Untersuchungen zur genetischen Disposition für chronische Darmentzündungen bei der IL10-defizienten Maus
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Claudia Most
aus Dortmund
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
2. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2001
Die vorliegende Arbeit war Bestandteil des Teilprojektes C16 im Sonderforschungsbereich 280 („Gastrointestinale Barriere”).
Meinen Eltern &
Geschwistern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 9
2 Literaturübersicht 11
2.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen 11
2.1.1 Definition 11
2.1.2 Epidemiologie 11
2.1.3 Ätiologie und Pathogenese 11
2.1.4 Klinik und Pathologie der CED 13
2.2 Genetik der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen beim Menschen 14
2.3 Tiermodelle für CED 15
2.4 Interleukin-10 defiziente (Il10tm1Cgn) Maus 18
2.4.1 Klinische Befunde 19
2.4.2 Histopathologie des Intestinaltraktes 19
2.4.3 Pathogenese 20
2.5 Genetische Marker 21
2.5.1 Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs) 21
2.5.2 Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) 22
2.5.3 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPDs) 23
2.5.4 Simple Tandem Repeats (STRs) 23
2.6 Genkarten 24
2.6.1 Physikalische Genkarte 24
2.6.2 Kopplungskarte 25
3 Material und Methoden 27
3.1 Versuchsaufbau 27
3.2 Versuchstiere 27
3.2.1 C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn 28
3.2.2 C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn 28
3.2.3 (C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1 28
3.2.4 (C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1 x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn 28
3.2.5 C57BL/6J@Ztm 28
3.2.6 C3H/HeJBir@Ztm 29
3.3 Haltung und Fütterung 29
3.4 Phänotypisierung 30
3.4.1 Narkose und Wiegen der Mäuse 31
3.4.2 Entnahme des Blutes zur Ermittlung der absoluten Leukozytenzahlen sowie zur Herstellung von Differentialblutbildern und zur Plasmagewinnung 31
3.4.2.1 Blutentnahme 31
3.4.2.2 Ermittlung der absoluten Leukozytenzahlen 32
3.4.2.3 Differentialblutbild 32
3.4.2.4 Plasmagewinnung 34
3.4.3 Bestimmung des Serum-Amyloid-A-Gehaltes 34
3.4.4 Bestimmung des relativen Milzgewichtes 36
3.4.5 Entnahme und Präparation des Dickdarms 36
3.4.6 Histologische Untersuchungen 37
3.4.6.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 37
3.4.6.2 Auswertung der histologischen Präparate 37
3.5 Nachweis von genetischen Markern 39
3.5.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) 39
3.5.2 Einstellen der DNA-Konzentration 40
3.5.3 Markerauswahl 40
3.5.4 Markertestung auf Polymorphismen 41
3.5.4.1 Polymerase- Kettenreaktion 45
3.5.4.2 Agarosegel-Elektrophorese 49
3.6 Genotypisierung 50
3.7 Statistische Auswertung 50
4 Ergebnisse 53
4.1 Makroskopisch-anatomische Krankheitsmerkmale 53
4.2 Phänotypisierung 53
4.2.1 Histologische und immunologische Merkmale der untersuchten Mäuse- stämme 53
4.2.2 Geschlechtsspezifische Unterschiede in den phänotypischen Merkmalen 57
4.2.3 Wechselbeziehungen zwischen den immunologischen und histologischen Merkmalen bei den Il10tm1Cgn-Mäusen 61
4.3 Kopplungsanalyse 65
5 Diskussion 81
5.1 Diskussion der Methodik 81
5.1.1 Versuchstiere 81
5.1.2 Phänotypisierung 83
5.1.3 Genotypisierung 83
5.2 Diskussion der Ergebnisse 85
5.2.1 Absolute Leukozytenzahl 85
5.2.2 Differentialblutbild 85
5.2.3 SAA 86
5.2.4 Relatives Milzgewicht 87
5.2.5 Histologie 87
5.2.6 Kopplungsanalyse 88
5.3 Genetische Homologien zwischen Maus und Mensch 89
5.4 Ausblick 90
6 Zusammenfassung 92
7 Summary 94
8 Literaturverzeichnis 96
9 Anhangstabellen 113
Abkürzungsverzeichnis
Aqua bidest. = Aqua bidestillata Aqua dest. = Aqua destillata
bp = Basenpaar
CED = chronisch entzündliche Darmerkrankungen
cM = Centi-Morgan
DNA = Desoxyribonukleinsäure
DSS = Dextran Sulfate Sodium EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure
H.E. = Hämatoxylin-Eosin
HSA = Bezeichnung für Chromosomen vom Homo sapiens H2 = Haupthistokompatibilitätskomplex der Maus IBD = Inflammatory bowel disease
I.E. = Internationale Einheit
Ig = Immunglobulin
IL = Interleukin
Il10tm1Cgn-Maus = IL10-defiziente Maus
kbp = Kilobasenpaar
kDa = Kilodalton
kPa = Kilopascal
mA = Milliampere
MEZ = Mitteleuropäische Zeit
MHC = major histocompatibility complex MHH = Medizinische Hochschule Hannover
MMU = Bezeichnung für Chromosomen von Mus musculus PCR = Polymerase chain reaction; Polymerase-Kettenreaktion
SAA = Serum-Amyloid-A
SPF = spezifiziert pathogenfrei
Taq = Thermophilus aquaticus
Th-Zellen = T-Helfer-Zellen
TNBS = trinitrobenzene sulfonic acid
UV = ultraviolett
1 Einleitung
Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind chronisch entzündliche Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes. Der Altersgipfel der Krankheitsmanifestation liegt im 2. bis 3.
Lebensjahrzehnt. Aufgrund ihres chronischen, in Schüben verlaufenden Charakters findet sich eine hohe Beeinträchtigung von Lebensqualität und sozioökonomischer Leistungsfähigkeit der Erkrankten. Langzeitfolge einer chronischen Entzündung des Kolons durch diese Krankheitsbilder ist eine deutlich erhöhte Inzidenz in der Entwicklung des kolorektalen Adenokarzinoms. Beide chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) sind weltweit verbreitet; in Westeuropa und den USA liegt die Prävalenz bei 100-200/100.000 Einwohnern (DUERR et al. 1998).
Die Ursachen der CED sind weitgehend unklar. Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der CED. Wesentliche Studien unterstützen die Hypothese einer genetisch bedingten inadäquaten Immunantwort auf Umweltfaktoren wie die normale Darmflora (BERG et al. 1996; SELLON et al. 1998;
HUGOT et al. 2001; OGURA et al. 2001). Eine genetische Disposition für CED läßt sich ableiten aus der erhöhten Prävalenz in bestimmten ethnischen Bevölkerungsgruppen, der erhöhten Prävalenz bei Verwandten ersten Grades von Patienten mit CED und der hohen Konkordanzrate für die Erkrankung bei monozygoten Zwillingen (DUERR 1996). Die Suche nach prädisponierenden Genen bei der CED des Menschen wird jedoch durch unvollständige Penetranz, oligogenetische Kontrolle und genetische Heterogenität erschwert. Durch genomweite Analysen konnten bisher vier Suszeptibilitätsloci für CED auf den Chromosomen 16 (HUGOT et al. 1996), 12 (SATSANGI et al. 1996), 6 (HAMPE et al. 1999b) und 14 (DUERR et al. 2000) beim Menschen identifiziert werden. Die involvierten Gene sind aber mit Ausnahme des Gens für den intrazellulären Lipopolysaccharid-Rezeptor NOD2 auf Chromosom 16 (HUGOT et al. 2001; OGURA et al. 2001) weiterhin unbekannt.
In den letzten Jahren sind zahlreiche Tiermodelle, vor allem Mausmodelle, für CED beschrieben worden (ELSON et al. 1995). Sie eignen sich vor allem zum Studium der genetischen, immunologischen und umweltbedingten Faktoren, die eine initiierende Rolle im Krankheitsgeschehen der CED spielen. Für das Studium der genetischen Faktoren, die die Suszeptibilität für CED im Tiermodell regulieren, eignet sich besonders das Modell der IL10-
defizienten (Il10tm1Cgn) Maus. Il10tm1Cgn-Mäuse weisen ähnlich wie der Mensch genetisch determinierte Unterschiede in der Suszeptibilität für CED auf. So zeigten Untersuchungen am Jackson Laboratory (Maine, USA), daß Il10tm1Cgn-Mutanten, bei denen der Inzuchtstamm C3H/HeJBir den genetischen Hintergrund bildet, unter gleichen Haltungsbedingungen wesentlich schwerer erkranken als entsprechende Mutanten auf C57BL/6J-Hintergrund (BRISTOL et al. 2000).
Die vorliegende Arbeit war Bestandteil des Teilprojektes C16 im Sonderforschungsbereich 280 („Gastrointestinale Barriere”). Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Erbganges der CED-Suszeptibilität im Modell der Il10tm1Cgn-Maus und die Bestimmung chromosomaler Regionen, die suszeptibilitätsvermittelnde Gene für CED enthalten. Zu diesem Zweck wurde die Erkrankung zunächst bei den Stämmen C3H/HeJBir@Ztm- Il10tm1Cgn, C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn und (C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm- Il10tm1Cgn)F1 mittels histologischer und immunologischer Parameter charakterisiert.
Anschließend erfolgte die Ermittlung von Suszeptibilitätsregionen durch eine genomweite Kopplungsanalyse (mittels genetischer Marker) an Mäusen der 1. Rückkreuzungsgeneration auf den partiell resistenten Stamm C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn. In Ergänzung zu der vorliegenden Arbeit wird gegenwärtig in einer weiteren Dissertationsarbeit eine entsprechende Kopplungsanalyse an Mäusen der 1. Rückkreuzungsgeneration auf den suszeptiblen Stamm C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn durchgeführt.
Aufgrund der sehr hohen genetischen Homologie zwischen Maus und Mensch ist davon auszugehen, daß die Gene, die bei der Maus den Phänotyp der CED modifizieren, auch beim Menschen eine Rolle spielen, Einsicht in die Pathogenese der CED und neue Ansätze für Therapie und Prophylaxe geben.
2 Literaturübersicht
2.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen
2.1.1 Definition
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind ein allgemeiner Begriff für eine Gruppe chronisch entzündlicher rezidivierender Störungen des Intestinaltraktes mit unbekannter Ursache. Sie werden in die Hauptgruppen Colitis ulcerosa und Morbus Crohn eingeteilt (PODOLSKY 1991).
2.1.2 Epidemiologie
In Westeuropa und den USA liegt die Prävalenz der CED bei etwa 100-200 Fällen/100.000 Einwohnern (DUERR et al. 1998). Dabei sind weiße Bevölkerungsgruppen häufiger betroffen als schwarze und asiatische Bevölkerungsgruppen. Innerhalb der weißen Bevölkerungsgruppen weisen Juden (besonders Aschkenasim-Juden) eine um 3-6mal höhere Inzidenz auf als Nichtjuden. Beide Geschlechter sind gleichermaßen betroffen (DUERR 1996; DUERR et al. 1998). Der Altersgipfel der Krankheitsmanifestation liegt im 2. bis 3.
Lebensjahrzehnt (DUERR 1996).
Es besteht eine familiäre Häufung für CED. Nach Schätzungen haben etwa 2-5% der an Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa Erkrankten in ihrer Verwandtschaft weitere Personen mit gleichem Krankheitsbild (DUERR 1996). Derartige epidemiologische Häufungen sprechen ursächlich entweder für genetische und/oder für umweltbedingte Faktoren (FIOCCHI 1998).
2.1.3 Ätiologie und Pathogenese
Trotz intensiver Forschungsanstrengungen ist die Ätiologie und Pathogenese der CED weitgehend unklar. Es gibt Hinweise, daß umweltbedingte, immunologische und genetische Faktoren eine Rolle spielen. Zu den umweltbedingten Faktoren zählen u. a. Rauchen, Ernährung, Hygiene, Klima, Umweltverschmutzung und Streß (FIOCCHI 1998).
Eine infektiöse Ursache für CED kann ebenfalls nicht ausgeschlossen werden. Da beim Morbus Crohn histologische Ähnlichkeiten mit der Tuberkulose festzustellen sind, wird
diskutiert, ob Mykobakterien, speziell Mycobacterium avium subspezies paratuberculosis, die Krankheit versursachen können (CHIODINI et al. 1984; FIOCCHI 1998). Bei einigen an Morbus Crohn erkrankten Patienten wurden signifikant erhöhte Serumantikörpertiter gegen Mycobacterium avium subspezies paratuberculosis gefunden (FIOCCHI 1998). Andere Diskussionen gehen in die Richtung, daß auch Masernviren ursächlich für CED verantwortlich sein können (FIOCCHI 1998). So zeigten elektronenmikroskopische Untersuchungen von intravaskulären Granulomen bei Morbus Crohn-Patienten die Anwesenheit von Paramyxovirus-ähnlichen Partikeln, die sich immunhistologisch als Masernviruspartikel erwiesen (WAKEFIELD et al. 1991; FIOCCHI 1998).
Die Gewebeschädigung der Darmschleimhaut bei CED wird durch das Immunsystem des Darmes bewirkt (SHANAHAN und TARGAN 1987). Bei diesen Prozessen könnte eine Autoimmunreaktion durch eine Störung der immunologischen Toleranz bzw. eine unspezifische Schädigung durch eine überschießende Reaktion auf exogene Antigene, verursacht durch eine defekte Regulation des intestinalen Immunsystems, eine Rolle spielen.
Das häufige Auftreten von Autoantikörpern gegen Bestandteile von Granulozyten bei Patienten mit CED (62% der Patienten mit Colitis ulcerosa, 4% der Patienten mit Morbus Crohn) unterstützt die Hypothese der Autoimmunpathogenese (SEIBOLD et al. 1996).
Patienten mit CED weisen ferner eine vermehrte Produktion von durch Monozyten/Makrophagen oder Granulozyten synthetisierten Entzündungsmediatoren (wie zum Beispiel Prostaglandine, Leukotriene, Plättchen-aktivierender Faktor und Zytokine) auf (MEENAN 1995). Bezüglich der lymphozytären Zytokinsynthese findet sich bei Patienten mit Morbus Crohn ein Th-1-typisches Zytokinmuster (vermehrte Produktion von Tumornekrosefaktor, Interleukin-2 und Interferon γ), während bei Patienten mit Colitis ulcerosa ein Th-2-typisches Zytokinmuster (vermehrte Produktion von Interleukin-4, Interleukin-5 und Interleukin-10) vorliegt (FIOCCHI 1998).
Die genetischen Faktoren werden ausführlich in Kapitel 2.2 beschrieben.
2.1.4 Klinik und Pathologie der CED
Leitsymptom der CED ist Durchfall. Während er bei Colitis ulcerosa blutig-schleimig ist, wird bei Morbus Crohn häufig kein Blut im Stuhl gefunden. Weitere Symptome der CED sind Fieber, Abdominalschmerz, allgemeine Ermüdbarkeit und Gewichtsverlust (PODOLSKY 1991; FIOCCHI 1998).
Der Morbus Crohn kann an jeder Stelle des Gastrointestinaltraktes (vom Mund bis zum Anus) vorkommen, wobei die Lokalisation der Entzündung im terminalen Ileum und Kolon überwiegt. Er präsentiert sich häufig diskontinuierlich. Stark befallene Darmsegmente sind durch Bereiche von scheinbar normalem Darm getrennt. Die Erkrankung ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß sich die Entzündung über sämtliche Schichten der Darmwand erstreckt.
Makroskopisch erscheint das terminale Ileum hyperämisch und aufgelockert. Die Mesenteriallymphknoten sind geschwollen und gerötet. Mit dem Fortschreiten der Erkrankung erscheint die Darmwand stark verdickt, lederartig und das Lumen ist verengt.
Eine Stenose kann an jeder Stelle des Darmes auftreten und in unterschiedlichen Ausmaßen zu mechanischen Obstruktionen führen. Der Entzündungprozeß betrifft vorwiegend die tiefen Wandschichten, besonders die Submukosa, die durch Ödeme und dichte lymphozytäre Infiltrationen verdickt und mit Lymphfollikeln durchsetzt ist. Zusätzlich sind tuberkuloide Knötchen mit Epitheloid- und Riesenzellen zu finden. Der Prozeß führt zu Fissuren, Ulzerationen, Fistelbildungen und Stenosen (PODOLSKY 1991).
Die Colitis ulcerosa beginnt meistens distal im Rektum und breitet sich kontinuierlich nach proximal zum Kolon aus. Das Rektum ist stets befallen. Makroskopisch werden das frische Stadium und das chronisch-fortgeschrittene Stadium unterschieden. Beim frischen Stadium wird eine entzündlich gerötete, ödematöse Schleimhaut, die bei externem Kontakt blutet, beobachtet. Eine normale Gefäßzeichnung ist nicht mehr erkennbar. Schleimhautulzerationen sind nicht zu beobachten. Beim chronisch-fortgeschrittenen Stadium führen rezidivierende Ulzerationen zur Schleimhautzerstörung mit Verlust des normalen Faltenreliefs. Die restlichen Schleimhautinseln heben sich als „Pseudopolypen“ hervor. Histologisch sind Infiltrationen der Schleimhaut überwiegend mit Lymphozyten und Histiozyten, Schleimhautatrophie, kleine Kryptabszesse, Zerstörung des Kryptenepithels, unregelmäßiges Kryptenepithel und submuköse Ödeme festzustellen (PODOLSKY 1991).
2.2 Genetik der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen beim Menschen
Eine genetische Disposition für CED läßt sich ableiten aus der erhöhten Prävalenz in bestimmten ethnischen Bevölkerungsgruppen, der erhöhten Prävalenz bei Verwandten ersten Grades von CED-Patienten und der hohen Konkordanzrate für die Erkrankung bei monozygoten Zwillingen (DUERR 1996). Die Suche nach prädisponierenden Genen bei der CED des Menschen wird erschwert durch unvollständige Penetranz, oligogenetische Kontrolle und genetische Heterogenität (DUERR 1996). Zu den Kandidatengenen, die möglicherweise an der Pathogenese der CED beteiligt sind, gehören die Klasse I- und Klasse II-Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA), die Gene für das Peptidtransportermolekül ABCB3 (frühere Bezeichnung: TAP2), den T-Zell- Rezeptorkomplex, das Komplementprotein C3, den Interleukin-1-Rezeptorantagonisten, den Tumornekrosefaktor alpha, das Adhäsionsmolekül ICAM-1 (DUERR 1996) und das Membrantransportprotein SLC11A1 (solute carrier family 11, member 1; frühere Bezeichnung: NRAMP) (HOFMEISTER et al. 1997) sowie das DNA-Reparaturgen MLH1 (POKORNY et al. 1997). Durch genomweite Kopplungsanalysen bei Familien mit CED wurden bisher vier Suszeptibilitätsloci für CED (IBD 1-4, engl.: inflammatory bowel disease) auf den Chromosomen 16, 12, 6 und 14 identifiziert. Eine französische Gruppe berichtete von einem Suszeptibilitätslocus IBD1 für Morbus Crohn auf Chromosom 16 bei nordwesteuropäischen Familien (HUGOT et al. 1996). Dieser Befund wurde nachfolgend bei Familien aus Großbritannien (PARKES et al. 1996), den USA (OHMEN et al. 1996; CHO et al. 1998; BRANT et al. 1998), Australien (CAVANAUGH et al. 1998) und Nordeuropa (CURRAN et al. 1998; HAMPE et al. 1999a) bestätigt. Daten einer anderen europäischen Untersuchung deuten an, daß IBD1 auch zur Suszeptibilität für Colitis ulcerosa beitragen kann (MIRZA et al. 1998). Fünf Jahre nach der Erstbeschreibung von IBD1 haben zwei Forschungsgruppen unabhängig voneinander das beteiligte Gen identifizieren können (HUGOT et al. 2001; OGURA et al. 2001). Es handelt sich um das Gen für den intrazellulären Lipopolysaccharid-Rezeptor NOD2. NOD2 wird in Monozyten exprimiert und aktiviert nach Bindung bakterieller Lipopolysaccharide den Transkriptionsfaktor NF-κB, der wiederum die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokine hochreguliert. Etwa 15% der Morbus Crohn-Patienten besitzen aufgrund einer Insertionsmutation mit Verschiebung des Leserasters im NOD2-Gen ein verkürztes NOD2-Protein (OGURA et al.
2001). Wie dieses veränderte Protein zu der Erkrankung führt, ist jedoch noch unklar.
Desweiteren ergaben sich Anhaltspunkte für epistatische Wechselwirkungen zwischen IBD1 und einem möglichen Suszeptibilitätslocus auf Chromosom 1p (CHO et al. 1998). Letztere Studie lieferte ferner Hinweise für die Anwesenheit von CED-assoziierten Loci auf den Chromosomen 3q und 4. Eine britische Gruppe fand eine signifikante Kopplung mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa auf Chromosom 12 (IBD2) und Hinweise für Kopplung auf den Chromosomen 3p und 7 (SATSANGI et al. 1996). Die Chromosom-12-Kopplung wurde anschließend bei nordamerikanischen (DUERR et al. 1998) und europäischen Familien mit CED (CURRAN et. al. 1998; HAMPE et al. 1999a) repliziert. Die Untersuchungen von HAMPE et al. (1999a) bestätigten die Chromosom-4-Kopplung und lieferten neue Hinweise für Kopplung auf den Chromosomen 1q, 6, 10, 22 und X. Hinweise für Kopplung auf Chromosom 6 fanden sich auch in einer kanadischen Studie (RIOUX et al. 2000) und wurden schließlich in einer weiteren Studie von HAMPE et al. (1999b) bestätigt. Dabei ergab sich eine signifikante Kopplung für CED mit einem Locus (IBD3) in der HLA-Region auf dem p- Arm dieses Chromosoms. In der kanadischen Studie (RIOUX et al. 2000) wurden desweiteren zwei Regionen mit signifikanter Kopplung für CED (Chromosom 19p) bzw. Morbus Crohn (Chromosom 5q) sowie Hinweise für Kopplung auf Chromosom 3p gefunden. Schließlich ergaben Untersuchungen von MA et al. (1999) Hinweise für Morbus Crohn-assoziierte Loci auf den Chromosomen 5q, 17q und 14q. Letzterer wurde kürzlich von DUERR et al. (2000) bestätigt (IBD4). Die erhobenen Daten legen nahe, daß Morbus Crohn und Colitis ulcerosa zusammenhängende polygenetische Krankheiten sind, die manche, aber nicht alle Suszeptibilitätsgene teilen (SATSANGI et al. 1998). Es ist anzunehmen, daß eine große genetische Heterogenität in Bezug zur Pathogenese zwischen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa besteht.
2.3 Tiermodelle für CED
In den letzten Jahren wurden zahlreiche neue Tiermodelle (vor allem Mausmodelle) für CED beschrieben (ELSON et al. 1995; ELSON 1999). Sie werden in chemisch induzierte, genetisch manipulierte und Zelltransfer-Modelle (siehe Tabelle 1) eingeteilt. Zur Untersuchung der genetischen, immunologischen und umweltbedingten Faktoren, die eine bedeutende Rolle im Krankheitsgeschehen der CED spielen, sind sie von großer Bedeutung.
Wie bei Menschen sind genetisch determinierte Unterschiede in der Suszeptibilität für chronische Darmentzündungen auch bei verschiedenen Inzuchtmäusen mit experimentell induzierter CED beobachtet worden (MOMBAERTS et al. 1993; ELSON et al. 1995; BERG et al. 1996; ELSON et al. 1996; MÄHLER et al. 1998; MÄHLER et al. 1999). Dies gilt für chemisch induzierte (ELSON et al. 1995; ELSON et al. 1996; MÄHLER et al. 1998) und für genetisch manipulierte Tiermodelle der CED (MOMBAERTS et al. 1993; ELSON et al.
1995; BERG et al. 1996). Interessanterweise erwiesen sich in mehreren Modellen bestimmte Inzuchtstämme als sehr anfällig und andere als relativ resistent gegenüber CED. Chemische Stoffe, mit denen nach oraler bzw. rektaler Applikation eine chronische Kolitis bei Versuchsnagern induziert werden kann, sind beispielsweise das Polysaccharid DSS (engl.:
dextran sulfate sodium) und das Kontaktallergen TNBS (engl.: trinitrobenzene sulfonic acid).
Sowohl bei der TNBS-induzierten (ELSON et al. 1996) als auch bei der DSS-induzierten Kolitis (MÄHLER et al. 1998) zeigten Mäuse des Stammes C3H/HeJ schwerere histopathologische Läsionen als Mäuse der Stämme DBA/2J und C57BL/6J. Zu den genetisch manipulierten Tiermodellen der CED gehören u.a. die Mausmutanten mit selektiver Deletion der Gene für die α-Kette des T-Zell-Rezeptors, Interleukin-2, Interleukin-10 und das Gαi2- Protein. Der Phänotyp der Kolitis wird bei diesen Deletionsmutanten deutlich durch die Genetik des Hintergrundstammes beeinflußt (MOMBAERTS et al. 1993; ELSON et al. 1995;
BERG et al. 1996). Deletionsmutanten, bei denen die Stämme 129, BALB/c oder C3H/He den genetischen Hintergrund bildeten, erkrankten unter gleichen Haltungsbedingungen deutlich schwerer an CED als entsprechende Mutanten auf C57BL/6-Hintergrund. Die Gene, die bei den genannten Mausmodellen eine erhöhte Suszeptibilität für CED bestimmen, haben aufgrund der sehr hohen genetischen Homologie zwischen Maus und Mensch möglicherweise auch beim Menschen eine Bedeutung in der Pathogenese der CED. Bisher gibt es nur sehr wenige Untersuchungen zur Identifikation solcher Gene bei Versuchsnagern mit experimenteller CED. Untersuchungen von MÄHLER et al. (1999) haben gezeigt, daß mehrere Gene die Suszeptibilität gegenüber der DSS-induzierten Kolitis bei der Maus kontrollieren.
Tabelle 1: Mausmodelle für CED
Chemisch induzierte Modelle: a. DSS (engl.: dextran sulfate sodium)-induzierte Kolitis (MÄHLER et al. 1998)
b. TNBS (engl.: trinitrobenzene sulfonic acid)- induzierte Kolitis (ELSON et al. 1996) c. Oxazolon-induzierte Kolitis (BOIRIVANT et
al. 1998)
Genetisch manipulierte Modelle: a. T-Zell-Rezeptor α-Kette defiziente Maus
(MOMBAERTS et al. 1993)
b. Interleukin-2 defiziente Maus (SADLACK et
al.1993)
c. Interleukin-2-Rezeptor α-Kette defiziente Maus
(WILLERFORD et al. 1995)
d. Interleukin-10 defiziente Maus (KÜHN et al.
1993)
e. Gαi2 defiziente Maus (RUDOLPH et al. 1995) f. NCAD∆ (N-Cadherin) transgene chimäre
Maus (HERMISTON und GORDON 1995)
g. Interleukin-7 transgene Maus (WATANABE et
al. 1998)
h. Mdr (engl.: multiple drug resistance)1α defiziente Maus (PANWALA et al. 1998) i. Stat (signal transducers and activators of
transcription) 4 transgene Maus (WIRTZ et al.
1999)
j. Orphan-Rezeptor CRF2-4 defiziente Maus
(SPENCER et al. 1998)
k. Stat3 (Makrophagen und Neutrophile) defiziente
Maus (TAKEDA et al. 1999)
l. WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)
defiziente Maus (SNAPPER et al. 1998)
m. TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) ARE (AU-reiche
Elemente) defiziente Maus (KONTOYIANNIS et
al. 1999)
n. Keratin-8 defiziente Maus (auf FVB/N
genetischem Hintergrund) (BARIBAULT et al.
1994)
o. Herpes simplex Virus Thymidinkinase transgene
Maus (BUSH et al. 1998)
p. α1,2-Fucosyltransferase transgene Maus
(MILLER et al. 2000)
q. gp39 transgene Maus (CLEGG et al. 1997)
Zelltransfer-Modelle: a. CD45RB-Transfer in Prkdcscid-Maus (POWRIE
et al. 1993)
b. Knochenmark-Transfer in transgene ε26 Maus
(HOLLANDER et al. 1995)
2.4 Interleukin-10 defiziente (Il10tm1Cgn) Maus
Interleukin-10 (IL10) ist ein wichtiges regulatorisches Zytokin, das Effektorfunktionen von Makrophagen, Th1-Zellen und natürlichen Killerzellen unterdrückt und die Proliferation und Differenzierung von B-Lymphozyten fördert (MOORE et al. 1993). IL10 wird hauptsächlich von Th2-Zellen produziert (FIORENTINO et al.1989). Es kann auch von Ly-1 B-Zellen, Makrophagen, Thymozyten, Keratinozyten und aktivierten Mastzell-Linien produziert werden (MOORE et al. 1993). Murines IL10 ist ein Polypeptid, das aus einem Gemisch von 17, 19 und 21 kDa-Spezies besteht (MOORE et al. 1993) und in vielen Geweben exprimiert wird (BROSKI und HALLORAN 1994).
Il10tm1Cgn- Mäuse wurden im Institut für Genetik der Universität Köln erzeugt (KÜHN et al.
1993). Das Il10-Gen wurde bei diesen Mäusen durch homologe Rekombination inaktiviert.
Die Il10tmCgn-Mutanten bilden daher kein IL10. Als Folge der Nullmutation entwickeln
Il10tm1Cgn-Mäuse nach dem Absetzen spontan eine chronisch entzündliche Darmerkrankung, die sich vom Duodenum bis zum Rektum erstrecken kann.
Die Il10tm1Cgn-Mutation wurde am Jackson Laboratory durch 10 Rückkreuzungszyklen jeweils auf die Inzuchtstämme C57BL/6J und C3H/HeJBir übertragen. Donormäuse waren Il10tm1Cgn- Mutanten mit segregierendem genetischen Hintergrund (C57BL/6J;129P2/OlaHsd). Nach der 10. Rückkreuzungsgeneration (N10) wurden heterozygote Il10tm1Cgn/+-Mäuse verpaart, um homozygote Il10tm1Cgn-Mäuse und homozygote Kontrollmäuse mit dem Il10-Wildtypallel zu erhalten. Die resultierenden kongenen Stämme C57BL/6J-Il10tm1Cgn und C3H/HeJBir- Il10tm1Cgn wurden anschließend ingezüchtet.
2.4.1 Klinische Befunde
Homozygote Mutanten mit segregierendem genetischen Hintergrund (C57BL/6J;129P2/OlaHsd) zeigen nach dem Absetzen Gewichtsverlust, Wachstumsstörungen und Diarrhoe (KÜHN et al. 1993). Über 90% der Tiere entwickeln ferner eine mikrozytäre, hypochrome Anämie in der 7. bis 11. Lebenswoche. Die sich spontan entwickelnde CED kann bei konventionell gehaltenen Tieren den gesamten Intestinaltrakt betreffen. Die Inzidenz der CED liegt bei 100%, die Sterblichkeitsrate bei über 30% vor dem 3. Lebensmonat der Tiere. Die anorektalen Läsionen bei Il10tm1Cgn-Mäusen werden durch genetische Faktoren beeinflußt. Unter konventionellen Haltungsbedingungen entwickeln C57BL/6J-Il10tm1Cgn- Mäuse und C57BL/6J;129P2/OlaHsd-Il10tm1Cgn-Mäuse Rektalprolaps und C3H/HeJBir- Il10tm1Cgn-Mäuse perianale Ulzerationen (KÜHN et al. 1993; LÖHLER et al. 1995; BERG et al. 1996; BRISTOL et al. 2000; MÄHLER et al. 2000).
2.4.2 Histopathologie des Intestinaltraktes
Zäkum und proximales Kolon sind bei den Il10tm1Cgn-Mäusen meistens hochgradig erkrankt.
Die intestinale Histopathologie der Il10tm1Cgn-Mäuse zeigt einige Merkmale des Morbus Crohn. Histologisch werden bei diesen Tieren Schleimhauthyperplasie, abnormale Kryptarchitektur, Becherzelldepletion, Erosionen, fokale Ulzerationen und Kryptabszesse beobachtet (KÜHN et al. 1993; LÖHLER et al. 1995; BERG et al. 1996). In der Mukosa und Submukosa befinden sich Entzündungszellinfiltrate und fokale transmurale Entzündungen.
Die Entzündungszellinfiltrate setzen sich aus Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen,
neutrophilen Granulozyten, eosinophilen Granulozyten und multinukleären Riesenzellen zusammen. Im Epithel des Dünndarmes und des Dickdarmes kommt es zu einer zunehmenden Expression von MHC Klasse II Molekülen. Ferner zeigen 60% der Il10tm1Cgn-Mäuse auf C57BL/6J;129P2/OlaHsd-Hintergrund im Alter von 6 Wochen kolorektale Adenokarzinome (BERG et al. 1996).
2.4.3 Pathogenese
Es wird angenommen, daß die intestinale Erkrankung der Il10tm1Cgn-Mäuse auf dem Fehlen der suppressiven Effekte von IL10 auf die Zytokinproduktion durch Makrophagen und Th1- Zellen beruht. Daraus resultiert eine erhöhte Th1-Antwort (erhöhte Produktion von Interferon γ) gegenüber Antigenen der enteralen Bakterienflora. Dies führt zur Aktivierung von Makrophagen und Produktion von Entzündungszellmediatoren wie Interleukin-1, Interleukin- 6, Tumornekrosefaktor α und Stickstoffoxiden, die zur Gewebeschädigung beitragen (BERG et al. 1996).
Eine wichtige Rolle bei der Entstehung der CED im Il10tm1Cgn-Mausmodell spielt die Darmflora. So entwickelten Il10tm1Cgn-Mäuse unter konventionellen Haltungsbedingungen eine Entzündung des gesamten Intestinaltraktes (KÜHN et al. 1993), während sie unter keimfreien Haltungsbedingungen keine CED zeigten (SELLON et al. 1998). Unter spezifiziert pathogenfreien (SPF)-Bedingungen hingegen war die Entzündung auf den Dickdarm beschränkt (KÜHN et al. 1993; SELLON et al. 1998). Diese Untersuchungen zeigen, daß zusätzlich zu einem genetischen Defekt des Immunsystems eine Stimulation durch die Darmflora nötig ist, um CED auszulösen.
Weiterhin wird der Phänotyp der CED im Modell der Il10tm1Cgn-Mäuse deutlich durch die Genetik des Hintergrundstammes beeinflußt. Il10tm1Cgn-Mäuse, bei denen die Stämme 129/
SvEv oder BALB/c den genetischen Hintergrund bildeten, erkrankten unter gleichen Haltungsbedingungen wesentlich schwerer als entsprechende Mutanten auf C57BL/6J- Hintergrund (BERG et al. 1996). BRISTOL et al. (2000) konnten zeigen, daß C3H/HeJBir- Il10tm1Cgn-Mäuse ebenfalls wesentlich schwerer an CED erkrankten als C57BL/6J-Il10tm1Cgn- Mäuse. Dieser Unterschied war am deutlichsten im Alter von 6 Wochen. Dabei wurde der Schweregrad der Erkrankung in Zäkum und Kolon mit Hilfe eines histologischen Scores ermittelt. Ferner wurden der Serum-Amyloid-A-Gehalt, der prozentuale Anteil von Granulozyten im peripheren Blut, das relative Milzgewicht und das relative Gewicht der
Mesenteriallymphknoten als Parameter für den Schweregrad der CED herangezogen, da diese stark positiv mit dem histologischen Score korrelierten. Interessanterweise lagen die entsprechenden Merkmalswerte von reziproken F1-Hybriden der beiden oben genannten Stämme zwischen den Werten ihrer Parentalstämme. Diese Befunde unterstützen die Hypothese einer polygenetischen Kontrolle der Suszeptibilität für CED im Il10tm1Cgn- Mausmodell.
2.5 Genetische Marker
Der Polymorphismus zwischen Inzuchtstämmen kann mit Hilfe biochemischer, immunologischer, serologischer sowie genetischer Marker dargestellt werden. Mit Hilfe dieser Marker können genetische Karten erstellt werden. Dabei haben sich gerade die molekulargenetischen Marker als vorteilhaft erwiesen, weil auf der DNA-Ebene mehr Allele als auf der Protein-Ebene ermittelt werden können.
Molekulargenetische Marker, die zur Charakterisierung von Inzuchtstämmen eingesetzt werden können, sind VNTRs (variable Anzahl von Wiederholungssequenzen; engl.: variable number of tandem repeats), RFLPs (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen; engl.:
restriction fragment length polymorphisms), RAPDs (zufällig amplifizierte polymorphe DNA; engl.: random amplified polymorphic DNA) und STRs (Einzelstrangwiederholungen;
engl.: simple tandem repeats).
2.5.1 Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs)
Die VNTRs sind unterschiedlich häufige Wiederholungen eines DNA-Sequenzelementes von 11-60 Basenpaaren an einem einzelnen DNA-Locus (NAKAMURA et al. 1987), die aus sich wiederholenden Sequenzmotiven bestehen. JEFFREYS et al. (1985) gaben die Länge des betroffenen DNA-Sequenzelementes mit 5-64 Basenpaaren an. Die einzelnen Repetitionen der auch als Minisatelliten (LOVE et al. 1990) bezeichneten VNTRs weisen sehr ähnliche, aber nicht vollkommen identische Sequenzen auf. SINGER (1982) bezeichnete die Charakteristik des Grundmotivs eines einzelnen Minisatelliten als Consensus-Sequenz. Sind zwischen einzelnen Minisatelliten eines Genoms Sequenzhomologien erkennbar, werden diese Minisatelliten zu Minisatellitenfamilien zusammengefaßt und das ihnen gemeinsame Grundmotiv als Core-Sequenz bezeichnet (NAKAMURA et al. 1987). Die verschiedenen
Allele eines Minisatellitenlocus ergeben sich aus den unterschiedlich häufigen Wiederholungen der DNA-Sequenz, was sich als Längenpolymorphismus darstellen läßt (MORI et al. 1992). Darstellen läßt sich dies einerseits durch die RFLP-Analyse (NAKAMURA et al. 1987) und andererseits durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)- Amplifikation mit Hilfe von Primern, die an den Minisatelliten flankierende Regionen binden (LOVE et al. 1990).
Werden Restriktionsenzyme eingesetzt, die innerhalb des Minisatelliten schneiden, ist die Länge der sich ergebenden Restriktionsfragmente proportional der Kopienanzahl der DNA- Sequenz (NAKAMURA et al. 1987). Zum Nachweis einzelner Minisatelliten werden Mono- Locus-Sonden eingesetzt. Mit Core-Sequenz erkennenden Multi-Locus-Sonden sind ganze Minisatellitenfamilien auf einmal nachweisbar. Insbesondere in der Forensik, aber auch für andere Anwendungsbereiche hat diese auch als DNA-Fingerprint bezeichnete Methode Bedeutung erlangt (JEFFREYS et al. 1985). Allerdings ist die Interpretation der gemeinsam nachgewiesenen Zahl an Restriktionsfragmenten mühsam (NAKAMURA et al. 1987).
Eine weitere Nachweismöglichkeit von VNTRs setzt die Kenntnis der dem Minisatelliten benachbarten DNA-Sequenz voraus. Werden aus diesem Bereich geeignete Primer für die PCR ausgewählt, so ist die Amplifikation des gesamten Minisatelliten möglich. Die unterschiedlichen Kopienanzahlen der DNA-Sequenz können direkt als Längenfragmentpolymorphismus nachgewiesen werden (JEFFREYS et al. 1988; HORN et al.
1989; BOERWINKLE et al. 1989). Bei der PCR-gestützten Analyse von Minisatelliten ist deren Einsatz bei sehr hohen Kopienanzahlen der DNA-Sequenz durch die resultierende Gesamtfragmentlänge der Minisatelliten limitiert (LOVE et al. 1990).
2.5.2 Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs)
Bei RFLPs handelt es sich um Fragmentlängenunterschiede, die nach dem Abbau der DNA mit Restriktionsenzymen entstehen können. Der Nachweis erfolgt mit DNA-Sonden nach vorheriger elektrophoretischer Auftrennung und Southern Blot. Die Ursachen für die Polymorphismen können eine Veränderung der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms (Erkennungssequenz-Polymorphismus), eine Umlagerung von DNA-Abschnitten zwischen zwei Schnittstellen (Rearrangement-Polymorphismen) oder eine Veränderung im Erkennungsbereich der DNA-Sonde sein. Ein Nachteil der RFPLs bei genetischen Charakterisierungen und Kartierungsvorhaben ist das aufwendige Nachweisverfahren und ein
für DNA-Marker verhältnismäßig geringer Polymorphismus (LOVE et al. 1990; WILLIAMS et al. 1990).
2.5.3 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPDs)
Die RAPDs wurden erstmals von WILLIAMS et al. (1990) beim Menschen und von SERIKAWA et al. (1992) bei Maus und Ratte eingesetzt. Hierbei handelt es sich um Marker, die mit Hilfe der PCR-Technik unter Einsatz von Oligonukleotiden (ca. 10 Basen) ermittelt werden. Der GC-Gehalt der eingesetzten Primer kann zwischen 40% und 80% liegen. Die Sequenz der Primer wird nach dem Zufallsprinzip festgelegt. Die Primer kommen sowohl einzeln als auch in Kombination zum Einsatz. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte können individuelle Bandenmuster der amplifizierten DNA-Fragmente beobachtet werden. Für die RAPD-Analyse eignen sich besonders Pflanzen, Bakterien und Nematoden. Bei der Maus und der Ratte erwies sich die RAPD-Analyse in erster Linie als speziesspezifisch (WILLIAMS et al. 1990).
2.5.4 Simple Tandem Repeats (STRs)
Die STRs, auch Mikrosatelliten genannt, sind definiert als 1-6 Basenpaar lange DNA- Sequenzmotive, die unterschiedlich oft hintereinander wiederholt werden. Die Gesamtlänge eines STR beträgt 100 - 500 Basenpaare. Die Anzahl der Wiederholungen ist der Gesamtlänge des Mikrosatelliten proportional. Daraus resultierende Fragmentlängenunterschiede werden in der PCR amplifiziert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Fragmentlängenunterschiede werden als SSLPs (engl.: Simple Sequence Length Polymorphism) bezeichnet (WEBER und MAY 1989). Mikrosatelliten konzentrieren sich im Gegensatz zu den Minisatelliten nicht an Telomeren der Chromosomen, sondern sind gleichmäßig über das gesamte Genom verteilt (SERIKAWA et al. 1992). Das X-Chromosom bildet eine Ausnahme. Auf ihm kommen Mikrosatelliten bei Maus und Ratte im Vergleich zu anderen Chromosomen seltener vor (JACOB et al. 1995; DIETRICH et al. 1994).
Es wird zwischen anonymen und genassoziierten Mikrosatelliten unterschieden.
Genassoziierte Mikrosatelliten liegen häufig in den Introns und in den nicht kodierenden Bereichen am 3` und 5` Ende des Gens. Einzelne Mikrosatelliten konnten auch in den Exons nachgewiesen werden (STALLINGS 1994).
Aufgrund ihres hohen Polymorphismusgrades, ihrer Häufigkeit und ihrer weiten Verteilung im Genom sind Mikrosatelliten für genetische Kartierungen besonders geeignet. Verglichen mit Minisatelliten sind Mikrosatelliten einfacher mit der PCR zu amplifizieren (LOVE et al.
1990). Erste Untersuchungen über SSPLs bei Menschen und bei der Maus stammen von WEBER und MAY (1989). Um den Nachweis der SSLPs erbringen zu können, wurden unterschiedliche Methoden eingesetzt. Primer können radioaktiv markiert und die PCR- Produkte auf denaturierende Polyacrylamidgele aufgetragen werden (REMMERS et al. 1993;
DIETRICH et al. 1994; JACOB et al. 1995). Zur Fragmentlängenanalyse der PCR-Produkte kommen weiterhin Agarosegele (PROKOP et al. 1993; MAIHARA et al. 1995) sowie nicht- denaturierende Polyacrylamidgele (LOVE et al. 1990) zum Einsatz.
2.6 Genkarten
Genkarten geben über die Position einzelner Genorte sowie über ihre chromosomale Zuordnung Auskunft. Sie stellen eine wichtige Grundlage für die Aufklärung monogener und polygener Erbgänge dar. Viele Erkrankungen werden erst durch die Isolierung von Kandidatengenen mit Hilfe dichter Genkarten molekularbiologisch aufgeklärt (REMMERS et al. 1993; DIETRICH et al. 1994; JACOB et al. 1995). Dichte Genkarten anderer Spezies lassen über evolutionsbiologische Vergleiche Rückschlüsse zur Auffindung einzelner Genorte beim Menschen zu und helfen so, die beim Menschen oft limitierten genetischen Untersuchungsmöglichkeiten zu überwinden.
2.6.1 Physikalische Genkarte
Physikalische Genkarten geben Auskunft über die genaue Basensequenz zwischen zwei Genorten. Sie werden in zwei Klassen unterteilt (STRACHAN und READ 1996):
a) Physikalische Kartierung mit niedriger Auflösung:
Die kleinste DNA-Kartierungseinheit liegt im Bereich zwischen einer und mehreren Megabasen Länge. Methodisch wird hauptsächlich die chromosomale Kartierung mit Hilfe von Hybridzellen und der In-Situ-Hybridisierung angewandt.
b) Physikalische Kartierung mit hoher Auflösung:
Der Auflösungsbereich umfaßt Hunderte von Kilobasen bis hin zu einem Nukleotid. Zum Einsatz kommen die FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) an künstlich entspiralisierten Chromatin- oder DNA-Fasern und die Restriktionskartierung. Die meisten Restriktionsenzyme schneiden DNA in Abständen von wenigen hundert bis tausend Basenpaaren. Die Restriktionskartierung wird in Contigs durchgeführt, die aus überlappenden, klonierten DNA-Fragmenten besteht. Mit Hilfe künstlicher Hefechromosomen, den YACs (engl.: Yeast Artificial Chromosomes)-Klonen, die Fragmente von über 1000 Kilobasenpaare (kbp) aufnehmen können, sind große Teile des menschlichen Genoms bereits in Form von Contigs kartiert worden. Für detaillierte Karten von einer Chromosomenregion werden Cosmidklone verwendet. Cosmide sind künstliche, genetische Elemente des Bakteriophagen Lamda, die in einem Wirtsbakterium vermehrt werden. Diese nehmen DNA-Fragmente von 50 kbp auf. Der Vorteil der YACs liegt in ihrer Fähigkeit, große DNA-Fragmente zu replizieren. Die Tendenz zur Chimärenbildung, Instabilität und die aufwendige Trennung vom Wirtsgenom wirken sich nachteilig aus. Darum werden heute vorzugsweise BACs (engl.: Bacterial Artificial Chromosomes), die bis zu 300 kbp aufnehmen können (SHIZUYA et al. 1992), und PACs (engl.: P1 Artificial Chromosomes, STERNBERG 1990) benutzt. P1 ist ein temperenter Bakteriophage, der DNA-Fragmente bis zu 100 kbp aufnehmen kann.
2.6.2 Kopplungskarte
Die Kopplungskarte gibt die relative Position von Genloci in Rekombinationseinheiten an, ausgedrückt in Centi-Morgan (cM). Ein cM entspricht einer Rekombinationshäufigkeit von 1%.
Die Kopplungshypothese wurde von MORGAN (1911) experimentell belegt. Durch Cross- Over-Ereignisse zwischen zwei Nicht-Schwester-Chromatiden kann es zum reziproken Austausch zwischen homologen Chromosomenabschnitten kommen. Die Häufigkeit solcher Kopplungsbrüche zwischen zwei Genen hängt von ihrem Abstand zueinander auf dem Chromosom ab.
Die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Genpaaren wird mit Hilfe von Kreuzungspopulationen ermittelt. Wichtigste Voraussetzung zum Nachweis der
Kopplungsbrüche ist das Vorhandensein von Polymorphismen in den betreffenden Genpaaren zwischen den Ausgangsstämmen der Kreuzungspopulation. Die Kreuzungspopulation kann eine F2-Generation (REMMERS et al. 1993; ZHA et al. 1993; JACOB et al. 1995) oder eine Rückkreuzung (KURAMOTO et al. 1993; PROKOP et al. 1993; YEUNG et al. 1993;
MAIHARA et al. 1995) sein.
Durch systematische Inzüchtung von Intercrossnachkommen zweier etablierter Inzuchtstämme können rekombinante Inzuchtstämme erzeugt werden, die in genetischer Hinsicht konventionellen segregierenden Populationen entsprechen. Die Fixation der Segregation in den einzelnen Linien eines rekombinanten Inzuchtstammes macht die Kumulation der erhobenen Daten möglich. Das Konzept rekombinanter Inzuchtstämme wurde von BAILEY (1971) entwickelt.
Die Austauschhäufigkeit läßt sich durch Genotypisierung der Individuen einer Kreuzungspopulation ermitteln. Sie ergibt sich aus dem prozentualen Anteil der Austauschkombinationen an den Gesamtkombinationen. Die Austauschhäufigkeit ist das Maß für die relative Entfernung zwischen zwei Genorten. Maßeinheit ist das Centi-Morgan. Über Kopplungsanalysen vieler einzelner Genorte können so genetische Kopplungskarten erstellt werden. Wenn ein Genort einer Kopplungsgruppe einem bestimmten Chromosom zugeordnet werden kann, so kann die Kopplungsgruppe als ganzes dem betreffenden Chromosom zugeschrieben werden (SERIKAWA et al. 1992; MAIHARA et al. 1995).
3 Material und Methoden 3.1 Versuchsaufbau
Es sollte zunächst überprüft werden, ob der Schweregrad der Kolitis im Modell der Il10tm1Cgn- Maus entsprechend den Befunden am Jackson Laboratory (BRISTOL et al. 2000) durch die Genetik des Hintergrundstammes beeinflußt wird. Zu diesem Zweck wurde die Erkrankung bei den Stämmen C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn und C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn sowie (C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1-Hybriden mittels immunologischer Parameter (absolute Leukozytenzahl [Kapitel 3.4.2.2], Differentialblutbild [Kapitel 3.4.2.3], Serum-Amyloid-A [Kapitel 3.4.3], relatives Milzgewicht [Kapitel 3.4.4]) und histologischer Parameter (Kapitel 3.4.6) charakterisiert. Anschließend sollte die chromosomale Zuordnung der Position von Genen (Grobkartierung), die die Suszeptibilität für Kolitis bei der Il10tm1Cgn-Maus regulieren, anhand einer segregierenden 1.
Rückkreuzungspopulation (N2) auf den partiell resistenten Stamm C57BL/6J@ZtmIl10tm1Cgn vorgenommen werden. Dabei wurde der Phänotyp der Kolitis immunologisch und histologisch bestimmt. Die Genotypisierung der Kreuzungsmäuse erfolgte mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern (Kapitel 3.6). Zur Ermittlung der chromosomalen Lokalisation von Suszeptibilitätsloci wurde anschließend das Vorliegen von Assoziationen zwischen Markern und phänotypischen Parametern mittels Kopplungsanalyse (Kapitel 3.7) geprüft.
3.2 Versuchstiere
Es wurden 42 ± 2 Tage alte Mäuse beiderlei Geschlechtes der nachfolgenden Stämme eingesetzt.
Von den Stämmen C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn (Kapitel 3.2.1), C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn (Kapitel 3.2.2), C57BL/6J@Ztm (Kapitel 3.2.4) und C3H/HeJBir@Ztm (Kapitel 3.2.5) wurden jeweils 10 weibliche und 10 männliche Mäuse eingesetzt. Desweiteren wurden 9 weibliche und 11 männliche (C3H/HeJBir@Ztm-Il10 tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1- Hybriden (Kapitel 3.2.3) sowie 100 weibliche und 103 männliche (C3H/HeJBir@Ztm- Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1 x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Rückkreuzungsmäuse (Kapitel 3.2.6) als Versuchstiere verwendet.
3.2.1 C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn
C57BL/6J-Il10tm1Cgn-Mäuse wurden 1997 von Herrn Dr. M. Mähler aus dem Jackson Laboratory (Maine, USA) an das Zentrale Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) verbracht. Zu diesem Zeitpunkt befanden sich die Tiere in der Generation N10F7. Die für die vorliegende Arbeit verwendeten Mäuse befanden sich in der Generation N10F11.
3.2.2 C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn
C3H/HeJBir-Il10tm1Cgn-Mäuse der Generationen N10F2 und N10F3 wurden 1998 von Herrn Dr. M. Mähler aus dem Jackson Laboratory in das Zentrale Tierlaboratorium der MHH überführt. Die hier verwendeten Mäuse befanden sich in der Generation N10F5.
3.2.3 (C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1
C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn-Weibchen wurden mit C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Männchen verpaart, um (C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1-Mäuse zu erzeugen.
3.2.4 (C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1 x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn
Zur Zucht der segregierenden Rückkreuzungstiere wurden Weibchen der oben genannten F1- Generation mit C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn - Männchen verpaart.
3.2.5 C57BL/6J@Ztm
C57BL/6J Mäuse wurden 1998 von Herrn Dr. M. Mähler aus dem Jackson Laboratory an das Zentrale Tierlaboratorium der MHH verbracht. Zu diesem Zeitpunkt befanden sich die Tiere in der Generation N11F3. Die hier verwendeten C57BL/6J@Ztm-Kontrollmäuse befanden sich in der Generation N11F6.
3.2.6 C3H/HeJBir@Ztm
C3H/HeJBir-Mäuse wurden 1998 von Herrn Dr. M. Mähler aus dem Jackson Laboratory an das Zentrale Tierlaboratorium der MHH verbracht. Zu diesem Zeitpunkt befanden sich die Tiere in der Generation N10F4. Die hier verwendeten C3H/HeJBir@Ztm-Kontrollmäuse befanden sich in der Generation N10F7.
3.3 Haltung und Fütterung
Die Versuchstiere wurden in einem barrieregeschützten Raum (Trockenbarriere) im Zentralen Tierlaboratorium der MHH nach Geschlechtern getrennt, in Gruppen von zwei bis fünf Tieren in Makrolonkäfigen der Typen II oder III (Firma Ibeco) auf Weichholzgranulat (Fichten- und Tannenholz, Firma Hahn & Co., Typ H 3/4) gehalten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert.
Die Raumtemperatur betrug 20°C ± 2°C, die Luftfeuchtigkeit 55% ± 5%. Die Beleuchtung erfolgte ausschließlich über Kunstlicht in der Zeit von 6:00 Uhr bis 18:00 Uhr MEZ.
Ein pelletiertes Alleinfutter, Altromin 1314, (Firma Altromin GmbH; Zusammensetzung siehe Tabelle 2) und Leitungswasser standen den Mäusen ad libitum zur Verfügung.
Tabelle 2 : Zusammensetzung von Altromin 1314 (Zuchtdiät für Ratten und Mäuse)
Gehalt an Inhaltsstoffen Prozent
Rohprotein 22,5 Lysin 1,2 Rohfett 5,0 Rohfaser 4,5 Rohasche 6,5 Kalzium 0,9 Phosphor 0,7 Zusatzstoffe je Kilogramm
Vitamin A 15.000 I.E.
Vitamin D3 600 I.E.
Vitamin E 75 mg
Kupfer 5 mg
3.4 Phänotypisierung
Die in den Kapiteln 3.2.1 bis 3.2.6 beschriebenen Versuchsmäuse wurden mit Äther narkotisiert und gewogen (Kapitel 3.4.1). Daran schloß sich eine Blutentnahme (Kapitel 3.4.2.1) für die absolute Leukozytenzählung (Kapitel 3.4.2.2), die Erstellung von Differentialblutbildern (Kapitel 3.4.2.3) und die Messung des Serum-Amyloid-A-Gehaltes (Kapitel 3.4.3) an. Anschließend wurden die Mäuse getötet und seziert. Im Rahmen der Sektion wurden makroskopisch-anatomische Krankheitsmerkmale (perianale Ulzerationen, Rektalprolaps, aktivierte Kniefalten-, Darm- und Mesenteriallymphknoten, Splenomegalie) festgestellt, die Milz zur Bestimmung des relativen Milzgewichtes (Kapitel 3.4.4) sowie Zäkum, Kolon und Rektum für die histologische Beurteilung der Darmentzündung entnommen (Kapitel 3.4.5). Die im Rahmen der Sektion festgestellten makroskopisch- anatomischen Krankheitsmerkmale werden im Kapitel 4.1 geschildert.
Die einzelnen Arbeitsschritte werden nachfolgend beschrieben.
3.4.1 Narkose und Wiegen der Mäuse
Vor dem Wiegen und der Blutentnahme wurden die Mäuse mittels Ätherinhalation narkotisiert. Hierzu wurden etwa 10 ml Äther und mehrere Lagen Zellstoff in ein verschließbares Glasgefäß eingebracht. Die Mäuse wurden einzeln in dieses Gefäß gesetzt und sofort nach Eintritt der Narkose (nach ca. 20 Sekunden) entnommen. Anschließend wurden die Mäuse mittels elektronischer Waage (Firma Satorius, MC1 Laboratory LC 6200D) gewogen.
3.4.2 Entnahme des Blutes zur Ermittlung der absoluten Leukozytenzahlen sowie zur Herstellung von Differentialblutbildern und zur Plasma- gewinnung
3.4.2.1 Blutentnahme
Zur retrobulbären Blutentnahme wurde die narkotisierte Maus mit dem zu punktierenden Auge nach oben auf die Arbeitsplatte gelegt. Mit Zeigefinger und Daumen der linken Hand wurde die lockere Kopfhaut des fixierten Tieres so nach hinten gespannt, daß es zur Stauung der Jugularvene kam. Während der kleine Finger den Mäuseschwanz fixierte, griffen Ring- und Mittelfinger um den Thorax herum. Mit der rechten Hand wurde retrobulbär eine 20 µl heparinbeschichtete Mikrohämatokritkapillare (Firma Brand) unter leichten Drehbewegungen vorsichtig am Bulbus vorbei in okzipitaler Richtung etwa 1-2 mm tief eingeführt und so der retrobulbäre Venenplexus punktiert. Das Blut wurde in einer EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)-Monovette (Firma Sarstedt; S-Monovetten; 2,7 ml) aufgefangen und anschließend leicht geschwenkt. Nach Lösen des Staudruckes auf die Jugularvene wurden die Mikrohämatokritkapillare entfernt.
Anschließend wurden die Mäuse per Genickbruch getötet. Nach Tötung wurden den Mäusen zwecks Desoxyribonukleinsäure-Isolierung (Kapitel 3.5.1) die Ohren und der distale Schwanzabschnitt abgetrennt und in 2ml sterile Reaktionsgefäße (Firma Eppendorf) überführt und anschließend bei -80°C gelagert.
3.4.2.2 Ermittlung der absoluten Leukozytenzahlen
Es wurden die absoluten Leukozytenzahlen im peripheren Blut bei den Mäusen der Parentalstämme, der F1-Population, der Kontrollstämme und der Rückkreuzungspopulation bestimmt, um zu überprüfen, ob diese als Maß für den Schweregrad der Kolitis herangezogen werden konnten.
Zur Leukozytendarstellung wurde EDTA-Blut bis zur Marke 1 in einer Leukozytenmischpipette (Firma Brand) und anschließend Essigsäure-Gentianaviolettlösung (Türks-Lösung; Firma Merck) im Verhältnis 1:10 bis zur Marke 1,1 aufgezogen und durch Rotation mittels Mikro-Mix 4 (Firma Omnilab) gefärbt.
Nach Verwerfen der ersten drei Tropfen aus der Leukozytenmischpipette wurden die zwei Zählfächer einer Bürker-Zählkammer mit je einem Tropfen aus der Leukozytenmischpipette bestückt. Anschließend wurden bei 100-facher Vergrößerung (Mikroskop Firma Leitz) mindestens 100 Leukozyten ausgezählt. Das Volumen eines Zählfeldes betrug 1/250 µl.
Die Berechnung der absoluten Leukozytenzahl pro µl erfolgte unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (1:10) nach folgender Formel:
(x • 250 • 10) : Anzahl der Felder = Zellen/µl
x = Anzahl der ausgezählten Zellen.
3.4.2.3 Differentialblutbild
Es wurden Differentialblutbilder von den Mäusen der Parentalstämme, der F1-Population und der Kontrollstämme erstellt, um abzuklären, ob die relativen Zahlen einzelner Leukozytenfraktionen im peripheren Blut mit dem Schweregrad der Kolitis korrelierten.
Zur Anfertigung eines Blutausstriches wurden 8 µl EDTA-Blut mit einem Deckgläschen (Firma Omnilab, 24x32 mm) auf einem entfetteten Objektträger (Firma Omnilab, ca. 76x26 mm/ 3x1 inch, geschnitten, Mattrand) ausgestrichen und luftgetrocknet. Nach frühestens 24 Stunden wurden die Blutausstriche mittels der panoptischen Färbung nach Pappenheim gefärbt.
Verwendete Lösungen:
A May-Grünwald-Lösung (Firma Merck): enthält eosinsaures Methylenblau in Methanol:Glycerin (2:1)
B Giemsa-Lösung (Stammlösung; Firma Riedel-de-Haen): enthält Azur II sowie eosinsaures Azur II in Methanol:Glycerin (1:1)
C Aqua bidest.
D Giemsa-Gebrauchslösung: ein Volumenteil Giemsa-Stammlösung wurde mit 20 Volumenteilen Aqua bidest. gemischt.
Färbeschritte:
A 3 min May-Grünwald-Lösung B 1 min mit Aqua bidest. nachfärben C Aqua bidest. abkippen
D 20 min Giemsa-Gebrauchslösung E anschließend mit Aqua bidest. abspülen F lufttrocknen
Die mikroskopische Differenzierung (Mikroskop Firma Leitz) der Leukozyten erfolgte bei 800-facher Vergrößerung mittels Ölimmersionsobjektiv. Jeder Ausstrich wurde mäanderförmig von Längsseite zu Längsseite durchgemustert bis 100 Zellen differenziert waren.
Bei der Differenzierung der Leukozyten wurden folgende Zellfraktionen nach Größe, Form, Struktur und Anfärbbarkeit von Zellkernen und Zellplasma unterschieden:
- segmentkernige neutrophile Granulozyten (neutrophiles Zytoplasma, vereinzelt
blaßviolette Granula; Kern dunkelviolett, grobschollig strukturiert; Kernsegmente durch Brücken verbunden, schmaler als 1/3 der Segmentbreite)
- stabkernige neutrophile Granulozyten (Plasma wie segmentkerniger Granulozyt; Kern weniger dunkel, grobschollig, gebogen)
- eosinophile Granulozyten (Plasma enthält blaßrote, grobe, gleichgroße und ungleichmäßig verteilte Granula; Kern ist oft zweilappig, kann auch stab- oder segmentkernig sein)
- basophile Granulozyten (Plasma enthält schwarzviolette Granula ungleichmäßiger Größe, Farbintensität und Verteilung; Kern sieht dem der eosinophilen Granulozyten ähnlich)
- Lymphozyten (vielgestaltig, meist mit blaugrauem Zytoplasma, das in Kernnähe heller wird und gelegentlich Azurgranula enthält; Kern rund bis polygonal, blaß- bis dunkelviolett, feinstrukturiert)
- Monozyten (Plasma blaßblau; Kern vielgestaltig, blaßviolett aufgelockert, meist plasmatische und nukleäre Vakuolen)
Die einzelnen Zellfraktionen wurden in Prozentwerten angegeben.
3.4.2.4 Plasmagewinnung
In einer Zentrifuge (Firma Heraeus) wurde das restliche Blut, das nicht zur Leukozytenzählung verwendet wurde, in EDTA-Monovetten 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Die Überstände wurden in sterile 0,5 ml Reaktionsgefäße (Firma Eppendorf) abpipettiert und bis zur Bestimmung des Serum-Amyloid-A-Gehaltes bei -80°C eingefroren.
3.4.3 Bestimmung des Serum-Amyloid-A-Gehaltes
Serum-Amyloid-A (SAA) ist ein Akutes-Phasen-Protein und dient als Parameter für ein akutes Entzündungsgeschehen. Die SAA-Konzentration korreliert stark positiv mit dem Schweregrad der Kolitis bei Il10tm1Cgn- Mäusen (BERG et al. 1996; BRISTOL et al. 2000).
Zur Überprüfung dieses Befundes wurde der SAA-Gehalt im Plasma der Mäuse der Parentalstämme, der F1-Population, der Kontrollstämme und einem Teil der Il10tm1Cgn- Rückkreuzungsmäuse bestimmt.
Zur Bestimmung des SAA-Gehaltes wurde der BioSource Cytoscreenâ-Maus-SAA-Kit verwendet. Dieser Kit ist ein Phasen-Sandwich-Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA). Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte (Firma BioSource) sind mit einem monoklonalen Anti-Maus-SAA-Antikörper (spezifischer IgG2b Antikörper gegen SAA) beschichtet. Nach Waschen und Entfernen des Waschpuffers (phosphatgepufferte Salzlösung;
verdünnt 1:20) wurde in alle Vertiefungen 50 µl Anti-SAA-Konjugat (alkalische Phosphatase konjugiert mit monoklonalem Anti-SAA-Antikörper in phosphatgepufferter Salzlösung mit bovinem Serumalbumin) einpipettiert. Im Anschluß daran wurden in die erste senkrechte Vertiefungsreihe der Mikrotiterplatte 50 µl des Standards (bekannte SAA-Konzentration;
lyophilisierter Maus-SAA-Standard) und in die restlichen Vertiefungen je 50 µl der jeweiligen Plasmaproben (verdünnt 1:50) einpipettiert, wobei je Probe eine Vertiefung verwendet wurde. Die so bestückte Mikrotiterplatte wurde in eine feuchte Kammer gelegt.
Diese Kammer wurde in einen Brutschrank (Firma Memmert) gegeben, in dem eine einstündige Inkubation bei 37°C erfolgte. Das SAA wurde von dem in den Vertiefungen immobilisierten Antikörper gebunden und durch den konjugierten zweiten Antikörper markiert. Nach erneutem Waschen und Entfernen des Waschpuffers wurde in jede Vertiefung je 100 µl Substratlösung (p-Nitrophenyl-Phosphat) hinzugegeben. Das Enzym (alkalische Phosphatase) setzte das Substrat zu 4-Aminophenylphosphat um (gelb gefärbtes Produkt).
Nach einer erneuten einstündigen Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde in jede Vertiefung je 50 µl 3 molare NaOH einpipettiert, um die Reaktion abzubrechen.
Anschließend erfolgte die Bestimmung der Extinktion (optische Dichte) durch photometrische Messung (Typ EL 311, Firma Behring) bei 405 nm. Die ermittelten Extinktionswerte verhielten sich proportional zur SAA-Konzentration.
Die Berechnung der SAA-Konzentration der Plasmaproben erfolgte mit Hilfe der folgenden Regressionsgleichung, die anhand einer auf den Standardproben basierenden Eichkurve
ermittelt wurde:
Y = – 0,384 + 2,62 • X
Y: SAA-Konzentration (µg/ml)
X: jeweilige Extinktion (optische Dichte) der Probe
3.4.4 Bestimmung des relativen Milzgewichtes
Bei der Sektion wurde das Abdomen median eröffnet und Milz, Zäkum und Kolon einschließlich Rektum (Kapitel 3.4.5) in toto entnommen. Anhängendes Fett wurde von den Milzen entfernt. Anschließend wurden die Milzen mit Hilfe einer Analysenwaage (Firma Satorius) gewogen. Bis zum Wiegen erfolgte eine maximal einstündige Aufbewahrung der Milzen in einer feuchten Kammer, um einen Gewichtsverlust durch Austrocknung zu verhindern. Zur Herstellung der feuchten Kammer wurde destilliertes Wasser verwendet.
Anschließend wurde als phänotypisches Merkmal der prozentuale Anteil des Milzgewichtes bezogen auf das Körpergewicht der entsprechenden Maus (relatives Milzgewicht) bestimmt.
3.4.5 Entnahme und Präparation des Dickdarms
Verwendete Fixationslösung:
Neutrales Formalin nach Sörensen (10%ig):
Lösung:
A 13,6 g Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 (Firma Merck) in 1000 ml Aqua dest.
B 17,7 g Dinatriumhydrogenphosphat-2-hydrat Na2HPO4 ∗2 H2O (Firma Merck) in 1000 ml Aqua dest.
Für 1 Liter: 352,8 ml Puffer A + 547,2 ml Puffer B
+ 100 ml Formalin (35%-37%; Firma Merck)
Zäkum und Kolon einschließlich Rektum wurden gesondert entnommen und durch leichtes Ausstreichen manuell entleert. Mit Hilfe einer Spritze wurden Zäkum und Kolon einschließlich Rektum mit 10%igem gepufferten Formalin gefüllt und als sogenannte „Swiss- Roll“ zwischen zwei 1 cm x 2 cm große Filterpapiere geheftet. Dabei wurde das proximale Kolon in die Mitte der Filterpapiere gelegt und das restliche Kolon, das Rektum und der Anus in Form einer Schnecke aufgerollt (siehe Abbildung 1). Anschließend wurde die „Swiss-Roll“
in ein formalingefülltes Glas überführt.
Abb. 1: Schematische Zeichnung einer „Swiss-Roll“
3.4.6 Histologische Untersuchungen
3.4.6.1 Hämotoxylin-Eosin-Färbung
Histologische Schnitte von Zäkum und Kolon einschließlich Rektum wurden im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (Abteilung Herr Prof. J. Pohlenz) angefertigt und mit Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbt. Die Organe wurden in Standardeinbettkassetten (Firma Engelbrecht) gelegt, mit Metalldeckeln (Firma Engelbrecht) verschlossen und anschließend in 10%iges gepuffertes Formalin verbracht. Das Einbetten in Paraffin geschah in einem Einbettautomaten (Firma Shandon) über Nacht. Nach der Einbettung wurden 2-4 µm dicke Längsschnitte von Zäkum und Kolon angefertigt und mit H.E. gefärbt (Färbeautomat; Firma Shandon). Die gefärbten Schnitte wurden anschließend mit Korbitbalsam (Firma Hecht) eingedeckt.
3.4.6.2 Auswertung der histologischen Präparate
Die Beurteilung des Schweregrades der Entzündung von Zäkum, proximalem Kolon, mittlerem Kolon und distalem Kolon (einschließlich Rektum) erfolgte nach einem Schema von BERG et al. (1996), das durch eigene Definitionen modifiziert wurde. Verwendet wurde ein Mikroskop der Firma Zeiss, mit dem bei einer 40-, 100- oder 400-fachen Gesamtvergrößerung eine Auswertung der histologischen Schnitte erfolgte.
Dabei wurde ein Score von 0 bis 3 jeweils für Zäkum, proximales Kolon, mittleres Kolon und distales Kolon (einschließlich Rektum) wie folgt zugeteilt:
Distales Kolon und Rektum Proximales
Kolon
Mittleres Kolon
• Grad 0: Zäkum:
keine pathologischen Veränderungen, d.h. einfaches hochprismatisches Schleimhautepithel; nicht mehr als 6 Becherzellen pro Krypte; vereinzelt Lymphfollikel in der Lamina propria.
Kolon:
keine pathologischen Veränderungen, d.h. einfaches hochprismatisches
Schleimhautepithel, Zellkerne liegen dicht beieinander; im apikalen Drittel der Krypten sind die Becherzellen groß, in den unteren beiden Dritteln der Krypten massenhaft Becherzellen, die dicht zusammenliegen; vereinzelt Lymphfollikel in der Lamina propria.
•••• Grad 1: Zäkum und Kolon:
geringgradige Schleimhauthyperplasie: 2-3fache Schleimhautdicke bei normaler Epithelmorphologie, im Vergleich zu Grad 0 geringere Anzahl von Becherzellen bzw. geringeres Becherzellvolumen; einige fokale leukozytäre Zellinfiltrate (überwiegend monomorphonukleäre Zellen) in der Lamina propria.
•••• Grad 2: Zäkum und Kolon:
mittelgradige Schleimhauthyperplasie: 2-3fache Schleimhautdicke, abnormale Kryptarchitektur mit verlängerten Krypten; vermehrte Mitosen; geringere Anzahl von Becherzellen bzw. einem geringeren Becherzelldurchmesser als bei Grad 1; vereinzeltes Auftreten von Kryptabszessen; fokale bis multifokale leukozytäre Zellinfiltrate vorwiegend in der Lamina propria sowie vereinzelt auch in der Submukosa; bei einzelnen Tieren: Hyperämie der Serosa mit
perivaskulärer Infiltration von Entzündungszellen; vereinzeltes Auftreten von Erosionen.
•••• Grad 3: Zäkum und Kolon:
hochgradige Schleimhauthyperplasie: mindestens vierfache Schleimhautdicke, abnormale Kryptarchitektur mit Verlängerung und Verzweigung der Krypten sowie einer höheren Mitoserate als bei Grad 2; kaum Becherzellen sichtbar;
viele Kryptabszesse; multifokale bis diffuse leukozytäre Zellinfiltrate (überwiegend neutrophile Granulozyten) in der Lamina propria und in der Submukosa sowie gelegentlich auch transmurale Entzündungen; Hyperämie der Serosa mit perivaskulärer Infiltration von Entzündungszellen; bei einzelnen Tieren Vaskulitiden feststellbar; Auftreten von Erosionen und Ulcera.
Anschließend wurde ein Kolonsummenscore durch Addition der Einzelscores von proximalem, mittlerem und distalem Kolon berechnet.
3.5 Nachweis von genetischen Markern
3.5.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)
Zur Isolierung von DNA wurde der QIAamp DNA Mini Kit verwendet (Firma Qiagen).
Für die DNA-Gewinnung wurde Ohrmuschelgewebe in ein 2 ml Reaktionsgefäß (Firma Eppendorf) mit Lysispuffer (ALT-Puffer) versetzt und mit einer sterilen Schere grob zerkleinert. Nach Zugabe von Proteinase K-Lösung wurde der Ansatz etwa 15 Sekunden gut durchmischt (Vortex; Firma Jürgens) und etwa 10 bis 12 Stunden in einem Thermomixer (Firma Eppendorf) bei 55°C inkubiert. Anschließend wurde ein Bindungspuffer (AL-Puffer) hinzupipettiert. Die Gewebe- und Zellreste wurden durch Zentrifugation (Biofuge; Firma Heraeus) für 1 Minute bei 12.000 Umdrehungen/min abgetrennt. Der Probenüberstand wurde in eine Silicium-Gelmembran-Säule überführt, die sich in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß befand. Nach Zentrifugation erfolgte ein zweimaliger Waschvorgang der in der Säule enthaltenen DNA mit einem Waschpuffer (AW-Puffer), um restliche Verunreinigungen zu entfernen und anschließend die Gewinnung der DNA mit Elutionspuffer (AE-Puffer).
3.5.2 Einstellen der DNA-Konzentration
Zunächst wurde jede DNA-Probe 1:10 mit Aqua dest. verdünnt. Anschließend wurde der DNA-Gehalt photometrisch (Photometer; Firma Pharmacia Biotech) bei 260 nm in einer 1 ml Quarzküvette bestimmt. Zur Berechnung der DNA-Menge pro µl Probe galt folgende Formel:
OD260 x 50/ 1000 = µgDNA/µl
Nach der Messung erfolgte die Einstellung der DNA-Konzentration auf 50 ng/µl mit sterilem Aqua dest. Die eingestellten DNA-Proben wurden bis zur Weiterverwendung bei 4°C gelagert.
3.5.3 Markerauswahl
Zur Genotypisierung der Rückkreuzungsmäuse mußten genetische Marker gefunden werden, die zwischen den Ausgangstämmen C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn und C57BL/6J@Ztm- Il10tm1Cgn polymorph sind. Die Darstellung solcher Polymorphismen erlaubt die Zuordnung, welche elterlichen Allele an welcher Lokalisation geerbt wurden. Aufgrund der hohen Polymorphismusrate und des relativ einfachen Nachweises mittels PCR wurden Mikrosatellitenmarker ausgewählt. Mit Hilfe dieser Marker sollten alle 19 Autosomen und das X-Chromosom in Abständen von 20-25 cM typisiert werden.
Bei der Auswahl der Mikrosatellitenmarker wurden veröffentlichte Daten für die Inzuchtstämme C3H/HeJ und C57BL/6J aus der Internetdatei der ‘Mouse Genome Informatics‘ Datenbank (www.informatics.jax.org/ [Mai 1999]) des Jackson Laboratory herangezogen. Dabei wurden bevorzugt solche Marker ausgewählt, die nach Datenbankangaben einen Längenpolymorphismus von mindestens 10 Basenpaaren für die Stämme C3H/HeJ und C57BL/6J aufweisen sollten. Insgesamt wurden 94 Mikrosatellitenmarker zur Testung auf Polymorphismen (Kapitel 3.5.4) ausgewählt.
Es wurde ein Marker für den Genort H2D basierend auf Angaben für die Stämme C3H/HeJ und C57BL/6J aus der Dissertationsarbeit von Herrn Dr. WEDEKIND (1998) ausgewählt, um eine mögliche Assoziation des Haupthistokompatibilitätskomplexes (H2) der Maus mit der Erkrankung prüfen zu können. Dieser Genort befindet sich innerhalb der MHC (engl.: major
