Aus dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
Genetische und mikrobiologische Untersuchungen zur Ätiologie chronischer Darmentzündungen
bei der IL-10-defizienten Maus
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Sybille Schmidtke
aus Mainz
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Müller
Tag der mündlichen Prüfung: 29. Mai 2002
Bestandteil des Teilprojektes C16 im Sonderforschungsbereich 280
Meiner Mutter
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABCB3 ATP-binding cassette, sub-family B, member 3 Aqua dest. aqua destillata
ARE AU-reiche Elemente
bp Basenpaar
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CED chronisch entzündliche Darmerkrankungen
cM centi-Morgan
DNA Desoxyribonukleinsäure DSS dextran sulfate sodium EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alii (und andere)
gp39 glycoprotein 39
H.E. Hämatoxylin-Eosin
HLA human leucocyte antigen
H2 Haupthistokompatibilitätskomplex der Maus IBD inflammatory bowel disease
ICAM-1 intercellular adhesion molecule
I.E. Internationale Einheit
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
KBE kolonibildende Einheiten
kbp Kilobasenpaar
kDa Kilodalton
kPa Kilopaskal
mA Milliampere
Mdr multiple drug resistance
MEZ Mitteleuropäische Zeit
MHC major histocompatibility complex MHH Medizinische Hochschule Hannover
MLH1 mutL homolog 1
MMU Bezeichnung für Chromosomen von Mus musculus
NCAD N-Cadherin
NF-κB nuclear factor-κB
NOD nucleotide-binding oligomerization domain PCR polymerase chain reaction
PG-PS Peptidoglykan-Polysaccharid
SAM senescence accelerated mouse SLC11A solute carrier family 11
SPF spezifiziert pathogenfrei
sp. Spezies
Stat signal transducers and activators of transcription
subsp. Subspezies
Th-Zellen T-Helfer-Zellen
TNBS trinitrobenzene sulfonic acid
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
u. a. unter anderem
UV ultraviolett
WASP Wiskott-Aldrich syndrome protein
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 11
2 LITERATURÜBERSICHT 13
2.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen 13 2.11 Definition 13 2.12 Epidemiologie 13 2.13 Ätiologie und Pathogenese 14 2.14 Klinik und Pathologie 15
2.15 Genetik 16
2.2 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen 18 2.2.1 Übersicht 18 2.2.2 Die Interleukin-10-defiziente (Il10tm1Cgn) Maus 20 2.2.3 Die Orphan-Rezeptor CRF2-4-defiziente Maus 22 2.2.4 Die Stat3-defiziente Maus 23 2.3 Einfluß der physiologischen Darmflora auf die Entstehung der CED 24 2.3.1 Tiermodelle 25 2.3.2 Wirkung von Antibiotika auf die Entwicklung der CED 28 2.3.3 Die Rolle des Genus Helicobacter im Krankheitsgeschehen
der CED 30
3 MATERIAL UND METHODEN 32
3.1 Genomweite Kopplungsanalyse 32 3.1.1 Versuchstiere 32 3.1.2 Haltung und Fütterung 33 3.1.3 Ermittlung des Hygienestatus 34 3.1.4 Phänotypisierung 40 3.1.4.1 Narkose 40 3.1.4.2 Körpergewicht 41 3.1.4.3 Blutentnahme 41 3.1.4.4 Ermittlung der absoluten Leukozytenzahl 41
3.1.4.5 Sektion 42 3.1.4.5.1 Bestimmung des relativen Milzgewichtes 42 3.1.4.5.2 Entnahme und Präparation des Dickdarms 42 3.1.4.6 Histologische Untersuchungen 43 3.1.4.6.1 Herstellung der histologischen Präparate 44 3.1.4.6.2 Auswertung der histologischen Präparate mit Hilfe des
semiquantitativen Scores 44 3.1.5 Genotypisierung 46 3.1.5.1 DNA-Isolierung 46 3.1.5.2 Messen und Einstellen der DNA 47 3.1.5.3 Auswahl der genetischen Marker 47 3.1.5.4 Polymerasekettenreaktion 52 3.1.5.5 Agarosegel-Elektrophorese 55 3.1.6 Statistische Auswertungen 56 3.2 Experimentelle Infektion 58 3.2.1 Versuchstiere 58 3.2.2 Haltung und Fütterung 60 3.2.3 Bakterien 60 3.2.4 Herstellen der Inokulationssuspension 60 3.2.5 Inokulation 61 3.2.6 Bestimmung der koloniebildenden Einheiten 61 3.2.7 Reisolierung der Erreger aus der Inokulationssuspension 62 3.2.8 Bakteriologische Untersuchungen des Kots 62 3.2.8.1 Anzucht der Bakterien 63 3.2.8.2 Identifizierung der Bakterien 65 3.2.9 Tötung der Versuchstiere 66 3.2.10 Postmortale Untersuchungen 67 3.2.10.1 Sektion 67 3.2.10.2 Bakteriologische Untersuchungen von Rachen, Genitale
und Koloninhalt 67 3.2.10.3 Histologische Untersuchungen von Zäkum und Kolon 67
4 ERGEBNISSE 68
4.1 Ermittlung des Helicobacter-Status 68 4.2 Geschlechtsspezifische Unterschiede in den phänotypischen
Merkmalen 68
4.3 Wechselbeziehungen zwischen den phänotypischen Merkmalen 69 4.4 Kopplungsanalyse 70 4.5 Experimentelle Infektion 98 4.5.1 Koloniebildende Einheiten der Bakteriensuspensionen 98 4.5.2 Reisolierung der Erreger aus der Inokulationssuspension 98 4.5.3 Bakteriologische Untersuchungen des Kots 99 4.5.4 Bakteriologische Untersuchungen von Rachen, Genitale und
Koloninhalt 99
4.5.5 Histologische Untersuchungen 100
5 DISKUSSION 102
5.1 Genomweite Kopplungsanalyse 102 5.1.1 Auswahl der Versuchstiere 102 5.1.2 Phänotypisierung 103 5.1.2.1 Absolute Leukozytenzahl 103 5.1.2.2 Relatives Milzgewicht 103 5.1.2.3 Histologie 104 5.1.3 Genotypisierung 105 5.1.4 Kopplungsanalyse 106 5.1.5 Genetische Homologien zwischen Maus und Mensch 108
5.1.6 Ausblick 108
5.2 Experimentelle Infektion 109 5.2.1 Auswahl der Versuchstiere 109 5.2.2 Auswahl der Bakterien 110 5.2.3 Bakteriologische Untersuchung der Mäuse 110 5.2.4 Histologie 111
5.2.5 Ausblick 111
6 ZUSAMMENFASSUNG 113
7 SUMMARY 116
8 LITERATURVERZEICHNIS 119
9 TABELLENANHANG 144
1 EINLEITUNG
Colitis ulcerosa und Morbus Crohn sind chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED).
Ihre Prävalenz liegt in Westeuropa und den USA bei 100 – 200/100.000 Einwohnern und der Altersgipfel der Krankheitsmanifestation liegt im 2. bis 3. Lebensjahrzehnt (DUERR et al., 1998).
Trotz intensiver Forschung seit der Erstbeschreibung der Colitis ulcerosa im 19. Jahrhundert sowie des Morbus Crohn im Jahre 1932 ist die Pathogenese der CED noch weitgehend unklar.
Die heute vorliegenden Daten zeigen, daß genetische und immunologische Mechanismen von Bedeutung sind, wobei Umwelteinflüsse ebenfalls eine wichtige Rolle spielen. Hinweise für die Bedeutung von Umweltfaktoren ergeben sich u. a. aus der Zunahme der Inzidenz der CED mit zunehmender Industrialisierung und Entwicklung (EKBOM et al., 1991). Wesentliche Studien unterstützen die Hypothese einer genetisch bedingten inadäquaten Immunantwort auf Umweltfaktoren wie die physiologische Darmflora (BERG et al., 1996; SELLON et al., 1998;
HUGOT et al., 2001; OGURA et al., 2001). Epidemiologische Untersuchungen zeigen eine erhöhte Prävalenz von CED in bestimmten ethnischen Bevölkerungsgruppen sowie innerhalb bestimmter Familien und deuten zusammen mit Zwillingsuntersuchungen darauf hin, daß eine genetische Prädisposition für CED besteht (DUERR et al., 1996). Die Suche nach prädisponierenden Genen bei der CED des Menschen wird jedoch durch unvollständige Penetranz, oligogenetische Kontrolle und genetische Heterogenität erschwert. Durch genomweite Analysen konnten bisher vier Suszeptibilitätsloci für CED auf den Chromosomen 6 (HAMPE et al., 1999b), 12 (SATSANGI et al., 1996), 14 (DUERR et al., 2000) und 16 (HUGOT et al., 1996) beim Menschen identifiziert werden. Die tatsächlich involvierten Gene sind jedoch mit Ausnahme des Gens für den intrazellulären Lipopolysaccharid-Rezeptor NOD2 auf Chromosom 16 (HAMPE et al., 2001; HUGOT et al., 2001; OGURA et al., 2001) weiterhin unbekannt.
In den letzten Jahren sind zahlreiche Tiermodelle, vor allem Mausmodelle für CED etabliert worden (ELSON et al., 1995). Sie eignen sich besonders zum Studium der genetischen, immunologischen und umweltbedingten Faktoren, die eine initiierende Rolle im Krankheitsgeschehen der CED spielen. Für das Studium der genetischen Faktoren, die die Suszeptibilität für CED im Tiermodell regulieren, eignet sich besonders das Modell der Interleukin-10-defizienten (Il10tm1Cgn) Maus. Il10tm1Cgn-Mäuse weisen ähnlich wie der Mensch genetisch determinierte Unterschiede in der Suszeptibilität für CED auf. So zeigen
Untersuchungen am Jackson Laboratory (Maine, USA), daß Il10tm1Cgn-Mutanten, bei denen der Inzuchtstamm C3H/HeJBir den genetischen Hintergrund bildet unter gleichen Haltungsbedingungen wesentlich schwerer an CED erkranken als entsprechende Mutanten auf C57BL/6J-Hintergrund (BRISTOL et al., 2000). Dieser Befund wurde in der Dissertationsarbeit von Frau Dr. Most (2001) am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover repliziert.
Die vorliegende Arbeit war Bestandteil des Teilprojektes C16 im Sonderforschungsbereich 280 („Gastrointertestinale Barriere“). Ziel dieser Arbeit war die chromosomale Zuordnung von genetischen Loci, welche die Suszeptibilität für CED im Modell der Il10tm1Cgn-Maus determinieren. Zu diesem Zweck wurde die Erkrankung bei Il10tm1Cgn-Mäusen einer Rückkreuzungspopulation auf den suszeptiblen Stamm C3H/HeBir@Ztm-Il10tm1Cgn mittels histologischer Parameter phänotypisiert. Anschließend erfolgte bei diesen Mäusen die Ermittlung von Suszeptibilitätsregionen durch eine genomweite Kopplungsanalyse mittels genetischer Marker.
Aufgrund der sehr hohen genetischen Homologie zwischen Maus und Mensch ist davon auszugehen, daß die Gene, die bei der Maus den Phänotyp der CED modifizieren, auch beim Menschen eine Rolle spielen. Dies könnte Einsicht in die Pathogenese der CED geben und neue Ansätze für Therapie und Prophylaxe aufweisen.
Wie beim Menschen spielt die physiologische Darmflora bei der Entstehung der CED im Modell der Il10tm1Cgn-Maus eine wichtige Rolle. Unter konventionellen Haltungsbedingungen entwickeln Il10tm1Cgn-Mäuse eine Entzündung des gesamten Intestinaltraktes (KÜHN et al., 1993), während sie unter spezifiziert pathogenfreien Bedingungen lediglich eine Entzündung des Zäkums und Kolons zeigen (KÜHN et al., 1993; SELLON et al., 1998). Unter keimfreien Haltungsbedingungen hingegen entwickeln Il10tm1Cgn-Mäuse keine CED (SELLON et al., 1998).
In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte geprüft werden, ob bestimmte Bakterienarten der Darmflora eine CED bei Il10tm1Cgn-Mäusen auslösen können. Zu diesem Zweck wurden keimfreie Il10tm1Cgn-Mäuse mit einer definierten Bakteriensuspension experimentell infiziert und anschließend auf Erkrankungen im Darmtrakt untersucht. Die Kenntnis der am Krankheitsgeschehen beteiligten Bakterien ist wichtig für das Verständnis der Pathogenese der CED und könnte neue Ansätze für Therapie und Prophylaxe (z.B.
Induktion einer immunologischen Toleranz) bieten.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen 2.1.1 Definition
Bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) des Menschen handelt es sich um chronisch entzündliche rezidivierende Störungen des Intestinaltraktes mit unbekannter Genese. Man unterscheidet zwei Hauptformen der CED: Morbus Crohn und Colitis ulcerosa (PODOLSKY, 1991). Colitis ulcerosa ist bereits seit dem späten 19. Jahrhundert bekannt (WILKS u. MOXON, 1875), während Morbus Crohn das erste Mal in den dreißiger Jahren des 20. Jahrhunderts beschrieben wurde (CROHN et al., 1932).
2.1.2 Epidemiologie
Die CED sind weltweit verbreitet. Ihre Prävalenz liegt in Westeuropa und den USA bei etwa 100-200 Fällen pro 100.000 Einwohnern (DUERR et al., 1998). Weiße Bevölkerungsgruppen sind häufiger betroffen als schwarze und asiatische, wobei innerhalb der weißen Bevölkerungsgruppen Juden (besonders Aschkenasim-Juden) eine um 3-6 mal höhere Inzidenz aufweisen als Nichtjuden. Beide Geschlechter sind gleichermaßen betroffen (DUERR et al., 1996; DUERR et al., 1998). Der Altersgipfel der Krankheitsmanifestation liegt im 2. bis 3. Lebensjahrzehnt (DUERR et al., 1996). Nach Schätzungen ist das Risiko an CED zu erkranken für Verwandte von CED-Patienten, verglichen mit der Gesamtbevölkerung, mindestens um den Faktor 10 erhöht (DUERR et al., 1996). Derartige epidemiologische Häufungen sprechen ursächlich entweder für genetische und/oder für umweltbedingte Faktoren (FIOCCHI, 1998).
2.1.3 Ätiologie und Pathogenese
Die Ätiologie und Pathogenese der CED sind weitgehend unklar. Es gibt Hinweise, daß umweltbedingte, immunologische und genetische Faktoren beteiligt sind. Zu den umweltbedingten Faktoren zählen u. a. Rauchen, Ernährung, Streß und Hygiene (FIOCCHI, 1998). Raucher erkranken beispielsweise eher an Morbus Crohn und Nichtraucher mit einer höheren Wahrscheinlichkeit an Colitis ulcerosa (FIOCCHI, 1998). Des Weiteren wird eine Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis als Ursache für Morbus Crohn diskutiert (FIOCCHI, 1998; COLLINS et al., 2000). Bei Morbus Crohn-Patienten wurden sowohl histologische Ähnlichkeiten mit der Paratuberkulose als auch signifikant erhöhte Serumantikörpertiter gegen Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis festgestellt (CHIODINI et al., 1984; FIOCCHI, 1998). Elektromikroskopische Untersuchungen von intravaskulären Granulomen bei Morbus Crohn-Patienten zeigten die Anwesenheit von Paramyxovirus-ähnlichen Partikeln, die sich immunhistologisch als Masernviruspartikel erwiesen und möglicherweise ebenfalls eine Rolle in der Pathogenese von Morbus Crohn spielen (WAKEFIELD et al., 1991; FIOCCHI, 1998). Ferner wird diskutiert, ob ein Subtyp der Spezies Eschericha coli in der Pathogenese von Morbus Crohn (DARFEUILLE- MICHAUD et al., 1998) sowie die Gattungen Shigella, Salmonella und Yersinia in der Pathogenese von Colitis ulcerosa eine Rolle spielen (SARTOR et al., 1996a). Das Toxin von Clostridium difficile wird mit einer Verschlimmerung der Erkrankung in Zusammenhang gebracht (SARTOR et al., 1996a). In neueren Untersuchungen konnte eine bestimmte DNA- Sequenz von Pseudemonas fluorescens in 43 % der Läsionen bei Morbus Crohn-Patienten nachgewiesen werden (SUTTON et al., 2000; WIE et al., 2001). Diese Sequenz ließ sich bevorzugt aus Lamina propria mononukleären Zellen der erkrankten Mukosa isolieren. Ob die erwähnten Mikroorganismen allerdings primär für die Entstehung der CED verantwortlich sind, oder ob sie sich erst sekundär in der erkrankten Darmschleimhaut ansiedeln, bleibt unklar.
Die Gewebeschädigung der Darmschleimhaut bei CED wird durch das Immunsystem des Darmes bewirkt (SHANAHAN et al., 1987). Bei diesen Prozessen könnte eine Autoimmun- reaktion durch eine Störung der immunologischen Toleranz bzw. eine unspezifische Schädigung durch eine überschießende Reaktion auf exogene Antigene, verursacht durch eine defekte Regulation des intestinalen Immunsystems, eine Rolle spielen. Das häufige Auftreten von Autoantikörpern gegen Bestandteile von Granulozyten bei Patienten mit CED (62% der
Patienten mit Colitis ulcerosa, 4% der Patienten mit Morbus Crohn) unterstützt die Hypothese der Autoimmunpathogenese (SEIBOLD et al., 1996).
Patienten mit CED weisen ferner eine vermehrte Produktion von durch Monozyten/Makrophagen oder Granulozyten synthetisierten Entzündungsmediatoren (wie zum Beispiel Prostaglandine, Leukotriene, Plättchen-aktivierender Faktor und Zytokine) auf (MEENAN, 1995). Bezüglich der lymphozytären Zytokinsynthese findet sich bei Patienten mit Morbus Crohn ein Th-1-typisches Zytokinmuster (vermehrte Produktion von Tumor- Nekrose-Faktor (TNF), Interleukin (IL)-2 und Interferon (IFN)-γ), während bei Patienten mit Colitis ulcerosa ein Th-2-typisches Zytokinmuster (vermehrte Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10) vorliegt (FIOCCHI, 1998).
Die genetischen Faktoren werden ausführlich in Kapitel 2.1.5 beschrieben.
2.1.4 Klinik und Pathologie
Leitsymptom der CED ist die Diarrhoe. Während der Stuhl bei Colitis ulcerosa blutig- schleimig ist, kommt es bei Morbus Crohn selten zu Blutbeimengungen. Weitere Symptome der CED sind Fieber, Abdominalschmerz, allgemeine Ermüdbarkeit und Gewichtsverlust (PODOLSKY, 1991; FIOCCHI, 1998).
Die Lokalisation der Entzündung überwiegt bei Morbus Crohn im terminalen Ileum und Kolon, kann sich jedoch über den gesamten Gastrointestinaltrakt (vom Mund bis zum Anus) ausdehnen. Morbus Crohn verläuft in der Regel diskontinuierlich. Stark befallene Darmsegmente sind durch Bereiche von scheinbar normalem Darm getrennt. Die Entzündung erstreckt sich über sämtliche Schichten der Darmwand. Mit fortschreitender Erkrankung kann es zu Stenosen und infolgedessen zu mechanischen Obstruktionen kommen (PODOLSKY, 1991).
Die Colitis ulcerosa beginnt meistens distal im Rektum und breitet sich kontinuierlich nach proximal zum Kolon aus. Das Rektum ist stets befallen. Die Entzündung ist hauptsächlich in den Darmschichten Mucosa und Submucosa lokalisiert. Patienten, die an Colitis ulcerosa erkranken, zeigen ein erhöhtes Risiko für Dickdarmkarzinome (PODOLSKY, 1991).
2.1.5 Genetik
Eine genetische Disposition für CED läßt sich ableiten aus einer erhöhten Prävalenz in bestimmten ethnischen Bevölkerungsgruppen (DUERR, 1996). Ferner besteht eine erhöhte Prävalenz bei Verwandten ersten Grades von CED-Patienten. Bei Morbus Crohn besteht ein 15-35fach höheres Risiko für Verwandte ersten Grades und bei Colitis ulcerosa ein 7-15fach höheres Risiko (ORCHARD et al., 2000). Des Weiteren spricht eine hohe Konkordanzrate für die Erkrankung bei monozygoten Zwillingen verglichen mit dizygoten Zwillingen für eine genetische Disposition gegenüber CED (DUERR, 1996).
Die Suche nach prädisponierenden Genen bei der CED des Menschen wird erschwert durch unvollständige Penetranz, oligogenetische Kontrolle und genetische Heterogenität (DUERR, 1996). Zu den Kandidatengenen, die möglicherweise an der Pathogenese der CED beteiligt sind, gehören die Klasse I- und Klasse II-Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA), die Gene für das Peptidtransportermolekül ABCB3 (frühere Bezeichnung: TAP2), den T-Zell-Rezeptor-Komplex, das Komplementprotein C3, den IL-1-Rezeptorantagonisten, den Tumor-Nekrose-Faktor, das Adhäsionsmolekül ICAM-1 (DUERR, 1996) und das Membrantransportprotein SLC11A (engl.: solute carrier family 11; frühere Bezeichnung:
NRAMP) (HOFMEISTER et al., 1997) sowie das DNA-Reparaturgen MLH1 (POKORNY et al., 1997). Weitere Kandidatengene, die für die Entstehung der CED verantwortlich sein könnten, sind das Motilin-Gen (ANNESE et al., 1998), das Kinin B1-Rezeptorgen (BACHVAROV et al., 1998) sowie das Vitamin D-Rezeptorgen (SIMMONS et al., 2000).
Durch genomweite Kopplungsanalysen bei Familien mit CED wurden kürzlich vier Suszeptibilitätsloci für CED (IBD 1-4, engl.: inflammatory bowel disease) auf den Chromosomen 6, 12, 14 und 16 identifiziert. Eine französische Gruppe berichtete von einem Suszeptibilitätslocus IBD1 für Morbus Crohn auf Chromosom 16 bei nordwesteuropäischen Familien (HUGOT et al. 1996). Dieser Befund wurde nachfolgend bei Familien aus Großbritannien (PARKES et al., 1996), den USA (OHMEN et al. 1996; CHO et al. 1998;
BRANT et al. 1998), Australien (CAVANAUGH et al. 1998) und Nordeuropa (CURRAN et al. 1998; HAMPE et al. 1999a) bestätigt. Daten einer anderen europäischen Untersuchung deuten an, daß IBD1 auch zur Suszeptibilität für Colitis ulcerosa beitragen kann (MIRZA et al.1998). Fünf Jahre nach der Erstbeschreibung von IBD1 haben drei Forschungsgruppen unabhängig voneinander das beteiligte Gen identifizieren können (HAMPE et al., 2001;
HUGOT et al., 2001; OGURA et al., 2001). Es handelt sich um das Gen für den
intrazellulären Lipopolysaccharid-Rezeptor NOD2. NOD2 wird in Monozyten exprimiert und aktiviert nach Bindung bakterieller Lipopolysaccharide den Transkriptionsfaktor NF-κB, der wiederum die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokine hochreguliert. Etwa 15 % der Morbus Crohn-Patienten besitzen aufgrund einer Insertionsmutation mit Verschiebung des Leserasters im NOD2-Gen ein verkürztes NOD2-Protein (OGURA et al., 2001). Wie dieses veränderte Protein zu der Erkrankung führt, ist jedoch noch unklar. Des Weiteren ergaben sich Anhaltspunkte für epistatische Wechselwirkungen zwischen IBD1 und einem möglichen Suszeptibilitätslocus auf Chromosom 1p (CHO et al. 1998). Letztere Studie lieferte ferner Hinweise für die Anwesenheit von CED-assoziierten Loci auf den Chromosomen 3 q und 4. Eine britische Gruppe fand eine signifikante Kopplung mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa auf Chromosom 12 (IBD2) und Hinweise für Kopplung auf den Chromosomen 3p und 7 (SATSANGI et al. 1996). Die Chromosom-12-Kopplung wurde anschließend bei nordamerikanischen (DUERR et al. 1998) und europäischen Familien mit CED (CURRAN et. al. 1998; HAMPE et al. 1999a) repliziert.
Die Untersuchungen von HAMPE et al. (1999a) bestätigten die Chromosom-4-Kopplung und lieferten neue Hinweise für Kopplung auf den Chromosomen 1q, 6, 10, 22 und X. Hinweise für Kopplung auf Chromosom 6 fanden sich auch in einer kanadischen Studie (RIOUX et al.
2000) und wurden schließlich in einer weiteren Studie von HAMPE et al. (1999b) bestätigt.
Dabei ergab sich eine signifikante Kopplung für CED mit einem Locus in der HLA-Region auf dem p-Arm dieses Chromosoms (IBD3). In der kanadischen Studie (RIOUX et al. 2000) wurden des Weiteren zwei Regionen mit signifikanter Kopplung für CED (Chromosom 19p) bzw. Morbus Crohn (Chromosom 5q) sowie Hinweise für Kopplung auf Chromosom 3p gefunden. Schließlich ergaben Untersuchungen von MA et al. (1999) Hinweise für Morbus Crohn-assoziierte Loci auf den Chromosomen 5q, 17 q und 14q. Letzterer wurde kürzlich von DUERR et al. (2000) bestätigt (IBD4). Die erhobenen Daten legen nahe, daß Morbus Crohn und Colitis ulcerosa zusammenhängende polygenetische Krankheiten sind, die manche, aber nicht alle Suszeptibilitätsgene teilen (SATSANGI et al., 1998). Es ist anzunehmen, daß eine große genetische Heterogenität in Bezug zur Pathogenese zwischen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa besteht.
2.2 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen 2.2.1 Übersicht
Die in den letzten Jahren beschriebenen Tiermodelle (vor allem Mausmodelle) für CED lassen sich in spontane, chemisch induzierte, genetisch manipulierte und Zelltransfer-Modelle einteilen. Die unterschiedlichen Modelle sind in Tabelle 1 dargestellt. Sie eignen sich besonders zum Studium der genetischen, immunologischen und umweltbedingten Faktoren, die eine initiierende Rolle im Krankheitsgeschehen der CED spielen.
Wie bei Menschen sind genetisch determinierte Unterschiede in der Suszeptibilität für chronische Darmentzündungen auch bei verschiedenen Inzuchtmäusen mit experimentell induzierter CED beobachtet worden (MOMBAERTS et al., 1993; ELSON et al., 1995;
ELSON et al., 1996; BERG et al., 1996; MÄHLER et al., 1998; MÄHLER et al., 1999). Dies gilt für chemisch induzierte (ELSON et al., 1995; ELSON et al., 1996; MÄHLER et al., 1998) und für genetisch manipulierte Tiermodelle der CED (MOMBAERTS et al., 1993; ELSON et al., 1995; BERG et al., 1996). Interessanterweise erwiesen sich in mehreren Modellen bestimmte Inzuchtstämme als sehr anfällig und andere als relativ resistent gegenüber CED.
Chemische Stoffe, mit denen nach oraler bzw. rektaler Applikation eine chronische Kolitis bei Versuchsnagern induziert werden kann, sind beispielsweise das Polysaccharid DSS (engl.:
dextran sulfate sodium) und das Kontaktallergen TNBS (engl.: trinitrobenzene sulfonic acid).
Sowohl bei der TNBS-induzierten (ELSON et al., 1996) als auch bei der DSS-induzierten Kolitis (MÄHLER et al., 1998) zeigten Mäuse des Stammes C3H/HeJ schwerere histopathologische Läsionen als Mäuse der Stämme DBA/2J und C57BL/6J.
Zu den genetisch manipulierten Tiermodellen der CED gehören u.a. die Mausmutanten mit selektiver Deletion der Gene für die α-Kette des T-Zell-Rezeptors, IL-2, IL-10 und das Gαi2- Protein. Der Phänotyp der Kolitis wird bei diesen Deletionsmutanten deutlich durch die Genetik des Hintergrundstammes beeinflußt (MOMBAERTS et al., 1993; ELSON et al., 1995; BERG et al., 1996). Deletionsmutanten, bei denen die Stämme 129, BALB/c oder C3H/He den genetischen Hintergrund bilden, erkrankten unter gleichen Haltungsbedingungen deutlich schwerer an CED als entsprechende Mutanten auf C57BL/6-Hintergrund. Die Gene, die bei den genannten Mausmodellen eine erhöhte Suszeptibilität für CED bestimmen, haben aufgrund der sehr hohen genetischen Homologie zwischen Maus und Mensch möglicherweise auch beim Menschen eine Bedeutung in der Pathogenese der CED. Bisher gibt es nur sehr
wenige Untersuchungen zur Identifikation solcher Gene bei Versuchsnagern mit experimenteller CED. Untersuchungen von MÄHLER et al. (1999) haben gezeigt, daß mehrere Gene die Suszeptibilität gegenüber der DSS-induzierten Kolitis bei der Maus kontrollieren.
Tabelle 1: Mausmodelle für CED.
Spontanes Modell SAMP1/Yit (engl.: senescence accelerated mouse) (MATSUMOTO et al., 1998)
Chemisch induzierte Modelle DSS (engl.: dextran sulfate sodium)-induzierte Kolitis (MÄHLER et al., 1998)
TNBS (engl.: trinitrobenzene sulfonic acid)-induzierte Kolitis (ELSON et al., 1996)
Oxazolon-induzierte Kolitis (BOIRIVANT et al., 1998)
Genetisch manipulierte Modelle T-Zell-Rezeptor-α-Kette-defiziente Maus (MOMBAERTS et al., 1993)
IL-2-defiziente Maus (SADLACK et al., 1993)
IL-2-Rezeptor α-Kette-defiziente (WILLERFORD et al., 1995)
IL-10-defiziente Maus (KÜHN et al., 1993) Gαi2-defiziente Maus (RUDOLPH et al., 1995) NCAD∆ (N-Cadherin) transgene chimäre Maus (HERMISTON und GORDON, 1995)
IL-7-transgene Maus (WATANABE et al., 1998)
Mdr (engl.: multiple drug resistance)1α-defiziente Maus (PANWALA et al., 1998)
Stat (signal transducers and activators of transcription) 4- transgene Maus (WIRTZ et al., 1999)
Fortsetzung Tabelle 1:
Genetisch manipulierte Modelle Orphan-Rezeptor CRF2-4-defiziente Maus (SPENCER et al., 1998)
Stat 3 (Makrophagen und Neutrophile)-defiziente Maus (TAKEDA et al., 1999)
WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)-defiziente Maus (SNAPPER et al., 1998)
TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) ARE (AU-reiche Elemente)- defiziente Maus (KONTOYIANNIS et al., 1999)
Keratin-8-defiziente Maus (auf FVB/N genetischem Hintergrund) (BARIBAULT et al., 1994)
Herpes simplex Virus Thymidinkinase-transgene Maus (BUSH et al., 1998)
α1,2-Fucosyltransferase-transgene Maus (MILLER et al., 2000)
gp39-transgene Maus (CLEGG et al., 1997)
Zelltransfer-Modelle CD45RB-Transfer in Prkdcscid-Maus (POWRIE et al., 1993)
Knochenmark-Transfer in transgene ε26 Maus (HOLLANDER et al., 1995)
2.2.2 Die Interleukin-10-defiziente (Il10tm1Cgn) Maus
IL-10 ist ein regulatorisches Zytokin, welches hauptsächlich von Th2-Zellen produziert wird (FIORENTINO et al., 1989). Es fördert die Proliferation und Differenzierung von B- Lymphozyten und unterdrückt die Effektorfunktionen von Makrophagen, Th1-Zellen und natürlichen Killerzellen (MOORE et al., 1993). Des Weiteren kann IL-10 von Ly-1 B-Zellen, Makrophagen, Thymozyten, Keratinozyten und aktivierten Mastzell-Linien produziert werden (MOORE et al., 1993). Murines IL-10 ist ein Polypeptid, das aus einem Gemisch von 17, 19
und 21 kDa-Spezies besteht (MOORE et al., 1993) und in vielen Geweben exprimiert wird (BROSKI et al., 1994).
Il10tm1Cgn-Mäuse wurden im Institut für Genetik der Universität Köln erzeugt (KÜHN et al., 1993). Das Il10-Gen wurde bei diesen Mäusen durch homologe Rekombination inaktiviert.
Die Il10tmCgn-Mutanten bilden daher kein IL-10. Als Folge der Nullmutation entwickeln Il10tm1Cgn-Mäuse nach dem Absetzen spontan eine chronisch entzündliche Darmerkrankung, die sich vom Duodenum bis zum Rektum erstrecken kann.
Die Il10tm1Cgn-Mutation wurde am Jackson Laboratory durch 10 Rückkreuzungszyklen jeweils auf die Inzuchtstämme C57BL/6J und C3H/HeJBir übertragen. Donormäuse waren Il10tm1Cgn- Mutanten mit segregierendem genetischen Hintergrund (C57BL/6J;129P2/OlaHsd). Nach der 10. Rückkreuzungsgeneration (N10) wurden heterozygote Mäuse verpaart, um homozygote Il10tm1Cgn-Mäuse und homozygote Kontrollmäuse mit dem Il10-Wildtypallel zu erhalten. Die resultierenden kongenen Stämme C57BL/6J-Il10tm1Cgn und C3H/HeJBir-Il10tm1Cgn wurden anschließend ingezüchtet.
Durch das Fehlen der suppressiven Effekte von IL-10 auf die Zytokinproduktion durch Makrophagen und Th1-Zellen kommt es zu einer erhöhten Immunreaktion der Th1-Zellen (vermehrte Produktion von IFN-γ) gegenüber Antigenen der enteralen Darmflora. Dies führt zu einer Proliferation und Aktivierung von Makrophagen sowie zu einer Produktion von Entzündungszellmediatoren wie IL-1, IL-6, TNF-α und Stickstoffoxiden. Diese über- schießende Immunreaktion trägt zu der Gewebeschädigung bei der intestinalen Erkrankung der Il10tm1Cgn-Mäuse bei (BERG et al., 1996).
Die Darmflora spielt bei der Entstehung der CED im Modell der Il10tm1Cgn-Maus eine wichtige Rolle. Unter konventionellen Haltungsbedingungen entwickeln Il10tm1Cgn-Mäuse eine Entzündung des gesamten Intestinaltraktes (KÜHN et al., 1993), während sie unter spezifiziert pathogenfreien (SPF) Bedingungen lediglich eine Entzündung des Zäkums und Kolons zeigen (KÜHN et al., 1993; SELLON et al., 1998). Klinische Symptome der Erkrankung beinhalten Gewichtsverlust, Diarrhoe und gelegentlich Rektalprolaps.
Histologisch erscheint die Darmschleimhaut hyperplastisch mit abnormaler Kryptarchitektur.
Es kommt zu gelegentlichen Kryptabszessen sowie Kryptulzera. Ferner finden sich leukozytäre Zellinfiltrate in der Lamina propria und Submukosa. Vereinzelt kommt es zu transmuralen Entzündungen (KÜHN et al., 1993; BERG et al., 1996; MÄHLER et al., 2000).
Unter keimfreien Haltungsbedingungen hingegen entwickeln Il10tm1Cgn-Mäuse keine CED (SELLON et al., 1998). Diese Untersuchungen zeigen, daß zusätzlich zu einem genetischen
Defekt des Immunsystems eine Stimulation durch die Darmflora nötig ist, um CED auszulösen.
Weiterhin wird der Phänotyp der CED im Modell der Il10tm1Cgn-Maus deutlich durch die Genetik des Hintergrundstammes beeinflußt (BERG et al., 1996). BRISTOL et al. (2000) und MOST (2001) konnten zeigen, daß unter gleichen Haltungsbedingungen C3H/HeJBir- Il10tm1Cgn-Mäuse wesentlich schwerer an CED erkranken als C57BL/6J-Il10tm1Cgn-Mäuse. Der Unterschied im Schweregrad der Darmentzündung zwischen diesen beiden Stämmen war am deutlichsten im Alter von 6 Wochen zu erkennen (BRISTOL et al., 2000). Dabei wurde der Schweregrad der Erkrankung in Zäkum und Kolon mit Hilfe eines histologischen Scores ermittelt. Ferner wurden der Serum-Amyloid-A-Gehalt, der prozentuale Anteil von Granulozyten im peripheren Blut, das relative Milzgewicht und das relative Gewicht der Mesenteriallymphknoten als Parameter für die Schwere der CED herangezogen, da diese stark positiv mit dem histologischen Score korrelierten. Interessanterweise lagen die entsprechenden Merkmalswerte von reziproken F1-Hybriden der beiden oben genannten Stämme zwischen den Werten ihrer Parentalstämme. Diese Befunde unterstützen die Hypothese einer polygenetischen Kontrolle der Suszeptibilität für CED im Il10tm1Cgn- Mausmodell.
2.2.3 Die Orphan-Rezeptor CRF2-4-defiziente Maus
Der Orphan-Rezeptor CRF2-4 zählt zu der Familie der Klasse-II-Zytokin-Rezeptoren.
Weitere Rezeptoren, die dieser Familie zugeordnet werden, sind der IL-10R1-Rezeptor (Untereinheit des IL10-Rezeptors), die IFN-γR1- und IFN-γR2-Rezeptoren (Untereinheiten des IFN-γ-Rezeptors) und die IFN-αR1- und IFN-αR2-Rezeptoren (Untereinheiten des IFN-α Rezeptors) (SPENCER et al., 1998). Vermutlich stellt der CRF2-4-Rezeptor eine Untereinheit des IL-10-Rezeptors dar und bildet mit diesem eine funktionelle Einheit (KOTENKO et al., 1997).
Um die Funktion und Wirkungsweise des CRF2-4-Rezeptors zu klären, wurde das CRFB4- Gen, welches für diesen Rezeptor kodiert, in Mäusen durch homologe Rekombination inaktiviert. Diese CRF2-4-Rezeptor-defizienten Mäuse zeigten zunächst keine pathologischen Veränderungen der untersuchten Organe (Gehirn, Herz, Nieren, Thymus und Pankreas).
Wachstum und Fertilität waren physiologisch. Die Tiere entwickelten jedoch im Alter von 12 Wochen unter konventionellen Haltungsbedingungen eine chronische Kolitis und eine
Splenomegalie (SPENCER et al., 1998). Die Krankheitsmerkmale der CRF2-4-Rezeptor- defizienten Maus entsprechen weitgehend dem Phänotyp der Il10tm1Cgn-Mäus. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, daß Makrophagen von CRF2-4-Rezeptor-defizienten Mäusen nicht auf eine Stimulation mit IL-10 reagierten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß der CRF2-4-Rezeptor für die Wirkung des IL-10 unerläßlich ist (SPENCER et al., 1998).
2.2.4 Die Stat3-defiziente Maus
Stat3 ist ein Zytoplasmaprotein, welches einer Gruppe von Proteinen, den STAT-Proteinen (engl.: signal transducers and activators of transcription), zugeordnet wird. Durch eine spezifische Kinase wird das Protein Stat3 im Zytoplasma von Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und anderen Zellen phosphoryliert und somit aktiviert (SCHINDLER et al., 1995; IHLE, 1996; DARNELL, 1997).
Um die Wirkungsweise des Stat3-Proteins beurteilen zu können, wurde durch zellspezifische Mutagenese mit Hilfe des cre-loxP-Rekombinasesystems das Stat3-Gen in Makrophagen und neutrophilen Granulozyten von Mäusen ausgeschaltet. Diese Mäuse entwickelten wie Il10tm1Cgn-Mäuse mit zunehmendem Alter eine CED, die mit einer erhöhten Produktion von Zytokinen einherging (KÜHN et al., 1993; BERG et al., 1996; TAKEDA et al., 1999). Des Weiteren wiesen sie eine hohe Suszeptibilität für Endotoxine auf, wobei die Endotoxin- induzierte Produktion der Entzündungszellmediatoren (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-γ) von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten aufgrund der fehlenden suppressiven Effekte von IL-10 vermehrt war (TAKEDA et al., 1999). Offensichtlich spielt Stat3 eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der antiinflammatorischen Wirkung von IL-10 auf Makrophagen und Th1-Zellen.
Die Untersuchungen an den genannten Mausmodellen (IL-10-defiziente Maus, CRF2-4- defiziente Maus, Stat3-defiziente Maus) zeigen, daß eine Unterbrechung der IL-10- induzierten Signalkaskade zu einer Kolitis führen kann. Die Zusammenhänge dieser Signalkaskade sind in Abbildung 1 zusammengefaßt.
Abb.1: IL-10 Signalkaskade, deren Unterbrechung bei der Maus zu einer Kolitis führen kann.
2.3 Einfluß der physiologischen Darmflora auf die Entstehung der CED
Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren scheinen an der Pathogenese der Colitis ulcerosa und des Morbus Crohn beteiligt zu sein. Unter den Umweltfaktoren (Kapitel 2.1.3) spielt die normale Darmflora eine wichtige Rolle. Die physiologische Darmflora umfaßt mehr als 400 verschiedene Bakterienspezies (BERG, 1996). Der Großteil dieser Bakterien ist im distalen Ileum und Kolon lokalisiert wo sich die CED am häufigsten manifestieren. Hier liegt die Konzentration der anaeroben Bakterien um das 1000-fache über der von Aerobiern. Die Aufgabe der anaeroben Mikroflora besteht in der bakteriellen Fermentation von Nahrungspartikeln, Synthese von Vitaminen und Schutz vor pathogenen Organismen. Aerobe und anaerobe Bakterien stellen als Antigene eine ständige Herausforderung an die in der Mukosa residenten immunkompetenten Zellen dar (PRANTERA et al., 1994; TURUNEN, 1994; SARTOR, 1995; GREENBLOOM et al., 1998; ARNOLD et al., 1999; COLOMBEL et al., 1999). Beim Menschen gibt es zunehmend Hinweise auf die bedeutende Rolle von darmresidenten Bakterien und bakteriellen Produkten in der Pathogenese der CED (SARTOR et al., 1999; SARTOR et al., 2000). So konnte in mehreren Studien gezeigt werden, daß Antibiotika vor allem bei Morbus Crohn effektiv sind, aber auch bei Colitis ulcerosa
Th1- Zelle
IL10
Makrophage IL10-R
CRF2-4
Stat3
?
X X
X
unterstützend wirken (SUTHERLAND et al., 1991; PRANTERA et al., 1994; RUTGEERTS et al., 1995; ARNOLD et al., 1999; COLOMBEL et al., 1999; GIONCHETTI et al., 1999).
Des Weiteren konnten erhöhte Konzentrationen von Antikörpern gegen luminale Bakterien in Seren und Darminhalt von Morbus Crohn-Patienten nachgewiesen werden (HELPHINGSTINE et al., 1979; GUMP et al., 1981; TURUNEN, 1994; SARTOR, 1995;
GREENBLOOM et al., 1998).
2.3.1 Tiermodelle
Da verschiedene Tiermodelle unter keimfreien Bedingungen keine CED entwickeln, ist eine Mitbeteiligung der physiologischen Darmflora an der Entstehung der CED sehr wahrscheinlich. Zu diesen Tiermodellen zählen die HLA-B27-transgene Ratte (TAUROG et al., 1994; RATH et al., 1996), die IL-2-defiziente Maus (SADLACK et al., 1993;
CONTRACTOR et al., 1998), die IL-10-defiziente Maus (SELLON et al., 1998), die T-Zell- Rezeptor-α-Kette-defiziente Maus (DIANDA et al., 1997) und die SAMP1/Yit Maus (MATSUMOTO et al., 1998).
Für die Entstehung einer Kolitis spielen sowohl aerobe als auch anaerobe Bakterien eine Rolle, wobei insbesondere die obligat anaeroben Darmbakterien von Bedeutung sind (RATH et al., 2001). So entwickelten HLA-B27-transgene Ratten, welche nur mit fakultativ anaeroben Bakterien besiedelt waren, eine deutlich geringere Kolitis und Gastritis als solche, die sowohl mit fakultativ anaeroben als auch mit obligat anaeroben Bakterien assoziiert waren (RATH et al., 1996; RATH et al., 2001). Die Ausprägung der Kolitis und Gastritis in HLA- B27-transgenen Ratten korrelierte direkt mit der Zeit der bakteriellen Darmbesiedlung, wobei sich ca. 4 Wochen nach Kolonisation der keimfreien Ratten mit spezifiziert pathogenfreien Darmbakterien histologisch und laborchemisch die Kolitis voll entwickelt hatte (RATH et al., 1996).
Im Verlauf der chronischen intestinalen Entzündung scheinen den verschiedenen Bakterien unterschiedliche Funktionen zuzufallen (RATH et al., 1996). Keimfreie HLA-B27-transgene Ratten, die mit einem Bakteriencocktail, bestehend aus sechs obligat und fakultativ anaerob wachsenden Bakterienspezies, einschließlich Bacteroides vulgatus, einem strikt anaeroben Keim, infiziert wurden, bildeten eine stärkere Kolitis aus, als solche, die mit dem gleichen Bakteriencocktail ohne Bacteroides vulgatus infiziert wurden (RATH et al., 1996). Des Weiteren scheint Bacteroides vulgatus eher für die Entstehung einer Kolitis und Gastritis
verantwortlich zu sein, während andere Bakterien, wie z.B. Escherichia coli und Bakterien der Gattung Enterococcus (ONDERDONK et al., 1998) eher für die Chronifizierung und systemische Ausbreitung der Entzündung von Bedeutung sind. Dies zeigte sich in Experimenten, in denen es durch Monoassoziation von keimfreien Ratten mit Bacteroides vulgatus zwar gelang, die Kolitis, aber nicht die Gastritis zu initiieren. Bei der Monoassoziation mit Escherichia coli entwickelte sich weder eine Kolitis noch eine Gastritis, wohingegen es bei Kolonisierung der keimfreien Ratten mit einem Bakteriencocktail, welcher sowohl Bacteroides vulgatus als auch Escherichia coli enthielt, zur ausgeprägten Kolitis und Gastritis kam (RATH et al.,1996; RATH et al., 1999).
Wird HLA-B27 transgenen Ratten eine selbstfüllende blinde Schlinge in das Zäkum gelegt (siehe Abb. 2B), verändert sich die Zusammensetzung der bakteriellen Darmflora im Zäkum.
Die Anzahl der anaeroben Bakterien, insbesondere der Gattung Bacteroides, nimmt im Verhältnis zur aeroben Darmflora zu (RATH et al., 1999). Bei diesen Tieren konnte eine signifikant stärker ausgeprägte Kolitis als bei HLA-B27-transgenen Ratten ohne selbstfüllende blinde Schlinge beobachtet werden (RATH et al., 1999). Die Entzündung im Zäkum von HLA-B27-transgenen Ratten konnte geheilt werden, indem dort die bakterielle Konzentration mittels Ausschluß des Organs vom fäkalen Strom vermindert wurde (siehe Abb. 2C). Zusätzlich kam es zu einer Heilung der Gastritis, obwohl sich die Konzentration der Bakterien im Magen nicht verringert hatte (RATH et al., 1999).
Abb. 2: Schematische Darstellung eines physiologischen Kolons mit Zäkum (A), einer selbstfüllenden blinden Schlinge (B) sowie der Ausschluß des Zäkums (C) (RATH et al., 1999).
A: B: Ligatur C: Kolonfistel
Ileum-Kolon-Anastomose
Z: Zäkum; I: terminales Ileum; KT: Kolon transversum; KD: Kolon descendens
LEW-Ratten, denen eine selbstfüllende blinde Schlinge in das Jejunum gelegt und eine Woche später TNBS rektal appliziert wurde, entwickelten eine sekundäre nekrotisierende Entzündung in dieser Schlinge (FREITAG et al., 2000). Diese Studien zeigen, daß Bakterien nicht nur lokal wirken, sondern auch bei der Entstehung und Chronifizierung von Entzündungen an anderen Stellen des Gastrointestinaltraktes eine Rolle spielen.
Ein weiteres Rattenmodell für CED ist die Peptidoglykan-Polysaccharid (PG-PS)-induzierte chronische granulomatöse Enterokolitis (SARTOR et al., 1985; 1996b). PG-PS ist eine Zellwandkomponente von nahezu allen Bakterienspezies. SARTOR et al. (1985; 1996b) injizierten PG-PS von Gruppe-A-Streptokokken intramural in das distale Ileum und Zäkum von Ratten. Dies führte bei den für PG-PS suszeptiblen LEW-Ratten zu einer biphasischen Entzündungsantwort. Zunächst entwickelte sich eine akute Enterokolitis, die nach ein bis zwei Tagen ihren Höhepunkt erreichte und nach 7 bis 9 Tagen zurückging. Nach 12 bis 17 Tagen erfolgte eine spontane Reaktivierung in Form einer aktiven Entzündung, die für mindestens 4 Monate anhielt. Des Weiteren manifestierte sich die Erkrankung bei diesen Ratten in verschiedenen extraintestinalen Organen (Gelenke, Leber, Milz und Blut). Auch SPRD- Ratten erwiesen sich als suszeptibel für PG-PS. Dieser Stamm entwickelte eine mindestens 6 Monate andauernde granulomatöse Enterokolitis, die jedoch nicht mit extraintestinalen Manifestationen assoziiert war. Im Gegensatz zu diesen Ratten entwickelten Ratten der
KT
Z Z Z
KT KT
I I
KD KD I KD
Stämme F344 und BUF lediglich eine vorübergehende akute Darmentzündung nach PG-PS- Injektion (MC CALL et al., 1994; SARTOR et al., 1996b); eine Chronifizierung und extraintestinale Manifestationen traten nicht auf.
2.3.2 Wirkung von Antibiotika auf die Entwicklung der CED
Im humanen Bereich konnte in mehreren Studien gezeigt werden, daß Antibiotika vor allem bei Morbus Crohn effektiv sind, aber auch bei Colitis ulcerosa unterstützend wirken (PRANTERA et al., 1994; TURUNEN et al., 1994; SARTOR et al., 1995; GREENBLOOM et al., 1998; ARNOLD et al., 1999; COLOMBEL et al., 1999). Metronidazol, ein Antibiotikum mit anaerobem Wirkungsspektrum, war bei Morbus Crohn besonders wirksam (KROOK et al., 1981; SUTHERLAND et al., 1991). Patienten, bei denen die Erkrankung lediglich auf den Dickdarm bzw. auf den Dickdarm und Dünndarm beschränkt war, konnten erfolgreicher behandelt werden, als solche, bei denen nur der Dünndarm erkrankt war (SUTHERLAND et al., 1991). In einer Studie von GREENBLOOM et al. (1998) konnte gezeigt werden, daß eine Behandlung von Morbus Crohn-Patienten mit einer Kombination aus Metronidazol und Ciprofloxacin zu einer vorübergehenden Verbesserung des Krankheitsbildes führte. Auch hier fiel auf, daß die Antibiotikatherapie besonders wirkungsvoll war, wenn nicht nur der Dünndarm sondern auch der Dickdarm betroffen waren.
Auch die alleinige Behandlung von Morbus Crohn-Patienten mit Ciprofloxacin führte zu einer Remission (COLOMBEL et al., 1999).
Wie auch beim Menschen wurde die Wirkung verschiedener Antibiotika sowohl auf die Entstehung als auch auf den Verlauf der CED bei unterschiedlichen Tiermodellen untersucht.
So konnte Metronidazol, welches nur gegen anaerobe Bakterien, einschließlich Bacteroides, wirksam ist, (KROOK et al.,1981) die Entstehung einer Kolitis und Gastritis bei HLA-B27- transgenen Ratten verhindern, nicht aber eine bereits etablierte Darmentzündung heilen (RATH et al., 1995; RATH et al., 2001). Ciprofloxacin, welches gegen fast alle Darmbakterien aktiv ist, ausgenommen gegen Gram-negative anaerobe Stäbchen, wie z.B.
Bacteroides, zeigte nur einen partiellen Effekt in der Prävention und ebenfalls keine heilende Wirkung auf die Kolitis (RATH et al., 1998; RATH et al., 2001). Vancomycin/Imipenem, eine Kombination mit extrem breiter Wirkung, auch gegen Bacteroides, war wirksam sowohl in der Prävention als auch in der Therapie (RATH et al., 1998; RATH et al., 2001). Diese Befunde unterstützen nachfolgende Hypothesen. Ein schmales Spektrum intestinaler
Bakterien aus dem anaeroben Milieu ist ausreichend, um die Initiierung der chronischen Darmerkrankung zu unterstützen. Dabei scheinen die unterschiedlichen Bakterienspezies ein ungleich hohes Potential zu besitzen, welches zu der Entstehung einer Kolitis führt (RATH et al., 2001). Für die Chronifizierung einer bereits etablierten Entzündung ist jedoch fast die gesamte Vielzahl der aeroben und anaeroben Darmflora vonnöten (RATH et al., 1998; RATH et al., 2001). Mikrobiologische Untersuchungen vom Darminhalt HLA-B27-transgener Ratten zeigten ferner, daß Vancomycin/Imipenem zu einem initialen Zusammenbruch der bakteriellen Flora führt, die sich aber rasch wieder erholt, obwohl die antiinflammatorische Wirkung noch anhält. Dieser initiale Zusammenbruch ist auch in abgeschwächter Form bei Metronidazol zu sehen. Beide Gruppen zeigten jedoch eine anhaltende veränderte bakterielle Komposition mit einer relativen Verminderung der anaeroben Flora (RATH, et al., 2001).
Ähnliche Ergebnisse ergaben Versuche mit BALB/c-Mäusen im DSS-induzierten Kolitismodell. Metronidazol wirkte präventiv vor Gabe von DSS, konnte jedoch eine bereits durch DSS induzierte Kolitis nicht heilen. Die Breitspektrumantibiotikakombination Vancomycin/Imipenem zeigte sowohl in der Prävention als auch in der Heilung der Kolitis eine Wirkung (RATH et al., 2001). Ferner wurde eine protektive Wirkung der Kombination von Metronidazol und Ciprofloxacin bei der akuten DSS-induzierten Kolitis beschrieben (OHKUSA et al., 1987; HANS et al., 2000).
Eine Behandlung von IL-10-defizienten Mäusen (auf 129Sv/Ev-Hintergrund) mit den Antibiotika Neomycin/Metronidazol bzw. Ciprofloxacin vor Ausbruch der Kolitis führte zu einer Verminderung von schleimhautadhärenten bzw. -invasiven Bakterien, wie z.B.
Clostridium sp., Bacteroides sp. und Viridanz-Streptokoken und verhinderte die Ausbildung einer Kolitis (MADSEN et al., 2000). Wurden die Mäuse mit der Kombination Neomycin/Metronidazol während der bereits etablierten Kolitis behandelt, veränderte sich die Anzahl der schleimhautadhärenten Bakterien nicht und die Kolitis konnte geheilt werden.
Eine Behandlung mit Ciprofloxacin hingegen führte zu einer Reduktion der schleimhautadhärenten Bakterien, konnte die bereits bestehende Kolitis jedoch nicht heilen.
Aus diesen und anderen Befunden schlossen die Autoren, daß adhärente Bakterien in diesem Tiermodell eine wichtige Rolle bei der Initiierung der Kolitis, nicht aber bei der Perpetuation der Kolitis spielen.
2.3.3 Die Rolle des Genus Helicobacter im Krankheitsgeschehen der CED
Das Genus Helicobacter (H.) beinhaltet bis heute mehr als 20 verschiedene Spezies. Einige dieser Spezies werden für die Entstehung von Gastritiden und Enteritiden beim Menschen (QUINN et al., 1983; TOTTEN et al., 1985; BLASER, 1992; BURNENS et al., 1993; LEE et al., 1993) sowie bei verschiedenen Tierarten (FOX et al., 1994) verantwortlich gemacht.
Nachfolgend wird ausschließlich auf die Spezies H. hepaticus, H. bilis und H. typhlonicus eingegangen, da diese mit der Entstehung von CED bei der Maus in Zusammenhang gebracht worden sind.
In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, daß bestimmte Immundefektmutanten (z. B.
Foxn1nu, Prkdcscid, Il10tm1Cgn), die mit H. hepaticus (WARD et al., 1996; FOLTZ et al., 1998;
LI et al., 1998), H. bilis (SHOMER et al., 1998) oder H. typhlonicus (FOX et al., 1999) infiziert sind, wesentlich häufiger und schwerer an chronischen Entzündungen des Dickdarmes erkranken als entsprechende Helicobacter-freie Mutanten. Ferner konnten CAHILL et al. (1997) im CD45RBhigh T-Zelltransfer-induzierten Kolitismodell bei der Prkdcscid-Maus zeigen, daß H. hepaticus-infizierte Empfängertiere deutlich schwerer an CED erkranken als Helicobacter-freie Empfängertiere. Der Zusammenhang zwischen den genannten Helicobacter-Arten und der Entwicklung von CED wurde anschließend durch experimentelle Infektion von immundefizienten, Helicobacter-freien Mäusen im Sinne der Koch'schen Postulate bestätigt. So konnte beispielsweise bei NF-κB-defizienten Mäusen (ERDMANN et al., 2001) und bei T-Zellrezeptor-α/β-defizienten Mäusen (CHIN et al., 2000) eine chronische Typhlokolitis durch Infektion mit H. hepaticus induziert werden. Ähnliche Befunde ergaben Infektionsexperimente mit H. bilis bei Prkdcscid- (SHOMER et al., 1997;
FRANKLIN et al., 1998) und T-Zellrezeptor-α-defizienten Mäusen (BURICH et al., 2001) sowie mit H. typhlonicus bei Prkdcscid-Mäusen (FOX et al., 1999; FRANKLIN et al, 1999).
Unterschiedliche Befunde liegen hingegen für die Rolle von Helicobacter-Spezies im Krankheitsgeschehen bei der Il10tm1Cgn-Maus vor. So konnten KULLBERG et al. (1998;
2001) und BURICH et al. (2001) klinisch und histologisch zeigen, daß Il10tm1Cgn-Mäuse (mit den genetischen Hintergründen C57BL/10SgSnAi, C57BL/10J und C57BL/6J) schon 1,5 bis 3 Wochen nach experimenteller Infektion mit H. hepaticus eine deutlich schwerere CED entwickeln als Helicobacter-freie Il10tm1Cgn-Mäuse. Im Gegensatz dazu stellten MADSEN et al. (2000) und DIELEMANN et al. (2000) keine Assoziation zwischen dem Schweregrad der CED und einer Infektion mit H. hepaticus bei Il10tm1Cgn-Mäusen (mit den genetischen
Hintergründen 129Sv/Ev und C57BL/6J;129P2/OlaHsd) fest. Als mögliche Gründe für die abweichenden Befunde werden von den Autoren Unterschiede in der Versuchsdurchführung, in den Umweltbedingungen, im Alter, Hygienestatus und genetischen Hintergrund der verwendeten Mäuse sowie Unterschiede zwischen den H. hepaticus-Stämmen diskutiert.
Weiterhin konnten FOX et al. (1999) durch experimentelle Infektion mit H. typhlonicus eine CED bei Il10tm1Cgn-Mäusen (mit C57BL/6J;129P2/OlaHsd-Hintergrund) induzieren sowie BURICH et al. (2001) durch experimentelle Infektion mit H. bilis den Verlauf der CED bei Il10tm1Cgn-Mäusen (mit den Hintergründen C57BL/10J und C57BL/6J) potenzieren.
Zusammengefaßt legen diese Daten nahe, daß Infektionen mit den genannten Helicobacter- Spezies zwar keine Voraussetzung für das Entstehen von CED bei Il10tm1Cgn-Mäusen sind, daß sie aber unter bestimmten Umständen den Krankheitsverlauf beschleunigen können.
3 MATERIAL UND METHODEN
In dem ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit wurde eine genetische Kopplungsanalyse an einer IL-10-defizienten Rückkreuzungspopulation in SPF-Haltung durchgeführt. Diese Kopplungsanalyse diente dem Auffinden von genetischen Loci, welche die Suszeptibilität für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) in diesem Modell determinieren.
In einem zweiten Teil wurden keimfreie, IL-10-defiziente Mäuse mit einer definierten Bakteriensuspension infiziert und anschließend auf Erkrankungen im Dickdarmtrakt untersucht. Da IL-10-defiziente Mäuse unter keimfreien Bedingungen keine CED aufweisen, sollte dieser Versuch prüfen, ob durch eine experimentelle Infektion der keimfreien Tiere mit bestimmten Bakterienstämmen eine CED ausgelöst werden kann.
3.1 Genomweite Kopplungsanalyse 3.1.1 Versuchstiere
Als Versuchstiere wurden 143 männliche und 116 weibliche Mäuse mit einem Alter von 42 ± 2 Tagen eingesetzt. Bei den verwendeten Mäusen handelte es sich um Rückkreuzungstiere, für deren Zucht folgende Parentalstämme verpaart wurden: Weibliche Tiere des Stammes C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn (Generation N10F5) wurden mit männlichen Tieren des Stammes C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn (Generation N10F11) verpaart. Weibchen der daraus entstandenen F1-Generation wurden anschließend auf den Stamm C3H/HeJBir@Ztm- Il10tm1Cgn rückgekreuzt: [(C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1 x C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn]N2. Im folgenden wird für diese Rückkreuzungsgeneration die Abkürzung N2(C3H)-Il10tm1Cgn verwendet.
Der Ausgangsstamm C57BL/6J-Il10tm1Cgn wurde 1997 und der Ausgangsstamm C3H/HeJBir- Il10tm1Cgn 1998 von Dr. Mähler aus dem Jackson Laboratory (Maine, USA) an das Zentrale Tierlaboratorium der MHH verbracht.
3.1.2 Haltung und Fütterung
Die Tiere wurden in einem barrieregeschützten Raum (Trockenbarrieresystem) im Zentralen Tierlaboratorium der MHH gehalten. Nach Geschlechtern getrennt saßen die Mäuse jeweils in kleinen Gruppen (2 bis 8 Tiere) in Makrolonkäfigen der Typen II oder III (Firma Ibeco) auf Weichholzgranulat (Fichten- und Tannenholz, Firma Hahn & Co., Typ H3/4). Die Raumtemperatur betrug 20 °C ± 2 °C und die Luftfeuchtigkeit 55 % ± 5 %. Die Beleuchtung erfolgte über Kunstlicht in der Zeit von 6:00 Uhr bis 18:00 Uhr MEZ. Der Tierraum wurde ausschließlich mit Schutzkleidung, bestehend aus Kittel, Überschuhen, Haube, Mundschutz und Handschuhen, betreten.
Ein pelletiertes Alleinfutter (siehe Tabelle 2) sowie Leitungswasser standen den Mäusen ad libitum zur Verfügung.
Tabelle 2: Zusammensetzung des Alleinfutters 1314 (Zuchtdiät für Ratten und Mäuse, Firma Altromin).
Gehalt an
Inhaltsstoffen Prozent % Rohprotein 22,5 Lysin 1,2
Rohfett 5,0 Rohfaser 4,5 Rohasche 6,5 Kalzium 0,9 Phosphor 0,7
Zusatzstoffe Je kg Vitamin A 15000 I.E.
Vitamin D3 600 I.E.
Vitamin E 75 I.E.
Kupfer 5 I.E.
3.1.3 Ermittlung des Hygienestatus
Entsprechend den FELASA-Empfehlungen (NICKLAS et al., 2002) wurde der Keimstatus der Tiere im Rahmen von vierteljährlichen Routineuntersuchungen im Labor von Dr. Mähler überprüft. Bei diesen Untersuchungen wurde lediglich Pasteurella pneumotropica als fakultativ pathogener Erreger nachgewiesen.
Aufgrund der Assoziation zwischen bestimmten Helicobacter-Arten und chronischen Darmentzündungen bei immundefizienten Mäusen (siehe Kapitel 2.3.3) wurde in der vorliegenden Arbeit eine Polymerasekettenreaktion (PCR)-Diagnostik zum Nachweis der Gattung Helicobacter sowie ihrer Spezies Helicobacter (H.) hepaticus, H. bilis und H.
typhlonicus aufgebaut. Diese Methodik kam bei der Gesundheitsüberwachung der IL-10- defizienten Mäuse zum Einsatz. Insgesamt wurden 20 Mäuse beider Parentalstämme untersucht.
Es erfolgte zunächst die Isolierung von Bakterien-DNA mit Hilfe des High Pure PCR Template Preparation Kits (Firma Qiagen) aus frisch entnommenen Kotproben der Mäuse.
Für die Amplifizierung und den Nachweis von Helicobacter-spezifischen DNA-Sequenzen wurde die PCR mit anschließender Gelelektrophorese eingesetzt. Nachfolgend werden die jeweiligen PCR-Protokolle beschrieben. Als positive Kontroll-DNA wurde bereits in dem Labor von Dr. Mähler vorhandene DNA der jeweiligen Helicobacter-Arten und als Negativkontrolle steriles Aqua dest. verwendet.
PCR zum Nachweis der Gattung Helicobacter (Protokoll modifiziert nach RILEY et al., 1996)
Mit dem Primerpaar H276f/H676r läßt sich ein 374-Basenpaarfragment der 16S rRNA Gensequenz aller Helicobacter Spezies (sp.) nachweisen.
Tabelle 3: PCR-Ansatz für eine Probe zum Nachweis von Helicobacter sp.
Volumen Enkonzentration
DNA 2,0 µl
Aqua dest. (steril) 14,37 µl
10x PCR-Puffer 2,5 µl 1x
25 mM MgCl2 1,5 µl 1,5 mM
2,5 mM dNTP Mix 2,0 µl 0,2 mM 20 µM H276f (Primer) 1,25 µl 1,0 µM 20 µM H676r (Primer) 1,25 µl 1,0 µM 5 U/µl TaqPol 0,13 µl 0,65 U Gesamt 25,0 µl
10x PCR-Puffer = 100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl; MgCl2 = Magnesiumchlorid; dNTP = di- Nukleotidtriphosphate; TaqPol = Thermophilus aquaticus Polymerase.
Das Temperaturprofil für die PCR-Reaktion war wie folgt:
1. 94 °C für 3 min.
2. 94 °C für 30 sec.
3. 53 °C für 30 sec.
4. 72 °C für 30 sec.
5. Schritte 2-4 werden 34x wiederholt 6. 72 °C für 10 min.
7. 4 °C bis zur Entnahme der Proben aus dem Thermocycler.
PCR zum Nachweis von H. hepaticus
(Protokoll modifiziert nach SHAMES et al., 1995)
Mit dem Primerpaar B38/B39 läßt sich ein H. hepaticus spezifisches 417-Basenpaarfragment der16S rRNA Gensequenz nachweisen.
Tabelle 4: PCR-Ansatz für eine Probe zum Nachweis von H. hepaticus.
Volumen Enkonzentration
DNA 2,0 µl
Aqua dest. (steril) 14,11 µl 10x PCR-Puffer 2,5 µl
25 mM MgCl2 3,0 µl 1x
2,5 mM dNTP Mix 2,0 µl 0,2 mM 20 µM B38 (Primer) 0,63 µl 0,5 µM 20 µM B39 (Primer) 0,63 µl 0,5 µM 5 U/µl TaqPol 0,13 µl 0,65 U Gesamt 25,0 µl
10x PCR-Puffer = 100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl; MgCl2 = Magnesiumchlorid; dNTP = di- Nukleotidtriphosphate; TaqPol = Thermophilus aquaticus Polymerase.
Das Temperaturprofil für die PCR-Reaktion war wie folgt:
1. 94 °C für 1 min.
2. 65 °C für 1min.
3. 72 °C für 1min
4. Schritte 1-3 werden 35x wiederholt 5. 72 °C für 7 min.
6. 4 °C bis zur Entnahme der Proben aus dem Thermocycler.
PCR zum Nachweis von H. bilis
(Protokoll modifiziert nach FOX et al., 1995)
Mit dem Primerpaar C62/C12 läßt sich ein H. bilis spezifisches 638-Basenpaarfragment der 16S rRNA Gensequenz nachweisen.
Tabelle 5: PCR-Ansatz für eine Probe zum Nachweis von H. bilis.
Volumen Enkonzentration
DNA 2 µl
Aqua dest. (steril) 14,56 µl
10x PCR-Puffer 2,5 µl 1x
25 mM MgCl2 2,25 µl 2,25 mM
2,5 mM dNTP Mix 2,0 µl 0,2 mM 20 µM C62 (Primer) 0,63 µl 0,5 µM 20 µM C12 (Primer) 0,63 µl 0,5 µM 5 U/µl TaqPol 0,13 µl 0,65 U Gesamt 25,0 µl
10x PCR-Puffer = 100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl; MgCl2 = Magnesiumchlorid; dNTP = di- Nukleotidtriphosphate; TaqPol = Thermophilus aquaticus Polymerase.
Das Temperaturprofil für die PCR-Reaktion war wie folgt:
1. 94 °C für 3 min.
2. 94 °C für 1min.
3. 57 °C für 1min. 27 sec.
4. 72 °C für 2min. 18 sec.
5. Schritte 2-4 werden 33x wiederholt 6. 72 °C für 5 min.
7. 4 °C bis zur Entnahme der Proben aus dem Thermocycler.
PCR zum Nachweis von H. typhlonicus
(Protokoll modifiziert nach FRANKLIN et al., 1999)
Mit dem Primerpaar Ht184f/Ht640r läßt sich ein H. typhlonicus spezifisches 474- Basenpaarfragment der 16S rRNA Gensequenz nachweisen.
Tabelle 6: PCR-Ansatz für eine Probe zum Nachweis von H. typhlonicus.
Volumen Enkonzentration
DNA 2 µl
Aqua dest. (steril) 14,37 µl
10x PCR-Puffer 2,5 µl 1x
25 mM MgCl2 1,5 µl 1,5 mM
2,5 mM dNTP Mix 2,0 µl 0,2 mM 20 µM Ht184f (Primer) 1,25 µl 1.0 µM 20 µM Ht640r (Primer) 1,25 µl 1.0 µM 5 U/µl TaqPol 0,13 µl 0,65 U Gesamt 25,0 µl
10x PCR-Puffer = 100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl; MgCl2 = Magnesiumchlorid; dNTP = di- Nukleotidtriphosphate; TaqPol = Thermophilus aquaticus Polymerase.
Das Temperaturprofil für die PCR-Reaktion war wie folgt:
1. 94 °C für 3 min.
2. 94 °C für 30 sec.
3. 53 °C für 30 sec.
4. 72 °C für 30 sec.
5. Schritte 2-4 werden 34x wiederholt 6. 72 °C für 10 min.
7. 4 °C bis zur Entnahme der Proben aus dem Thermocycler.
Alle im Rahmen der oben genannten PCRs verwendeten Primer wurden über die Firma Roth als Lyophilisat bezogen und entsprechend den Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest.
rekonstituiert. Der 10x PCR-Puffer, das 25 mM MgCl2, die 2,5 mM di-Nukleotidtriphosphate und die Taq-Polymerase wurden bei der Firma Perkin Elmer bestellt. Während des gesamten Pipettiervorgangs lagerten alle verwendeten Reagenzien sowie die Reaktionsgefäße (0,5 ml PCR-Tubes, Firma Biozym) auf einer Kühlplatte.
Die Darstellung der PCR-Produkte erfolgte mittels Agarosegel-Elektrophorese. Verwendet wurden 50 ml 1,5 % (w/v) SeaKem (Firma FMC BioProducts) Agarosegele, für deren Herstellung das Agarosepulver in 1x TBE-Puffer (hergestellt aus 10x TBE-Puffer, 1:10 verdünnt mit Aqua dest.) in einem Glasgefäß unter Aufkochen in einer Mikrowelle gelöst wurde. Unter ständigem Rühren wurde das Gel bis auf 50 °C abgekühlt und 4 µl Gel Star
(10.000fach konzentriert, Firma Biozym) hinzugefügt. Die Gellösung wurde in einem 7,4 x 5,8 cm großen Kunststoffschlitten (Firma Roth) ausgegossen. Dieser wurde zuvor mit einem bzw. zwei Gelkämmen mit jeweils 8 oder 12 Zähnen und einer Dicke von 1 mm bestückt. Die Gelstärke betrug etwa 0,5 cm. Nach 20 min. war das Gel auspolymerisiert, die Kämme wurden gezogen und die mit 1x TBE gefüllte Elektrophoresekammer (Typ Mini/L721.1, Firma Roth) mit dem Gel bestückt. Jede PCR-Probe wurde mit 5 µl Ladepuffer (0,05 % Orange G, Firma Sigma) versetzt und von diesem Gemisch 12 µl pro Probe in die einzelnen Geltaschen einpipettiert. Um die Basenpaarlänge der in der PCR amplifizierten DNA-Stränge beurteilen zu können, wurden 5 µl einer Basenpaarleiter (DNA-Längenstandard XIV, 100 Basenpaarleiter, 250 µg/ml, Firma Roche) in eine separate Geltasche einpipettiert.
Dieser Längenmaßstab wurde bei jeder Gelelektrophorese mitgeführt. Die Elektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur bei einer Spannung von 90 Volt und einer Stromstärke von 90 mA für eine Dauer von etwa 1 Stunde. Die Ergebnisse wurden auf einem UV- Transilluminator (Firma Bachofer) bei 312 nm Wellenlänge ausgewertet und mit einer Sofortbildkamera (CRT instant camera, Firma Ormaf) auf einem Papierbild (Polapan
schwarz-weiß Film, Firma Polaroid) festgehalten.
Reagenzien:
Zusammensetzung der verwendeten Orange G-Lösung (0,05 %):
30 ml 99 % Glyzerin (Firma Sigma) 70 ml steriles Aqua dest.
0,05 g Orange G in Pulverform (Firma Sigma).
Zusammensetzung des verwendeten 10x TBE:
121 g Tris-Puffer (Firma Roth) 55,5 g Borsäure (Firma Roth) 9,3 g EDTA (Firma Merk) 1000 ml Aqua dest.
pH-Wert 8,3.
3.1.4 Phänotypisierung
Die in dem Kapitel 3.1.1 beschriebenen Versuchstiere wurden narkotisiert (Kapitel 3.1.4.1) und gewogen (Kapitel 3.1.4.2) Es folgte eine retrobulbäre Blutentnahme (Kapitel 3.1.4.3) für die Ermittlung der absoluten Leukozytenzahl (Kapitel 3.1.4.4). Anschließend wurden die Mäuse getötet und seziert. Im Rahmen der Sektion wurde die Milz zur Bestimmung des relativen Milzgewichtes (Kapitel 3.1.4.5.1) entnommen. Des Weiteren wurden Zäkum und Kolon einschließlich des Rektums für die histologische Beurteilung der Darmentzündung entnommen (Kapitel 3.1.4.5.2).
3.1.4.1 Narkose
Die Narkose erfolgte in Form einer Ätherinhalationsnarkose. Hierzu wurden ca. 10 ml Äther und mehrere Lagen Zellstoff in ein verschließbares Glasgefäß verbracht. Die Mäuse wurden einzeln in dieses Gefäß gesetzt und sofort nach Eintritt der Narkose (nach ca. 20 sec.) wieder entnommen.
3.1.4.2 Körpergewicht
Nach Eintritt der Narkose wurden die Mäuse mit Hilfe einer elektronischen Waage (Firma Satorius, MC1 Laboratory LC 6200D) gewogen.
3.1.4.3 Blutentnahme
Das Blut wurde aus dem retrobulbären Venenplexus der Mäuse entnommen. Zu diesem Zweck wurden die narkotisierten Mäuse mit dem zu punktierenden Auge nach oben auf die Arbeitsplatte gelegt. Mit Zeigefinger und Daumen der einen Hand wurde die lockere Nackenhaut so fixiert, daß es zur Stauung der Vena jugularis kam. Mit der anderen Hand wurde retrobulbär eine 20 µl heparinbeschichtete Mikrohämatokrit-Kapillare (Firma Brand) unter leichten Drehbewegungen vorsichtig am Bulbus vorbei in okzipitaler Richtung etwa 2 mm tief eingeführt. Nach Punktion des retrobulbären Venenplexus konnten ca. 1,5 - 2 ml Blut gewonnen werden, welches in EDTA-Monovetten (2,7 ml S-Monovetten, Firma Sarstedt) aufgefangen wurde. Nach Lösen des Drucks auf die Vena jugularis wurde die Kapillare entfernt.
3.1.4.4 Ermittlung der absoluten Leukozytenzahl
Die Ermittlung der absoluten Leukozytenzahl diente dem Auffinden einer eventuellen Korrelation zwischen dem Krankheitsgrad der Tiere und deren Leukozytenanzahl pro µl Blut.
Verwendet wurde eine Leukozytenmischpipette (Firma Brand), in die das entnommene EDTA-Blut bis zur Marke 1 und anschließend Essigsäure-Gentianaviolettlösung (Türks- Lösung, Firma Merk) bis zur Marke 1,1 aufgezogen wurde, so daß eine Verdünnung von 1:10 vorlag. Nach mehrminütiger Rotation der Pipette auf einem Mikro-Mix 4 (Firma Omnilab) wurden die ersten drei Tropfen des Blut-Gentianaviolett-Gemisches verworfen und anschließend ein Zählfach einer Bürker-Zählkammer mit einem Tropfen aus der Leukozytenmischpipette bestückt. Die durch die Farblösung sichtbar gewordenen Leukozyten wurden bei 100-facher Vergrößerung mit einem Mikroskop (Firma Leitz) ausgezählt. Es wurden mindestens 100 Leukozyten gezählt. Das Volumen eines Zählfeldes betrug 1/250 µl.
Die Berechnung der Leukozytenzahl pro µl Blut erfolgte unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (1:10) nach folgender Formel:
3.1.4.5 Sektion
Nach erfolgter Blutentnahme und Tötung der Mäuse per Genickbruch erfolgte das Abtrennen von Ohren und Schwanzspitze sowie die Sektion mit anschließender Organentnahme (Kapitel 3.1.4.5.1 u. 3.1.4.5.2). Beide Ohren und die Schwanzspitze wurden zur späteren DNA- Isolierung in sterile 2 ml Reaktiosgefäße (Firma Eppendorf) überführt und bei -80 °C gelagert.
3.1.4.5.1 Bestimmung des relativen Milzgewichtes
Nach Eröffnung der Bauchhöhle von der Medianen aus wurden die Milzen in toto entnommen und nach Entfernen des anhängenden Fettes mittels einer Analysenwaage (Firma Sartorius) gewogen. Bis zum Wiegen erfolgte eine maximal einstündige Aufbewahrung der Milzen in einer feuchten Kammer, um einen Gewichtsverlust durch Austrocknen zu verhindern. Zur Herstellung der feuchten Kammer wurde destilliertes Wasser verwendet.
Als phänotypisches Merkmal wurde der prozentuale Anteil des Milzgewichtes bezogen auf das Körpergewicht der entsprechenden Maus (relatives Milzgewicht) bestimmt.
3.1.4.5.2 Entnahme und Präparation des Dickdarms
Im Anschluß an die Milzentnahme erfolgte die Präparation von Zäkum und Kolon einschließlich des Rektums. Die jeweiligen Darmabschnitte wurden in toto entnommen, durch leichtes Ausstreichen manuell entleert und mit Hilfe einer Spritze, die mit einer 10 %igen gepufferten Formalinlösung gefüllt war, durchspült und anschließend mit dieser Formalinlösung gefüllt. Die Anteile Kolon und Rektum wurden zwischen zwei 1 x 2 cm große Filterpapiere geheftet. Dabei befand sich das proximale Kolon zentral und die weiteren Kolonabschnitte (mittleres Kolon, distales Kolon einschließlich Rektum) wurden in Form
Blut.
µl pro Leukozyten der
Anzahl
10 250 Felder
en ausgezählt der
Anzahl
Leukozyten gezählten
der
Anzahl × × =
einer Schnecke aufgerollt („Swiss-Roll“, MOOLENBEEK et al., 1981; siehe Abb.3). Zäkum und „Swiss-Roll“ wurden anschließend in ein mit 10 %iger gepufferter Formalinlösung gefülltes Glasgefäß überführt.
Abb.3: Schematische Zeichnung einer „Swiss-Roll“.
Reagenzien:
Verwendete Formalinlösung: Neutrales Formalin nach Sörensen (10 %):
Puffer A: 13,6 g Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 (Firma Merck) in 1000 ml Aqua dest.
Puffer B: 17,7 g Dinatriumhydrogenphosphat-2-hydrat Na2HPO4*2H2O (Firma Merck) in 1000 ml Aqua dest.
Für 1 Liter Formalinlösung:
352,8 ml Puffer A + 547,2 ml Puffer B + 100 ml Formalin (35-37 %, Firma Merck).
3.1.4.6 Histologische Untersuchungen
Die histologische Untersuchung von Zäkum und Kolon einschließlich des Rektums diente der Beurteilung der Schwere der Entzündung in diesen Organteilen. Hierzu wurden von Zäkum und Kolon einschließlich des Rektums Paraffinschnitte angefertigt und diese mit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung angefärbt. Die Auswertung der histologischen Präparate erfolgte mit Hilfe eines semiquantitativen Scores.
Proximales Kolon Distales
Kolon und Rektum
Mittleres Kolon
