GenoQuick ® HLA-B27
VER 2.0
Arbeitsanleitung IFU-311-11
0483
nur für den in-vitro-diagnostischen Gebrauch
GenoQuick
®HLA-B27 VER 2.0
Molekulargenetisches Schnelltestsystem zum Nachweis des HLA-B27-Gens
GENO•CARD-kompatibel
Bitte lesen Sie die vorliegende Arbeitsanleitung vollständig und gründlich, bevor Sie den Kit verwenden. Halten Sie sich exakt an die vorgegebene Abarbeitung, um korrekte Testergebnisse zu erhalten.
Verwendungszweck
Der GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 ist ein qualitativer In-vitro-Test zum Nachweis des menschlichen HLA-B27-Gens aus Vollblut.
Der Test ist indiziert zur Unterstützung der Diagnosestellung und zur Anwendung in medizinischen Laboratorien vorgesehen.
Zusammenfassung und Erklärung
Seit Langem ist eine Assoziation zwischen dem Zelloberflächenprotein HLA-B27 und der Erkrankung Morbus Bechterew bekannt. Rund 90% der Morbus- Bechterew-Patienten sind HLA-B27-positiv, während dies in der Normalbevölkerung nur auf ca. 8% zutrifft. Morbus Bechterew ist eine chronisch- entzündliche rheumatische Erkrankung der Gelenke, die hauptsächlich die Wirbelsäule betrifft. Darüber hinaus können aber auch Entzündungen der Regenbogenhaut oder anderer Organe auftreten.
Die ersten Anzeichen der Erkrankung sind häufig unspezifisch, sodass zwischen erster Symptomatik und einer gesicherten Diagnose ein längerer Zeitraum liegen kann. Aufgrund der hohen diagnostischen Aussagekraft einer HLA-B27-Bestimmung wird durch dessen Nachweis eine frühzeitige Diagnose unterstützt [1].
Testprinzip
Der gesamte Testablauf unterteilt sich in folgende drei Phasen: (i) DNA-Isolierung aus Patientenproben (Vollblut; ein hierzu benötigter DNA-Isolierungskit ist nicht Bestandteil des Kits), (ii) Multiplex-Amplifikation mit unterschiedlich markierten Primern (eine hierzu benötigte thermostabile DNA-Polymerase ist nicht Bestandteil des Kits) mit nachfolgender Hybridisierung und (iii) Detektion auf dem Teststreifen.
Bei Vorhandensein des HLA-B27-Gens wird zunächst durch eine sequenzspezifische PCR ein Amplifikationsprodukt hergestellt, das dann auf einem Teststreifen nachgewiesen wird. Die einzelsträngigen Amplifikate hybridisieren zunächst spezifisch mit im Primer-Nukleotid-Mix enthaltenen Sonden. Im nachfolgenden Schnelltest werden diese Komplexe selektiv an die Testbande gebunden und durch eine Gold-Markierung visualisiert.
Reagenzien und Geräte
Bestandteile des Kits
Artikelnummer 311 31196
Anzahl Tests 12 96
Teststreifen (DS GQ HLA-B27 VER 2.0)
beschichtet mit spezifischen Sonden 12 96
Primer-Nukleotid-Mix (PNM GQ HLA-B27 VER 2.0)
enthält spezifische Oligonukleotide, Nukleotide, Farbstoff 420 µl 2x 1,68 ml Kontroll-DNA (C+ GQ HLA-B27 VER 2.0)
enthält spezifische Polynukleotide 45 µl 45 µl
Laufpuffer (RB GQ HLA-B27 VER 2.0)
enthält Puffersubstanz, <1% NaCl, <1% anionisches Tensid 1,2 ml 9,6 ml
Laufstation mit 96 Röhrchen 1 1
Auswertungsbogen 1 4
Arbeitsanleitung 1 1
Chargen-Etikett 3 3
Lagerung und Entsorgung der Kitbestandteile
Primer-Nukleotid-Mix (PNM) und Kontroll-DNA (C+) streng getrennt von kontaminierender DNA lagern. Zur kurzzeitigen Lagerung bis zu 4 Wochen bei 2°C bis 8°C, zur langfristigen Lagerung bei –20°C bis –18°C aufbewahren. Mehrmaliges Auftauen und Einfrieren des PNM sollte vermieden werden; falls nur wenige Proben pro Lauf abgearbeitet werden, PNM aliquotieren. Alle weiteren Kitbestandteile bei 2°C bis 8°C lagern. Die Röhrchen mit den Teststreifen stets gut verschließen; die Beschichtung an der Röhrchenwandung enthält Trockenmittel.
Das angegebene Haltbarkeitsdatum darf nicht überschritten werden. Unbenutzte Reagenzien und Abfälle gemäß den behördlichen Vorschriften entsorgen.
Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Kitbestandteilen
Die Teststreifen enthalten biologisches Material. Daher sind sie als potenziell infektiös einzustufen und entsprechend zu behandeln (siehe z.B. [2] oder [3]).
Die jeweils geltenden Vorschriften zur Unfallverhütung, zum Umweltschutz und zum Umgang mit Gefahrstoffen sind einzuhalten. Es müssen stets geeignete Schutzkleidung und Schutzhandschuhe getragen werden.
Erforderliche Laborgeräte und Hilfsmittel – Einmal-Handschuhe
– Natriumhypochlorit-Lösung (haushaltsübliche Chlorbleiche ohne Geruchs- und Farbstoffe) – PCR-Reaktionsgefäße, DNase- und RNase-frei
– Pipetten (variabel im Bereich bis 10, 20, 200 und 1000 µl)
– Silica-basierte Säulchen (z.B. GenoType DNA Isolation Kit, s. Kapitel Bestellinformationen) sowie hierfür notwendige Reagenzien und Geräte oder
GENO•CARD (s. Kapitel Bestellinformationen) sowie hierfür notwendige Hilfsmittel – Sterile Pipettenspitzen mit Filter
– Thermocycler
– Thermostabile DNA-Polymerase inkl. Puffer (Empfehlung: HotStarTaq DNA Polymerase der Fa. Qiagen, Hilden) – Wasser (molecular biology grade)
– Zeitmesser
Qualitätssicherung
Zur Überprüfung der korrekten Testdurchführung und der Funktionalität der Kitbestandteile trägt jeder Teststreifen 2 Kontrollzonen:
– eine Konjugatkontrollzone (CC), die eine erfolgreiche Konjugatbindung anzeigt
– eine Probenkontrollzone (SC), die die DNA-Zugabe kontrolliert und eine erfolgreiche Amplifikationsreaktion anzeigt
Die für die Nukleinsäureamplifikation notwendigen Vorsichtsmaßnahmen sind zu beachten. Utensilien wie Pipettenspitzen, die mit den Reagenzien in Berührung kommen, müssen frei von DNasen sein. Reagenzien und Teststreifen unterschiedlicher Kits dürfen nicht ausgetauscht oder miteinander gemischt werden, außer sie haben die gleiche Charge. Die Kitcharge und die zugehörigen Chargen der Kitbestandteile finden Sie auf den im Kit enthaltenen Chargen-Etiketten.
Einer Negativkontrolle zur Überprüfung auf etwaige Kontaminationen wird statt DNA-Lösung Wasser (molecular biology grade) zugesetzt; diese Kontrolle sollte bei jedem Lauf mitgeführt werden. Auf dem entsprechenden Teststreifen sollte nur die CC-Bande entwickelt sein. Zusätzlich kann eine Positiv- kontrolle unter Verwendung der mitgelieferten Kontroll-DNA (C+) mitgeführt werden. Die C+ enthält Polynukleotide mit einer HLA-B27-spezifischen Sequenz. Mit der gelieferten Menge können 9 Positivkontrollproben angesetzt werden.
Untersuchungsmaterial
Als Ausgangsmaterial für die DNA-Isolierung kann EDTA- oder Citrat-Vollblut verwendet werden (Heparinblut nur nach einer Vorbehandlung). Die Leistungsfähigkeit des Tests unter Einsatz anderer Probenmaterialien wurde bis zur Erstellung dieser Arbeitsanleitung nicht validiert.
Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Untersuchungsmaterial
Untersuchungsmaterial von Patienten ist als infektiös einzustufen und entsprechend zu behandeln (siehe z.B. [2] oder [3]). Es müssen stets geeignete Schutzkleidung und Schutzhandschuhe getragen werden. Proben von Risikopatienten (infiziert mit pathogenen Mikroorganismen einschließlich Hepatitis B und Humanem Immundefizienz-Virus (HIV)) sollten immer gekennzeichnet und im Einklang mit den institutionellen Richtlinien unter geeigneten Sicherheitsvorkehrungen bearbeitet werden.
Die Pipettenspitzen müssen nach Gebrauch sofort in einem Abfallbehälter für biogefährliche Stoffe entsorgt werden. Nach der Abarbeitung müssen alle gebrauchten Einmalartikel in einem Abfallbehälter für biogefährliche Stoffe entsorgt werden.
Lagerung und Transport
Es muss gewährleistet sein, dass die Blutproben bis zu ihrer Verarbeitung maximal 7 Tage bei 2°C bis 8°C aufbewahrt wurden. Sollen die Proben erst später verarbeitet werden, können sie bei –20°C aufbewahrt werden.
Vorbereitung
Soll Heparin-Blut verwendet werden, muss das Heparin vor der DNA-Isolierung aus dem Blut entfernt werden. Für ein entsprechendes Protokoll wenden Sie sich bitte an den Technischen Support von Hain Lifescience (support@hain-lifescience.de).
DNA-Isolierung
Als Ausgangsmaterial für die DNA-Isolierung kann Vollblut eingesetzt werden.
Zur DNA-Isolierung eignen sich Silica-basierte Säulchen (z.B. der GenoType DNA Isolation Kit; s. Kapitel Bestellinformationen). Alternativ kann die GENO•CARD (s. Kapitel Bestellinformationen) eingesetzt werden. Die Handhabung entnehmen Sie bitte den jeweiligen Anleitungen.
Die hier genannten Methoden wurden zur Validierung des GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 eingesetzt. Die Leistungsfähigkeit des Tests unter Einsatz anderer Isolierungsmethoden wurde bis zur Erstellung dieser Arbeitsanleitung nicht evaluiert.
Amplifikation
Den Amplifikations-Mix (45 µl) in einem Raum herstellen, der garantiert frei von kontaminierender DNA ist. Zur Vermeidung von Kontaminationen muss die zu amplifizierende DNA in einem abgetrennten Arbeitsbereich zugegeben werden. Benutzen Sie möglichst eine Hot-Start-DNA-Polymerase. Falls kein solches Enzym eingesetzt wird, sollten alle Pipettierschritte auf Eis durchgeführt werden.
Pro Probe werden benötigt:
– 35 µl PNM – im Kit enthalten
– 5 µl 10-fach PCR-Puffer – nicht im Kit enthalten – x µl MgCl2-Lösung1) – nicht im Kit enthalten
– 1-2 Unit(s) thermostabile DNA-Polymerase (Angaben des Herstellers beachten) – nicht im Kit enthalten
– y µl Wasser (molecular biology grade) zum Auffüllen auf 45 µl (ohne Berücksichtigung des Enzymvolumens) – nicht im Kit enthalten – 5 µl DNA-Lösung in getrenntem Arbeitsbereich zugeben. Dies ergibt ein Endvolumen von 50 µl (ohne Berücksichtigung des Enzymvolumens).
1) Je nach eingesetztem Enzym/Puffersystem liegt die optimale MgCl2-Endkonzentration zwischen 1,5 und 2,5 mM. Beachten Sie, dass manche 10-fach
10 Zyklen 10 Zyklen
Die Leistungsbewertungsprüfung des GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 erfolgte mit der HotStarTaq DNA Polymerase der Fa. Qiagen. Bei Verwendung dieses Enzyms werden pro Probe benötigt:
– 35 µl PNM – im Kit enthalten
– 5 µl 10x PCR Buffer für HotStarTaq DNA Polymerase (enthält 15 mM MgCl2) – nicht im Kit enthalten – 2 µl 25 mM MgCl2-Lösung – nicht im Kit enthalten
– 0,2 µl (1 U) HotStarTaq DNA Polymerase – nicht im Kit enthalten – 3 µl Wasser (molecular biology grade) – nicht im Kit enthalten – 5 µl DNA-Lösung (in getrenntem Arbeitsbereich zugeben)
Die Endkonzentration an MgCl2 in diesem Amplifikationsansatz beträgt 2,5 mM.
Berechnen Sie die Gesamtzahl der Proben. Diese ergibt sich aus der Zahl der zu untersuchenden Proben zuzüglich der Kontrollproben. Bereiten Sie die benötigte Anzahl an PCR-Reaktionsgefäßen vor. Erstellen Sie einen Master-Mix, der bis auf die DNA-Lösungen sämtliche zur Amplifikation benötigten Reagenzien enthält, und mischen Sie vorsichtig, aber gründlich (nicht vortexen). Aliquotieren Sie den Master-Mix zu je 45 µl in die vorbereiteten PCR- Reaktionsgefäße und geben Sie für die Negativkontrollprobe einem Ansatz 5 µl Wasser (molecular biology grade) zu. Geben Sie anschließend in einem getrennten Arbeitsbereich jedem Ansatz (außer dem der Negativkontrolle) 5 µl DNA-Lösung (bzw. C+ für die Positivkontrolle) zu.
Das Vorgehen bei Verwendung von GENO•CARD-Stanzstücken entnehmen Sie bitte der GENO•CARD-Arbeitsanleitung.
Programmierungsprotokoll für Thermocycler22):
Bei Verwendung eines Thermocyclers von Hain Lifescience mit entsprechender Vorinstallation wählen Sie für isolierte DNA das Protokoll „GQHOT 30“ und für GENO•CARD-Stanzstücke das Protokoll „GQHOT 35“.
Isolierte DNA GENO•CARD 15 min 95°C 1 Zyklus 1 Zyklus 30 sec 95°C
2 min 58°C 25 sec 95°C
40 sec 53°C 20 Zyklen 25 Zyklen 40 sec 70°C
8 min 70°C 1 Zyklus 1 Zyklus 2 min 95°C 1 Zyklus 1 Zyklus 5 min 20°C 1 Zyklus 1 Zyklus ( 8°C)
Heizrate ≤2,2°C/sec ≤2,2°C/sec
2) Gilt für die bei der Validierung verwendete Taq-Polymerase. Bei anderen Hot-Start-DNA-Polymerasen muss der erste Schritt eventuell verkürzt werden (Herstellerangaben beachten).
Amplifikationsprodukte können bei –20°C bis +8°C gelagert werden. Es ist jedoch zu beachten, dass der Hybrid-Komplex nur begrenzt stabil ist. Bei einer Pause zwischen Amplifikation und Detektion von mehr als 30 min bei Raumtemperatur (15°C bis 25°C) bzw. 1 Tag bei –20°C bis +8°C müssen deshalb die Hybridisierungsschritte des Thermocyclerprogramms (2 min 95°C, 5 min 20°C) noch einmal durchgeführt werden.
Detektion
Beschriftungsfeld
Testfeld
Goldmatrix Konjugatkontrolle (CC)
Probenkontrolle (SC) HLA-B27
Hinweis: Der Teststreifen entspricht nicht der Originalgröße.
Vorbereitung
Für jede Probe unmittelbar vor der Detektion einen Teststreifen aus dem Streifenröhrchen nehmen und mit einem Bleistift auf dem weißen Beschriftungs- feld kennzeichnen. Der Streifen ist fast vollständig mit einer transparenten Folie überzogen und kann daher im Bereich des Beschriftungsfelds gefahrlos berührt werden. Für jede Probe 100 µl Laufpuffer (RB) in ein Röhrchen der mitgelieferten Laufstation pipettieren.
1. Je 10 µl hybridisiertes Amplifikat in ein Röhrchen mit 100 µl RB geben und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.
Der Laufpuffer färbt sich nach Zugabe des Amplifikats blassgelb.
2. Teststreifen mit der Goldmatrix nach unten (Pfeile weisen nach oben) in das zugehörige Röhrchen stellen und ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Positive Ergebnisse können vor Ablauf der Inkubationszeit sichtbar werden. Trotzdem sollte die angegebene Zeitspanne eingehalten werden. Eine Überschreitung der angegebenen Inkubationszeit kann dazu führen, dass sich die Signalintensitäten verändern.
3. Ergebnisse unmittelbar nach Ablauf der Inkubationszeit ablesen und auf dem mitgelieferten Auswertungsbogen notieren (s. Kapitel Auswertung und Interpretation der Ergebnisse); Teststreifen verwerfen.
Aufbewahrte Teststreifen stellen eine Kontaminationsquelle dar; zudem können sich die Signalintensitäten durch Trocknung des Streifens verändern.
Daher sollten die Streifen nach dem Ablesen verworfen oder digital archiviert werden.
Nach erfolgter Abarbeitung Teststreifen und Röhrchen mit restlichem Laufpuffer in Abfallgefäß mit frisch verdünnter 1,5%iger Natriumhypochlorit-Lösung geben und Handschuhe verwerfen. Arbeitsfläche mit frisch verdünnter 1,5%iger Natriumhypochlorit-Lösung reinigen und anschließend mit Wasser nachwischen.
Auswertung und Interpretation der Ergebnisse
Ein Auswertungsbogen liegt dem Kit bei.
Konjugatkontrolle (CC)
Diese Reaktionszone dokumentiert die Effizienz der Konjugatbindung sowie den korrekten Durchlauf des Teststreifens und muss immer entwickelt sein.
Probenkontrolle (SC)
Das bei korrekter Durchführung während der Amplifikation entstehende Kontrollprodukt bindet an die Probenkontrollzone. Die Probenkontrolle weist einen konservierten humanen Genlocus nach und muss immer entwickelt sein. Sie zeigt damit eine erfolgte DNA-Zugabe sowie eine erfolgreiche Amplifikationsreaktion an.
Bei einem positiven Testergebnis kann das Signal der Probenkontrollbande aufgrund von Kompetitionsreaktionen während der Amplifikation oder dem Vorhandensein einer begrenzten Menge an Hemmstoffen abgeschwächt sein und unter Umständen sogar ganz wegfallen. Die Amplifikationsreaktion ist in diesem Falle jedoch ordnungsgemäß durchgeführt worden und eine Wiederholung nicht erforderlich.
Sind nur die Banden CC und SC entwickelt, stellt dies ein valides negatives Ergebnis dar.
Eine schwache oder fehlende Probenkontrolle bei einem negativen Testergebnis ist ein Hinweis auf fehlende oder degradierte DNA, das Vorhandensein von Hemmstoffen oder Fehler bei Ansatz und/oder Durchführung der Amplifikationsreaktion (s. Kapitel Troubleshooting). Das Testergebnis ist dann als nicht valide zu werten und der Test muss mit der entsprechenden Probe wiederholt werden.
Beachten Sie bitte, dass es sich bei der Probenkontrolle nicht um eine PCR-Kontrolle handelt, d.h. bei Negativ- und Positivkontrollen bleibt diese Reaktionszone negativ.
HLA-B27
Ist diese Reaktionszone entwickelt, dokumentiert sie das Vorhandensein des HLA-B27-Allels (s. Kapitel Leistungsdaten). Die Intensität dieser Bande sollte mindestens der der SC entsprechen. Bei einer HLA-B27-Bande, deren Intensität schwächer als die der SC ist, ist nicht zu unterscheiden, ob es sich um ein eigentlich nicht nachzuweisendes HLA-B-Gen mit einer der Zielsequenz sehr ähnlichen Basenabfolge oder um ein HLA-B27-Allel mit geringfügigen Sequenzvariationen handelt. Ein solches Ergebnis ist daher als nicht valide zu werten und es müssen weitere Detektionstechniken angewendet werden.
Mögliche Bandenmuster von Patientenproben
Mögliche Bandenmuster von Kontrollproben
Hinweis: Die hier gezeigten Bandenintensitäten verstehen sich nicht als absolute Bezugsgröße zur Bewertung einzelner Testergebnisse, sondern dienen lediglich zur Andeutung der möglichen Bandbreite der Signalstärken.
Grenzen der Methode
Alle Vorgaben der vorliegenden Arbeitsanleitung sind einzuhalten, um korrekte Testergebnisse zu erhalten und Kontaminationen zu vermeiden.
Dieser Test ist nur von Fachpersonal durchzuführen, welches im Testverfahren geschult wurde und mit molekularbiologischen Techniken vertraut ist.
Die Ergebnisse dieses Testsystems müssen im Zusammenhang mit anderen dem behandelnden Arzt zur Verfügung stehenden Labordaten und klinischen Befunden interpretiert werden.
Der Test spiegelt den aktuellen Kenntnisstand der Firma Hain Lifescience wider.
Mit den hier eingesetzten sequenzspezifischen Primern und Sonden werden die häufigsten HLA-B27-Subtypen nachgewiesen (s. Kapitel Leistungsdaten).
Dieser Test und die daraus resultierende Aussage beziehen sich ausschließlich auf die Genomabschnitte, aus denen die spezifischen Primer und Sonden ausgewählt wurden. Wie bei jedem Nachweissystem auf Hybridisierungsbasis besteht auch beim vorliegenden Testsystem die Möglichkeit, dass Sequenzvariationen in den Genombereichen, aus denen die Primer und Sonden gewählt wurden, für deren Detektion der Test aber nicht konzipiert ist, zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Aufgrund der hohen Variabilität des HLA-Systems ist es daher möglich, dass bestimmte Allele fälschlicherweise erkannt oder nicht erkannt werden.
Die Leistungsbewertungsprüfung dieses Testsystems wurde mit der HotStarTaq DNA Polymerase der Fa. Qiagen (Hilden) durchgeführt. Für die DNA- Isolierung aus Vollblut wurden Silica-basierte Säulchen (z.B. der GenoType DNA Isolation Kit von Hain Lifescience und der QIAamp DNA Mini-Kit von Qiagen) sowie die GENO•CARD verwendet. Die Leistungsfähigkeit des Tests unter Einsatz anderer Isolierungsmethoden, Probenmaterialien oder Polymerasen wurde bis zur Erstellung dieser Arbeitsanleitung nicht validiert.
Troubleshooting
Schwache oder gar keine Banden inkl. Konjugatkontrollzone – Zu wenig oder zu viel Laufpuffer verwendet.
– Zu viel Amplifikat in den Laufpuffer gegeben.
– Teststreifen nicht korrekt in den Laufpuffer getaucht.
Detektion wiederholen.
Schwache oder keine Probenkontroll-Bande bei negativer HLA-B27-Bande
– Qualität der isolierten DNA lässt keine effiziente Amplifikation zu. DNA-Isolierung wiederholen; evtl. eine andere DNA-Isolierungsmethode einsetzen (s.
Kapitel DNA-Isolierung).
– Keine oder zu wenig DNA zum Amplifikationsansatz gegeben. Amplifikation wiederholen.
– Amplifikat nicht denaturiert und hybridisiert. Hybridisierung wiederholen (s. Kapitel Amplifikation).
– Zwischen Hybridisierung und Detektion sind mehr als 30 min vergangen oder die Proben wurden in dieser Zeit über Raumtemperatur e rwärmt.
Hybridisierung wiederholen (s. Kapitel Amplifikation).
– Kein oder zu wenig Amplifikat in den Laufpuffer gegeben. Detektion wiederholen.
Unerwartetes Ergebnis
– Kontamination der isolierten DNA durch zuvor isolierte oder amplifizierte DNA. Isolierung wiederholen.
– Kontamination der Isolierungsreagenzien. Isolierung mit neuen Reagenzien wiederholen.
– Kontamination der Amplifikationsreagenzien. In diesem Fall zeigt die Negativkontrolle außer der CC noch weitere Banden. Amplifikation mit neuen Reagenzien wiederholen.
– Kontamination benachbarter Röhrchen während der Amplifikatzugabe. Detektion wiederholen.
– Es liegt ein HLA-B-Gen mit einer dem HLA-B27-Gen sehr ähnlichen Sequenz vor, das daher ein schwach positives HLA-B27-Signal liefert (s. Kapitel Auswertung und Interpretation der Ergebnisse). Das Ergebnis ist nicht valide und es müssen weitere Detektionstechniken angewendet werden.
– Es liegt ein HLA-B27-Allel mit einer Sequenzvariation vor, für dessen Detektion das vorliegende Testsystem nicht konzipiert ist. In diesem Fall kommt es trotz Anwesenheit des HLA-B27-Gens zu keiner oder nur einer schwachen HLA-B27-Bande (s. Kapitel Auswertung und Interpretation der
Bestellinformationen
Hain Lifescience Artikelnummer
GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 (Kit zur Analyse von 12 Proben) 311 GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 (Kit zur Analyse von 96 Proben) 31196 GenoType DNA Isolation Kit (Kit zur manuellen DNA-Isolierung von 12 Proben) 51512 GenoType DNA Isolation Kit (Kit zur manuellen DNA-Isolierung von 48 Proben) 51548
GENO•CARD für 3x 4 Proben G001
GENO•CARD für 24x 4 Proben G00196
Starterset Stanze (Stanze inkl. 5 Stanzunterlagen) G002
Set Ersatzspitze (Stanzspitze inkl. 5 Stanzunterlagen) PR027
Leistungsdaten
Für die Leistungsbewertungsprüfung des GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 wurde der Test wie in dieser Arbeitsanleitung beschrieben durchgeführt.
Diagnostische Leistungsdaten
DNA-Isolierung mit Silica-basierten Säulchen
Die diagnostischen Leistungsdaten des GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 wurden in drei Studien mit insgesamt 114 Patientenproben ermittelt. Außerdem wurden 4 Ringversuchsproben (INSTAND, Düsseldorf) getestet. Für die retrospektiv analysierten Proben diente die Sequenzierung mit der HLA- Alleltypisierung Atria (Abbott Diagnostics, Wiesbaden), der HLA Typing Kit (GenoVision, Wien, Österreich), die FACS-Analyse mit dem HLA-B27 Kit (BD Biosciences, San Jose, USA) oder die Sequenzierung mit dem Protrans HLA-B-Testkit (Protrans, Hockenheim) als Vergleichsmethode.
Die DNA-Isolierung erfolgte mit verschiedenen Silica-basierten Säulchen (GenoType DNA Isolation Kit von Hain Lifescience, QIAamp DNA Blood Mini-Kit von Qiagen, Hilden und chemagic DNA Blood250-Kit von PerkinElmer chemagen, Baesweiler) entsprechend den jeweiligen Arbeitsanleitungen.
Ein Testergebnis wurde als richtig-positiv gewertet, wenn mit der Vergleichsmethode eines der nachzuweisenden Allele identifiziert und mit dem GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 ein positives Ergebnis erhalten wurde.
Tabelle 1: Ergebnisse des GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 im Vergleich zur HLA-Alleltypisierung ATRIA, zum HLA Typing Kit, zur FACS-Analyse oder Sequenzierung nach DNA-Isolierung mit Silica-basierten Säulchen
Vergleichsmethode Diagnostische Sensitivität: 98,4%
HLA-B27-positiv HLA-B27-negativ Diagnostische Spezifität: 100%
GenoQuick® HLA-B27
VER 2.0
HLA-B27-positiv 61 0 Positiver prädiktiver Wert: 100%
HLA-B27-negativ 1 56 Negativer prädiktiver Wert: 98,2%
Eignung der GENO•CARD
In einer retrospektiven Studie mit 21 Proben (9 HLA-B27-positive und 12 HLA-B27-negative) wurde die Eignung der GENO•CARD ermittelt. Als Vergleichsmethode diente der QIAamp DNA Blood Mini-Kit (Qiagen). Die Blutproben wurden parallel aufbereitetet und anschließend mit dem GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 getestet. Die Übereinstimmung betrug 100%.
Analytische Leistungsdaten Analytische Spezifität
Die Spezifität dieses Tests wird durch die sorgfältige Auswahl spezifischer Primer und Sonden, die u.a. anhand von Homologievergleichen der in Gendatenbanken publizierten Sequenzen erfolgte, sowie durch stringente Reaktionsbedingungen gewährleistet.
Zur Bestimmung der analytischen Spezifität des GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 wurden 117 hinsichtlich ihres HLA-Status genotypisierten Patientenproben (61 HLA-B27-positive und 56 HLA-B27-negative Proben) analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass der Test spezifisch die HLA-B27-Allele 02, 03, 04, 05, 05:08, 10, 14, 16, 27 und 34 nachweist. Alle untersuchten HLA-B27- negativen Proben wurden eindeutig als HLA-B27-negativ identifiziert (B07:01, B07:02, B08:01, B08:01:01, B13:01, B13:02, B14:02, B1501, B15:01/15:01N/95:02/95:04, B15:06, B15:12, B15:17, B18:01, B35:01, B35:02, B35:03, B35:08, B37:01, B38:01, B40, B40:01, B40:02, B40:06, B41:01, B42:01, B44:02, B44:03, B46:01, B47:01, B49:01, B50:01, B51:01, B51:08, B52:01, B54:01, B55:01, B55:02, B56:01, B57:01, B58:01, B58:01/58:11, B67:01, B73, B73:01, B81 und B81:01). Somit wies das Testsystem eine analytische Spezifität von 100% auf.
Nach einer in-silico-Analyse (Alignment) wurden folgende 195 HLA-B27-Allele als detektierbar klassifiziert:
27:02:01:01 27:05:12 27:10 27:45 27:73 27:104 27:135
27:02:01:02 27:05:13 27:11 27:46 27:74 27:105 27:136
27:02:01:03 27:05:14 27:12:01:01 27:47 27:76 27:106 27:138
27:02:01:04 27:05:15 27:12:01:02 27:48 27:78 27:107 27:139
27:02:01:05 27:05:16 27:13 27:49 27:79 27:108 27:141
27:02:02 27:05:17 27:14 27:50:01 27:80 27:109 27:142
27:02:03 27:05:18 27:15 27:50:02 27:81 27:110 27:143
27:02:04 27:05:19 27:16 27:51 27:82 27:111 27:144
27:03 27:05:20 27:17 27:52 27:83 27:112 27:145
27:04:01 27:05:21 27:19 27:53 27:84 27:113 27:146
27:04:02 27:05:22 27:20 27:54 27:86 27:114 27:147
27:04:03 27:05:24 27:21 27:55 27:87 27:115 27:148
27:04:04 27:05:25 27:24 27:56 27:88 27:116 27:149
27:04:05 27:05:26 27:25 27:57 27:89 27:117 27:150
27:04:06 27:05:27 27:27 27:58 27:90:01 27:118 27:151
27:05:02:01 27:05:28 27:28 27:60 27:90:02 27:120 27:152
27:05:02:02 27:05:29 27:30 27:61 27:90:03 27:121 27:153
27:05:02:03 27:05:30 27:32 27:62 27:90:04 27:122 27:154
27:05:02:04Q 27:05:31 27:33 27:63 27:94N 27:123 27:155
27:05:02:05 27:05:32 27:34 27:64N 27:95 27:124 27:156
27:05:03 27:06 27:35 27:65N 27:96:01 27:125 27:158
27:05:04 27:07:01 27:36 27:66N 27:96:02 27:126 27:159
27:05:05 27:07:02 27:37 27:67 27:97 27:127 27:160
27:05:06 27:07:03 27:38 27:68 27:98 27:128 27:161
27:05:07 27:07:04 27:40 27:69 27:99 27:130 27:162
27:05:08 27:07:05 27:41 27:70 27:100 27:132 27:163
27:05:10 27:08 27:42 27:71 27:102 27:133 27:164
27:05:11 27:09 27:43 27:72 27:103 27:134
Darüber hinaus konnten nach der in-silico-Analyse 4630 HLA-B-Allele als nicht detektierbar klassifiziert werden.
Analytische Sensitivität (Limit of Detection, LOD)
Zur Bestimmung des LOD wurden von 4 verschiedenen HLA-B27-positiven Proben Verdünnungen mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt und jeweils im Dreifachansatz mit dem GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 abgearbeitet. Es wurde ein unteres LOD von 30 Kopien pro PCR (entspricht ca. 0,1 ng chromosomaler DNA) für den GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 ermittelt. Damit weist dieser Test eine mehr als ausreichende Sensitivität für das vorgesehene Probenmaterial auf. Das obere LOD liegt bei ca. 100 ng DNA pro PCR.
Reproduzierbarkeit
Zur Bestimmung der Intraassaypräzision wurden zwei HLA-B27-positive Proben (eine am LOD und eine über dem LOD) sowie eine HLA-B27-negative Probe im Fünffachansatz unter gleichen Bedingungen (gleiche Kitcharge, gleiches Gerät, gleiche durchführende Person, gleicher Zeitpunkt usw.) mit dem GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 abgearbeitet. Alle Parallelproben lieferten das gleiche korrekte Ergebnis, es wurden keinerlei Abweichungen festgestellt.
Somit wurde eine Intraassaypräzision von 100% erreicht.
Zur Bestimmung der Interassaypräzision wurden die gleichen Proben, wie sie auch zur Bestimmung der Intraassaypräzision eingesetzt wurden, verwendet und im Dreifachansatz zu drei verschiedenen Zeitpunkten unter sonst gleichen Bedingungen (gleiche Kitcharge, gleiches Gerät, gleiche durchführende Person usw.) mit dem GenoQuick® HLA-B27 VER 2.0 abgearbeitet. Alle Parallelproben lieferten das gleiche korrekte Ergebnis, es wurden keinerlei Abweichungen festgestellt. Somit wurde eine Interassaypräzision von 100% erreicht.
Störsubstanzen
Bestimmte Substanzen können PCR-Reaktionen inhibieren. Bekannte Inhibitoren sind beispielsweise Natriumperchlorat, Ethanol, Hämoglobin, Phenol und Chloroform. Diese Substanzen liegen bei Verwendung der validierten DNA-Isolierungsmethoden nach den Angaben in den jeweiligen Anleitungen nicht in relevanter Konzentration in der DNA-Lösung vor.
Inhibitoren können außerdem durch Probenmaterial eingebracht werden. Ein bekannter PCR-Inhibitor ist Heparin, weshalb dieses bei Verwendung von Heparinblut zunächst aus dem Probenmaterial entfernt werden muss. Für ein entsprechendes Protokoll wenden Sie sich bitte an den Technischen Support von Hain Lifescience (support@hain-lifescience.de).
Stabilität
Haltbarkeit des Testkits bei Einhaltung der empfohlenen Lagerungsbedingungen: siehe Außenetikett.
Die Haltbarkeit wird nach DIN EN ISO 23640 ermittelt.
Literatur
1. Rudwaleit M, van der Heijde D, Khan MA, Braun J, Sieper J. How to diagnose axial spondyloarthritis early. Ann Rheum Dis 2004; 63: 535–543.
2. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 5th edition. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA 2009.
3. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections. Approved guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards), USA, Document M29 (please refer to the latest version).
Wichtige Änderungen in IFU-311-11
Kapitel Änderung
Reagenzien und Geräte, Qualitätssicherung,
Im Kit ist ab sofort eine neue Kontroll-DNA (C+) enthalten, welche die bisherige Kontroll-DNA (HCD) ersetzt.
Die C+ enthält Polynukleotide mit einer HLA-B27-spezifischen Sequenz. Mit der gelieferten Menge können 9 Positivkontrollproben angesetzt werden.
Auswertung und Interpretation der Ergebnisse
Bitte beachten Sie, dass die SC-Bande bei Positivkontrollen (C+) nicht entwickelt ist.
