Untersuchungen zur genetischen Disposition für die Peptidoglykan-Polysaccharid-induzierte chronische
Enterokolitis und Arthritis bei der Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Sonja Hopf geb. Hahn aus Hannover
Hannover 2003
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl
Tag der mündlichen Prüfung: 03.06.2003
Die vorliegende Arbeit wurde durch die Crohn´s and Colitis Foundation of America gefördert.
2 Literaturübersicht 11 2.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen 11
2.2 Genetik der CED beim Menschen 13
2.3 Extraintestinale Manifestationen bei den CED des Menschen 16 2.4 Einfluß der physiologischen Darmflora auf die Entstehung der CED 19
2.4.1 Einfluß von Antibiotika auf die CED 21
2.5 Tiermodelle für CED 23
2.6 Die Peptidoglykan-Polysaccharid-induzierte Enterokolitis 27
3 Material und Methoden 29
3.1 Versuchstiere 29
3.2 Induktion der Enterokolitis und systemischen Entzündung 30
3.3 Phänotypisierung 30
3.4 Nachweis von genetischen Markern 32
3.4.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) 32
3.4.2 Einstellen der DNA-Konzentration 33
3.4.3 Markerauswahl 33
3.4.4 Testen der Marker auf Polymorphismen 34
3.4.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 34
3.4.4.2 Agarosegel-Elektrophorese 36
3.5 Genotypisierung 37
3.6 Statistische Auswertung 38
4 Ergebnisse 41 4.1 Häufigkeitsverteilungen der Krankheitsmerkmale 41
4.2 Genetische Marker 48
4.3 Korrelationsanalyse 52
4.4.2 Intervallkartierung und Kruskal-Wallis-Test 60
5 Diskussion 83
5.1 Auswahl des Tiermodells 83
5.2 Auswahl der Versuchstiere 84
5.3 Phänotypisierung 84
5.4 Genotypisierung 86
5.5 Kopplungsanalyse 87
5.5.1 χ2-Test 87
5.5.2 Intervallkartierung 90
5.5.3 Kruskal-Wallis-Test 91
5.5.4 Zusammenfassende Betrachtung und Kandidatengene 92
5.6 Genetische Homologien zwischen Ratte und Mensch 93
5.7 Genetische Nähe zu Loci anderer Autoimmunerkrankungen der Ratte 96
5.8 Ausblick 98
6 Zusammenfassung 100
7 Summary 103
8 Literaturverzeichnis 105
9 Anhangstabellen 139
ACTH Adrenokortikotropes Hormon
Aqua dest. aqua destillata
BUF Buffalo (Rattenstamm)
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CED chronisch entzündliche Darmerkrankungen
CIA collagen-induced arthritis
cM centi-Morgan
d. h. das heißt
DNA deoxyribonucleic acid
dNTP 2`-Deoxynukleosidtriphosphat
DSS dextran sulfate sodium
EAE experimentelle Autoimmunencephalomyelitis
EAN experimentelle Autoimmunneuritis
EAU experimentelle Autoimmunuveoretinitis
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
engl. englisch
et al. et alii (und andere)
F344 Fischer 344 (Rattenstamm)
g Gramm
gp39 glycoprotein 39
HLA human leucocyte antigen
HSA Bezeichnung für Chromosomen von Homo sapiens
IBD inflammatory bowel disease
ICAM-1 intercellular adhesion molecule-1 IDDM insulin-dependent diabetes mellitus
IGF insulin-like growth factor
IL Interleukin
LEW Lewis (Rattenstamm)
Lod logarithm of the odds
mA Milliampere
Mdr multiple drug resistance
mg Milligramm
MHC major histocompatibility complex
MHH Medizinische Hochschule Hannover
ml Milliliter
µl Mikroliter
MLH1 mutL homolog 1
mm Millimeter
mM millimolar
µM mikromolar
NCAD N-Cadherin
NF-κB nuclear factor-κB
ng Nanogramm
NOD nucleotide-binding oligomerization domain
OIA adjuvant-oil-induced arthritis
PCR polymerase chain reaction
PG-PS Peptidoglykan-Polysaccharid
Prkdc protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide
PSC primäre sklerosierende Cholangitis
QTL quantitative trait locus
RNO Bezeichnung für Chromosomen von Rattus
norvegicus
rs Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman
SAM senescence accelerated mouse
scid severe combined immunodeficient
SPRD Sprague-Dawley (Rattenstamm)
Stat signal transducers and activators of transcription
TGF transforming growth factor
Th-1 T-Helfer-Zellen vom Typ 1
Th-2 T-Helfer-Zellen vom Typ 2
TNBS Trinitrobenzolsulfonsäure
TNF Tumornekrosefaktor
U unit (internationale Einheit)
UV ultraviolett
vs. versus
WASP Wiskott-Aldrich syndrome protein
z. B. zum Beispiel
Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind chronisch entzündliche, rezidivierende Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes mit weitgehend unbekannter Genese, die unter dem Oberbegriff „chronisch entzündliche Darmerkrankungen“ (CED) zusammengefaßt werden (PODOLSKY 1991; FIOCCHI 1998). Bei diesem Krankheitsbild sind sowohl intestinale als auch extraintestinale Manifestationen zu beobachten, welche in Form von Arthritiden, Hauterkrankungen, Leberveränderungen und Augenerkrankungen auftreten. Die beiden Formen der CED sind weltweit verbreitet und liegen mit einer Prävalenz von 100-200 Fällen pro 100.000 Einwohnern in Westeuropa und den USA vor (CALKINS und MENDELHOFF 1995). Lebensqualität und Leistungsfähigkeit des Erkrankten werden durch den chronischen, in Schüben auftretenden Krankheitsverlauf, der häufig in der Ausbildung eines kolorektalen Adenokarzinoms mündet, stark beeinträchtigt.
Die Ursachen der CED sind weitgehend unklar; es existieren jedoch deutliche Hinweise darauf, daß ein Zusammenspiel von Suszeptibilitätsgenen und Umwelteinflüssen eine wichtige Rolle in ihrer Pathogenese spielt (FIOCCHI 1998).
Eine genetische Komponente ist aus einer erhöhten Prävalenz in bestimmten ethnischen Bevölkerungsgruppen und aus Familien- und Zwillingsstudien abzuleiten (DUERR 1996). Durch Kopplungsanalysen konnten bisher sieben Suszeptibilitätsloci für CED auf den Chromosomen 16 (HUGOT et al. 1996), 12 (SATSANGI et al. 1996), 6 (HAMPE et al. 1999b), 14 (DUERR et al. 2000), 5 (Rioux et al. 2000), 19 (Rioux et al. 2000) und 1 (CHO et al. 2000) beim Menschen identifiziert werden. Mit Ausnahme des Gens für den intrazellulären Lipopolysaccharid-Rezeptor NOD2 auf Chromosom 16 (HUGOT et al. 2001; OGURA et al. 2001) sind die beteiligten Gene jedoch bislang unbekannt.
In den letzten 15 Jahren sind zahlreiche Tiermodelle für CED beschrieben worden (ELSON et al. 1999). Für das Studium der genetischen Faktoren, die die Suszeptibilität für CED (einschließlich extraintestinaler Manifestationen) im Tiermodell regulieren, eignet sich besonders das Modell der Peptidoglykan- Polysaccharid (PG-PS)-induzierten Enterokolitis bei der Ratte. Verschiedene
Rattenstämme weisen ähnlich wie der Mensch genetisch determinierte Unterschiede in der Suszeptibilität für CED auf. So entwickeln LEW-Ratten nach intramuraler Injektion von PG-PS-Polymeren eine chronisch rezidivierende Enterokolitis, begleitet von verschiedenen extraintestinalen Symptomen, während Ratten vom Stamm F344 lediglich eine akute Entzündungsreaktion zeigen, die nach wenigen Tagen selbständig abheilt (McCALL et al. 1994; SARTOR et al. 1989; SARTOR et al.
1996a).
Die vorliegende Arbeit entstand in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof.
Dr. Sartor (University of North Carolina, USA) und wurde von der Crohn´s and Colitis Foundation of America gefördert. Ziel dieser Arbeit war die Ermittlung der chromosomalen Lokalisationen von Suszeptibilitätsloci, welche für die deutlich schwerwiegendere Erkrankung von Ratten des Stammes LEW im Vergleich zu Ratten des Stammes F344 verantwortlich sind. Um dies zu ermöglichen, wurde an der University of North Carolina bei der zweiten Filialgeneration aus einer Kreuzung der beiden Rattenstämme die Erkrankung induziert und mit Hilfe pathologischer Parameter charakterisiert. Am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover folgte die Ermittlung der suszeptibilitätsvermittelnden chromosomalen Regionen durch eine genomweite Kopplungsanalyse.
Die humanen Homologe der Gene, die bei der Ratte den Phänotyp der PG-PS- induzierten Enterokolitis regulieren, sind möglicherweise auch bei den CED des Menschen von Bedeutung. Auf diesem Wege können die Ätiopathogenese der CED weiter erforscht und neue Möglichkeiten für Therapie und Prophylaxe eröffnet werden.
2.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind ein allgemeiner Begriff für eine Gruppe chronisch entzündlicher rezidivierender Störungen des Gastrointestinaltraktes mit unbekannter Ursache. Sie werden in die Hauptgruppen Colitis ulcerosa und Morbus Crohn eingeteilt (PODOLSKY 1991). Laut CALKINS und MENDELHOFF (1995) sind in Westeuropa und in den USA 0,1 bis 0,2% der Bevölkerung von diesem Krankheitsbild betroffen. Dabei liegt die Prävalenz bei schwarzen und asiatischen Bevölkerungsgruppen niedriger als bei weißen Bevölkerungsgruppen, innerhalb derer Juden (besonders Aschkenasim-Juden) 3 bis 6mal häufiger betroffen sind als Nichtjuden (DUERR 1996; KARLINGER et al. 2000).
Der Altersgipfel der Krankheitsmanifestation liegt im 2. bis 3. Lebensjahrzehnt, wobei beide Geschlechter gleichermaßen betroffen sind. Ferner ist eine familiäre Häufung zu beobachten. Bei schätzungsweise 2 bis 5% der an CED Erkrankten lassen sich in der Verwandtschaft weitere Personen mit gleichem Krankheitsbild finden (DUERR 1996). Derartige epidemiologische Häufungen sprechen ursächlich für genetische und/oder für umweltbedingte Faktoren (FIOCCHI 1998).
Obwohl es Hinweise auf eine Beteiligung umweltbedingter, immunologischer und genetischer Faktoren am Krankheitsgeschehen gibt, sind Ätiologie und Pathogenese der CED bisher weitgehend unklar. Als Umweltfaktoren sind u. a. Nikotinmißbrauch, Ernährung, Hygiene, Klima, Umweltverschmutzung und Streß zu nennen (FIOCCHI 1998). Auch eine infektiöse Ursache für CED kann nicht ausgeschlossen werden. Da zwischen Morbus Crohn und Tuberkulose histologische Ähnlichkeiten im Krankheitsbild bestehen, wird eine ursächliche Beteiligung von Mykobakterien, speziell Mycobacterium avium subspezies paratuberculosis, gegen das einige an Morbus Crohn erkrankte Patienten einen signifikant erhöhten Serumantikörpertiter aufweisen, diskutiert (CHIODINI et al. 1984; FIOCCHI 1998). Weiterhin zeigen elektronenmikroskopische Untersuchungen von intravaskulären Granulomen bei manchen Morbus Crohn-Patienten die Anwesenheit von Paramyxovirus-ähnlichen
Partikeln, die sich immunhistologisch als Masernviruspartikel erweisen, was für eine Beteiligung von Masernviren spricht (WAKEFIELD et al. 1991; FIOCCHI 1998).
Die Gewebeschädigung der Darmschleimhaut bei CED wird durch das Immunsystem des Darmes bewirkt (SHANAHAN und TARGAN 1987), wobei möglicherweise eine Autoimmunreaktion, verursacht durch eine Störung der immunologischen Toleranz, vorliegt. Eine weitere Erklärung liegt in einer defekten Regulation des intestinalen Immunsystems, das in einer überschießenden Reaktion auf exogene Antigene eine unspezifische Schädigung hervorruft. Die Hypothese der Autoimmunpathogenese wird dabei durch das vermehrte Auftreten von Autoantikörpern gegen Bestandteile von Granulozyten bei 62% der Patienten mit Colitis ulcerosa und 4% der Patienten mit Morbus Crohn unterstützt (SEIBOLD et al. 1996). Ferner weisen Patienten mit CED eine vermehrte Produktion von Prostaglandinen, Leukotrienen, Plättchen- aktivierendem Faktor und Zytokinen sowie weiteren durch Monozyten/Makrophagen oder Granulozyten synthetisierten Entzündungsmediatoren auf (MEENAN 1995), wobei Morbus Crohn-Patienten ein Th-1-typisches Zytokinmuster, geprägt durch vermehrte Produktion von Tumornekrosefaktor, Interleukin-2 und Interferon γ, aufweisen (FIOCCHI 1998). Colitis ulcerosa-Patienten dagegen zeigen mit vermehrter Produktion von Interleukin-4, Interleukin-5 und Interleukin-10 ein Th-2- typisches Zytokinmuster.
Die genetischen Faktoren werden ausführlich in Kapitel 2.2 beschrieben.
Als Leitsymptom der CED gilt die Diarrhoe, die sich bei Colitis ulcerosa blutig- schleimig zeigt, bei Morbus Crohn jedoch nur selten blutig verläuft. Fieber, Abdominalschmerz, allgemeine Ermüdbarkeit und Gewichtsverlust sind weitere Begleiterscheinungen (PODOLSKY 1991; FIOCCHI 1998).
Auch in Lokalisation und Ausweitung der Entzündung unterscheiden sich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. Bei der Colitis ulcerosa ist das Rektum stets befallen.
Hier sitzt auch meistens der Ursprungsort der Erkrankung, von dem aus die Ausbreitung kontinuierlich nach proximal zum Kolon stattfindet. Die Krankheit verläuft in zwei makroskopisch unterscheidbaren Stadien, die als frisches Stadium und als
Schleimhaut, bei der eine normale Gefäßzeichnung nicht mehr erkennbar ist, die jedoch keine Schleimhautulzerationen zeigt. Das chronisch-fortgeschrittene Stadium ist durch rezidivierende Ulzerationen gekennzeichnet, die zur Schleimhautzerstörung mit Verlust des normalen Faltenreliefs führen und restliche Schleimhautinseln als
„Pseudopolypen“ hervortreten lassen. Histologische Merkmale sind eine lymphozytäre und histiozytäre Infiltration der Schleimhaut sowie deren Atrophie, kleine Kryptabszesse, eine Zerstörung des häufig unregelmäßig ausgeprägten Kryptenepithels und submuköse Ödeme (PODOLSKY 1991).
Beim Morbus Crohn überwiegt zwar die Lokalisation der Entzündung im terminalen Ileum und Kolon, er kann aber an jeder Stelle des Gastrointestinaltraktes vom Mund bis zum Anus auftreten. Häufig präsentiert er sich diskontinuierlich, wobei stark befallene Darmsegmente durch Bereiche von scheinbar nicht betroffenem Darm unterbrochen werden. Die Entzündung findet unter Einbeziehung der gesamten Darmwand statt, betrifft aber vorwiegend deren tiefe Schichten. Besonders die Submukosa ist durch Ödeme und dichte lymphozytäre Infiltrationen verdickt, mit Lymphfollikeln durchsetzt und weist tuberkuloide Knötchen mit Epitheloid- und Riesenzellen auf. Das terminale Ileum erscheint makroskopisch hyperämisch und aufgelockert, die Mesenteriallymphknoten sind geschwollen und gerötet. Je weiter die Erkrankung fortschreitet, desto mehr präsentiert sich die Darmwand lederartig verdickt und läßt das Lumen verengt erscheinen. Der ganze Prozeß kann zu Fissuren, Ulzerationen und Fistelbildungen führen. Auch eine Stenose kann an jeder Stelle des Darmes auftreten und in unterschiedlichen Ausmaßen zu mechanischen Obstruktionen führen (PODOLSKY 1991).
2.2 Genetik der CED beim Menschen
Da sowohl bei engem verwandtschaftlichen Verhältnis zu CED-Patienten als auch in bestimmten ethnischen Bevölkerungsgruppen eine erhöhte Prävalenz für diese Erkrankungen besteht, liegt eine genetische Disposition für CED nahe (DUERR
1996). Liegt ein Fall von Morbus Crohn vor, so ist das Erkrankungsrisiko bei Verwandten ersten Grades 15 bis 35mal erhöht, im Falle von Colitis ulcerosa 7 bis 15mal (ORCHARD et al. 2000). Bei monozygoten Zwillingen liegt die Konkordanzrate für Morbus Crohn (44-58%), verglichen mit Colitis ulcerosa (6-18%), deutlich höher, was darauf hindeutet, daß der genetische Einfluß bei Morbus Crohn größer ist als bei der Colitis ulcerosa (TYSK et al. 1988; ORHOLM et al. 2000). Weiße Bevölkerungsgruppen sind häufiger betroffen als schwarze und asiatische, Juden (besonders Aschkenasim-Juden) häufiger als Nichtjuden (YANG und ROTTER 1994).
Bisher wurden mehrere möglicherweise an der Pathogenese der CED beteiligte Kandidatengene benannt. Zu ihnen gehören die Klasse I- und Klasse II-Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA), die Gene für das Peptidtransportermolekül ABCB3 (frühere Bezeichnung: TAP2), den T-Zell- Rezeptorkomplex, das Komplementprotein C3, den Interleukin-1- Rezeptorantagonisten, den Tumornekrosefaktor α und das Adhäsionsmolekül ICAM- 1 (DUERR 1996). Weiterhin bestehen Hinweise auf eine Beteiligung des Gens für das Membrantransportprotein SLC11A1 (engl.: solute carrier family 11, member 1;
frühere Bezeichnung: NRAMP) (HOFMEISTER et al. 1997), des DNA-Reparaturgens MLH1 (POKORNY et al. 1997), des Motilin-Gens (ANNESE et al. 1998), des Kinin B1-Rezeptorgens (BACHVAROV et al. 1998) sowie des Vitamin D-Rezeptorgens (SIMMONS et al. 2000). Auch MDR1, das Gen für die ATP Bindungskasette B1 (BRANT et al. 2000), das Guanylatzyklase-Aktivatorgen UCA1B (LAWRANCE et al.
2001) sowie das Transkriptionsfaktor STAT6-Gen und das Metalloproteinase MMP18-Gen (SATSANGI 2001) gelten als mögliche an der Entstehung der CED beteiligte Kandidatengene.
Durch genomweite Kopplungsanalysen konnten bisher sieben Suszeptibilitätsloci für CED (IBD 1-7, engl.: inflammatory bowel disease) beim Menschen identifiziert werden (Tabelle 1).
Locusbezeichnung Chromosom (HSA)
Assoziation
IBD1 16cen Morbus Crohn
IBD2 12q Morbus Crohn, Colitis ulcerosa IBD3 6p Morbus Crohn, Colitis ulcerosa
IBD4 14q Morbus Crohn
IBD5 5q Morbus Crohn
IBD6 19q Morbus Crohn, Colitis ulcerosa IBD7 1p Morbus Crohn, Colitis ulcerosa
HSA: Bezeichnung für die Chromosomen von Homo sapiens
Die Referenzen für die einzelnen Suszeptibilitätsloci lauten wie folgt: IBD1 (HUGOT et al. 1996; OHMEN et al. 1996; PARKES et al. 1996; BRANT et al. 1998;
CAVANAUGH et al. 1998; CHO et al. 1998; CURRAN et al. 1998; HAMPE et al.
1999a), IBD2 (SATSANGI et al. 1996; CURRAN et al. 1998; DUERR et al. 1998;
HAMPE et al. 1999a), IBD3 (HAMPE et al. 1999b; RIOUX et al. 2000), IBD4 (MA et al. 1999; DUERR et al. 2000), IBD5 (RIOUX et al. 2000; RIOUX et al. 2001), IBD6 (RIOUX et al. 2000), IBD7 (CHO et al. 2000).
Unabhängig voneinander haben zwei Arbeitsgruppen fünf Jahre nach der Erstbeschreibung von IBD1 ein an der Entstehung von Morbus Crohn beteiligtes Gen auf HSA 16 identifizieren können (HUGOT et al. 2001; OGURA et al. 2001). Es handelt sich um das Gen für den intrazellulären Lipopolysaccharid-Rezeptor NOD2 („nucleotide-binding oligomerization domain 2“). Dieser wird in Monozyten exprimiert und aktiviert nach Bindung bakterieller Lipopolysaccharide den Transkriptionsfaktor NF-κB, wodurch die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokine hochreguliert wird. Bei etwa 40% der Morbus Crohn-Patienten ist aufgrund einer Insertionsmutation mit Verschiebung des Leserasters im NOD2-Gen ein verkürztes
NOD2-Protein zu finden (OGURA et al. 2001). Allerdings ist bisher die Wirkungsweise dieses veränderten Proteins ungeklärt.
Die erhobenen Daten legen nahe, daß Morbus Crohn und Colitis ulcerosa zusammenhängende polygenetische Krankheiten sind, die manche, aber nicht alle Suszeptibilitätsgene teilen (SATSANGI et al. 1998). Wahrscheinlich besteht im Hinblick auf die Pathogenese eine große genetische Heterogenität zwischen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. Die Suche nach prädisponierenden Genen bei den CED des Menschen wird durch unvollständige Krankheitspenetranz, oligogenetische Kontrolle und genetische Heterogenität erschwert (DUERR 1996).
2.3 Extraintestinale Manifestationen bei den CED des Menschen
Etwa 25% aller an CED erkrankten Patienten zeigen extraintestinale Manifestationen und Komplikationen der Krankheit, meist in mehr als einer Ausprägungsform. Obwohl nahezu alle Organsysteme in Mitleidenschaft gezogen werden können, sind am häufigsten die Gelenke, die Gallengänge, die Haut und die Augen betroffen (GREENSTEIN et al. 1976; MONSEN et al. 1990).
Es treten drei verschiedene Ausprägungen der Arthritis auf. Am häufigsten ist der Kolitis-Typ zu beobachten. Dieser ist nicht deformierend und üblicherweise asymmetrisch. Bevorzugt betroffen sind die großen Gelenke der unteren Extremitäten (Hüft-, Knie- und Sprunggelenke). Während der aktiven Phasen der Darmentzündung kommt es zu einer Verschlechterung der Arthritis. An zweiter Stelle steht die Spondylitis ankylosans, welche dem Auftreten von Darmsymptomen vorausgehen kann und die nicht ausschließlich während der aktiven Phasen der Darmentzündung voranschreitet. Hier sind häufig die Wirbelsäule sowie die Gelenke der unteren Extremitäten betroffen. Auffallend ist der große Anteil an HLA-B27- positiven männlichen Patienten. Die dritte Form der CED-assoziierten Gelenkerkrankungen ist die isolierte Arthritis, von der Hüft-, Schulter- und Sakroiliakalgelenk betroffen sein können (SCOTT et al. 1990). Mit dieser Form der
1965).
Etwa 5 bis 15% aller Patienten mit CED leiden außerdem an hepatobiliären Erkrankungen (GREENSTEIN et al. 1976; WIESNER und LaRUSSO 1980). Die üblicherweise beschriebene Fettleber (DEW et al. 1979) ist unspezifisch, meist reversibel und vom makrovesikulären Typ der Fettablagerungen, bedingt durch Malabsorption, Proteinmangel und durch Medikamente verursachte Leberschäden.
Eine spezifische mit CED assoziierte Erkrankung des Leber-Gallengang-Systems ist die primäre sklerosierende Cholangitis (PSC), von der bis zu 10% aller Patienten betroffen sind. Dabei ist die Erkrankung in 70 bis 90% aller Fälle mit Colitis ulcerosa assoziiert (LINDOR et al. 1987; OLSSON et al. 1991). Eine Manifestation der PSC kann den ersten klinischen Symptomen der CED um Jahre vorausgehen (BROOME et al. 1995). Zwischen Beginn, Dauer und Schweregrad von PSC und CED besteht kein Zusammenhang. Es kann sogar mehrere Jahre nach einer Kolektomie zur Ausbildung dieser Lebererkrankung kommen (CANGEMI et al. 1989).
Etwa 9 bis 19% aller Patienten mit CED zeigen Manifestationen der Erkrankung an der Haut, mit steigender Inzidenz bei Ausweitung der CED auf den Dickdarm (GREENSTEIN et al. 1976; GREGORY und HO 1992). Spezifische Hauterkrankungen sind das Erythema nodosum und die Pyoderma gangraenosum.
Beide treten häufiger bei Colitis ulcerosa als bei Morbus Crohn auf. In der Mehrzahl der Fälle sind Frauen betroffen. Besonders während der aktiven Phase der CED kommt es bei etwa 20% der Patienten zur Ausprägung des Erythema nodosum, bei 5% zur Pyoderma gangraenosum. Dieses Krankheitsbild wird häufig von weiteren Manifestationen der CED an Gelenken und Augen begleitet. Zum Auftreten von Pyoderma vegetans und vesikulopustulären Eruptionen kommt es nur bei Colitis ulcerosa, wohingegen aphtöse Ulzerationen im Mundbereich, üblicherweise während der aktiven Phase der Entzündung, sowie nekrotisierende Vesikulitis vorwiegend bei Morbus Crohn auftreten. Weiterhin kommt es häufig zu Psoriasis, Vitiligo und dem darmassoziierten Dermatose-Arthritis-Syndrom (BIANCHI 1984). Durch Unterversorgung mit notwendigen Nahrungsinhaltsstoffen können weitere Erkrankungen der Haut auftreten.
Komplikationen im Bereich der Augen sind meistens mit Erkrankungen der Gelenke vergesellschaftet (SALMON et al. 1991). Am häufigsten treten Uveitis, Iritis und Episkleritis auf, üblicherweise während der aktiven Phase der Darmerkrankung.
Obwohl der Zusammenhang zwischen CED und den extraintestinalen Manifestationen schon vor über 50 Jahren erkannt wurde, sind die pathophysiologischen Vorgänge weiterhin großenteils unbekannt. Bei einem großen Anteil dieser Erkrankungen handelt es sich wahrscheinlich um Autoimmunprozesse (BROBERGER und PERLMANN 1959; PADOLSKY 1991). Die Beteiligung zirkulierender Autoantikörper (CHAPMAN et al. 1986; NAPARSTEK und PLOTZ 1993) sowie autoreaktiver T-Zellen (MURPHY et al. 1990) wird diskutiert. Zytokine, die eine wichtige Rolle in der Pathogenese der CED spielen (SARTOR 1994), sind wahrscheinlich auch an der Ausbildung der extraintestinalen Manifestationen beteiligt. Mehrere Studien deuten auf eine Beteiligung der Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA) am Krankheitsgeschehen hin (FUJITA et al. 1984; TOYODA et al. 1993). Dabei prädisponieren bestimmte HLA-DR- Haplotypen, die im Zusammenhang mit CED auftreten, zur Entwicklung bestimmter extraintestinaler Manifestationen. Beispielsweise kommt es bei an Colitis ulcerosa erkrankten Patienten mit einem HLA-B8, DR3-Haplotyp in gehäuftem Maße zur Ausbildung einer PSC (CHAPMAN et al. 1983), während der HLA DRB1*0103- Haplotyp mit Erkrankungen an Augen und Gelenken assoziiert ist (ROUSSOMOUSTAKAKI et al. 1997). Hinweise auf die Beteiligung genetischer Faktoren sind das gehäufte familiäre Auftreten von extraintestinalen Manifestationen und die unterschiedliche Empfänglichkeit von Ratteninzuchtstämmen für mit CED vergesellschaftete extraintestinale Manifestationen im Modell der Peptidoglykan- Polysaccharid-induzierten Enterokolitis (SARTOR et al. 1985). Untersuchungen bei der HLA-B27/β2m-transgenen Ratte weisen auf eine Beteiligung der Darmflora hin, da diese Tiere unter keimfreien Bedingungen weder eine Kolitis noch eine Arthritis oder psoriasisartige Veränderungen der Haut entwickeln (TAUROG et al. 1994).
Weiterhin wird die mögliche Beteiligung einer Reovirusinfektion (BANGARU et al.
1980; MINUK et al. 1987) diskutiert.
CED
Zu den an der Pathogenese der CED beteiligten Umweltfaktoren gehören Mikroorganismen und deren Produkte. Dabei scheint die tragende Rolle nicht bei einem einzelnen bakteriellen Pathogen zu liegen, sondern bei der Zusammensetzung und Konzentration der physiologischen Darmflora (SARTOR et al. 1996b; SARTOR 1999). Diese umfaßt mehr als 400 Bakterienspezies (BERG 1996) und ist zum Großteil im distalen Ileum und Kolon lokalisiert, wo es auch am häufigsten zur Manifestation der CED kommt. Dabei liegt die Konzentration der anaeroben Bakterien um das 1000-fache über der Aerobierkonzentration. Aerobe und anaerobe Bakterien stellen als Antigene eine ständige Herausforderung an die in der Mukosa ansässigen Immunzellen dar (PRANTERA et al. 1994; TURUNEN 1994;
GREENBLOOM et al. 1998; ARNOLD et al. 1999; COLOMBEL et al. 1999; SARTOR 1999). Beim Menschen gibt es zunehmend Hinweise auf die bedeutende Rolle von darmresidenten Bakterien und bakteriellen Produkten in der Pathogenese der CED (SARTOR 1999; SARTOR 2000). So konnte in mehreren Studien gezeigt werden, daß der Einsatz von Antibiotika sowohl bei der Therapie des Morbus Crohn einen positiven Effekt hat als auch bei Behandlung der Colitis ulcerosa unterstützend wirkt (SUTHERLAND et al. 1991; PRANTERA et al. 1994; RUTGEERTS et al. 1995;
ARNOLD et al. 1999; COLOMBEL et al. 1999; GIONCHETTI et al. 1999). Ein weiterer Hinweis ist die erhöhte Konzentration von Antikörpern gegen luminale Bakterien in Serum und Darminhalt von Morbus Crohn-Patienten (HELPHINGSTINE et al. 1979; GUMP et al. 1981; TURUNEN 1994; GREENBLOOM et al. 1998;
SARTOR 1999).
Desweiteren ist die Tatsache, daß es in einigen Tiermodellen nicht zur Manifestation der Erkrankung kommt, wenn die Tiere unter keimfreien Bedingungen gehalten werden (ELSON et al. 1995), ein Hinweis auf die tragende Rolle der physiologischen Darmflora im Krankheitsgeschehen. Zu diesen Tiermodellen zählen die IL-2- defiziente Maus (SADLACK et al. 1993; CONTRACTOR et al. 1998), die IL-10- defiziente Maus (SELLON et al. 1998), die T-Zell-Rezeptor α-Kette-defiziente Maus
(DIANDA et al. 1997), die SAMP1/Yit Maus (MATSUMOTO et al.1998) und die HLA- B27/β2m-transgene Ratte (TAUROG et al. 1994; RATH et al. 1996). Weitere Hinweise auf eine Beteiligung der Darmflora liefern die Modelle der Indometacin- (YAMADA et al. 1993) und der Dextran-Natriumsulfat (DSS; engl.: dextran sulfate sodium)-induzierten Kolitis (OKAYASU et al. 1990) sowie die Kolitis bei der CD45RBhigh T-Zell-rekonstituierten Prkdcscid Maus (ARANDA et al. 1997) und bei der C3H/HeJBir Maus (BRANDWEIN et al. 1997; CONG et al. 1998).
Im Verlauf der chronischen Darmentzündung fallen den verschiedenen Bakterien unterschiedliche Funktionen zu (RATH et al. 1996). So spielen bei der Entstehung einer Kolitis sowohl aerobe als auch anaerobe Bakterien eine Rolle, die größere Bedeutung fällt aber den obligat anaeroben Darmbakterien zu (RATH et al. 2001).
HLA-B27/β2m-transgene Ratten, welche ausschließlich mit fakultativ anaeroben Bakterien besiedelt sind, entwickeln eine deutlich geringere Kolitis und Gastritis als solche, die sowohl mit fakultativ anaeroben als auch mit obligat anaeroben Bakterien assoziiert sind (RATH et al. 1996; RATH et al. 2001). Werden keimfreie HLA- B27/β2m-transgenen Ratten mit spezifiziert pathogenfreien Darmbakterien kolonisiert, so ist nach ca. 4 Wochen die Kolitis histologisch und laborchemisch voll entwickelt (RATH et al. 1996). Der Schweregrad der Kolitis und Gastritis korreliert direkt mit der Dauer der bakteriellen Darmbesiedlung.
Auch unter den anaerob wachsenden Darmbakterien gibt es Unterschiede in der Bedeutung für die chronischen intestinalen Entzündungen. Werden keimfreie HLA- B27/β2m-transgene Ratten mit einem aus sechs obligat und fakultativ anaerob wachsenden Bakterienspezies bestehenden Cocktail assoziiert, so bilden sie eine Kolitis aus (RATH et al. 1996). Der Schweregrad der Kolitis ist erhöht, wenn dieser Cocktail Bacteroides vulgatus, ein strikt anaerob wachsendes Gram-negatives Stäbchen, enthält. In der zäkalen Mikroflora von erkrankten HLA-B27/β2m- transgenen Ratten sind Escherichia coli sowie Bakterien der Gattung Enterococcus in erhöhter Anzahl zu finden (ONDERDONK et al. 1998). Dabei tragen sie zur Chronifizierung und systemischen Ausbreitung der Entzündung bei, während Bacteroides vulgatus für die Entstehung einer Kolitis und Gastritis verantwortlich ist.
Durch Monoassoziation keimfreier Ratten mit Bacteroides vulgatus ist es zwar
mit Escherichia coli entwickelt sich weder eine Kolitis noch eine Gastritis, wohingegen es bei Kolonisierung der keimfreien Ratten mit einem Bakteriencocktail, welcher sowohl Bacteroides vulgatus als auch Escherichia coli enthält, zu ausgeprägter Kolitis und Gastritis kommt (RATH et al.1996; RATH et al. 1999).
Wird bei HLA-B27/β2m-transgenen Ratten das Zäkum durch eine selbstfüllende blinde Schlinge (SFBL; engl.: self-filling blind loop) vom Kolon getrennt und gleichzeitig der Fäkalstrom durch eine Ileokolostomie aufrecht erhalten, so entwickeln sie eine deutlich ausgeprägtere Kolitis und Typhlitis in Verbindung mit einer Gastritis als Kontrolltiere ohne SFBL (RATH et al. 1999). Während die Zahl der aerob wachsenden Bakterien im Zäkum signifikant vermindert ist, ist die der anaerob wachsenden signifikant gesteigert mit einem deutlich erhöhten Anteil an Bakterien der Gattung Bacteroides. Durch Ausschluß des Zäkums vom fäkalen Strom und damit verbundener Reduzierung der bakteriellen Konzentration ist die Entzündung heilbar. Obwohl es im Magen nicht zu einer Verringerung der Bakterienkonzentration kommt, tritt auch hier Heilung ein. Dieses Modell liefert nicht nur Hinweise auf eine Beteiligung der Darmflora am Krankheitsgeschehen, sondern betont auch die Rolle der genetischen Suszeptibilität, da nicht-transgene Ratten mit SFBL keine entzündlichen Reaktionen zeigen (RATH et al. 1999).
Diese Studien zeigen, daß Bakterien nicht nur lokal wirken, sondern auch bei der Entstehung und Chronifizierung von Entzündungen an anderen Stellen des Gastrointestinaltraktes sowie bei der Ausbildung systemischer Entzündungsprozesse eine Rolle spielen.
Auch die PG-PS-induzierte chronisch granulomatöse Enterokolitis (SARTOR et al.
1985; SARTOR et al. 1996a) bei der Ratte zeigt die Bedeutung bakterieller Bestandteile für die Entwicklung der CED (siehe Kapitel 2.6).
2.4.1 Einfluß von Antibiotika auf die CED
Das Absenken der Bakterienkonzentration im Darmlumen kann sich positiv auf den Heilungsprozeß auswirken. Dabei ist ein Einsatz von Antibiotika besonders bei
Morbus Crohn effektiv, führt aber auch bei Colitis ulcerosa zu einer Verbesserung des Krankheitsbildes (PRANTERA et al. 1994; TURUNEN 1994; GREENBLOOM et al. 1998; ARNOLD et al. 1999; COLOMBEL et al. 1999; SARTOR 1999). Der positive Einfluß der Antibiotika beschränkt sich dabei nicht nur auf die intestinalen Entzündungsprozesse, sondern zeigt auch bei den systemischen Manifestationen eine effektive Wirkung (DRENICK et al. 1982; LICHTMAN et al. 1991; LICHTMAN et al. 1995). Anscheinend nimmt die Ausweitung der Erkrankung Einfluß auf deren Therapierbarkeit, da Patienten, bei denen der Dickdarm ins Krankheitsgeschehen eingeschlossen ist, mit größerem Erfolg behandelt werden können als solche, bei denen lediglich der Dünndarm betroffen ist (SUTHERLAND et al. 1991;
GREENBLOOM et al. 1998). Eine Kombination von Metronidazol, einem Antibiotikum mit anaerobem Wirkungsspektrum, das auch gegen Bacteroides wirksam ist (KROOK et al. 1981; SUTHERLAND et al. 1991), und Ciprofloxacin führt bei der Behandlung von Morbus Crohn-Patienten zu einer Remission (GREENBLOOM et al.
1998). Der ausschließliche Einsatz von Ciprofloxacin, dessen Wirkungsspektrum nahezu alle Darmbakterien, ausgenommen Gram-negative anaerobe Stäbchen, umfaßt, zieht ebenfalls eine vorübergehende Verbesserung des Krankheitsbildes nach sich (COLOMBEL et al. 1999). Bei HLA-B27/β2m-transgenen Ratten zeigt dieses Antibiotikum lediglich einen verlaufsmildernden Effekt bei der Entstehung einer CED, eine heilende Wirkung auf eine bereits etablierte Kolitis ist nicht zu beobachten (RATH et al. 1998; RATH et al. 2001). Ähnliche Reaktionen zeigen diese Tiere auf Metronidazol, welches ebenfalls eine präventive aber keine heilende Wirkung zeigt (RATH et al. 1995; RATH et al. 2001). Sowohl schützend als auch therapeutisch wirksam zeigt sich dagegen eine Kombination aus Vancomycin und Imipenem, deren extrem breites Wirkungsspektrum auch Bacteroides umfaßt (RATH et al. 1998; RATH et al. 2001). Unter Einfluß dieser Antibiotika kommt es zu einem initialen Zusammenbruch der Darmflora mit anhaltender entzündungshemmender Wirkung. Die rekonvaleszente bakterielle Flora weist eine dauerhafte relative Verminderung des anaeroben Anteils auf. In schwächerer Ausprägung ist diese Wirkungsweise auch bei Metronidazol zu beobachten. Ähnliche Ergebnisse wie bei der HLA-B27/β m-transgenen Ratte lassen sich auch mit dem Modell der DSS-
aus Metronidazol und Ciprofloxacin hat in diesem Modell eine protektive Wirkung (OHKUSA et al. 1987; HANS et al. 2000). Nachfolgende Hypothese von RATH et al.
(2001) wird von den gesammelten Befunden untermauert: Während zur Initiierung der CED lediglich ein schmales Spektrum anaerob wachsender Darmbakterien mit unterschiedlichem pathogenen Potential vonnöten ist, beansprucht die Chronifizierung nahezu die gesamte Vielfalt der Darmflora.
Eine Hypothese von MADSEN et al. (2000) besagt, daß schleimhautadhärente Bakterien wie z.B. Clostridium sp., Bacteroides sp. und Viridanz-Streptokokken bei der Initiierung der CED eine tragende Funktion übernehmen, für die Chronifizierung der Erkrankung jedoch wenig bedeutend sind. Diese Theorie wird von folgenden Ergebnissen unterstützt: Werden IL-10-defiziente Mäuse (mit 129Sv/Ev-Hintergrund) mit einer Kombination aus Metronidazol und Neomycin oder mit Ciprofloxacin behandelt, so kommt es zu einem Rückgang der schleimhautadhärenten bzw.
-invasiven Bakterien und der Ausbruch einer Kolitis wird verhindert. Eine Anwendung des Kombinationspräparates während der bereits etablierten Kolitis führt zwar nicht zu einer Verminderung dieser Bakterien, beeinflußt den Heilungsprozeß aber positiv, wohingegen Ciprofloxacin die Anzahl der schleimhautadhärenten Bakterien reduziert ohne die Kolitis zu heilen.
2.5 Tiermodelle für CED
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Tiermodelle für CED entwickelt (ELSON et al. 1995; ELSON 1999). Sie werden in chemisch induzierte und genetisch manipulierte Modelle, Zelltransfer-Modelle und die spontan auftretende Kolitis (siehe Tabelle 2) eingeteilt und sind von großer Bedeutung für die Untersuchung der genetischen, immunologischen und umweltbedingten Faktoren im Krankheitsgeschehen der CED.
Von starkem Interesse sind chemisch induzierte (SARTOR et al. 1992; ELSON et al.
1995; ELSON et al. 1996; MÄHLER et al. 1998) und genetisch manipulierte
Tiermodelle (MOMBAERTS et al. 1993; ELSON et al. 1995; BERG et al. 1996), die bei verschiedenen Inzuchtstämmen mit experimentell induzierter CED auf genetisch determinierte Unterschiede in der Suszeptibilität, wie sie auch beim Menschen zu beobachten sind, hinweisen. In mehreren Modellen zeigen sich bestimmte Inzuchtstämme als sehr anfällig und andere als relativ resistent gegenüber CED, wobei die Suszeptibilitätsmuster, unabhängig von chemischer Induktion oder genetischer Manipulation, ähnlich sind. Chemische Stoffe, mit denen sich bei Versuchsnagern durch Injektion eine chronische Kolitis initiieren läßt, sind beispielsweise das bakterielle Zellwandpolymer PG-PS und das nichtsteroidale Antiphlogistikum Indometacin. Sowohl bei der PG-PS-induzierten (SARTOR et al.
1985; McCALL et al. 1994) als auch bei der Indometacin-induzierten Kolitis (SARTOR et al. 1992; YAMADA et al. 1993) zeigen Ratten der Stämme LEW und SPRD schwerere histopathologische Läsionen als Ratten der Stämme F344 und BUF. Zusätzlich ist zu beobachten, daß Ratten des Stammes LEW im PG-PS-Modell regelmäßig extraintestinale Manifestationen, wie Arthritis (STERNBERG et al. 1989), granulomatöse Hepatitis (WAHL et al. 1986) und Anämie (SARTOR et al. 1989) ausbilden. Weitere Hinweise auf die Bedeutung des genetischen Hintergrundes liefert das Modell der Interleukin-10-defizienten (Il10tm1Cgn) Maus, bei der durch homologe Rekombination das Il10-Gen ausgeschaltet wurde und die infolgedessen nach dem Absetzen spontan eine CED ausbildet (KÜHN et al. 1993). Unter gleichen Haltungsbedingungen entwickeln hier Il10tm1Cgn-Mäuse auf dem genetischen Hintergrund der Stämme 129/SvEv, BALB/c (BERG et al. 1996) oder C3H/HeJBir (BRISTOL et al. 2000) eine deutlich schwerere Kolitis als entsprechende Mutanten mit C57BL/6J-Hintergrund. Weiterhin liefert dieses Tiermodell Hinweise darauf, daß mehrere Gene, die epistatische und additive Interaktionen zeigen, für die Kontrolle der Kolitis verantwortlich sind (FARMER et al. 2001). Aufgrund der hohen genetischen Homologie zwischen Ratte und Mensch bzw. zwischen Maus und Mensch ist anzunehmen, daß die Homologe der Gene, die in den genannten Tiermodellen den Krankheitsverlauf beeinflussen, auch beim Menschen eine Bedeutung in der Pathogenese der CED spielen.
Chemisch induzierte Modelle: a. DSS (engl.: dextran sulfate sodium)- induzierte Kolitis (MÄHLER et al. 1998) b. TNBS (engl.: trinitrobenzene sulfonic acid)-
induzierte Kolitis (ELSON et al. 1996) c. Oxazolon-induzierte Kolitis (BOIRIVANT et
al. 1998)
d. PG-PS (Peptidoglykan-Polysaccharid)- induzierte Kolitis (McCALL et al. 1994)
e. Indometacin-induzierte Kolitis (SARTOR et al. 1992)
Genetisch manipulierte Modelle: a. T-Zell-Rezeptor α-Kette-defiziente Maus (MOMBAERTS et al. 1993)
b. Interleukin-2-defiziente Maus (SADLACK et al.1993)
c. Interleukin-2-Rezeptor α-Kette-defiziente Maus (WILLERFORD et al. 1995)
d. Interleukin-10-defiziente Maus (KÜHN et al.
1993)
e. Gαi2-defiziente Maus (RUDOLPH et al.
1995)
f. NCAD∆ (N-Cadherin)-transgene chimäre Maus (HERMISTON und GORDON 1995) g. Interleukin-7-transgene Maus (WATANABE
et al. 1998)
h. Mdr (engl.: multiple drug resistance)1α- defiziente Maus (PANWALA et al. 1998)
Fortsetzung siehe nächste Seite
Fortsetzung von Tabelle 2
i. Stat (signal transducers and activators of transcription) 4-transgene Maus (WIRTZ et al. 1999)
j. Orphan-Rezeptor CRF2-4-defiziente Maus (SPENCER et al. 1998)
k. Makrophagen und neutrophile Granulozyten –spezifische Stat3-defiziente Maus (TAKEDA et al. 1999)
l. WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)- defiziente Maus (SNAPPER et al. 1998) m. TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) ARE (AU-
reiche Elemente)-defiziente Maus (KONTOYIANNIS et al. 1999)
n. Keratin-8-defiziente Maus (auf FVB/N genetischem Hintergrund) (BARIBAULT et al. 1994)
o. Herpes simplex Virus Thymidinkinase- transgene Maus (BUSH et al. 1998)
p. α1,2-Fucosyltransferase-transgene Maus (MILLER et al. 2000)
q. gp39-transgene Maus (CLEGG et al. 1997) r. HLA-B27/β2m-transgene Ratte (HAMMER et
al. 1990)
Zelltransfer-Modelle: a. CD45RBhigh T-Zell-Transfer in Prkdcscid- Maus (POWRIE et al. 1993)
Fortsetzung siehe nächste Seite
b. Knochenmark-Transfer in transgene ε26 Maus (HOLLANDER et al. 1995)
Spontanes Modell: a. SAMP1/Yit Maus (MATSUMOTO et al.
1998)
2.6 Die Peptidoglykan-Polysaccharid-induzierte Enterokolitis
Ein für die Erforschung extraintestinaler Manifestationen und für die Analyse genetischer Faktoren besonders informatives experimentelles Rattenmodell der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ist die von Prof. Sartor entwickelte Peptidoglykan-Polysaccharid (PG-PS)-induzierte chronisch granulomatöse Enterokolitis (SARTOR et al. 1985; SARTOR et al. 1996a).
PG-PS-Polymere sind eine primäre Zellwandkomponente nahezu aller Bakterienspezies. Bei Ratten führen die in Ileum und Zäkum intramural injizierten, gereinigten, sterilen PG-PS Polymere, gewonnen aus Gruppe A oder D Streptokokken, abhängig vom Rattenstamm zu Entzündungsreaktionen von unterschiedlicher Schwere und Dauer. Hierbei erwiesen sich Ratten vom Stamm BUF und F344 als resistent. Bei ihnen kommt es lediglich an den Injektionsstellen zur Entzündungsantwort, nach drei Wochen tritt Heilung ein. Weder extraintestinale Manifestationen noch Fibrosen oder Granulome sind zu beobachten (McCALL et al.
1994; SARTOR et al. 1996a). Ratten vom Stamm LEW dagegen sind suszeptibel.
Sie zeigen eine biphasische, spontan reaktivierende granulomatöse Enterokolitis mit Fibrosen und systemischen Manifestationen der Erkrankung in Form von einer erosiven peripheren Arthritis, einer granulomatösen Hepatitis, Milzgranulomen und – nekrosen, einer chronischen Anämie und einer profunden Leukozytose für mindestens neun Monate (SARTOR et al. 1989). Zunächst entwickeln die Tiere eine akute Enterokolitis, die nach ein bis zwei Tagen ihren Höhepunkt erreicht und nach 7
bis 9 Tagen zurückgeht. Nach 12 bis 17 Tagen erfolgt eine spontane Reaktivierung in Form einer aktiven Entzündung, die für mindestens 4 Monate persistiert. Auch SPRD-Ratten erwiesen sich als suszeptibel für die PG-PS-induzierte Enterokolitis (SARTOR et al. 1985). Dieser Stamm entwickelt eine mindestens 6 Monate andauernde granulomatöse Enterokolitis, die jedoch nicht mit extraintestinalen Manifestationen assoziiert ist.
Sowohl die akute als auch die chronische Phase der intestinalen und systemischen Entzündung sind IL-1 vermittelt (McCALL et al. 1994) unter Beteiligung des Kinin- Kallikrein-Systems (SARTOR et al. 1996a). Dabei kommt es zur Aktivierung einer Vielzahl von proinflammatorischen Zytokinen aus aktivierten Makrophagen, wie IL- 1α, IL-1β, IL-6, Chemokinen und TNF-α (HERFARTH et al. 1996). Die chronisch granulomatöse Phase der Entzündung ist bei LEW-Ratten T-Zell-abhängig, wobei die Zytokine ein Th1-Profil aufweisen (HERFARTH et al. 1996). Die Fibrosen in der chronischen Phase der Entzündung sind durch Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise IGF-1 und TGF-β aus Myofibroblasten, vermittelt (ZIMMERMANN et al. 1993; VAN TOL et al. 1999).
Es gibt einige Hypothesen zu den unterschiedlichen Entzündungsantworten bei LEW-, F344- und BUF-Ratten. Diese beinhalten eine gestörte ACTH-Antwort auf PG- PS und IL-1β (STERNBERG et al. 1989), ein abnormes Verhältnis von IL-1 zum IL-1 Rezeptorantagonisten (BRISTOL et al. 1993; McCALL et al. 1994) sowie eine geschwächte Toleranzinduktion durch die physiologische Bakterienflora bei empfänglichen LEW-Ratten (VAN DEN BROEK et al. 1992).
Die vorliegende Arbeit war Bestandteil einer Kooperation mit Prof. Dr. R. B. Sartor (Department of Medicine/Division of Digestive Diseases, University of North Carolina, USA) und Dr. H. A. van Lith, Ph.D. (Hoofdafdeling Proefdierkunde, Faculteit der Diergeneeskunde, Universiteit Utrecht, Niederlande). Die Zucht der Versuchstiere (Kapitel 3.1), die Induktion der Enterokolitis und systemischen Entzündung (Kapitel 3.2) und die Phänotypisierung der Versuchstiere (Kapitel 3.3) wurden von Prof.
Sartors Arbeitsgruppe an der University of North Carolina durchgeführt. Die Tierversuche waren vom dort ansässigen Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt worden. Ein Teil der statistischen Auswertung (Kopplungsanalyse mit dem Computerprogramm MapQTL; Kapitel 3.6) wurde von Dr. van Lith durchgeführt. Alle anderen Untersuchungen wurden am Zentralen Tierlaboratorium und Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.
3.1 Versuchstiere
Ausgangsstämme der verwendeten Rattenpopulation waren die Inzuchtstämme LEW und F344. Diese Stämme wurden ausgewählt, weil LEW-Ratten eine hohe Suszeptibilität für PG-PS-induzierte, chronisch granulomatöse, intestinale und systemische Entzündungen aufweisen (McCALL et al., 1994; SARTOR et al., 1996a), während F344-Ratten resistent gegenüber diesen Entzündungen sind (VAN DEN BROEK et al., 1992; McCALL et al., 1994). Außerdem exprimieren beide Stämme annähernd den gleichen MHC (major histocompatibility complex)- Haplotypen (LEW, RT1l: RT1-A l, RT1-B/D l, RT1-C l; F344, RT1lv1: RT1-A l, RT1-B/D l, RT1-Clv1) (HEDRICH, 1990), was die Analyse von Nicht-MHC-Determinanten erleichtert. Unterschiede bestehen lediglich in der atypischen MHC-Klasse Ib, deren Gene nicht an der Antigenpräsentation beteiligt sind.
Spezifiziert pathogenfreie weibliche LEW-Ratten wurden mit männlichen F344- Ratten gekreuzt. Beide Elternstämme stammten von der Firma Charles River Laboratories (Raleigh, NC). Die resultierenden (LEW x F344)F1-Hybriden wurden untereinander gekreuzt und so eine segregierende (LEW x F344)F2-Population erzeugt, von denen 168 weibliche Tiere (Gewicht: 150 - 160 g) für den Versuch genutzt wurden. Es wurden ausschließlich weibliche Ratten verwendet, da sie eine aggressivere PG-PS-induzierte Arthritis entwickeln als männliche Ratten (ALLEN et al., 1983). Alle Tiere wurden unter kontrollierten Bedingungen gehalten.
3.2 Induktion der Enterokolitis und systemischen Entzündung
Die F2-Ratten wurden durch intramuskuläre Applikation von Ketamin (80 mg/kg) und Acepromazin (0,15 mg/kg) anästhesiert. Nach Laparotomie wurden je 0,05 ml eines homogenen PG-PS-Sonikates (45 mg/kg Trockengewicht), hergestellt aus der Zellwand von Gruppe A, Typ 3, Stamm D58 Streptokokken (Streptococcus pyogenes), unter sterilen Kautelen an sieben verschiedenen Stellen (zweimal Peyersche Platten des Ileums, zweimal am Übergang des Mesenteriums in das terminale Ileum, dreimal Zäkum einschließlich der lymphoiden Zellaggregation an der Zäkumspitze) in die Darmwand injiziert. Nach Verschluß des Abdomens wurden die Tiere bis zur Tötung unter kontrollierten Bedingungen gehalten.
3.3 Phänotypisierung
Die Durchmesser (mm) der Sprunggelenke der Tiere wurden vor den Injektionen von PG-PS (Ausgangswert) und an drei verschiedenen Zeitpunkten (Tag 17, Tag 21 und Tag 24) nach den Injektionen gemessen. Als Maße für den Schweregrad der Arthritis dienten die jeweils für das rechte und linke Sprunggelenk ermittelten drei Differenzen zwischen den Werten post injectionem und dem Ausgangswert; ferner
herangezogen.
24 Tage nach den Injektionen wurden die Ratten durch CO2-Inhalation getötet und der Grad der Enterokolitis makroskopisch beurteilt. Zu diesem Zweck wurden folgende Parameter jeweils mit Hilfe eines semiquantitativen Scores von 0 - 4 bewertet: Anzahl der Zäkumgranulome, Ausmaß der Verdickung der Zäkumwand, Schweregrad der Kontraktion des Mesenteriums und Schweregrad der Adhäsionen (SARTOR et al. 1985; McCALL et al. 1994). Als Summe dieser Einzelscores ergab sich für den Grad der Enterokolitis ein Score von 0 - 16.
Weiterhin wurde das Lebergewicht (mg/g Körpergewicht) bestimmt und die Anzahl der Lebergranulome mit Hilfe eines semiquantitativen Scores von 0 - 4 beurteilt.
Ferner wurde Herzblut entnommen und die absolute Leukozytenzahl (103/mm3) sowie der Hämatokrit (%) ermittelt.
Unmittelbar nach der Tötung wurden Ohrmuschel- und Nierengewebe für die DNA- Gewinnung (Kapitel 3.4.1) entnommen und bei -80°C tiefgefroren.
Schließlich wurde im Rahmen der Phänotypisierung ein inflammatorischer Gesamtscore, basierend auf der Summe von Einzelscores für die intestinalen und systemischen Entzündungsparameter, erstellt (Tabelle 3). Die Veränderungen der Gelenkdurchmesser wurden dabei nicht berücksichtigt, da diese nicht mit den anderen PG-PS-induzierten Parametern korrelierten (Kapitel 4.3). Der höchste erreichbare Wert des Gesamtscores betrug 10, der niedrigste 0.
Tabelle 3: Parameter zur Berechnung des inflammatorischen Gesamtscores
Parameter Spannweite Score
Enterokolitis (Score): <6 6-10
>10
0 1 2 Lebergewicht (mg/g Körpergewicht): <50
50-70
>70
0 1 2 Lebergranulome (Score): <0,25
0,25-2,5
>2,5
0 1 2 Absolute Leukozytenzahl (103/ml): <15
15-25
>25
0 1 2
Hämatokrit (%): >45
40-45
<45
0 1 2
3.4. Nachweis von genetischen Markern
3.4.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)
Die DNA der F2-Ratten sowie Kontroll-DNA der Parenteralstämme und der F1- Hybriden wurde unter der Nutzung des QIAamp DNA Mini Kits (Firma Qiagen) isoliert.
Für die DNA-Gewinnung wurden 25 mg des tiefgefrorenen Ohrmuschel- oder Nierengewebes in einem 2 ml Reaktionsgefäß (Firma Eppendorf) mit einer sterilen
durchmischt (Vortex; Firma Jürgens) und 10 bis 12 Stunden in einem Thermomixer (Firma Eppendorf) bei 55°C inkubiert. Anschließend wurden 200 µl eines Bindungspuffers (AL-Puffer) hinzugefügt. Die Gewebe- und Zellreste wurden durch einminütige Zentrifugation (Biofuge; Firma Heraeus) bei 12.000 Umdrehungen/min abgetrennt. Der Probenüberstand wurde in eine Silicium-Gelmembran-Säule, die sich in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß befand, überführt. Nach Zentrifugation erfolgte ein zweimaliger Waschvorgang der in der Säule enthaltenen DNA mit je 500 µl eines Waschpuffers (AW-Puffer), um restliche Verunreinigungen zu entfernen. Im Anschluß wurde die DNA mit 200 µl eines auf 80°C erwärmten Elutionspuffers (AE-Puffer) gewonnen.
3.4.2 Einstellen der DNA-Konzentration
Nachdem jede DNA-Probe 1:10 mit sterilem Aqua dest. verdünnt wurde, folgte eine photometrische Bestimmung des DNA-Gehaltes (Photometer; Firma Pharmacia Biotech) bei 260 nm in einer 1 ml Quarzküvette. Zur Berechnung der DNA-Menge pro µl Probe galt folgende Formel:
OD260 x 50/ 1000 = µg DNA/µl
Im Anschluß an die Ermittlung der DNA-Konzentration erfolgte deren Einstellung auf 50 ng/µl mit sterilem Aqua dest. Die eingestellten DNA-Proben wurden bis zur Weiterverwendung bei 4°C, zur längeren Aufbewahrung bei −18°C gelagert.
3.4.3 Markerauswahl
Zur Genotypisierung der F2-Generation mußten genetische Marker gefunden werden, die Polymorphismen zwischen den Ausgangsstämmen F344 und LEW zeigen. Die Darstellung solcher Polymorphismen erlaubt die Zuordnung der an einem Markerlocus befindlichen Allele zu einem der beiden Ausgangsstämme. Aufgrund der
hohen Polymorphismusrate und des relativ einfachen Nachweises mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden Mikrosatellitenmarker ausgewählt. Mit Hilfe dieser Marker sollten alle 20 Autosomenpaare sowie die X-Chromosomen in Abständen von ca. 20 cM typisiert werden.
Bei der Auswahl der Mikrosatellitenmarker wurden veröffentlichte Daten für die Inzuchtstämme F344 und LEW aus der Datenbank der ‘Rat Genome Database‘
(www.rgd.mcw.edu/ [Juli 2000]) herangezogen. Dabei wurden bevorzugt solche Marker ausgewählt, die nach Datenbankangaben einen Längenpolymorphismus von mindestens 10 Basenpaaren für die Stämme F344 und LEW aufweisen sollten.
3.4.4 Testen der Marker auf Polymorphismen
Alle in Frage kommenden Marker wurden mit Hilfe der nachfolgend beschriebenen Polymerase-Kettenreaktion- (Kapitel 3.4.4.1) und Elektrophoreseprotokolle (Kapitel 3.4.4.2) mit der DNA der Stämme F344 und LEW sowie der F1-Generation auf Polymorphismen getestet.
Die Organproben zur Gewinnung dieser DNA wurden von Prof. Sartor bezogen.
Der Marker war für die Analyse geeignet, wenn ein Polymorphismus sowohl zwischen den beiden Inzuchtstämmen als auch bei der F1-Generation deutlich zu erkennen war. Insgesamt wurden 95 von 123 Mikrosatellitenmarkern (Tabelle 5 in Kapitel 4.2) erfolgreich getestet und für die Genotypisierung der F2-Generation (Kapitel 3.5) verwendet.
3.4.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Alle im Rahmen dieser Arbeit ausgewählten Mikrosatelliten wurden zunächst unter den PCR-Bedingungen eines Basisprotokolls (Tabelle 4) getestet. Die verwendeten Verbrauchsmaterialien, wie Pipettenspitzen (Firma Roth), Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml; Firma Eppendorf), 96er-Mikrotiterplatten (Multi-Rigid Ultra Plates; Firma Roth), PCR-Deckel (MT-SealMat; Firma Biozym) und PCR-Gefäße (0,2 ml mit Deckel;
Überdruck).
Tabelle 4: PCR-Ansatz für die Mikrosatellitenmarker pro DNA-Probe
Volumen Endkonzentration DNA-Lösung (50ng/µl) 2µl 100 ng
Mastermix:
Aqua dest. (steril) 1,2 µl dNTP-Mix
(pro dNTP 2,5 mM)
2,5 µl pro dNTP 0,52 mM
10x PCR-Puffer (Tris-HCl) (KCl)
1,5 µl
(12,5 mM) (62,5 mM) 10x PCR-Enhancer 3 µl
25 mM MgCl2 1,2 µl 2,5 mM
6,7 µM Forward-Primer 0,25 µl 0,14 µM 6,7 µM Backward-Primer 0,25 µl 0,14 µM 5 U/µl AmpliThermTM DNA
Polymerase
0,1 µl 0,5 U
Gesamt 12 µl
MgCl2: Magnesiumchlorid; 10 x PCR-Puffer: 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KCl;
dNTP: 2`-Desoxynukleosidtriphosphat; AmpliThermTM DNA-Polymerase:
MasterAmpTM AmpliThermTM DNA-Polymerase, thermostabile DNA-Polymerase aus einem thermophilen Bakterium
Die Primerpaarsequenzen der verwendeten Mikrosatellitenmarker wurden der Datenbank des Jackson Laboratory (www.jax.org/ [Juni 2000 bis November 2001]) entnommen.
Die Primer wurden von der Firma Roth synthetisiert, als Lyophilisat bezogen und nach Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest. rekonstituiert. Es wurden 100 µl Aliquots 6,7 µM Primerlösungen hergestellt und bei 4°C gelagert. MgCl2-Lösung, 10x PCR-Puffer, 10x PCR-Enhancer, dNTP-Mix und die MasterAmpTM AmpliThermTM DNA-Polymerase wurden über die Firma Epicentre Technologies (Biozym) bezogen.
Alle Pipettierarbeiten wurden auf Kühlplatten durchgeführt, um vorzeitige Reaktionen zu minimieren. Zunächst wurden 2µl DNA-Lösung in die PCR-Gefäße vorgelegt und dann eine der Probenzahl entsprechende Menge (10 µl pro DNA-Probe) des in Tabelle 4 beschriebenen Mastermixes in ein 2 ml Reaktionsgefäß gegeben und auf einem Vortexer durchmischt. Anschließend wurden je 10 µl des Mastermixes in die vorgelegte DNA-Lösung gegeben. Dieses Gemisch wurde kurz anzentrifugiert und in einen Thermocycler (Typ PTC-200; Firma MJ Research) verbracht. Das Basistemperaturprofil der PCR begann mit einem Denaturierungsschritt von 4 min bei 95°C. Es folgten 35 Zyklen je 15 s bei 94°C (Denaturierungsschritt), 1 min bei 55°C (Annealingschritt) und 2 min bei 72°C (Extensionsschritt). Nach dem letzten Zyklus wurde die Temperatur von 72°C für 7 min gehalten. Bis zu ihrer Entnahme hielt der Thermocycler die Proben auf 8°C gekühlt.
Konnten die Mikrosatelliten nicht sicher nachgewiesen werden, wurden die PCR- Bedingungen modifiziert. In den meisten Fällen führten veränderte MgCl2- Konzentrationen (2,3 mM bzw. 2,7 mM) zum Erfolg. Die Mikrosatelliten, deren Nachweis vom Basisprotokoll (2,5 mM MgCl2) abweichende MgCl2-Konzentrationen erforderten, sind in Tabelle 5 (Kapitel 4.2) gekennzeichnet.
3.4.4.2 Agarosegel-Elektrophorese
Zur Herstellung der Gele wurde 3% (w/v) NuSieve-Agarose (Firma Bioproducts) oder 3% Metaphor-Agarose (Firma Bioproducts) in 1x TBE-Puffer durch dreiminütiges Erhitzen in einer Mikrowelle und durch anschließendes Rühren gelöst.
TBE (pH-Wert 8,3) wurde hergestellt aus Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Firma Merck), Borsäure (Firma Roth) und EDTA (Firma Calbiochem). Metaphor-Gele wurden ausschließlich für die Marker D1Rat66 und D12Rat4 verwendet. Alle anderen
ständigem Rühren mittels eines Magnetrührers wurde die Agaroselösung bis auf etwa 50°C abgekühlt und 5 µl Ethidiumbromidlösung (Firma Serva; 10 mg/ml;
verwendet bei Metaphor-Gelen) bzw. „Gel Star“ (10.000fach konzentriert; Firma Biozym; verwendet bei NuSieve-Gelen) pro 100 ml Gellösung zugesetzt. Die Gellösung wurde in eine 15 cm x 18 cm große Kunststoffkammer ausgegossen.
Zuvor wurde die Kunststoffkammer an den Enden mit Klebeband abgedichtet und die Gelkämme (1 mm stark mit 25 Zähnen) angebracht. Die Gelstärke betrug 0,7 cm.
Nach 30 Minuten war das Gel polymerisiert, so daß die Gelkämme gezogen werden konnten. Anschließend wurden die Klebestreifen entfernt und die Gelkammer samt Gel in eine horizontal ausnivellierte Elektrophoresekammer (Firma Roth) gelegt. Die Elektrophoresekammer wurde bis zu einer Höhe von mindestens 3 mm oberhalb des Gels mit 1x TBE-Puffer gefüllt.
Die PCR-Proben wurden mit je 5 µl Ladepuffer [0,05 %iges Orange G; Orange G wurde hergestellt aus: 99%-igem Glycerin (Firma Serva), sterilem Aqua dest. und Orange G (Firma Sigma)] versetzt. Von diesem Gemisch wurden je 12 µl in die einzelnen Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte mit einer Spannung von 100 Volt und bei einer Stromstärke von 90 mA für eine Dauer von 45 Minuten bis zu fünf Stunden.
Die Ergebnisse wurden auf einem UV-Transilluminator (Firma Bachofer) bei 312 nm Wellenlänge ausgewertet und mit einer Sofortbildkamera (CRT instant camera, Firma Ormaf) auf einem Papierbild (Polapan Schwarz-Weiß-Film, Firma Polaroid) oder mit einer Digitalkamera (DC 120 Zoom, Firma Kodak) festgehalten.
3.5 Genotypisierung
Die Strategie zur Genotypisierung der F2-Tiere beinhaltete zwei Schritte. In der ersten Phase der Analyse wurden von den insgesamt 168 Ratten der F2-Generation die 17 Tiere (10% der Gesamtpopulation) mit dem niedrigsten inflammatorischen Gesamtscore (Scorewerte von 0 bis 2) und die 41 Tiere (24% der Gesamtpopulation)
mit dem höchsten Gesamtscorewert von 10 unter Verwendung aller 95 polymorphen Marker (Tabelle 5 in Kapitel 4.2) genotypisiert. Auf die gleiche Weise wurde mit den Tieren verfahren, bei denen extreme Werte an den Gelenken ermittelt worden waren.
Als Auswahlkriterium galt die Summe der für das rechte und linke Sprunggelenk ermittelten Differenzen zwischen dem Wert am Tag 24 post injectionem und dem Ausgangswert. Es wurden die 35 Tiere (21% der Gesamtpopulation) ausgewählt, deren Sprunggelenke einen Unterschied im Gesamtdurchmesser von mindestens 1,404 mm aufwiesen sowie die 17 Tiere (10% der Gesamtpopulation), bei denen der Unterschied im Gesamtdurchmesser höchstens 0,123 mm betrug. Da es bei der Auswahl der Tiere zu Überschneidungen zwischen den verschiedenen Kriterien kam, ergab sich eine Gesamtzahl von 88 Tieren mit phänotypischen Extremwerten. In der zweiten Phase der Analyse wurden die übrigen 80 F2-Tiere mit den Markern (χ2- Test: n=15, Intervallkartierung und Kruskal-Wallis-Test: n=24) typisiert, die bei den 88 Tieren mit phänotypischen Extremwerten Hinweise auf eine Kopplung mit der Erkrankung lieferten (Kapitel 3.6 und 4.4).
Die Genotypisierung der F2-Ratten erfolgte mit Hilfe der in Kapitel 3.4.4 beschriebenen PCR- und Elektrophoreseprotokolle. Dabei wurden mit PCR-Deckeln (MT-SealMat; Firma Biozym) abgedeckte 96er-Mikrotiterplatten (Multi-Rigid Ultra Plates; Firma Roth) als PCR-Reaktionsgefäße verwendet. Anschließend wurde die PCR nach dem oben genannten Basisprotokoll (Tabelle 4) bzw. den in Tabelle 5 dargestellten abweichenden MgCl2-Konzentrationen durchgeführt.
3.6 Statistische Auswertung
Zur Überprüfung von Abhängigkeiten zwischen den einzelnen Krankheitsmerkmalen wurde eine Korrelationsanalyse nach Spearman mit dem Programm StatView 5.0 (HAYCOCK et al. 1992) durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt.
Zur Identifizierung von chromosomalen Regionen, die Suszeptibilitätsloci für CED
Kolmogorov-Smirnov-Tests auf Normalverteilung überprüft und, soweit notwendig und möglich, in eine Normalverteilung transformiert. Dazu wurden folgende Transformationen genutzt: logarithmisch (y = 10log[x + a]) bzw. logistisch (y = [x + a]/[b – x]) bei den Kolitis-assoziierten Daten und das Prinzip der inversen Funktion (y
= 1/[x + a]) bei den Arthritis-assoziierten Daten. Dabei stellt y den transformierten Wert dar, x den Originalwert und a und b Konstanten. Für normalverteilte Merkmale wurde das Intervallkartierungs-Modul nach LANDER und BOTSTEIN (1989) herangezogen. Dabei wird mit Hilfe einer Maximum-Likelihood-Methode die wahrscheinlichste Lage eines QTLs zwischen zwei Markern bestimmt. Die Abstände für die Kalkulationen betrugen 0,5 cM. Für nicht normalverteilte Merkmale wurde das nichtparametrische Verfahren nach KRUGLYAK und LANDER (1995) genutzt. Die Ergebnisse der normalverteilten Merkmale wurden als Lod Score (engl.: logarithm of the odds; der Logarithmus des Verhältnisses der Wahrscheinlichkeit für Kopplung gegenüber der Wahrscheinlichkeit gegen Kopplung) ausgedrückt. Der Schwellenwert des Lod Scores für signifikante Kopplung bei einer genomweiten Analyse wurde entsprechend den Kriterien von LANDER und KRUGLYAK (1995) für einen freien Erbgang auf ≥ 4,3 festgelegt, für einen dominanten oder rezessiven Erbgang auf ≥ 3,4 und für einen additiven Erbgang auf ≥ 3,3. Als schwach signifikante Kopplung galt bei einem freien Erbgang ein Lod Score von ≥ 2,8, bei einem dominanten oder rezessiven Erbgang von ≥ 2,0 und bei einem additiven Erbgang von ≥ 1,9. Nicht normalverteilte Merkmale wurden mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests untersucht, wobei entsprechend den Angaben von VAN OOIJEN und MALIEPAARD (1996) p ≤ 0,01 auf schwach signifikante Kopplung und p ≤ 0,005 auf signifikante Kopplung hinwies. Zur Bestätigung der errechneten Ergebnisse wurde eine Post-hoc-Analyse mit dem Student´s t-Test bei normalverteilten Merkmalen und mit dem Median-Test bei nicht normalverteilten Merkmalen durchgeführt. Mit Hilfe dieser Tests wurden auch die phänotypischen Unterschiede zwischen den verschiedenen Genotypen pro Markerlocus bestimmt und so der jeweilige Erbmodus festgelegt. Diese Berechnungen wurden von Dr. Hein van Lith, Ph.D. an der Universität Utrecht durchgeführt, wobei für Kolmogorov-Smirnov-Test, Student´s t-Test und Median-Test
das SPSS PC+ Computer Programm (SPSS INC. 1990) und für Intervallkartierung und Kruskal-Wallis-Test die Software MapQTLTM Version 3.0 (VAN OOIJEN und MALIEPAARD 1996) genutzt wurden. Zunächst wurden die beschriebenen Berechnungen mit den Werten der Tiere durchgeführt, die besonders ausgeprägte Krankheitserscheinungen zeigten, sowie der Tiere, die sich als besonders resistent gegenüber der PG-PS-Injektion erwiesen (n=88; Kapitel 3.5). Wurde der Schwellenwert für Signifikanz unterschritten, so wurden die Berechnungen für dieses Markerintervall oder für diesen Marker auf die gesamte Population ausgeweitet.
Weiterhin wurde im Rahmen der Kopplungsanalyse ein χ2-Test durchgeführt.
Aufgrund technischer Fehler (Fehlinjektionen, Abfließen des PG-PS-Polymers ins Darmlumen) war bei ca. 20% aller Tiere nicht mit dem Auftreten von Krankheitserscheinungen (Phänokopie) zu rechnen (persönliche Mitteilung Prof. Dr.
Sartor). Aus diesem Grunde wurden im Rahmen des χ2-Tests lediglich die besonders schwer erkrankten Tiere untersucht. Mit Ausnahme aller Marker auf Chromosom X waren pro Markerlocus homozygote LEW-, heterozygote LEW/F344- und homozygote F344-Genotypen im Verhältnis 1:2:1 zu erwarten. Die Marker auf Chromosom X sollten homozygote LEW- und heterozygote LEW/F344-Genotypen im Verhältnis 1:1 aufweisen. Mit Hilfe des χ2-Tests wurden die beobachteten Werte auf Abweichungen von dem erwarteten Verteilungsverhältnis überprüft. Ein Wert von p ≤ 0,05 galt dabei als ein Hinweis auf Abweichung vom erwarteten Verhältnis und somit auf mögliche Kopplung. In einem ersten Schritt wurden die 41 Tiere, die den höchsten inflammatorischen Gesamtscore aufwiesen, sowie die 35 am schwersten an Arthritis erkrankten Tiere (Kapitel 3.5) überprüft. Ergab sich ein p-Wert von ≤ 0,05, wurde die Berechnung für den entsprechenden Marker auf die Gesamtpopulation von 168 Tieren ausgeweitet, um zu prüfen, ob sich die Abweichung vom erwarteten Verhältnis auf alle Tiere erstreckte. Der χ2-Test wurde mit Microsoft Excel 97 durchgeführt.
Die Werte der phänotypischen Merkmale sowie die Ergebnisse der Genotypisierung für jedes Tier sind den Anhangstabellen 2, 3 und 4 zu entnehmen.
4.1 Häufigkeitsverteilungen der Krankheitsmerkmale
Die graphische Darstellung der Häufigkeiten der Meßwerte bei den 168 untersuchten F2-Tieren zeigt, daß es sich um kontinuierlich verteilte variable Einzeldaten handelt.
Keiner der Parameter erwies sich als normalverteilt (Abb. 1 – 13).
Abb. 1: Histogramm der Enterokolitis
0 5 10 15 20 25 30
0-1,5 1,5 - 3 3 - 4,5 4,5 - 6 6 - 7,5 7,5 - 9 9 - 10,5 10,5 - 12 12 - 13,5 13,5 - 15 15 - 16
Scorewert
Tierzahl
Abb. 2: Histogramm des Lebergewichtes
KGW: Körpergewicht
Abb. 3: Histogramm der Lebergranulome
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
30 - 45 45 - 60 60 - 75 75 - 90 90 - 105 105 - 120
mg/g KGW
Tierzahl
0 10 20 30 40 50 60 70
0 - 0,5 0,5 - 1 1 - 1,5 1,5 - 2 2 - 2,5 2,5 - 3 3 - 3,5 3,5 - 4
Tierzahl
Abb. 5: Histogramm des Hämatokrits
0 10 20 30 40 50 60 70
5 - 15 15 - 25 25 - 35 35 - 45 45 - 55 55 - 65 65 - 75 75 - 85 1000/ml
Tierzahl
0 10 20 30 40 50 60
20 - 25 25 - 30 30 - 35 35 - 40 40 - 45 45 - 50 50 - 55
%
Tierzahl
Abb. 6: Histogramm des inflammatorischen Gesamtscores
Abb. 7: Histogramm der Veränderung des Sprunggelenkdurchmessers (Tag 17, links)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Scorew ert
Tierzahl
0 20 40 60 80 100 120 140
-0,5 - 0 0 - 0,5 0,5 - 1 1 - 1,5 1,5 - 2 2 - 2,5 2,5 - 3 3 - 3,5 3,5 - 4
Tierzahl
(Tag 17, rechts)
Abb. 9: Histogramm der Veränderung des Sprunggelenkdurchmessers (Tag 21, links)
0 20 40 60 80 100 120 140
-0,5 - 0 0 - 0,5 0,5 - 1 1 - 1,5 1,5 - 2 2 - 2,5 2,5 - 3 3 - 3,5 3,5 - 4
Veränderung des Sprunggelenkdurchmessers (mm) bis Tag 17
Tierzahl
0 20 40 60 80 100 120 140
-0,5 - 0 0 - 0,5 0,5 - 1 1 - 1,5 1,5 - 2 2 - 2,5 2,5 - 3 3 - 3,5 3,5 - 4 4 - 4,5 4,5 - 5 5 - 5,5 Veränderung des Sprunggelenkdurchmessers (mm) bis Tag 21
Tierzahl
Abb. 10: Histogramm der Veränderung des Sprunggelenkdurchmessers (Tag 21, rechts)
Abb. 11: Histogramm der Veränderung des Sprunggelenkdurchmessers (Tag 24, links)
0 20 40 60 80 100 120 140
-0,5 - 0 0 - 0,5 0,5 - 1 1 - 1,5 1,5 - 2 2 - 2,5 2,5 - 3 3 - 3,5 3,5 - 4 4 - 4,5 4,5 - 5 5 - 5,5 5,5 - 6 6 - 6,5
V erän d eru n g d es S p ru n g g elen kd u rch m essers (m m ) b is T ag 21
Tierzahl
0 20 40 60 80 100 120 140
-0,5 - 0 0 - 0,5 0,5 - 1 1 - 1,5 1,5 - 2 2 - 2,5 2,5 - 3 3 - 3,5 3,5 - 4 4 - 4,5 4,5 - 5 5 - 5,5 5,5 - 6 6 - 6,5
Tierzahl
