ISBN 978-3-86345-299-5
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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Katharina Schulz Hannover
- Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell -
Katharina Schulz Dissertation - Hannover 2015 -
Medizinische Hochschule Hannover
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2015
© 2015 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-299-5
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466
Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1
em1ZtmRatte - Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell -
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Katharina Schulz Neustadt am Rübenberge
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. André Bleich, PhD
Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. André Bleich, PhD
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2015
Für Biene
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... V Abbildungsverzeichnis ... IX Tabellenverzeichnis ... XII
1 Einleitung ... 1
1.1 Hintergrund ... 1
1.2 Ziele der Arbeit ... 2
2 Theoretische Grundlagen ... 3
2.1 Immunsystem... 3
2.1.1 B- und T-Zellreifung ... 5
2.1.2 Rag1 und V(D)J-Rekombination ... 8
2.2 Primäre Immundefizienzerkrankungen ... 10
2.2.1 Schwere kombinierte Immundefizienzerkrankungen ... 10
2.2.2 Omenn Syndrom ... 13
2.3 Immundefiziente Tiermodelle ... 15
2.3.1 Rag1 und Rag2 defiziente Mäuse ... 15
2.3.2 Rag1 defiziente Ratten ... 17
3 Material und Methoden ... 20
3.1 Versuchstiere ... 20
3.1.1 Haltung ... 21
3.1.2 Gesundheitsüberwachung ... 21
3.2 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien ... 22
3.3 Anfertigung histologischer Präparate ... 22
3.3.1 Histologische Auswertung ... 23
3.3.1.1 Immunsystem ... 23
3.3.1.2 Gastrointestinaltrakt ... 23
3.3.1.3 Leber ... 24
3.3.1.4 Herz ... 25
3.3.1.5 Haut ... 25
3.3.1.6 Speicheldrüsen ... 25
3.3.1.7 Lunge ... 25
3.4 Bestimmung der Leukozytenzahlen in verschiedenen Lymphknoten und der Milz ... 26
3.4.1 Lebend-Tot-Färbung der Lymphozyten ... 26
3.5 Erfassung physiologischer Parameter ... 26
3.6 Erfassung pathologischer Symptome ... 27
3.7 Gemischte Leukozytenkultur ... 28
3.8 Fluoreszenzbasierte durchflusszytometrische Analysen ... 30
3.8.1 Blut ... 31
3.8.2 Milz und Lymphknoten ... 32
3.8.3 Thymus ... 33
3.8.4 Intrazelluläre Färbung ... 33
3.8.5 Auswertung der FACS-Daten mit CellQuest Pro® ... 33
3.9 Aufarbeitung der Blutproben ... 34
3.9.1 EDTA-Vollblut ... 35
3.9.2 Blutserum ... 35
3.9.2.1 Serumchemie ... 35
3.9.2.2 Multiplex Assay ... 36
3.9.2.3 ELISA ... 36
3.10 Statistische Auswertungen ... 37
4 Ergebnisse ... 38
4.1 Klinische Befunde ... 38
4.1.1 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome der LEW-Rag1 Ratte ... 38
4.1.1.1 Wachstum ... 42
4.1.1.2 Reproduktionsparameter ... 42
4.1.2 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome an den Organen ... 44
4.2 Histologische Befunde ... 45
4.2.1 Histologische Befunde an den Organen des Immunsystems ... 46
4.2.2 Histologische Befunde am Gastrointestinaltrakt ... 51
4.2.3 Histologische Befunde an der Leber ... 54
4.2.5 Histologische Befunde an der Haut ... 54
4.2.6 Histologische Befunde an den Speicheldrüsen ... 58
4.2.7 Histologische Befunde an der Lunge ... 59
4.2.8 Histologische Befunde an den heterozygoten Merkmalsträgern ... 60
4.2.9 Gesamtergebnis der histologischen Auswertung ... 62
4.3 Blut- und Serumanalysen ... 64
4.3.1 Kleines und Großes Blutbild ... 64
4.3.2 Chemische Parameter im Blut ... 68
4.3.3 IgE und IgG im Serum ... 68
4.3.4 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren im Serum ... 69
4.4 In vitro Proliferation der T-Lymphozyten nach Antigenstimulation ... 70
4.4.1 Verhalten der Lymphozyten in Kultur ... 72
4.4.2 Absolute Zellzahlen in den Lymphknoten und der Milz ... 73
4.5 Zusammensetzung der Lymphozytenpopulation ... 75
4.5.1 Lymphozytenpopulation im Blut ... 75
4.5.2 Lymphozytenpopulation in den lymphatischen Organen ... 81
4.5.3 T-Zellrezeptorrepertoire ... 92
4.6 Analyse antibiotisch vorbehandelter Rag1 defizienter Ratten ... 93
5 Diskussion ... 96
5.1 Unterschiede zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungen ... 97
5.1.1 Physiologische Parameter und Organmorphologie ... 97
5.1.2 Unterschiede in der Leukozytenpopulation und damit zusammenhängende Effekte ... 103
5.1.3 Unterschiede der homozygoten und heterozygoten Träger des Gendefektes ... 110
5.2 Vergleich der LEW-Rag1 Ratte mit anderen Maus- und Rattenmodellen ... 111
5.3 Übertragbarkeit des LEW-Rag1 Phänotyps auf das Omenn Syndrom ... 115
5.4 Ausblick ... 117
6 Zusammenfassung ... 119
7 Summary ... 121
8 Literaturverzeichnis ... 123
9 Anhang ... 133
9.1 Material und Methoden ... 133
9.1.1 Geräte ... 133
9.1.2 Reagenzien ... 134
9.1.3 Verbrauchsmaterialien ... 135
9.1.4 Verwendete Kits ... 135
9.1.5 Computerprogramme ... 136
9.1.6 Protokolle der histologischen Arbeiten ... 136
9.1.7 Antikörper ... 138
9.1.8 Lösungen und Reagenzien für ELISA ... 140
9.1.9 Befundbogen des Tierpflegepersonals ... 141
9.2 Ergebnisse ... 142
9.2.1 Reproduktionsparameter ... 142
9.2.2 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren ... 144
Danksagung ... 146
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
µCi Mikrocurie
µl Mikroliter
µm Mikrometer
Abb. Abbildung
AIRE Autoimmun-Regulator Protein
ALT Alanin-Aminotransferase
ANOVA analysis of variance
Aqua dest. destilliertes Wasser
AST Aspartat-Aminotransferase
bcl-2 B-cell lymphoma 2
bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
ca. circa
CD Cluster of differentiation
CI Colony Index
cm Centimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
ConA Concanavalin A
cpm counts per minute
DN doppelt negativ
DNA deoxyribonucleic acid
DP doppelt positiv
DSB Doppelstrangbruch
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EPO Erythropoetin
FACS Fluorescence-Activated-Cell-Sorter
FCS fetales Kälberserum
FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
Foxp3 Forkhead-Box-Protein P3
FSC Forward Scatter
g Gramm
G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor
GM-CSF Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor
GRO/KC Growth-related Oncogene
Gy Gray
H2SO4 Schwefelsäure
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
ILC innate lymphoid cell
Kap. Kapitel
KO Knockout
l Liter
Ln./Lnn. Lymphonodus/Lymphonodi
M molar
Max. Maximum
MCP-1α Monocyte Chemotactic Protein-1 Alpha
M-CSF Macrophage colony-stimulating Factor
mg Milligramm
MHC major histocompatibility complex
MHH Medizinische Hochschule Hannover
min Minute(n)
Min. Minimum
MIP-3α Macrophage Inflammatory Protein-3 Alpha
MLC Mixed Leucocyte Culture
mM millimolar
NaCl Natriumchlorid
NKT-Zelle natürliche Killer T-Zelle
NK-Zelle natürliche Killerzelle
nm Nanometer
ns nicht signifikant
OS Omenn Syndrom
PALS periarterioläre lymphatische Scheide
PBS phosphatgepufferte Salzlösung
PCR Polymerase chain reaction
PE Phycoerythrin
pH negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PID primäre Immundefizienz
RAG humanes Recombination activating gene
Rag murines Recombination activating gene
RAG Protein, welches durch das murine Rag oder das humane RAG codiert wird
RANTES Chemokin mit folgenden Eigenschaften: regulated on activation, normal T cell expressed and secreted RITA Registry of Industrial Toxicology Animal-data
rpm revolutions per minute
RSS Recombination Signal Sequence
RT Raumtemperatur
SA-PE Streptavidin- Phycoerythrin
SCID Severe Combined Immunodeficiency
SD Sprague-Dawley
SPF spezifisch pathogenfrei
SSC Side Scatter
Tab. Tabelle
TCR T-Zell-Rezeptor
TNF-α Tumornekrosefaktor Alpha
Treg Regulatorische T-Zelle
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
WT Wildtyp
x g mal der Erdbeschleunigung
ZFN Zink-finger Nuklease
ZTL Zentrales Tierlaboratorium
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: T-Zellreifung im Thymus ... 7
Abbildung 2: Schematische Darstellung der RAG Proteine in voller Länge ... 8
Abbildung 3: Strukturen unreifer und reifer B- und T-Zell-Antigenrezeptoren ... 9
Abbildung 4: Pipettierschema MLC ... 29
Abbildung 5: Lymphozytengate ... 33
Abbildung 6: Gatingstrategie der durchgeführten FACS Färbungen ... 34
Abbildung 7: Klinisches Bild der LEW-Rag1 Ratte ... 38
Abbildung 8: Prävalenz der Erkrankungen der LEW-Rag1 Tiere ... 39
Abbildung 9: Inzidenz der klinischen Symptome bei den LEW-Rag1 Ratten ... 40
Abbildung 10: Gewichtsverläufe ... 42
Abbildung 11: Colony Index ... 43
Abbildung 12: Gewichte der Lebern und Milzen der LEW und LEW-Rag1 Ratten in Relation zu deren Körpergewicht ... 45
Abbildung 13: Entzündungszellinfiltrationen der Milzen von LEW und LEW-Rag1 Ratten . 47 Abbildung 14: Pathohistologische Veränderungen der Organe des Immunsystems ... 49
Abbildung 15: Histologischer Vergleich der Lymphknotenmorphologie von LEW und LEW- Rag1 Ratten ... 50
Abbildung 16: Vergleich der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 51
Abbildung 17: Pathohistologische Befunde am Magen-Darm-Trakt der LEW-Rag1 Ratten . 52 Abbildung 18: Haltungsabhängigkeit der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt der LEW-Rag1 Ratten ... 53
Abbildung 19: Pathohistologische Veränderungen der Leber und des Herzens der LEW-Rag1 Ratten ... 55
Abbildung 20: Einfluss des Gesundheitszustands und der Haltungseinheit auf den histologischen Score der Haut bei LEW-Rag1 Ratten im Vergleich zu LEW Kontrolltieren . 56 Abbildung 21: Pathohistologische Veränderungen der Speicheldrüsen und der Haut ... 57
Abbildung 22: Histologische Unterschiede der Speicheldrüsen von LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungen ... 59
Abbildung 23: Vergleich der Lungen gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten in
verschiedenen Haltungseinheiten ... 60 Abbildung 24: Histologische Präparate der Lungen von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 61 Abbildung 25: Vergleich der histologischen Scores gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten mit LEW und LEW-Rag1 +/- Ratten ... 63 Abbildung 26: Vergleich der histologischen Scores erkrankter und gesunder LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungseinheiten ... 63 Abbildung 27: Subjektive Krankheitsstärke ... 64 Abbildung 28: Vergleich der Anzahl der Leukozyten im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 66 Abbildung 29: Zusammensetzung der Leukozyten bei LEW und bei gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten ... 67 Abbildung 30: Verhältnisse von Lymphozyten zu neutrophilen Granulozyten ... 68 Abbildung 31: Vergleich der Immunglobulinkonzentrationen im Serum von LEW und LEW- Rag1 Ratten ... 69 Abbildung 32: Ausgewählte Zytokine im Vergleich ... 70 Abbildung 33: Proliferationsstärke in counts per minute (cpm) der Lymphozyten von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 72 Abbildung 34: Ergebnisse der Trypan-Blau-Färbung der LEW und LEW-Rag1
Lymphknotenzellen ... 73 Abbildung 35: Gesamtleukozytenzahlen der Milzen und Lymphknoten von LEW und LEW- Rag1 Ratten ... 74 Abbildung 36: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 75 Abbildung 37: Vergleich der Anteile reifer T-Lymphozyten im Blut bei gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinheiten ... 76 Abbildung 38: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten ... 77 Abbildung 39: Vergleich der Anteile αβTCR tragender T-Zellen zwischen LEW und LEW- Rag1 Ratten ... 78 Abbildung 40: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen im Blut von LEW und
Abbildung 41: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten
... 80
Abbildung 42: Vergleich der Anzahlen nachweisbarer NKT- und NK-Zellen im Lymphozytengate von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 81
Abbildung 43: Vorkommen reifer T-Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 82
Abbildung 44: Vorkommen der CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 83
Abbildung 45: Vorkommen der CD4+CD8+ Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 84
Abbildung 46: Vorkommen der reifen Lymphozyten in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Tieren ... 85
Abbildung 47: Verhältnis der verschiedenen reifen T-Lymphozyten im Lymphknoten zueinander ... 86
Abbildung 48: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Tieren ... 87
Abbildung 49: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 88
Abbildung 50: Vorkommen von NK-Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 89
Abbildung 51: Ergebnisse der FACS Analysen der LEW-Rag1 Thymi ... 90
Abbildung 52: FACS Daten des Blutes der heterozygoten LEW-Rag1 Ratten ... 92
Abbildung 53: Prozentuale Anteile der verschiedenen Vα- und Vβ-Rezeptortypen ... 93
Abbildung 54: Unterschiede in der Zytokin- Chemokin und Wachstumsfaktorkonzentration im Serum zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten und LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungen ... 144
Abbildung 55: Unterschiede der Zytokin-, Chemokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen im Serum zwischen gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Ratten ... 145
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Klassifizierung verschiedener SCID Formen... 12
Tabelle 2: Klassisches und atypisches Omenn Syndrom ... 14
Tabelle 3: Verwendete Tierstämme ... 20
Tabelle 4: Klinischer Score der histologisch ausgewerteten Tiere ... 27
Tabelle 5: Zellkulturmedium für MLC ... 29
Tabelle 6: FACS Puffer ... 32
Tabelle 7: Erythrozyten Lysis Puffer (Erylyse) ... 32
Tabelle 8: Pappenheim Färbung ... 35
Tabelle 9: Zusammenfassung aller beobachteten Symptome ... 41
Tabelle 10: Gruppenzusammensetzung für die histologischen Untersuchungen ... 46
Tabelle 11: Histologische Scores der mit Cotrim K behandelten Tiere ... 94
Tabelle 12: FACS Ergebnisse der mit Cotrim K behandelten Tiere ... 94
Tabelle 13: Protokoll für die Entwässerung ... 136
Tabelle 14: Protokoll der H&E Färbung ... 137
Tabelle 15: Antikörper für allgemeine Analysen ... 138
Tabelle 16: Antikörper für die Analyse des αβTCR Repertoires ... 139
Tabelle 17: Bicarbonat/Carbonat Coating Puffer (100mM) ... 140
Tabelle 18: ELISA Waschlösung ... 140
Tabelle 19: ELISA Blockinglösung ... 140
Tabelle 20: ELISA Proben-/ Konjugatverdünnung ... 140
Tabelle 21: Reproduktionsparameter der LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 142
1 Einleitung
1.1 Hintergrund
Das Recombination Activating Gene 1 (Rag1) ist für die B- und T-Zellreifung unerlässlich.
Sein gleichnamiges Protein wird vorwiegend in B- und T-Zellvorläufern exprimiert und katalysiert zusammen mit dem RAG2 einen wichtigen Teil des Reifungsprozesses dieser Zellen (Tonegawa 1983). Durch die Induktion von DNA Doppelstrangbrüchen kann es zur Rekombination der T-Zellrezeptoren und der Immunglobulinmoleküle kommen, was zu einer großen Variabilität führt, wodurch eine breit gefächerte Reaktion des adaptiven Immunsystems auf Antigene möglich wird (Fugmann et al. 2000, Gellert 2002, Lewis 1994, McBlane et al. 1995). 2012 wurde am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover mittels zinc-finger Nucleasen (ZFN) ein Rag1 defizienter Rattenstamm generiert. Die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm entstand mit dem Ziel, ein effizientes immundefizientes Rattenmodell für die Transplantationsforschung zu entwickeln. Außerdem wurde ihm die Verwendbarkeit in Wiederherstellungsexperimenten des Immunsystems zugeschrieben (Zschemisch et al. 2012). Näher betrachtet, ähnelt der beobachtete Phänotyp der LEW/Ztm- Rag1em1Ztm einer humanen Immundefizienzerkrankung, dem sogenannten Omenn Syndrom.
Hierbei handelt es sich um eine schwere Immundefizienzerkrankung, die in 90 % aller Fälle durch Mutationen des RAG1 oder RAG2 bedingt ist und mit schweren Infektionen des Atmungs- und Gastrointestinaltraktes einhergeht (Corneo et al. 2001, Niehues, Perez-Becker
& Schuetz 2010). Des Weiteren werden bei Patienten mit dem Omenn Syndrom variable Anzahlen zirkulierender T-Lymphozyten mit eingeschränktem T-Zellrezeptor Repertoire und ein nahezu vollständiges Fehlen von B-Lymphozyten nachgewiesen. Dazu kommen eine schwere Erythrodermie mit Alopezie, vergrößerte lymphatische Gewebe, Thymusdysplasie und eine Eosinophilie im Blut und Gewebe (Hönig, Schwarz 2006, Kato et al. 2006, Villa et al. 2008). Kinder mit diesem Gendefekt fallen schon früh im Leben, im Alter von wenigen Monaten, mit diesen Symptomen auf. Die einzigen heutzutage angewendeten Therapiemaßnahmen bilden eine Knochenmarktransplantation oder die Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut. Trotzdem liegt die Mortalität der betroffenen Kinder noch immer bei 46 % (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006).
1.2 Ziele der Arbeit
Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte phänotypisch zu charakterisieren. Dabei werden nicht nur die Unterschiede dieses Rattenstammes zu seinem Ursprung, der LEW Ratte, untersucht, sondern es erfolgt auch eine differenzierte Betrachtung symptomloser und erkrankter Rag1 defizienter Tiere untereinander. Ein weiterer Fokus liegt auf der Fragestellung, ob die Haltungshygiene einen Einfluss auf den Phänotyp hat. Zur Klärung dieser Fragestellungen werden sowohl das ganze Tier umfassende Methoden angewendet, als auch zahlreiche Untersuchungen auf zellulärer Ebene durchgeführt.
Letztendlich wird ein besonderes Augenmerk auf seine Vergleichbarkeit mit dem humanen Omenn Syndrom und anderen murinen Rag1 und Rag2 defizienten Tieren gelegt.
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Immunsystem
Das Immunsystem ist ein interaktives Netzwerk aus Zellen und Molekülen, die spezialisierte Aufgaben in der Infektionsabwehr übernehmen. Dafür setzt es zwei völlig unterschiedliche Mechanismen ein, um den Körper gegen Antigene zu schützen. Dies sind zum einen die angeborenen und zum anderen die erworbenen (adaptiven) Immunantworten. Die angeborenen Mechanismen sorgen mit phagozytierenden Zellen (neutrophile Granulozyten, Monozyten, Makrophagen), Zellen, welche inflammatorische Mediatoren freisetzen (basophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Mastzellen), natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und weiteren innate lymphoid cells (ILC) für einen sofortigen Schutz. Auch Komplement, Zytokine und Akute-Phase-Proteine spielen hier eine große Rolle. Die adaptive Immunität setzt sich aus Antigen-spezifischen Reaktionen der B- und T-Lymphozyten zusammen. Während die angeborenen Immunmechanismen zwar schnell greifen aber wenig spezifisch sind, arbeitet das adaptive Immunsystem deutlich präziser, benötigt allerdings mehrere Tage oder Wochen um seine komplette Wirkung zu entwickeln (Abbas et al. 2015, Delves, Roitt 2000b, Parkin, Cohen 2001).
Alle immunologischen Vorgänge des angeborenen Immunsystems laufen immer in gleicher Weise ab, ohne bei wiederholtem Kontakt mit demselben Antigen eine Anpassungsreaktion auszubilden. Einen zentralen Baustein dieses Anteils bilden die neutrophilen Granulozyten.
Nach Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren sie als mobile Zellen frei in der Blutbahn des Körpers. Erst mit Hilfe proinflammatorischer Mediatoren, Adhäsionsmolekülen und Chemokinen gelangen diese Zellen in infiziertes Gewebe, um dort Erreger durch Phagozytose und anschließende Lyse zu zerstören (Witko-Sarsat et al. 2000). Letztendlich nutzen alle Leukozyten den oben beschriebenen Mechanismus um zum Infektionsherd zu gelangen (Marchesi, Gowans 1964, von Andrian, Mackay 2000). Darüber hinaus exprimieren sowohl Makrophagen als auch neutrophile Granulozyten Rezeptoren für Antikörper und Komplementfaktoren. Dadurch wird die Phagozytose antiköper- oder komplementmarkierter Mikroorganismen zusätzlich forciert (Aderem, Underhill 1999). Die vorwiegende Aufgabe eosinophiler Granulozyten besteht im Schutz des Organismus vor parasitären Infektionen und
auch im Verlauf von Allergien wird ihnen eine Funktion zugeschrieben. Im Gegensatz zu neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sind eosinophile Granulozyten nicht in der Lage, Erreger zu phagozytieren. Anstatt dessen sezernieren sie zytotoxisch wirkende Substanzen in den Extrazellularraum und setzen zusätzlich Leukotriene, Prostaglandine und zahlreiche Zytokine frei (Wardlaw, Moqbel & Kay 1995). Basophile Granulozyten und Mastzellen weisen ähnliche funktionelle Charakteristika auf (Abraham, Arock 1998).
Während basophile Granulozyten im Blut zu finden sind, kommen Mastzellen vor allem im Bindegewebe und in Schleimhäuten vor. Beide Zelltypen besitzen hoch-affine IgE Rezeptoren (FcεR) (Kinet 1999). Binden Antikörper-markierte Antigene daran, werden Entzündungsmediatoren von der Zelle freigesetzt. Eine große Rolle spielen diese beiden Zelltypen auch in der Entstehung von Allergien, wie zum Beispiel Ekzemen, Heuschnupfen und Asthma (Cruse, Bradding 2015, Knol et al. 1996). NK-Zellen und weitere ILCs ähneln morphologisch den Lymphozyten, besitzen allerdings keinen spezifischen Antigenrezeptor.
Ihre Aufgabe ist es, infizierte oder maligne entartete Zellen zu zerstören und spezifische Zytokine zu produzieren (Biron et al. 1999, Walker, Barlow & McKenzie 2013). Neben den zellulären Bestandteilen des angeborenen Immunsystems kommen auch zahlreiche lösliche Faktoren vor. Dazu zählt zum einen das Komplementsystem, welches unter anderem zur Lyse von Mikroorganismen beiträgt, Antigene für Phagozyten markiert und so die Phagozytose erleichtert (Reid, Porter 1981). Zum anderen assistieren Akute-Phase-Proteine und Zytokine bei der Immunantwort. Während die Akute-Phase-Proteine proinflammatorisch wirken und dadurch die Resistenz des Organismus verstärken und die Reparatur von geschädigtem Gewebe vorantreiben (Cid et al. 1993, Gabay, Kushner 1999), agieren Zytokine als Vermittler innerhalb des Immunsystems und zwischen dem Immunsystem und anderen Organsystemen des Körpers (Thorpe et al. 1992).
Antigen-spezifische Rezeptoren auf B- und T-Lymphozyten bilden das Charakteristikum der adaptiven Immunität. Obwohl sehr ähnliche Gensegmente für die Entstehung der verschiedenen Rezeptoren zuständig sind, unterscheiden sich diese beiden Zelltypen in ihrer Spezifität grundlegend. B-Zellen exprimieren Serumimmunglobulin Moleküle auf der Außenseite ihrer Zellmembran, welche lösliche Antigene direkt binden. Im Gegensatz dazu nutzen T-Zellen ein Heterodimer, das bestimmte Kombinationen von Antigenproteinen mit
anderer Zellen erkennt (Germain 1986). Damit es zu einer spezifischen Immunantwort kommen kann, muss das Antigen den antigenspezifischen B- und T-Zellen präsentiert und von ihnen erkannt werden. Das führt dann zur Zellvorbereitung, -aktivierung und - differenzierung in den lymphatischen Organen, worauf hin eine spezifische Immunantwort erfolgt. Hierbei verlassen aktivierte T-Lymphozyten das lymphatische Gewebe und gelangen durch homing zum Infektionsherd, aktivierte B-Lymphozyten (Plasmazellen) setzen Antikörper in Blut und Gewebsflüssigkeit frei (Parkin, Cohen 2001). Die Antigene werden mit der Lymphe oder gebunden (endozytiert) an Antigen-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, B-Zellen), in lymphatisches Gewebe transportiert. Endogen produziertes (z.B. virales) Antigen wird als Komplex mit MHC I Molekülen exprimiert, exogene und daraufhin phagozytierte Antigene dagegen als Komplex mit MHC Klasse II (Germain 1986, Morrison et al. 1986). Eben beschriebene Komplexe sind nötig, um eine spezifische Immunantwort auszulösen. Diese äußert sich in direkter Zytotoxizität, der Generierung spezifischer Antikörper oder in der Produktion und Freisetzung von Zytokinen, die weitere Zellen aktivieren (Parkin, Cohen 2001).
Diese Tatsachen machen klar, dass das Immunsystem ein hoch komplexes Gebilde ist, welches sich ständig moduliert und auch mit anderen Organsystemen des Körpers eng verflochten ist (Ottaway, Husband 1994). Allein die Dysfunktion eines kleinen Anteils kann schwerwiegende Folgen für den Organismus haben. Zudem bietet es jedoch auch viele Ansatzmöglichkeiten für verschiedene Therapieformen wie zum Beispiel Stammzelltransplantationen, Vakzinationen oder die Immunmodulation mittels Zytokinen oder deren Antagonisten (Ibrahim, Gotch 2000, Parkin, Cohen 2001).
2.1.1 B- und T-Zellreifung
Da die Kenntnis des spezifischen Reifungsprozesses der Zellen des adaptiven Immunsystems (B- und T-Lymphozyten) essentiell für das Verständnis dieser Arbeit ist, wird dieser Vorgang in diesem Kapitel genauer beschrieben. Beide Zelltypen durchlaufen während ihres Reifungsprozesses eine Umordnung der zuständigen Antigenrezeptorgene (Schatz, Oettinger
& Schlissel 1992) (Kap. 2.1.2). Sowohl die Vorläuferzellen der B-Lymphozyten als auch die Vorläuferzellen der T-Lymphozyten befinden sich im Knochenmark. Während die B-
Zellreifung komplett im Knochenmark abläuft, findet der größte Teil der T-Zellreifung nach der Migration dieser Zellen in den Thymus statt (Parkin, Cohen 2001).
Nach Abschluss der oben angesprochenen Genrekombination gelangen antigenspezifische, naive B-Zellen ins Blut und besiedeln von dort aus die sekundären lymphatischen Organe.
Während einer Immunantwort entstehen dort Keimzentren („germinal centers“), die ein gutes Umfeld für die Interaktion zwischen Antigen-präsentierenden und antigenspezifischen Zellen bilden (Tarlinton 1998). Hier kommt es als Erstes zur Antigen stimulierten Proliferation der naiven B-Zellen, verbunden mit dem Vorgang der somatischen Hypermutation, auch
„receptor editing“ genannt. Dabei findet ein erneuter Genumbau der variablen Antikörperregionen statt, um Autoreaktivität zu vermeiden und die Rezeptorspezifität zu erhöhen. In dieser Phase tragen die naiven B-Zellen ihre Antikörper als B-Zellrezeptoren auf der Zelloberfläche (Radic, Zouali 1996). Im nächsten Schritt erfolgt die positive Selektion hochaffiner, antigenspezifischer B-Lymphozyten. Allein die Zellen, die in der Lage sind, mit Antigen-Antikörperkomplexen auf follikulären dendritischen Zellen zu interagieren, werden von der Apoptose ausgeschlossen. Diese positiv selektierten Zellen proliferieren und generieren so eine große Masse an hochspezifischen B-Lymphozyten (klonale Proliferation).
Diese erzeugen antigenspezifische Antiköper, welche im Falle einer Aktivierung in die Peripherie entlassen werden und dort entweder direkt oder indirekt zur spezifischen Immunantwort beitragen (Delves, Roitt 2000a).
Im Thymus findet der dominierende Anteil der T-Zellreifung statt (Abb. 1). Anders als Antikörper sind T-Zellrezeptoren (TCRs) ausschließlich als transmembrane Moleküle vorhanden (Delves, Roitt 2000b). Nach ihrer Ankunft im Thymus verlieren die lymphoiden Vorläuferzellen ihr Potential, sich zu B-Lymphozyten oder NK-Zellen entwickeln zu können.
Dadurch erreichen sie das Stadium eines doppelt negativen (DN; CD4-CD8-) T-Zellvorläufers (Michie et al. 2000, Germain 2002). Das bedeutet, sie besitzen weder die Oberflächenmoleküle CD4 und CD8 noch einen TCR. Im Rahmen der Entwicklungsstufen einer DN Zelle ist entweder eine Entwicklung zu einer αβ- oder einer γδTCR exprimierenden T-Zelle möglich (Delves, Roitt 2000b).
Noch im Laufe ihres DN Stadiums entwickeln die Thymozyten über Zwischenstufen, in denen eine Umstellung und Neuordnung der Rezeptorgene vonstattengeht, einen ausgereiften TCR auf ihrer Oberfläche (Germain 2002). Dieser ist stets mit einem weiteren Proteinkomplex assoziiert, dem CD3/ζ-Komplex (van Oers, von Boehmer & Weiss 1995).
Zusätzlich beginnen die DN Zellen Co- Rezeptorproteine (CD4 und CD8) zu exprimieren. Das lässt sie in den doppelt positiven (DP; CD4+CD8+) Entwicklungsabschnitt übertreten (Germain 2002). Nun geben alle DP Thymozyten, die körpereigene MHC Moleküle erkennen, entweder ihren CD4- oder ihren CD8-Proteinkomplex ab und vermehren sich durch Teilung (positive Selektion) (Jameson, Hogquist
& Bevan 1995, Teh et al. 1988). In einem zweiten Schritt werden die Zellen, die gegen körpereigene Antigene gerichtet sind, durch Apoptose am Fortbestehen gehindert (negative Selektion) (Germain 2002). Dadurch entsteht eine Population einfach positiver (CD3+CD4+ oder CD3+CD8+), selbsttoleranter T-Lymphozyten, die körperfremde Antigene, in Kombination mit MHC Molekülen, erkennen können. Diese naiven T-Zellen werden in die Peripherie entlassen. Dort zirkulieren sie im Blut oder der Lymphe und sind in großer Anzahl in den sekundären lymphatischen Organen auffindbar. Treffen sie auf eine antigenpräsentierende Abbildung 1: T-Zellreifung im Thymus
Aus DN Thymozyten entstehen in der Thymusrinde TCR tragende DP Thymozyten. Im Laufe der Entwicklung kommt es zur Retention von entweder CD4 oder CD8 und Zellen, die mit körpereigenem MHC interagieren können, durchlaufen den weiteren Reifungsprozess (Positive Selektion). Lymphozyten, deren TCR gegen körpereigene Antigene gerichtet ist, werden durch negative Selektion aussortiert. So können nur selbsttolerante, funktionsfähige T-Zellen den Thymus verlassen.
Modifiziert nach Parkin, Cohen (2001)
Zelle mit passendem Antigen, dann differenzieren sie sich innerhalb der nächsten 2-3 Tage zu aktivierten T-Lymphozyten (Parkin, Cohen 2001).
2.1.2 Rag1 und V(D)J-Rekombination
Das Immunsystem kann eine riesige Bandbreite an Antigenen erkennen und darauf reagieren.
Diese extreme Vielschichtigkeit entsteht durch das große Repertoire des Körpers an spezifischen Antigenrezeptoren und Immunglobulinmolekülen (Fugmann et al. 2000, Gellert 2002, Lewis 1994). Hierfür sind die von den „Recombination Activating Genes“ produzierten Proteine, RAG1 und RAG2, unerlässlich. Sie sind überwiegend in T- und B-Zellvorläufern exprimiert und katalysieren einen wichtigen Teil ihres Reifungsprozesses, die V(D)J- Rekombination (Tonegawa 1983). Beide Proteine interagieren miteinander (Ji et al. 2010). In einer Studie konnte Rag1 Transkript auch im zentralen Nervensystem von Mäusen nachgewiesen werden (Chun et al. 1991).
Die Struktur des Rag Lokus ist in den meisten Wirbeltiergenomen gleich.
Innerhalb dieses Lokus liegen die Gene, die RAG1 und RAG2 kodieren, sehr nah beieinander, haben eine besonders kompakte Organisation und werden zusammen transkribiert. Die Proteinsequenzen der Wirbeltiere gleichen sich zu 50-90 % (Gellert 2002). Beim Menschen befindet sich RAG1 auf dem Chromosom 11p13 (Sherrington et al.
1992), bei der Maus auf Chromosom 2qE2 und auf 3q31 bei der Ratte. Für das murine RAG1 ergibt sich eine Größe von 1040 und für das kürzere RAG2 eine Länge von 527
Aminosäuren. Da die RAG Proteine relativ groß sind, geht die Mehrheit aller Studien lediglich auf Proteinfragmente ein, welche den sogenannten „Core-Regionen“ zuzuordnen Abbildung 2: Schematische Darstellung der RAG Proteine in voller Länge
NBR stellt die nonamer-binding region dar, welche spezifisch an der Recombination Signal Sequence (RSS) der DNA bindet. D600, D708 und E962 zeigen die mutmaßlichen Areale der aktiven Rückstände.
Zusätzlich ist die zinc-binding dimerization domain (ZDD), mit ihren Zink-bindungsmustern, RING finger (RING) und zinc finger A (ZFA), sowie ein zinc finger B (ZFB), eingezeichnet.
Modifiziert nach De, Rodgers (2004)
sind (Abb. 2). Diese Regionen, von RAG1 und RAG2 zusammen, reichen für die komplette DNA Spaltungsaktivität in in vitro und in vivo Assays aus (Cuomo, Mundy & Oettinger 1996, Sadofsky, Hesse & Gellert 1994, Silver et al. 1993). In der Abbildung sind die Proteine schematisch als Balken dargestellt.
1989 wurde RAG1 von Schatz et al. das erste Mal isoliert und mit dem Mechanismus der V(D)J-Rekombination in Verbindung gebracht (Schatz, Oettinger & Baltimore 1989). Sein direkter Einfluss durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen wurde 1995 von McBlane et al. nachgewiesen.
Bei V (variable), D (diversity) und J (joining) handelt es sich um drei nicht verbundene codierende Segmente der Antigenrezeptorgene. Diese werden während des Vorgangs der sogenannten V(D)J- Rekombination in verschiedenster Art zusammengefügt. Das Zusammenfügen nach der 12/23 Regel gewährleistet eine sehr große Variabilität der neugenerierten Gene.
Damit bilden sie die Grundlage für eine möglichst breite T-Zellrezeptor- und Immunglobulinvariabilität (Bassing, Swat &
Alt 2002, De, Rodgers 2004) (Abb. 3).
Dieser Vorgang findet an sieben unterschiedlichen Lokalisationen statt: Der schweren Immunglobulinkette und der leichten Kettenloci κ und λ in B-Lymphozyten (Tonegawa 1983) und an den TCR α, β, γ, und δ Kettenloci der T-Lymphozyten (Davis, Bjorkman 1988). Zusätzlich gliedert er sich in zwei Phasen. Als erstes bilden RAG1 und RAG2 einen Multiproteinkomplex durch Interaktion mit einer eigenständigen Recombination Signal Sequence (RSS), welche jedes V, D und J Segment flankiert. Anschließend katalysieren die RAG Proteine einen DNA Doppelstrangbruch an jeder RSS (McBlane et al.
1995). Das führt zu einem Komplex mit vier DNA Enden (zwei 5‘ phosphorylierte Abbildung 3: Strukturen unreifer und reifer B- und
T-Zell-Antigenrezeptoren Modifiziert nach Delves, Roitt 2000
recombination signal Enden und zwei codierende Enden, die in DNA hairpinstructures münden). In der zweiten Phase der V(D)J-Rekombination werden die getrennten DNA Enden mittels „nonhomologous end-joining“ Reparatur wieder zusammengefügt. An den kodierenden Enden geschieht dies sehr unpräzise, so dass dort eine große Variabilität entsteht (Lieber et al. 2003) und später viele verschiedene Antigene vom Organismus erkannt werden können.
Frame shift Mutationen in den „non-core regions“ der Rekombinations aktivierenden Gene führen zu ineffizienter V(D)J-Rekombination und dadurch zu Immundefizienz (Noordzij et al.
2000, Santagata et al. 2000). Eine mögliche fehlende oder eingeschränkte Rekombinationsaktivität kann mithilfe eines sogenannten „V(D)J recombination assays“
nachgewiesen werden (Schwarz et al. 1996, Villa et al. 1998). Hierbei werden Fibroblastenkulturen mit Expressionsplasmiden transfiziert, welche Wildtyp- oder mutierte RAG1/2 Proteine kodieren. (Zur genauen Durchführung des Assays siehe: Hesse et al. (1987), Lieber et al. (1987) und Gauss et al. (1998).) (Hesse et al. 1987, Lieber et al. 1987, Gauss et al. 1998)
2.2 Primäre Immundefizienzerkrankungen
Die primären Immundefizienzen (primary immunodeficiencies, PIDs) sind angeboren und vererbbar und können sowohl den angeborenen als auch den erworbenen Teil des Immunsystems beeinflussen. Ist letzterer betroffen, dann kommt es zu einem Mangel an Antikörpern oder zu einer fehlerhaften Zusammenarbeit diverser Komponenten des Immunsystems.Daraus differenzieren sich die schweren kombinierten Immundefizienzen (severe combined immunodeficiencies, SCIDs) als eine Gruppe verschiedener angeborener Erkrankungen, welche entweder die zelluläre oder die humorale Immunität betreffen, heraus (Aloj et al. 2012, Fischer et al. 2005).
2.2.1 Schwere kombinierte Immundefizienzerkrankungen
Eine (fast) vollständige Insuffizienz der körpereigenen T-Zellen bildet das Hauptcharakteristikum der schweren kombinierten Immundefizienzerkrankungen (SCID
direkte Schädigung des B-Zell-Zyklus oder sekundär, durch inadäquate B-Zell Aktivierung der gestörten T-Helferzellpopulation, gestört (Aloj et al. 2012). Gegenwärtig erfolgt die Klassifizierung der verschiedenen SCID Formen anhand des Auftretens oder Fehlens bestimmter Immunzellen, speziell T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und NK-Zellen (Tab. 1).
In den letzten Jahren wurden zahlreiche ursächliche Gendefekte identifiziert und viele neue Formen weisen zudem extrahämatopoetische Veränderungen auf, welche zu komplexen Organveränderungen, auch außerhalb des Immunsystems, führen (Aloj et al. 2012).
In Tabelle 1 werden zahlreiche Gene aufgeführt, deren Dysfunktion zu SCID Erkrankungen führen kann. Eines davon ist RAG1. Schwarz et al. identifizierten 1996 beim Menschen eine Mutation in diesem Gen als Auslöser für eine klassische SCID Form, bei der weder T- noch B-Lymphozyten nachgewiesen wurden (Schwarz et al. 1996). Handelt es sich bei der Schädigung des Gens um eine hypomorphe Mutation, kommt es zu „atypischen“ SCID Ausprägungen (de Villartay et al. 2005, Ehl et al. 2005, Schuetz et al. 2008). Dazu zählt unter anderem das klassische Omenn Syndrom (Niehues, Perez-Becker & Schuetz 2010).
Die Prävalenz der SCIDs in der Bevölkerung liegt ungefähr bei 1:50.000, mit einem erhöhten Anteil männlicher Individuen (Aloj et al. 2012). Betroffene dieser angeborenen Erkrankungen leiden schon früh im Leben, innerhalb der ersten Lebensmonate, an schweren, lebensbedrohlichen Infektionen bakteriellen, viralen oder mykotischen Ursprungs. Diese äußern sich oft in einer interstitiellen Pneumonie, chronischer Diarrhö und einer mangelnden Gewichtszunahme (Notarangelo et al. 2009). Zusätzlich können Betroffene einen Hautausschlag entwickeln, welcher häufig entweder durch plazentar übergetretene maternale T-Zellen ausgelöst wird, oder durch die Aktivierung autologer T-Zellen bedingt ist, die sich in einer Autoreaktion gegen Hautkomponenten richten (Palmer et al. 2007).
Der spezielle Phänotyp des jeweiligen Erkrankten kann Hinweise auf die Lage des Defektes geben und sollte zur Diagnosestellung herangezogen werden. Allerdings können SCID Patienten bei unterschiedlicher Pathogenese und unterschiedlichen zugrunde liegenden genetischen Mechanismen auch einen sehr ähnlichen Phänotyp ausprägen.
2 Theoretische Grundlagen 12
1: Klassifizierung verschiedener SCID Formen ormPhänotypGendefektPathogenese 3 Defizienz, γ-KettendefizienzT- B+ NK- JAK3, γ cGestörte Zytokinsignalgebung efizienzT- B+ NK+ IL-7RαGestörte Zytokinsignalgebung efizienzT- B- NK- ADAAkkumulation toxischer Me fizienzT- B+ NK- PNPAkkumulation toxischer Me 1/RAG2 DefizienzT- B- NK+ RAG1/RAG2Gestörte V(D)J-Rekombina IS, KU70/80, DNA PK- AligaseIV Defizienz T- B- NK+ ARTEMIS, KU70/80, DNA PK- cs, LIG4 Gestörte V(D)J-Rekombina gestörte DSB Reparatur NOS/XLF DefizienzTlow Blow NK+ CERNUNNOS/XLFGestörte V(D)J-Rekombina gestörte DSB Reparatur kuläre DysgeneseT- B-/+ NK- AK 2Verstärkte Apoptose efizienzT- B+ NK+ ZAP70Gestörte TCR Signalgebung I DefizienzT+ B+ NK+ TAP1/TAP2, TAPASINGestörte Antigenpräsentati II DefizienzTlow B+ NK+ HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DM, HLA-DO Gestörte Antigenpräsentati DefizienzT- B- NK+ CORO1AAnormale Aktin Polymerisatio K8 DefizienzT- B+ NK+ DOCK8Defekte Aktin Polymerisati /SCIDT-/low B+ NK+ FOXN1Gestörter "cross-link" (Th modifiziert nach Aloj et al. (2012).
2.2.2 Omenn Syndrom
Das humane Omenn Syndrom (OS) wurde 1965 als erstes von Gilbert S. Omenn beschrieben.
Hier berichtete er über das Auftreten einer Retikuloendotheliose mit Eosinophilie bei mehreren Mitgliedern einer amerikanischen Familie irischen Ursprungs (Omenn 1965). Er beschrieb den Symptomkomplex als Immundefizienzerkrankung mit zusätzlichen Symptomen, welche an eine Graft-versus-Host Reaktion erinnern. Dieses Syndrom schien das Resultat verschiedener genetischer und primär immunologischer Mechanismen zu sein, die zu einem homogenen Krankheitsbild führten (Karol et al. 1983, Omenn 1965, Omenn 1971).
Später konnte ein autosomal-rezessiver Erbgang nachgewiesen werden (Villa et al. 1999).
Aufgrund des gemeinsamen Auftretens dieser beiden Effekte (Immundefizienz und Graft- versus-Host Reaktion) galt das OS lange Zeit als eine rätselhafte Erkrankung, dessen molekulare Grundlagen erst im letzten Jahrzehnt aufgedeckt wurden (Marrella, Maina & Villa 2011). Villa et al. berichteten 1998 das erste Mal von einem Zusammenhang dieses Syndroms mit einer Mutation der Recombination Activating Genes.
Genetische Studien haben gezeigt, dass der Omenn Phänotyp eine breite molekulare Heterogenität aufweist und nicht einzig und allein durch Mutationen der Gene RAG1 und RAG2 zustande kommt (Ege et al. 2005, Giliani et al. 2006, Roifman, Gu & Cohen 2006, Roifman et al. 2008, Shibata et al. 2007). Zusätzlich ist es wichtig, zwischen dem
„klassischen OS”, in Form einer gestörten V(D)J-Rekombination, und „Omenn-ähnlichen“
SCIDs zu unterscheiden (Tab. 2). Letztere sind durch Genmutationen bedingt, welche direkten Einfluss auf die Reifung der Lymphozyten haben (Marrella, Maina & Villa 2011).
Das „klassische OS“ dagegen ist durch hypomorphe Defekte in Genen, welche für die V(D)J- Rekombination zuständig sind, gekennzeichnet (Marrella, Maina & Villa 2011). Diese schwächen die V(D)J-Rekombination nur ab, anstelle eines kompletten Funktionsverlusts (Villa et al. 1998). Hierbei sind Mutationen der Gene RAG1 und RAG2 für über 90 % aller beschriebenen OS Fälle verantwortlich (Niehues, Perez-Becker & Schuetz 2010, Corneo et al.
2001). Bei den meisten Mutationen handelt es sich um einen Aminosäureaustausch. Des Weiteren wurden aber auch einige kleine in-frame Deletionen beschrieben (Sobacchi et al.
2006). Zusätzlich zu diesen Erkenntnissen gab es auch Patienten mit einem unvollständigen
Omenn Phänotyp aufgrund einer RAG Mutation (Villa et al. 2001). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass das OS als eine kontinuierliche Einheit betrachtet werden sollte, deren meist verbreitete Eigenschaft das Auftreten von Entzündungen und schweren Infektionen darstellt (Villa et al. 2008).
Tabelle 2: Klassisches und atypisches Omenn Syndrom
Gen Funktion Phänotyp
RAG1/RAG2 V(D)J-Rekombination OS; T+ B- NK+
klassisch Artemis V(D)J-Rekombination OS; T+ B- NK+
IL7Rα Lymphozyten Entwicklung OS; T+ B+ NK+
atypisch IL2Rγ Lymphozyten Entwicklung OS; NK Infiltr. der Haut; T+ B+
CHD7 Chromatin Remodelierung OS; keine Erythrodermie; T- B+ NK+ ADA Purin Metabolismus OS; weniger T-zellen; T+ B- NK+
RMRP Zellzyklus OS; T+ B+ NK+
Modifiziert nach Marella, Maina & Villa (2011) und Villa et al. (2008)
Kinder mit diesem Gendefekt fallen schon sehr früh im Leben (2. bis 5. Lebensmonat) mit chronischem Durchfall, Pneumonie und gestörtem Wachstum auf. Im Gegensatz zu an SCID erkrankten Menschen kommen noch zahlreiche weitere Symptome dazu. Hierzu zählen zum einen vergrößerte lymphatische Gewebe, schwere Erythrodermie, erhöhte IgE-Level und Eosinophilie im Blut und Gewebe (Villa et al. 2008) und zum anderen Hepatosplenomegalie, Alopezie (Kato et al. 2006) und Thymusdysplasie (Hönig, Schwarz 2006). Alle anderen Immunglobuline sind, laut Villa et al. (1999), in verminderter Konzentration im Serum nachweisbar.
Der Anteil an zirkulierenden T-Lymphozyten im peripheren Blut ist sehr variabel. Er kann normal oder erhöht sein (Villa et al. 1999). Bei den vorhandenen T-Zellen handelt es sich um oligoklonale, häufig aktivierte Lymphozyten mit einem eingeschränkten TCR Repertoire (de Saint-Basile et al. 1991, Rieux-Laucat et al. 1998), überwiegend vom Th2-Typ (Schandene et al. 1993). In vitro lassen sich diese aktivierten T-Zellen kaum durch Mitogene zur Proliferation anregen (Villa et al. 1999). Meistens sind B-Lymphozyten im Blut nur in sehr
Zellen dagegen liegt bei uneingeschränkter Funktion im Referenzbereich oder kann auch erhöht sein (Aleman et al. 2001, Villa et al. 2008).
Die einzigen heutzutage bekannten und angewendeten Therapiemaßnahmen bilden eine Knochenmarktransplantation oder die Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut.
Vorangehend sind myeloablative Maßnahmen, sowie ein Abtöten der autoreaktiven T-Zellen, zum Beispiel mittels Chemotherapie, notwendig. Trotz dieser Therapiemaßnahmen beträgt die Mortalität 46 % (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006). Nach der Diagnostizierung ist übergangsweise eine immunsuppressive Therapie mit Prednison und Cyclosporin A hilfreich, um sowohl die Expansion als auch die Infiltration der T-Lymphozyten einzudämmen (Villa et al. 2008). Zusätzlich gibt es neue Therapieansätze, welche sich mit einer Gentherapie beschäftigen (Pike-Overzet et al. 2011, van Til et al. 2014).
2.3 Immundefiziente Tiermodelle
Über das humane RAG1 hinaus werden seit langer Zeit auch die vergleichbaren Gene von Mäusen, Ratten, Zebrafischen (Willett, Cherry & Steiner 1997) und Regenbogenforellen (Hansen, Kaattari 1995) untersucht. Dieses Kapitel soll einen Überblick über Rag defiziente Maus- und Rattenstämme verschaffen.
2.3.1 Rag1 und Rag2 defiziente Mäuse
Ein wichtiges Rag1 defizientes Mausmodell wurde 1992 von Mombaerts et al. generiert und analysiert. Die Rag1 Genmutation fand hierbei in pluripotenten, embryonalen Mäusestammzellen statt. Durch homologe Integration des zielgerichteten Vektors erfolgte eine 1356 bp lange Deletion der Coding Sequenz des 5‘ Endes im Rag1. Da die Deletion in etwa die halbe Coding Sequenz des Gens umfasst (incl. wichtiger Strukturen), handelt es sich, bei der daraus resultierenden Mutation, um eine Null-Mutation. Die mittels dieser Technik generierten Mäuse (129/Sv x CD1) weisen sehr kleine, zellarme lymphatische Organe auf, welche keine reifen B- und T-Lymphozyten (CD3+ oder TCRαβ+) beinhalten. In der Milz und im Knochenmark wiesen die Forscher einen geringen Anteil Prä-B-Zellen nach (Mombaerts et al. 1992b, Mombaerts et al. 1992a).
Den gleichen Immunophänotyp beschrieben Shinkai et al. (1992) bei einer von ihnen generierten Rag2 defizienten Maus. Diese weist eine 286 Aminosäuren lange Deletion des Rag2 auf, was zu einem vollständigen Fehlen reifer B- und T-Lymphozyten in diesen Tieren führt.
Die von Mombaerts et al. (1992) generierten Mäuse sind vital und fertil und lassen sich adspektorisch bis zur 21. Lebenswoche nicht vom Wildtyp unterscheiden. Der Nachweis des Fehlens von Serum IgM bis zur 16. Lebenswoche dient als Beweis eines „non-leaky“
Phänotyps bis zu diesem Zeitpunkt.
Während bei den genannten Mausmodellen eine spezifische Omenn-Symptomatik fehlt, wurden in der Vergangenheit auch einzelne Mausmodelle, die im Phänotyp dem OS ähneln, entdeckt. Dazu zählt zum einen die 2007 von Khiong et al. beschriebene spontane Rag1 Mutante (memory mutant; MM) einer C57BL/10 Maus mit partieller Rag1 Aktivität. Die beschriebenen Tiere zeigen, zusätzlich zu einer geröteten Haut, sowohl eine Hepatosplenomegalie und Eosinophilie als auch erhöhte IgE Serumlevel, oligoklonal expandierte CD4+ T-Zellen und unnatürlich hohe Anzahlen an „memory-phenotype“ T- Zellen. Durch ein Beseitigen der IL-4 und IL-6 produzierenden CD4+ T-Zellen konnten die Autoren den Anstieg des IgE’s im Serum verhindern. Diese Tatsache weist auf eine Dysfunktion dieser Zellpopulation als Ursache für die OS-artigen Symptome dieses Mausstammes hin (Khiong et al. 2007).
Zum anderen wurde von Marella et al. ein Rag2 mutierter Mausstamm generiert (R229Q), welchem es an AIRE Expression im Thymus fehlt und welcher zusätzlich eine starke Reduktion der Forkhead box P3+ Treg Zellen und der NKT-Zellen aufweist. Zusätzlich zeigen diese Tiere ein oligoklonales T-Zellrepertoire, periphere Eosinophilie und ein völliges Fehlen zirkulierender B-Zellen. Darm und Haut sind mit aktivierten T-Zellen infiltriert, was zu Durchfall, Alopezie und, in manchen Fällen, zu schwerer Erythrodermie führt (Marrella et al.
2007, Marrella et al. 2008). Diese Modelle unterstützen die Hypothese, dass sowohl eine verminderte zentrale Toleranz und eine gestörte Entwicklung der regulatorischen T-Zellen als auch eine homöostatische T-Lymphozytenproliferation in die Pathogenese des OS involviert sein könnten (Villa et al. 2008).
2.3.2 Rag1 defiziente Ratten
„Die Ratte ist eine physiologisch und experimentell wichtige Spezies. Jedoch gibt es für sie erst wenige genetische Modifizierungsmöglichkeiten, was sie gegenüber Mäusen nicht nur für genetische Studien ins Hintertreffen geraten lässt, sondern auch bei der Generierung anderer nützlicher Forschungsmodelle“ (Aitman et al. 2008).
Diese Arbeit basiert auf dem 2012 am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover generierten Rattenstamm LEW/Ztm-Rag1em1Ztm. Dieser ist auf dem Hintergrund des Inzuchtstammes LEW/Ztm entstanden. Das Ziel war es, mittels Zink-finger Nukleasen (ZFN) einen Rag1 knockout (KO) zu kreieren (Zschemisch et al. 2012).
ZFN bilden eine sehr effiziente Möglichkeit, spezifische Genmodifikationen herbei zu führen.
Es handelt sich dabei um Hybridproteine, die aus polymeren Zink-finger Proteinen zusammengesetzt und an die Endonuklease Domäne des Restriktionsenzyms FokI gebunden sind. Ein ZFN Paar bindet an zwei angrenzende Target Sequenzen jedes DNA Stranges im Abstand von 6 bp und spaltet sie. Eine anschließende Dimerisierung der FokI Domäne verursacht den Doppelstrangbruch (DSB) und initiiert den endogenen Reparaturprozess.
Erfolgt letzterer fehlerhaft, kann es zu Deletionen und Insertionen kommen und darüber hinaus zur Generierung eines inaktiven Proteins (Aitman et al. 2008, De, Rodgers 2004).
Um den spezifischen Genknockout herbeizuführen, wurde Rag1 spezifische ZFN mRNA in Zygoten ingezüchteter LEW/Ztm Ratten mikroinjiziert. Von 59 geborenen Nachkommen trug ein Weibchen („founder 58“) auf einem Allel eine Mutation im Rag1. Verschiedene Untersuchungen der Arbeitsgruppe wiesen nach, dass es sich dabei um eine 4 bp Deletion handelte, welche in einem verfrühten Stopcodon resultierte und dadurch zu einer verkürzten Version des RAG1 Proteins führte.
Die Homozygoten Nachkommen des Foundertieres 58 zeigten einen deutlich veränderten Phänotyp zu den Wildtypen (WT). Es konnte ein komplettes Fehlen von B-Lymphozyten im peripheren Blut nachgewiesen werden, zudem einige wenige reife T-Zellen (4,6 %) und eine deutlich vergrößerte NK-Zellpopulation. Des Weiteren wiesen die untersuchten Milzen der Nachkommen einen reduzierten Anteil weißer Pulpa auf, sowie fehlende PALS. Die Thymi der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm waren hypoplastisch, ohne follikuläre Strukturen und beinhalteten
kaum RAG1 Protein. Die Lymphknoten zeigten ein lymphozytenarmes Bild. An weiteren Organen außerhalb des Lymphatischen Systems wurden sowohl makroskopisch als auch histologisch keine Veränderungen nachgewiesen (Zschemisch et al. 2012).
Außer dem in dieser Arbeit verwendeten Rattenmodell, sind in der Literatur noch wenige andere Rag1 defiziente Rattenstämme beschrieben. Einen davon bildet die SD-Rag1tm1sage. Dieses Rattenmodell entstand aus dem Auszuchtstamm Sprague-Dawley (SD) und wurde mit derselben ZFN Technik wie oben beschrieben erstellt. Sie weist eine 29 bp Deletion im Exon 2 auf Chromosom 3 auf. Bei homozygoten Knockoutträgern kann kein RAG1 Protein per Western Blot im Milzgewebe nachgewiesen werden und durchflusszytometrische Analysen zeigen einen nahezu kompletten B-Zellverlust. Einige wenige reife T-Zellen lassen sich auch bei diesem Rattenstamm noch nachweisen. Diese Ratte ist kommerziell erhältlich und wird von der Firma SAGE Labs als Tiermodell für Xenotransplantationen und immunologische Studien angepriesen. Allerdings ist sie bisher kaum phänotypisch charakterisiert (SAGE Labs 2015).
Des Weiteren haben Ménoret et al. (2013) eine immundefiziente Rag1-KO Ratte mittels
„engineered meganucleases“ erschaffen. In ihrer Studie wenden sie als erste Gruppe Meganukleasen an, um das Genom in Säugetierzygoten zu modifizieren. Zudem bezeichnen sie sich als die erste Forschungsgruppe, die einen immundefizienten Rag1-KO Rattenstamm generiert und diesen vollständig phänotypisch charakterisiert hat. Nach erfolgreicher Genmodifikation wies ein Tier (4 %) eine 5 bp Deletion im Rag1 auf (Ménoret et al. 2013).
Meganukleasen werden ähnlich den ZFN angewendet und produzieren auch DSB der DNA.
Sie verhalten sich jedoch spezifischer, wodurch unerwünschte Effekte weniger häufig auftreten. Humanes RAG1 wurde damit schon früher detektiert (Grizot et al. 2009, Redondo et al. 2008).
Für ihre Untersuchungen haben Ménoret et al. Ratten der Linie Sprague-Dawley verwendet.
Alle Untersuchungen zur Immunophänotypisierung fanden an 8 Wochen alten Tieren statt.
Die KO-Tiere wiesen verkleinerte lymphatische Organe (Milz, Thymus, Lymphknoten) auf, deren totale Zellzahlen signifikant vermindert waren. Zudem zeigten sich im Vergleich zum WT deutliche Abweichungen in den Lymphozytenpopulationen. Die Forscher detektierten
kleinere und in ihrer Anzahl verminderte, unreife und reife B- und T-Lymphozyten im peripheren Blut, Thymus, Milz und Lymphknoten. Das Knochenmark zeigte einen deutlichen Verlust an Prä-B-Zellen und reifen B-Zellen. Die Makrophagen- und NK-Zellpopulation stellte sich normal dar. Des Weiteren konnte kein RAG1 Protein im Thymus der KO-Tiere nachgewiesen werden und die IgG, IgA und IgE Immunglobulinlevel im Serum waren vermindert. Letztendlich wurde die Immunantwort der KO-Ratten in vivo bestimmt. Dazu erfolgte die Transplantation von MHCI/II inkompatiblen Spenderherzen (LEW.1A), woraufhin die Abstoßung durch die immundefizienten Tiere deutlich verzögert verlief.
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Rattenstämme, deren verwendete Abkürzungen und die Hygieneeinheiten, in denen sie gezüchtet und gehalten werden, aufgelistet. KF steht hier für eine keimfreie Haltung, SPF3/4 beschreibt zwei voneinander unabhängige spezifisch pathogenfreie Haltungseinheiten mit unterschiedlichen Keimstatus.
Diese werden in Kapitel 3.1.2 näher beschrieben.
Tabelle 3: Verwendete Tierstämme
Stamm Abkürzung Hygieneeinheit
LEW/Ztm LEW Konventionell2, SPF31
LEW/Ztm-Rag1em1Ztm LEW-Rag1 KF1, SPF31, SPF41
LEW.1F/TCRA (black hooded) LEW.1F Konventionell2
LEW.1W/7B LEW.1U Konventionell1
1 Zentrales Tierlaboratorium, MHH
2 Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie, MHH
In der gesamten Arbeit wurden ausnahmslos LEW/Ztm Ratten als Kontrolltiere zu den LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratten verwendet. Einige wenige Daten wurden auch an heterozygoten Trägern des Rag1 Gendefektes erhoben (Kap. 4.2.8 und 4.5.2). Diese werden vereinfacht als LEW-Rag1+/- benannt. Als LEW-Rag1 Ratten werden ausschließlich die homozygoten Träger dieses Gendefektes bezeichnet.
Die gesamte Studie wurde entsprechend den Bestimmungen des Deutschen Tierschutzgesetzes und der Richtlinien 86/609/EEC und 2010/63/EU der Europäischen Gemeinschaft zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt. Die Zucht der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit gemäß § 8 Abs. 1 des Tierschutzgesetzes genehmigt (33.14-42502-04-14/1492).
Um die Vergleichbarkeit der erhobenen Daten zu gewährleisten, wurden in allen folgenden Untersuchungen vergleichbare Probenanzahlen junger (<60 Tage alt), mittelalter (60-120 Tage alt) und alter (>120 Tage alt) Ratten analysiert.
3.1.1 Haltung
Die Tiere der Stämme LEW, LEW-Rag1 und LEW.1U wurden im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der MHH gehalten. Der Stamm LEW.1F und die LEW Kontrolltiere für die in vitro Proliferationstests wurden im Tierhaltungsraum an der Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie der MHH gehalten. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2°C, die Luftfeuchtigkeit lag bei 55 ± 5% und die Beleuchtung der Räume mit Kunstlicht erfolgte täglich über 14 Stunden, gefolgt von einer 10 stündigen Dunkelphase. Die Ratten wurden in Typ IVs Makrolon®-Käfigen [Bayer MaterialScience AG, Leverkusen, Deutschland] in unterschiedlichen Hygienebereichen gehalten und die Einstreu aus Weichholzgranulat wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Wasser und pelletiertes Alleinfutter (ssniff®, M-Z), mit 22 % Protein, 4,5 % Fett und 3,9 % Rohfaser, standen den Tieren ad libitum zur Verfügung.
Die Keimfreien Ratten wurden in Überdruck-Plastikfilm-Isolatoren [Metall + Plastik GmbH, Radolfzell-Stahringen, Deutschland] gehalten. Wasser und Einstreu wurden autoklaviert (134°C, 60 min), das Futter wurde mit 50 kGy bestrahlt. In den spezifisch pathogenfreien Haltungen wurde die Einstreu zuvor autoklaviert (134°C, 10 min), das Wasser steril filtriert und autoklaviert (134°C, 10 min) und das Futter bestrahlt (SPF4; 50 kGy) oder autoklaviert (SPF3; 134°C, 10 min).
Zu den unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen geführten Tierräumen hatte nur eine begrenzte Anzahl von Personen Zutritt. Das strikte Hygienemanagement umfasste eine Dusche mit anschließendem Kleidungswechsel (Nassbarriere). Auch die konventionellen Tierräume durften nur mit Schutzkleidung und nach entsprechenden Desinfektionsmaßnahmen betreten werden.
3.1.2 Gesundheitsüberwachung
Die Gesundheitsüberwachung der Tiere wurde im Rahmen vierteljährlicher Routineuntersuchungen gemäß den FELASA-Empfehlungen (Mähler et al. 2014, Nicklas et
al. 2002) am ZTL durchgeführt. Hierbei wurden bei den LEW-Rag1 Ratten der SPF3 Staphylococcus aureus und Klebsiella oxytoca als fakultativ pathogene Erreger nachgewiesen.
Ergänzt wurde die Überwachung durch PCR basierte Tests auf Kilham rat virus, Toolhan’s H- 1 virus, Pneumocystis spp., Mycoplasma pulmonis, Chlostridium piliforme, Helicobacter spp.
und Streptobacillus moniliformis an auffälligen LEW-Rag1 Tieren aller Hygienestatus, die sich jedoch auch als negativ erwiesen.
Bei der in Kapitel 3.1 als „Konventionell“ bezeichneten Haltungseinheit handelt es sich um einen experimentellen Haltungsbereich, dessen Hygienestatus regelmäßig überwacht wird.
3.2 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien
Eine vollständige Liste aller verwendeten Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien, Reagenzien, Kits und Computerprogramme befindet sich im Anhang.
3.3 Anfertigung histologischer Präparate
Die Tiere wurden mittels CO2-Inhalation betäubt. Die nachfolgende Tötung erfolgte durch Blutentzug mittels Herzpunktion. Danach wurde auf einer Waage ihr Körpergewicht bestimmt, um später ihre Körpergewichte und Organgewichte in Relation zum Gesamtgewicht zu vergleichen. Alle Organe wurden auf ihre Lage, Form, Farbe und Konsistenz hin untersucht und der Sektionsgang verlief bei allen untersuchten Tieren nach demselben Schema. Alle präparierten Organe wurden umgehend nach ihrer Entnahme in ein formaldehydhaltiges Fixans (4 %iges Formalin) überführt und darin 3 Tage zur Fixierung belassen.
Der Zuschnitt erfolgte nach der Registry of Industrial Toxicology Animal-data (RITA). Die zugeschnittenen Organteile wurden danach in Standardeinbettkassetten verbracht und über Nacht entwässert (Tab. 13). Anschließend erfolgte das Einbetten in Paraffin, danach wurden mit dem Mikrotom 2-3 µm dicke Organschnitte angefertigt. Nach dem Aufziehen auf Glasobjektträger wurden die Schnitte im Färbeautomaten mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) nach
dem in Tabelle 14 im Anhang dargestellten Protokoll gefärbt und danach luftdicht eingedeckt.
Das Farbergebnis ist folgendes: Zellkerne – blau; Zytoplasma – rot; Knorpel – blau-violett;
Erythrozyten – rot; Muskulatur – rot.
3.3.1 Histologische Auswertung
Alle für die Charakterisierung dieses Tiermodells notwendigen Organe wurden histologisch ausgewertet. Das Vorgehen richtete sich dabei nach der Stärke und Komplexität der Veränderungen. Im Folgenden werden die Bewertungsmaßstäbe und Scores der einzelnen Organe detailliert beschrieben. Zur Vereinfachung der Auswertung steht die Zahl 0 für ein nicht vorhandenes Merkmal, bzw. für ein Merkmal, welches auch bei den Kontrolltieren zu finden ist. Eine Einteilung in 0 und 1 bedeutet lediglich, dass das Kriterium vorhanden ist oder nicht. Weiterführend kommen die Einteilungen 0-2, 0-3 und 0-5 vor. Je höher die zugeordnete Zahl ist, desto stärker ist das zu bewertende Merkmal ausgeprägt. Bei allen bewerteten Zellinfiltrationen fand auch immer eine Bestimmung des Zelltyps statt.
3.3.1.1 Immunsystem
Die Infiltration mit Entzündungszellen wurde in der Milz mithilfe einer Skala von 0-3 bewertet.
An den Mesenteriallymphknoten wurden folgende Befunde bewertet: Größe (klein/groß bzw.
0/1), Mastozytose (0/1), Nekrose (0/1), Hämosiderinspeicherung (0/1) und Entzündungszellinfiltration (0-3). Anschließend wurden die Zahlen addiert. Eine gesonderte Beurteilung der Unterkieferlymphknoten fand gepaart mit der Bewertung der Speicheldrüsen statt.
Da sich die Veränderungen an den Thymi der Rag1-Ratten im Vergleich zu den LEW Ratten glichen, erfolgte hier nur eine Beschreibung des Befundes. Eine Einteilung in verschiedene Ausprägungsgrade war nicht möglich.
3.3.1.2 Gastrointestinaltrakt
Die Scores für die verschiedenen Anteile des Verdauungstraktes gleichen sich im Wesentlichen. Leichte Unterschiede in der Schichtverteilung der Entzündungszellen ergaben sich nach den Vergleichen mit den Kontrollorganen. Alle zugehörigen Organe wurden zum
