Intrazelluläre Zytokindetektion

2.5.1 Prinzip der intrazellulären Zytokinfärbung

Das Prinzip der intrazellulären Zytokindetektion wurde zuerst von Sander et al. (66) für mikroskopische Untersuchungen von Einzelzellen auf dem Objektträger beschrieben.

Dabei wurden die Zellen mittels Paraformaldehyd fixiert, die Zellmembran durch das Detergens Saponin permeabilisiert und die intrazellulären Zytokine mittels indirekter Immunfluoreszenz markiert. Um die danach durchgeführte sehr zeitaufwendige mikroskopische Quantifizierung zu automatisieren, wurde diese Methode von Jung et al.

(67) für durchflußzytometrische Untersuchungen an isolierten T-Zellen adaptiert. Die Detektion des sehr schwachen Fluoreszenzsignals der markierten Zytokine wurde durch die Stimulation der in Suspension vorliegenden Zellen und Zugabe von Monensin möglich.

Monensin unterbricht den intrazellulären Zytokintransport, führt zur Akkumulation von Zytokinen im Golgi-Apparat und erhöht damit die Signalintensität. Mittlerweile ist Monensin weitgehend durch das, auch von uns verwendete, weniger zytotoxische Brefeldin A ersetzt worden, welches gleichzeitig die Zytokinsekretion noch effizienter hemmt (68-70). Dies läßt sich möglicherweise durch die verschiedenen Wirkweisen von Monensin und Brefeldin A erklären. Während Monensin den Transport im Golgi-Apparat blockiert, hemmt Brefeldin A den Transport vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat.

Die Zellstimulation erfolgt in Zellkulturmedium bei 37°C entweder polyklonal mittels einer Kombination aus PMA und Ionomycin, wie ursprünglich von Jung et al. (67) beschrieben, T-Zell spezifisch mit anti-CD3 und anti-CD28 (71) oder antigenspezifisch (72). Durch die Stimulation wird die Zytokinproduktion auf ein Niveau erhöht, das in Verbindung mit einem Sekretionsinhibitor wie Brefeldin A die durchflußzytometrische Detektion des Fluoreszenzsignals gestattet. Wir haben die gegenüber PMA und Ionomycin

physiologischere T-Zell spezifische Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 verwendet, die zusätzlich besser zur Stimulation von Th2 Zytokinen geeignet zu sein scheint (73).

Nach der Stimulation werden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und in Saponinpuffer mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen Zytokine für 30 min. bei 4°C inkubiert.

Gleichzeitig oder auch vor der Fixierung können Antikörper gegen Oberflächenantigene eingesetzt werden. Anschließend kann durchflußzytometrisch der mit Antikörpern markierte Prozentsatz der Zellen ermittelt werden. So ist eine simultane Bestimmung des Phänotyps und der Zytokinproduktion auf Einzelzellniveau möglich.

2.5.2 Durchführung der intrazellulären Zytokindetektion für IFN-γ, IL-5 und IL-9 1. Zellseparation und -zählung

Die frisch gewonnene BAL-Flüssigkeit wurde mittels eines 100 μm Zellsiebes von größeren Bestandteilen gereinigt, gleichmäßig auf zwei 50 ml Röhrchen aufgeteilt und für 10 min. bei 250g zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen und für weitere Untersuchungen (ELISA) bei –80°C aufbewahrt. Die beiden hauptsächlich aus Zellen bestehenden Pellets wurden je nach Zellzahl in insgesamt 1 bis 10 ml PBS aufgenommen und in einem der beiden Röhrchen zusammengeführt. 10μl dieser Zellsuspension wurden in 90 μl Trypan-Blau gefärbt und die Leukozytenzahl unter dem Lichtmikroskop in einer Neubauer Zählkammer bestimmt.

2. Stimulation der Zellen

Für die Stimulation wurde eine 24 well Kulturplatte mit anti-CD3 beschichtet. Hierfür wurde frischer Karbonatpuffer benötigt, der aus 1,7 ml Lösung A (10,6 g Na₂CO₃ (0,1 Mol) ad 1l Aqua dest.), 0,8 ml Lösung B (8,4 g NaHCO3 (0,1 Mol) ad 1 l Aqua dest.) und 7,5 ml Aqua dest. bestand. Der pH-Wert wurde auf etwa 10,2 eingestellt, anschließend die Lösung steril filtriert und auf die Kulturplatte gegeben. Nach Zugabe des anti-CD3 Antikörpers erreichte dieser eine Konzentration von 150 ng/ml.

Es folgte eine Inkubation für 2 h bei 37°C und 5 %CO2. Die Platte wurde danach zweimal mit RPMI 1640 gewaschen (5 min. zentrifugiert bei 280g).

Nun war die Platte bereit für die Aufnahme des Kulturmediums und der Zellen. Das Kulturmedium bestand aus 86% RPMI 1640, 10% FCS und Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin, Aminosäuren und Na-Pyruvat zu je 1%. Von den durch BAL gewonnen Zellen wurden 0,8 bis 6 Mio. eingesetzt, bei einer maximalen Konzentration im well von 1 Mio. Zellen pro ml. Als Kosignal für die Stimulation wurde anti-CD28 in einer

Konzentration von 0,5 μg/ml zugegeben. Die Sekretion der synthetisierten Zytokine wurde durch Zugabe von Brefeldin A 1 μM blockiert.

Anschließend wurde die Kulturplatte für 6 h bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.

3. Intrazelluläre Zytokinfärbung

Die Zellen wurden aus der für die Stimulation benutzten Kulturplatte geerntet und zum Waschen in ein 15 ml Röhrchen gegeben, das mit staining buffer aufgefüllt wurde. Der staining buffer bestand aus 10% FCS und 0,09% Natriumazid in PBS mit einem pH-Wert zwischen 7,4 und 7,6. Zum Waschen der Zellen wurde das Röhrchen 5 min. bei 250g zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Für die Färbung wurden die Zellen zu 100 μl auf FACS Röhrchen aufgeteilt, nachdem sie in einer entsprechenden Menge staining buffer resuspendiert worden waren.

Zunächst erfolgte die Oberflächenfärbung mit anti-CD4 FITC und anti-CD8 PerCP bei 4°C im Dunkeln für 30 min. Die Oberflächenfärbung erfolgte vor der Fixierung, da die Anfärbbarkeit nach der Fixierung schlechter war, wie sich in Vorversuchen gezeigt hatte.

Den FACS Röhrchen wurde 1 ml staining buffer zugegeben, sie wurden 5 min. bei 250g zentrifugiert und dann dekantiert.

Das Fixieren erfolgte mit 250 μl Cytofix bei 4°C für 20 min. im Dunkeln, dann wurde zweimal mit Perm/Wash-buffer gewaschen (5 min. zentrifugieren bei 250g). Cytofix und Perm/Wash-buffer sind Bestandteile des Cytofix/Cytoperm Kits von Becton Dickinson.

Danach wurde der unmarkierte anti-IL-9 Primärantikörper zu einem Teil der Zellen zugegeben. Diese Zellen wurden nach einer Inkubation von 30 min. bei 4°C im Dunkeln mit Perm/Wash-buffer gewaschen (5 min., 250g). Danach wurde der PE-markierte Sekundärantikörper und zu den entsprechenden übrigen Zellen jeweils die fluoreszenz-markierten (PE) Antikörper gegen IFN-γ und IL-5 zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation von 30 min. bei 4°C im Dunkeln wurden alle Zellen erneut mit Perm/Wash-buffer gewaschen.

Für die direkt im Anschluß folgende Messung wurden die Zellen in staining buffer aufgenommen.

Die zu verdünnenden Antikörper wurden mit Perm/Wash-buffer verdünnt.

Bei allen Versuchen wurde ein Teil der Zellen mit entsprechenden Isotypkontroll-antikörpern (mouse IgG1) inkubiert und mitgemessen, um eine unspezifische Anfärbung auszuschließen.

4. Durchflußzytometrische Messung

Das verwendete Durchflußzytometer FACSCalibur besaß zwei Streulichtkanäle (Vorwärts- und Seitwärtsstreuung) und drei Farbkanäle. Die graphische Darstellung der Meßdaten erfolgte mit CellQuest 3.1. Die Lymphozyten wurden anhand ihrer Steulichteigenschaften, die der Größe und Granularität der Zellen entsprechen, identifiziert. Dazu wurden alle Zellen (ca. 60.000) in einem Diagramm entsprechend ihrer Vorwärts- und Seitwärts-streuung aufgetragen und die Zellpopulation, die in diesen Eigenschaften den Lymphozyten entspricht, markiert. Diese Population umfaßte 2000 bis 5000 Zellen. Für alle weiteren Darstellungen wurden nur noch diese Zellen benutzt. Um in dieser Zellpopulation die CD4⁺ und die CD8⁺ T-Lymphozyten und ihre Zytokinproduktion zu detektieren, wurden jeweils zwei der drei Farbkanäle gegeneinander aufgetragen. In den entstehenden Diagrammen wurden jeweils die für den entsprechenden Marker negativen und positiven Zellen durch das Setzen einer Linie voneinander getrennt. Durch die Zellzahlen in den so gebildeten Quadranten (siehe Abbildung 3) ließen sich sowohl die Prozentsätze der T-Subpopulationen bezogen auf die Lymphozytengesamtzahl, als auch der Prozentsatz der für die intrazellulären Zytokine positiv gefärbten Zellen bezogen auf die T-Subpopulationen berechnen. Für die Berechnung der absoluten Zellzahlen pro ml Flüssigkeit wurden die Daten der Differentialzellzählung und der BAL-Recovery (jeweilige Menge der gewonnenen BAL-Flüssigkeit) herangezogen.

A B C

Abbildung 3: FACS-Messung

A: Messung der prozentualen Anteile der CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen an den Lymphozyten B: Messung des prozentualen Anteils der IFN-γ⁺ CD4⁺ T-Zellen an den CD4⁺ T-Zellen C: Messung des prozentualen Anteils der IFN-γ⁺ CD8⁺ T-Zellen an den CD8⁺ T-Zellen

46%

16%

34% 0%

20%

37%

29% 36% 18%

17% 36%

11%

CD8 PerCP

CD8 PerCP CD4 FITC

IFN-γ PE

CD4 FITC IFN-γ PE