosurf® ist ein Surfactantisolat aus zerkleinerten Schweinelungen, während Survanta® aus zerkleinerten Rinderlungen gewonnen wird und dann mit DPPC, Palmitinsäure und Triacylglycerol angereichert wird.
In diesen Präparaten finden sich SP-B und SP-C, allerdings in niedrigerer Konzentration als in nativen Surfactantisolationen. Die hydrophilen Proteine SP-A und SP-D werden bei der Lipidextraktion vollständig entfernt und finden sich daher nicht.
In allen Präparaten bildet Phosphatidylcholin (PC) den Hauptanteil der enthaltenen Phospholipide. In nativen Schweine- und Rindersurfactantisolaten beträgt der PC Anteil an der gesamten Phospholipidmenge ca. 85%, bei Alveofact® 84%, bei Survanta® 79%, bei Curosurf® 73% (62). Die Zusammensetzung des PC Anteils in den Präparaten unterscheidet sich deutlich. Das aus Rinderlungen gewonnene Alveofact® enthält nur 39%
DPPC, im Gegensatz zu dem aus Schweinelungen gewonnenen Curosurf®, das 50% DPPC enthält. Das mit DPPC angereicherte Survanta® enthält zu 75% DPPC (62).
In der vorliegenden Arbeit wurde für die Untersuchung des Einflusses der intrabronchialen Surfactantinstillation auf das allergische Asthma bronchiale Curosurf® verwendet. Die Wahl fiel auf Curosurf®, da es bezogen auf die Reduktion der Oberflächenspannung ein sehr wirksames Präparat ist. Außerdem war es, auf Grund der zum Studienzeitpunkt herrschenden öffentlichen Diskussion über BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie), den Probanden aus Sicherheitsgründen als porcines Präparat besser vermittelbar als ein bovines.
2.4 Endobronchiale segmentale Allergenprovokation
2.4.1 Prinzip der segmentalen Allergenprovokation
Die endobronchiale segmentale Allergenprovokation ist ein Verfahren, bei welchem ein Allergenextrakt, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, via Bronchoskop in einen Subsegmentbronchus instilliert wird. Um die so ausgelöste lokale allergische Entzündung zu untersuchen, erfolgt aus dem provozierten Areal nach einem bestimmten Zeitraum ebenfalls über ein Bronchoskop eine BAL. Mit der BAL werden in das Bronchuslumen eingewanderte Entzündungszellen und Mediatoren, wie Zytokine, herausgewaschen.
Zusätzlich können bei diesem Verfahren auch andere Substanzen neben dem Allergenextrakt instilliert werden und so ihre Auswirkung auf die Entzündungsreaktion beobachtet werden. Im Vergleich zu dem weniger invasiven Verfahren der inhalativen Allergenprovokation ergeben sich spezifische Vorteile:
1) Da nur ein geringer Teil der Lunge provoziert wird, kann eine erheblich stärkere allergische Reaktion ohne Gefährdung des Patienten ausgelöst werden. Dadurch wird eine Probengewinnung bei Veränderungen, die einem schweren Asthmaanfall entsprechen, möglich, was die Detektion dieser Veränderungen begünstigt (63).
2) In einem anderen Lungensegment kann parallel zu der Allergenprovokation eine Kontrolluntersuchung stattfinden, um den Einfluß der bronchoskopischen Manipulation abzuschätzen. Auch ein Vergleich mit prämedizierten Arealen ist möglich.
3) Die Allergengabe erfolgt unter Sicht über das Bronchoskop, was die Reaktion der Schleimhaut beobachtbar macht.
Die endobronchiale segmentale Allergenprovokation ist trotz der Invasivität als sicheres Verfahren einzuschätzen (64,65) und wird von den Probanden gut toleriert. In einer früheren Studie (65) ergab sich bei einem Kollektiv von 49 Patienten zwei Stunden nach Allergenprovokation ein FEV1-Abfall von 97,6±13,9% auf 83,4±21,7%. Nach 4 bis 6 Stunden war das FEV1 mit 87,7±20,4% noch reduziert und erreichte nach 24 Stunden mit 93,2±14,0% fast den Ausgangswert. Die zweite Bronchoskopie mit BAL/Biopsie induzierte einen vergleichbaren FEV1-Abfall. Die kurzfristige minimale Sauerstoff- sättigung lag im Median bei 87 % und war durch Erhöhung von Sauerstoffzufuhr und Gabe von Beta2-Sympathikomimetika sofort reversibel. Alle Probanden verließen nach einer 4-stündigen Beobachtungsphase das Krankenhaus.
Zusammenfassend sollten für die sichere Durchführung der Allergenprovokation folgende Maßnahmen ergriffen werden:
1. Sorgfältige Auswahl der Probanden mit Messung der FEV1 und des PC20 2. Überprüfung der FEV1 vor der Bronchoskopie und danach
3. Bronchodilatative Prämedikation (inhalatives Beta2-Sympathikomimetikum)
4. Sauerstoffgabe und Überwachung der Sauerstoffsättigung während der Bronchoskopie 5. Bereitstellung eines inhalativen Beta2-Sympathikomimetikums während der
Bronchoskopie.
2.4.2 Durchführung der Surfactantbehandlung und Allergenprovokation
Die Probanden wurden nüchtern zur Bronchoskopie einbestellt. Zuerst erfolgte zum Ausschluß einer Obstruktion eine Lungenfunktionsmessung (FEV1 > 70%). Als Provokationsallergene wurden gemischte Gräserpollen oder Dermatophagoides pteronyssinus verwendet. Die Auswahl richtete sich nach der stärksten Hautreaktion im Pricktest der Voruntersuchung. Um die zur Provokation verwendete Allergenkonzentration zu bestimmen, wurde ein Hautpricktest am Unterarm mit einer Verdünnungsreihe von 1:1 (= 100.000 SQ-E/ml) bis 1:105 durchgeführt. Verwendet wurde ein Zehntel der Konzentration, die nach 15 Minuten noch eine mindestens 3 mm große Quaddel erzeugte.
Als Prämedikation erhielten alle Probanden 1,5 mg Salbutamol (inhalativ) und 0,5 mg Atropin (s.c.). Midazolam (i.v.) erhielten die Probanden im Laufe der Untersuchung (0 bis 10 mg, Median 5 mg).
Nach Lokalanästhesie der Nasen- und Rachenschleimhaut mit Lidocainspray (4%) wurde das Bronchoskop nasal oder oral eingeführt und Larynx und untere Atemwege via Bronchoskop mit Lidocain (2%) betäubt. Die Bronchoskopie erfolgte unter nasaler Sauerstoffinsufflation, als Sicherheitsparameter wurden Herzfrequenz und Sauerstoffsätti- gung überwacht. Zur Gewinnung eines Ausgangswertes wurde im linken Bronchus basalis anterior (LB8) eine bronchoalveoläre Lavage (BAL) durchgeführt. Dazu wurden 6 mal 20 ml vorgewärmter Kochsalzlösung (0,9%) instilliert und direkt anschließend unter vorsich- tigem Sog wieder aspiriert. Die erste Fraktion wurde verworfen, da sie hauptsächlich Schleim enthielt. Die anderen Fraktionen wurde gesammelt und ihr Volumen bestimmt (Recovery). Dann folgten die Provokationen. Zuerst wurden in den Bronchus lingularis superior (LB4) 10 ml Kochsalzlösung als Kontrollprovokation gegeben, dann in den Bron- chus medialis (RB5) Surfactant instilliert, anschließend in den Bronchus anterior (RB3) 10 ml der vorbereiteten Allergenlösung und zuletzt auch in den Bronchus medialis 10 ml der Allergenlösung appliziert (siehe Abbildung 2, Seite 12). Bei der Surfactantkontroll- gruppe wurde in den Bronchus anterior anstelle der Allergenlösung Surfactant gegeben.
Nach der Bronchoskopie inhalierten die Probanden Salbutamol und wurden für vier Stunden im Ruheraum überwacht. Vor Entlassung fand eine abschließende Lungen- funktionsmessung statt, den Probanden wurden ein Peakflowmeter zur Messung der Lungenfunktion zu Hause und eine Telefonnummer des betreuenden Arztes ausgehändigt.
Am folgenden Tag wurde die Bronchoskopie unter identischer Prämedikation und Überwachung durchgeführt. Es erfolgte je eine BAL aus den drei provozierten Arealen.
2.5 Intrazelluläre Zytokindetektion
2.5.1 Prinzip der intrazellulären Zytokinfärbung
Das Prinzip der intrazellulären Zytokindetektion wurde zuerst von Sander et al. (66) für mikroskopische Untersuchungen von Einzelzellen auf dem Objektträger beschrieben.
Dabei wurden die Zellen mittels Paraformaldehyd fixiert, die Zellmembran durch das Detergens Saponin permeabilisiert und die intrazellulären Zytokine mittels indirekter Immunfluoreszenz markiert. Um die danach durchgeführte sehr zeitaufwendige mikroskopische Quantifizierung zu automatisieren, wurde diese Methode von Jung et al.
(67) für durchflußzytometrische Untersuchungen an isolierten T-Zellen adaptiert. Die Detektion des sehr schwachen Fluoreszenzsignals der markierten Zytokine wurde durch die Stimulation der in Suspension vorliegenden Zellen und Zugabe von Monensin möglich.
Monensin unterbricht den intrazellulären Zytokintransport, führt zur Akkumulation von Zytokinen im Golgi-Apparat und erhöht damit die Signalintensität. Mittlerweile ist Monensin weitgehend durch das, auch von uns verwendete, weniger zytotoxische Brefeldin A ersetzt worden, welches gleichzeitig die Zytokinsekretion noch effizienter hemmt (68-70). Dies läßt sich möglicherweise durch die verschiedenen Wirkweisen von Monensin und Brefeldin A erklären. Während Monensin den Transport im Golgi-Apparat blockiert, hemmt Brefeldin A den Transport vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat.
Die Zellstimulation erfolgt in Zellkulturmedium bei 37°C entweder polyklonal mittels einer Kombination aus PMA und Ionomycin, wie ursprünglich von Jung et al. (67) beschrieben, T-Zell spezifisch mit anti-CD3 und anti-CD28 (71) oder antigenspezifisch (72). Durch die Stimulation wird die Zytokinproduktion auf ein Niveau erhöht, das in Verbindung mit einem Sekretionsinhibitor wie Brefeldin A die durchflußzytometrische Detektion des Fluoreszenzsignals gestattet. Wir haben die gegenüber PMA und Ionomycin
physiologischere T-Zell spezifische Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 verwendet, die zusätzlich besser zur Stimulation von Th2 Zytokinen geeignet zu sein scheint (73).
Nach der Stimulation werden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und in Saponinpuffer mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen Zytokine für 30 min. bei 4°C inkubiert.
Gleichzeitig oder auch vor der Fixierung können Antikörper gegen Oberflächenantigene eingesetzt werden. Anschließend kann durchflußzytometrisch der mit Antikörpern markierte Prozentsatz der Zellen ermittelt werden. So ist eine simultane Bestimmung des Phänotyps und der Zytokinproduktion auf Einzelzellniveau möglich.
2.5.2 Durchführung der intrazellulären Zytokindetektion für IFN-γ, IL-5 und IL-9 1. Zellseparation und -zählung
Die frisch gewonnene BAL-Flüssigkeit wurde mittels eines 100 μm Zellsiebes von größeren Bestandteilen gereinigt, gleichmäßig auf zwei 50 ml Röhrchen aufgeteilt und für 10 min. bei 250g zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen und für weitere Untersuchungen (ELISA) bei –80°C aufbewahrt. Die beiden hauptsächlich aus Zellen bestehenden Pellets wurden je nach Zellzahl in insgesamt 1 bis 10 ml PBS aufgenommen und in einem der beiden Röhrchen zusammengeführt. 10μl dieser Zellsuspension wurden in 90 μl Trypan-Blau gefärbt und die Leukozytenzahl unter dem Lichtmikroskop in einer Neubauer Zählkammer bestimmt.
2. Stimulation der Zellen
Für die Stimulation wurde eine 24 well Kulturplatte mit anti-CD3 beschichtet. Hierfür wurde frischer Karbonatpuffer benötigt, der aus 1,7 ml Lösung A (10,6 g Na2CO3 (0,1 Mol) ad 1l Aqua dest.), 0,8 ml Lösung B (8,4 g NaHCO3 (0,1 Mol) ad 1 l Aqua dest.) und 7,5 ml Aqua dest. bestand. Der pH-Wert wurde auf etwa 10,2 eingestellt, anschließend die Lösung steril filtriert und auf die Kulturplatte gegeben. Nach Zugabe des anti-CD3 Antikörpers erreichte dieser eine Konzentration von 150 ng/ml.
Es folgte eine Inkubation für 2 h bei 37°C und 5 %CO2. Die Platte wurde danach zweimal mit RPMI 1640 gewaschen (5 min. zentrifugiert bei 280g).
Nun war die Platte bereit für die Aufnahme des Kulturmediums und der Zellen. Das Kulturmedium bestand aus 86% RPMI 1640, 10% FCS und Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin, Aminosäuren und Na-Pyruvat zu je 1%. Von den durch BAL gewonnen Zellen wurden 0,8 bis 6 Mio. eingesetzt, bei einer maximalen Konzentration im well von 1 Mio. Zellen pro ml. Als Kosignal für die Stimulation wurde anti-CD28 in einer
Konzentration von 0,5 μg/ml zugegeben. Die Sekretion der synthetisierten Zytokine wurde durch Zugabe von Brefeldin A 1 μM blockiert.
Anschließend wurde die Kulturplatte für 6 h bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.
3. Intrazelluläre Zytokinfärbung
Die Zellen wurden aus der für die Stimulation benutzten Kulturplatte geerntet und zum Waschen in ein 15 ml Röhrchen gegeben, das mit staining buffer aufgefüllt wurde. Der staining buffer bestand aus 10% FCS und 0,09% Natriumazid in PBS mit einem pH-Wert zwischen 7,4 und 7,6. Zum Waschen der Zellen wurde das Röhrchen 5 min. bei 250g zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Für die Färbung wurden die Zellen zu 100 μl auf FACS Röhrchen aufgeteilt, nachdem sie in einer entsprechenden Menge staining buffer resuspendiert worden waren.
Zunächst erfolgte die Oberflächenfärbung mit anti-CD4 FITC und anti-CD8 PerCP bei 4°C im Dunkeln für 30 min. Die Oberflächenfärbung erfolgte vor der Fixierung, da die Anfärbbarkeit nach der Fixierung schlechter war, wie sich in Vorversuchen gezeigt hatte.
Den FACS Röhrchen wurde 1 ml staining buffer zugegeben, sie wurden 5 min. bei 250g zentrifugiert und dann dekantiert.
Das Fixieren erfolgte mit 250 μl Cytofix bei 4°C für 20 min. im Dunkeln, dann wurde zweimal mit Perm/Wash-buffer gewaschen (5 min. zentrifugieren bei 250g). Cytofix und Perm/Wash-buffer sind Bestandteile des Cytofix/Cytoperm Kits von Becton Dickinson.
Danach wurde der unmarkierte anti-IL-9 Primärantikörper zu einem Teil der Zellen zugegeben. Diese Zellen wurden nach einer Inkubation von 30 min. bei 4°C im Dunkeln mit Perm/Wash-buffer gewaschen (5 min., 250g). Danach wurde der PE-markierte Sekundärantikörper und zu den entsprechenden übrigen Zellen jeweils die fluoreszenz- markierten (PE) Antikörper gegen IFN-γ und IL-5 zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation von 30 min. bei 4°C im Dunkeln wurden alle Zellen erneut mit Perm/Wash- buffer gewaschen.
Für die direkt im Anschluß folgende Messung wurden die Zellen in staining buffer aufgenommen.
Die zu verdünnenden Antikörper wurden mit Perm/Wash-buffer verdünnt.
Bei allen Versuchen wurde ein Teil der Zellen mit entsprechenden Isotypkontroll- antikörpern (mouse IgG1) inkubiert und mitgemessen, um eine unspezifische Anfärbung auszuschließen.
4. Durchflußzytometrische Messung
Das verwendete Durchflußzytometer FACSCalibur besaß zwei Streulichtkanäle (Vorwärts- und Seitwärtsstreuung) und drei Farbkanäle. Die graphische Darstellung der Meßdaten erfolgte mit CellQuest 3.1. Die Lymphozyten wurden anhand ihrer Steulichteigenschaften, die der Größe und Granularität der Zellen entsprechen, identifiziert. Dazu wurden alle Zellen (ca. 60.000) in einem Diagramm entsprechend ihrer Vorwärts- und Seitwärts- streuung aufgetragen und die Zellpopulation, die in diesen Eigenschaften den Lymphozyten entspricht, markiert. Diese Population umfaßte 2000 bis 5000 Zellen. Für alle weiteren Darstellungen wurden nur noch diese Zellen benutzt. Um in dieser Zellpopulation die CD4+ und die CD8+ T-Lymphozyten und ihre Zytokinproduktion zu detektieren, wurden jeweils zwei der drei Farbkanäle gegeneinander aufgetragen. In den entstehenden Diagrammen wurden jeweils die für den entsprechenden Marker negativen und positiven Zellen durch das Setzen einer Linie voneinander getrennt. Durch die Zellzahlen in den so gebildeten Quadranten (siehe Abbildung 3) ließen sich sowohl die Prozentsätze der T-Subpopulationen bezogen auf die Lymphozytengesamtzahl, als auch der Prozentsatz der für die intrazellulären Zytokine positiv gefärbten Zellen bezogen auf die T-Subpopulationen berechnen. Für die Berechnung der absoluten Zellzahlen pro ml BAL-Flüssigkeit wurden die Daten der BAL-Differentialzellzählung und der BAL- Recovery (jeweilige Menge der gewonnenen BAL-Flüssigkeit) herangezogen.
A B C
Abbildung 3: FACS-Messung
A: Messung der prozentualen Anteile der CD4+ und CD8+ T-Zellen an den Lymphozyten B: Messung des prozentualen Anteils der IFN-γ+ CD4+ T-Zellen an den CD4+ T-Zellen C: Messung des prozentualen Anteils der IFN-γ+ CD8+ T-Zellen an den CD8+ T-Zellen
46%
16%
34% 0%
20%
37%
29% 36% 18%
17% 36%
11%
CD8 PerCP
CD8 PerCP CD4 FITC
IFN-γ PE
CD4 FITC IFN-γ PE
2.6 Detektion der Zytokine IFN-γ, IL-5, IL-9 in der BAL
Die Detektion der Zytokine in der BAL erfolgte mittels enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA). Nach dem Zentrifugieren der frisch gewonnen BAL-Flüssigkeit wurde der zellfreie Überstand abgenommen und bis zur Messung bei -80°C aufbewahrt.
ELISA-Protokoll
Da die Zytokine mit Antikörpern bzw. Sets von verschiedenen Herstellern gemessen wurden, unterschieden sich die Protokolle für IFN-γ, IL-5 und IL-9 voneinander. Für alle Messungen wurden 96-well MaxiSorp Platten von Nunc verwendet, für die Waschschritte ein Autowascher.
Substrat Lösung: Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxyd Stoplösung: 2N H2SO4
IFN-γ: Für die Detektion von IFN-γ kam ein OptEIA Set von PharMingen zum Einsatz.
Das Vorgehen und die verwendeten Konzentrationen entsprachen den Herstellerangaben, das Detektionslimit lag bei 2,5 pg/ml. Als Assaylösung wurde PBS mit 10% FCS verwendet. Das Beschichten der Platte mit in 0,1 M Carbonatpuffer verdünntem Primärantikörper erfolgte über Nacht bei 4°C. Nach dreimaligem Waschen wurde die Platte am nächsten Morgen mit 200 μl Assaylösung je well für 1 h bei RT (Raum- temperatur) geblockt und danach erneut dreimal gewaschen. Proben und Standard wurden nun zu je 100 μl aufgetragen und für 2 h bei RT inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen folgte eine einstündige Inkubation bei RT mit 100 μl eines innerhalb von 15 min. vorher angesetzten Gemisches aus Sekundärantikörper und Avidin-HRP. Die Platte wurde anschließend siebenmal gewaschen und 100 μl Substrat Lösung in die wells gegeben. Nach 30 min. wurde die Farbreaktion durch Zugabe 50 μl Stoplösung beendet. Die Messung folgte binnen einer halben Stunde.
IL-5: Für die IL-5 Messung wurde ein DuoSet von R&D Systems verwendet. Auch hier richtete sich das Vorgehen nach den Herstellerangaben, das Detektionslimit lag bei 23 pg/ml. Als Blockpuffer diente PBS mit 1% BSA, 5% Sucrose und 0,05% NaN3, die Reagenzien wurden in PBS mit 1% BSA verdünnt. Über Nacht wurde die Platte mit in 0,1 M Carbonatpuffer verdünntem Primärantikörper bei RT beschichtet. Am folgenden Morgen wurde sie nach dreimaligem Waschen mit 300 µl Blockpuffer für 1 h bei RT geblockt und danach dreimal gewaschen. Nun wurden 100 µl Standard oder Probe je well aufgetragen und dort für 2 h bei RT belassen. Ein weiterer dreifacher Waschschritt wurde von einer zweistündigen Inkubation bei RT mit 100µl Sekundärantikörper gefolgt. Nach
dreimaligem Waschen wurden für 20 min. bei RT 100 µl von 1:200 verdünnter Streptavidin-HRP eingesetzt, danach wurde die Platte dreimal gewaschen. Je well wurden nun 100 µl Substrat Lösung aufgetragen und nach 20 min. 50 µl Stoplösung zugegeben.
Die Messung folgte direkt im Anschluß.
IL-9: Da für humanes IL-9 kein kommerzieller ELISA verfügbar war, wurde in enger Anlehnung an das IL-5 Protokoll ein eigener ELISA etabliert, wobei insbesondere geeignete Primär- und Sekundärantikörper zu finden und die jeweils eingesetzten Konzentrationen zu optimieren waren. Als Primärantikörper diente ein polyklonaler Ziegenantikörper (R&D Systems) in einer Konzentration von 1,25 µg/ml, als Sekundärantikörper ein biotinylierter, polyklonaler Kaninchenantikörper (PeproTech) in einer Konzentration von 0,5 µg/ml. Polyklonale Antikörper wurden verwendet, da monoklonale Antikörper zu diesem Zeitpunkt nicht erhältlich waren. Zum Verdünnen der Reagenzien und als Blockpuffer wurden die gleichen Reagenzien wie beim IL-5 ELISA benutzt. Das Detektionslimit lag bei 242 pg/ml, im Wiederfindungstest wurden im Mittel 98% der eingesetzten Konzentration detektiert (74). Die Beschichtung der Platte mit dem in 0,1 M Carbonatpuffer verdünnten Primärantikörper erfolgte über Nacht bei RT. Nach vier Waschschritten, dem Blocken mit 300 µl Blockpuffer je well bei 37°C für 1 h und viermaligem Waschen wurden je 50 µl Standard und Proben in die wells gegeben, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation bei 37°C. Nach vier weiteren Waschschritten wurden für 2 h bei RT 100 µl Sekundärantikörper je well aufgetragen und die Platte viermal gewaschen. Nun wurden 100 µl von 1:200 verdünnter Streptavidin-HRP für 20 min. bei RT eingesetzt, die Platte viermal gewaschen und die Farbreaktion durch Zugabe von 100µl Substrat Lösung gestartet. Nach 20 min. Inkubation bei RT wurden 50 µl Stoplösung zugegeben. Direkt im Anschluß folgte die Messung.
Messung und Auswertung erfolgten für alle Zytokine mit dem ELISA Reader MRX bei einer Wellenlänge von 450 nm.
2.7 Statistik
Für die Berechnung der statistischen Signifikanzen wurden als Testmethoden der Wilcoxon Test für Merkmalsvergleiche innerhalb der Gruppen und für Gruppenvergleiche der Mann-Whitney-U Test verwendet. Die Bonferroni-Korrektur wurde durchgängig beachtet.
Tabelle 2: Materialien
Liste der Geräte
Bronchoskop Olympus BF 160 P Olympus Optical, Japan
Durchflußzytometer FACS-Calibur Becton Dickinson, San Jose, California ELISA Reader MRX Dynatech Laboratories, Chantilly, USA Zentrifuge Labofuge 400R (Heraeus) Kendro Laboratory Products, Hanau
Mikroskop Zeiss, Jena
pH-Meter Knick, Berlin
Brutschrank (Heraeus) Kendro Laboratory Products, Hanau
Zellsieb 100µm Falcon (Becton Dickinson), Franklin Lakes, USA Röhrchen 15/50ml Roth, Karlsruhe
24 well Kulturplatte (3847 Primaria) Falcon (Becton Dickinson), Franklin Lakes, USA FACS Röhrchen Falcon (Becton Dickinson), Franklin Lakes, USA
Liste der Reagenzien
Trypan Blau Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Na-Azid (NaN3) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Brefeldin A Sigma-Aldrich, St. Louis, USA BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
PBS BioWhittaker,Verviers, Belgien
RPMI 1640 BioWhittaker,Verviers, Belgien
FCS Biochrom, Berlin
NaCl (0,9%) Braun, Melsungen Provokationsallergene: Dermatophagoides
pteronyssinus, Gräserpollenmischung Alk-Scherax, Hamburg
Surfactant: Curosurf 120 Serono Pharma, Unterschleißheim Cytofix/Cytoperm Becton Dickinson, San Jose, California IFN-γ OptEIA Set PharMingen, San Diego, California IL-5 Duo-Set R&D Systems, Minneapolis
TMB&H2O2 R&D Systems, Minneapolis
Liste der Antikörper
Anti CD3 (Muromonab-CD3 / OKT 3) Janssen-Cilag, Neuss
Anti CD28 (clone L293) Becton Dickinson, San Jose, California mouse IgG1 FITC PharMingen, San Diego, California mouse IgG1 PE PharMingen, San Diego, California mouse IgG1 PerCP Becton Dickinson, San Jose, California Anti CD4 FITC Immunotech (Coulter), Krefeld
Anti CD8 PerCP Becton Dickinson, San Jose, California Anti IFN-γ PE (mouse) PharMingen, San Diego, California Anti IL-5 PE (mouse) PharMingen, San Diego, California Anti IL-9 (rabbit) Santa Cruz Biotechnology, California Goat-anti-rabbit PE Caltag, Burlingame, California Anti IL-9 (für ELISA) R&D Systems, Minneapolis Anti IL-9, Biotinyliert (für ELISA) PeproTech, London, UK
3. Ergebnisse
3.1 Klinische Parameter
Die Bronchoskopie inklusive segmentaler Allergenprovokation und Biopsieentnahme wurde von den Probanden aller Gruppen gut toleriert. In einem Fall kam es im Verlauf der ersten Bronchoskopie zu einem Laryngospasmus, der zum Abbruch der Untersuchung führte, wodurch die Beschwerden spontan sistierten. Die zweite Bronchoskopie wurde bei diesem Probanden nicht durchgeführt.
Bei allen Asthmatikern führte die segmentale Allergenprovokation innerhalb der ersten Minuten nach Applikation zu einer sichtbaren Bronchokonstriktion, die von einem Atemwegsödem begleitet wurde. In der Gruppe der Kontrollprobanden war diese Reaktion nicht zu beobachten. Die Kochsalzprovokation löste weder bei den Kontrollprobanden noch bei den Asthmatikern eine sichtbare Reaktion der Atemwege aus, auch nach Gabe von Surfactant waren bei den sechs Asthmaprobanden der Surfactantkontrollgruppe keine sichtbaren Veränderungen zu erkennen. Nach 24 Stunden, am zweiten Untersuchungstag, waren bei allen Probanden keine Veränderungen mehr zu erkennen.
Der Median des FEV1 fiel bei den Asthmatikern von 112 % nach Inhalation von Sultanol vor Untersuchungsbeginn auf 93 % vier Stunden nach Untersuchungsende (p<0,01; siehe Tabelle 3).
Tabelle 3: FEV1
Kontrollprobanden Asthmatiker FEV1 % predicted FEV1 % predicted
Ausgangswert prä Bronchoskopie 112 (104-125) 104 (67-124)**
Tag 1 nach Sultanol prä Bronchoskopie 118 (108-126) 112 (83-124) 4 Std. post Bronchoskopie 112 ( 98-121) 93 (63-117)**
Ausgangswert prä Bronchoskopie 113 ( 95-123) 93 (56-110)**
Tag 2 nach Sultanol prä Bronchoskopie 116 (102-124) 104 (76-117) 4 Std. post Bronchoskopie 113 ( 95-118) 95 (69-112)**
Median (Min.-Max.)
FEV1 (in % vom Sollwert) der Asthmatiker und Kontrollprobanden am ersten Untersuchungstag (Provokationen) und am zweiten Untersuchungstag (nach 24 Std.).
** p<0,01 im Vergleich zum Wert nach Sultanolinhalation
Bei den Kontrollprobanden zeigte sich keine signifikante Veränderung des FEV1. 24 Stunden nach den Provokationen war das FEV1 nach Sultanolinhalation im Vergleich zum Ausgangswert des ersten Tages in beiden Gruppen nicht mehr signifikant verändert.
3.2 BAL-Rücklauf (Recovery)
Die Menge der nach der Allergenprovokation gewonnen Lavageflüssigkeit in ml (Recovery) war bei den Asthmatikern geringer im Vergleich zu der Recovery der Basallavage (p<0,05). Im Gegensatz dazu war die Recovery 24h nach Surfactantgabe höher als bei der Basallavage (p<0,05; siehe Tabelle 4). 24h nach Allergenprovokation mit Surfactantgabe war kein Unterschied zur Recovery der Basallavage festzustellen.
Bei den Kontrollprobanden zeigte sich bei allen vier Lavagen kein Unterschied der Recovery.
Tabelle 4: Recovery
Kontrollprobanden Asthmatiker BAL n
Recovery (ml) n
Recovery (ml)
Basal 5 78 (73-93) 16 73 (58-85)
NaCl 0,9% 5 82 (80-94) 16 76 (57-90)
Surfactant 0 – 6 91 (76-96)*
NaCl+Allergen 5 86 (84-88) 10 68 (34-82)*
Surfactant+Allergen 5 86 (81-94) 16 77 (34-91) Median (Min.-Max.); Menge der Lavageflüssigkeit in ml; * für p<0,05 im Vergleich zur BasalBAL
3.3 Differentialzellbild der BAL
Die Gesamtzellzahl der BAL, das ist die Leukozytenanzahl in der gesamten Lavageflüssigkeit, zeigte bei den Kontrollprobanden keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Lavagen. Bei den Asthmatikern erhöhte sich nach Allergenprovokation die Gesamtzellzahl im Vergleich zu der Kontrollprovokation (p<0,01). Die Allergenprovokation nach Surfactantgabe ergab eine noch höhere Gesamtzellzahl als die Allergenprovokation ohne Surfactantgabe (p<0,01), wohingegen die Gabe von Surfactant in der Surfactantkontrollgruppe keine signifikante Änderung der Gesamtzellzahl gegenüber der Kochsalzprovokation auslöste (siehe Tabelle 5 und Abbildung 4).
