Phänotypisierung .1 Absolute Leukozytenzahl

5.1.2 Phänotypisierung 5.1.2.1 Absolute Leukozytenzahl

Da die absolute Leukozytenzahl nur schwach mit den histologischen Scores korrelierte (Kapitel 4.3), wurde diese Zahl nicht als Parameter für den Schweregrad der CED herangezogen. Zu einem ähnlichen Ergebnis führten die Untersuchungen von MOST (2001) mit Il10^tm1Cgn-Mäusen.

5.1.2.2 Relatives Milzgewicht

Aufgrund der stark positiven Korrelation zwischen dem relativen Milzgewicht und den histologischen Scores (Kapitel 4.3) wurde das relative Milzgewicht als phänotypischer Parameter für den Schweregrad der Erkrankung im Rahmen der Kopplungsanalyse herangezogen. Ein ähnlicher Zusammenhang wurde bereits von BRISTOL et al. (2000) und MOST (2001) beobachtet.

Die Splenomegalie, die bei den in dieser Arbeit verwendeten Mäusen diagnostiziert wurde, konnte auch in Studien von LÖHLER et al. (1995), BRISTOL et al. (2000), DAVIDSON et al. (2000) und MOST (2001) bei Il10^tm1Cgn-Mäusen festgestellt werden. Sie ist Folge einer verstärkten extramedullären Hämatopoese als Kompensation einer mikrozytären, hypochromen Anämie (DAVIDSON et al., 2000). Als Ursachen für diese Anämie kommen eine Störung der Absorption von Eisen sowie ein chronischer Blutverlust über den entzündeten Darm in Frage (LÖHLER et al., 1995).

5.1.2.3 Histologie

Hauptparameter als Maß für den Schweregrad der CED war die histologische Beurteilung des Zäkums und des Kolons der Mäuse. Diese Beurteilung erfolgte in Analogie zur Dissertationsarbeit von MOST (2001) mit Hilfe eines semiquantitativen Scores (Kapitel 3.1.4.6.2). Dabei wurden aufgrund des segmentalen Charakters der Entzündungsprozesse Längsschnitte der einzelnen Darmabschnitte (sogenannte “Swiss-Roll”) herangezogen (Kapitel 3.1.4.5.2). Diese Technik hat sich auch in anderen Arbeiten zur Bestimmung des Schweregrades der CED bewährt (BERG et al., 1996; MÄHLER et al., 1998; MÄHLER et al., 1999; BRISTOL et al., 2000; MOST, 2001).

Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Rückkreuzungsmäuse wiesen in allen Dickdarmregionen signifikant höhere histologische Scorewerte auf als die in der Arbeit von MOST (2001) untersuchten C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn-Mäuse und (C3H/HeJBir@Ztm-Il10^tm1Cgn × C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn)F1-Hybriden (MÄHLER, persönliche Mitteilung).

Des Weiteren wiesen sie in allen Regionen mit Ausnahme des distalen Kolons signifikant höhere Scorewerte auf als die von MOST untersuchten C3H/HeJBir@Ztm-Il10^tm1Cgn-Mäuse.

Keine wesentlichen Unterschiede hingegen bestanden zu den Kolonscores der von MOST untersuchten Rückkreuzungspopulation auf den Stamm C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn. Lediglich die Zäkumscores der hier untersuchten Rückkreuzungspopulation waren signifikant höher als die der Rückkreuzung auf C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn. Diese Befunde deuten darauf hin, daß nicht nur Gene des suszeptiblen Stammes C3H/HeJBir@Ztm-Il10^tm1Cgn sondern auch Gene des partiell resistenten Stammes C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn zur CED-Suszeptibilität im Modell der Il10^tm1Cgn-Maus beitragen. Dies wurde durch die Untersuchungen von MOST (2001) und durch die vorliegende Kopplungsanalyse (Kapitel 4.4 und 5.1.4) bestätigt.

Es ist nicht auszuschließen, daß interindividuelle Unterschiede in der Anwendung des semiquantitativen Scores ebenfalls zu den genannten Unterschieden beigetragen haben. Für eine objektivere und genauere Beurteilung der pathohistologischen Veränderungen sind bildanalytische Verfahren besser geeignet. Sie fanden jedoch aufgrund der großen Tierzahlen in dieser Arbeit keine Verwendung.

BRISTOL et al. (2000) beobachteten eine stark positive Korrelation zwischen dem histologischen Kolonsummenscore und dem relativen Gewicht des Mesenteriallymphknotens bei erkrankten Il10^tm1Cgn-Mäusen. Da zum Zeitpunkt der Veröffentlichung von BRISTOL et

al. (2000) die eigene Untersuchungsreihe bereits zu weit fortgeschritten war, wurde letzterer Parameter in der vorliegenden Arbeit nicht berücksichtigt. Er sollte jedoch bei zukünftigen Untersuchungen im Rahmen der Phänotypisierung Berücksichtigung finden.

5.1.3 Genotypisierung

Die genetische Analyse von Krankheitsmerkmalen beinhaltet üblicherweise eine Untersuchung des Genoms von segregierenden Kreuzungstieren mit Hilfe von genetischen Markern (Genotypisierung), um eventuelle Assoziationen zwischen der Erkrankung und den eingesetzten Markern zu ermitteln. Besteht eine solche Assoziation, ist anzunehmen, daß das krankheitsvermittelnde Gen bzw. die krankheitsvermittelnden Gene mit den betreffenden Markern gekoppelt sind.

In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 72 genetische Marker mit Polymorphismen zwischen den Parentalstämmen C3H/HeJBir@Ztm-Il10^tm1Cgn und C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn zur Genotypisierung der Il10^tm1Cgn-Rückkreuzungsmäuse eingesetzt (Kapitel 3.1.5.3). Diese Marker erfaßten alle Chromosomen mit Ausnahme des Y-Chromosoms. Der mittlere Markerabstand betrug 19,3 cM. Mit Ausnahme des H2D-Markers (siehe unten) wurden dabei ausschließlich Mikrosatellitenmarker verwendet. Diese Marker sind aufgrund ihres Polymorphismusgrades, ihrer Häufigkeit, ihrer weiten Verteilung und ihrer leichten Darstellbarkeit mittels PCR besonders für genetische Kartierungen geeignet (DIETRICH et al., 1994). Aufgrund der deutlichen Hinweise auf Assoziationen zwischen Genen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA) und der CED beim Menschen (DUERR et al., 1996; HAMPE et al., 1999b) wurde auch eine mögliche Assoziation zwischen dem Haupthistokompatibilitätskomplex (H2) der Maus und der CED überprüft. Zu diesem Zweck wurde ein Marker für den Genort H2D (WEDEKIND, 1998), der sich innerhalb der Klasse Ia-Region des H2-Komplexes auf Chromosom 17 befindet, eingesetzt.

Die Strategie zur Genotypisierung der Il10^tm1Cgn-Rückkreuzungsmäuse beinhaltete zwei Schritte (Kapitel 3.1.5). In der ersten Phase der Analyse wurde eine genomweite Genotypisierung mit Hilfe aller Marker bei den 10% Mäusen mit den höchsten histologischen Scorewerten und den 10% Mäusen mit den niedrigsten histologischen Scorewerten durchgeführt. In der zweiten Phase der Analyse wurden die übrigen Rückkreuzungsmäuse mit den Markern genotypisiert, die bei den Mäusen mit histologischen Extremwerten Hinweise auf eine Assoziation mit der Erkrankung lieferten. Diese Strategie der selektiven

Genotypisierung hat sich bei der genetischen Analyse quantitativer Merkmale bewährt (SOLLER, 1991; MÄHLER et al., 1999; MOST, 2001).

5.1.4 Kopplungsanalyse

Zur Identifizierung der chromosomalen Lokalisationen von CED-modulierenden Genen wurde mittels nichtparametrischer Verfahren untersucht, ob Assoziationen zwischen den genetischen Markern und bestimmten Krankheitsmerkmalen bei den Il10^tm1Cgn -Rückkreuzungsmäusen vorlagen (Kopplungsanalyse, Kapitel 3.1.6). Dabei wurde der Schwellenwert für Signifikanz aufgrund multipler Vergleiche entsprechend den Kriterien von LANDER und KRUGLYAK (1995) für eine genomweite Kopplungsanalyse auf p ≤ 0,0034 (schwach signifikant) bzw. p ≤ 0,0001 (signifikant) festegelegt.

In Übereinstimmung mit den Befunden von MOST (2001) und FARMER et al. (2001) zeigen die Ergebnisse der Kopplungsanalyse, daß die CED-Suszeptibilität im Modell der Il10^tm1Cgn -Maus durch mehrere Gene reguliert wird (Kapitel 4.4). So bestanden schwach signifikante Assoziationen der Marker D1Mit215 (47,0 cM), D3Mit257 (70,3 cM), D3Mit19 (87,6 cM), D8Mit200 (58,0 cM), D8Mit280 (72,0 cM) und D19Mit1 (52,0 cM) mit einem bzw. zwei Krankheitsmerkmalen. Ferner ergaben sich Hinweise für einen Einfluß dieser Loci auf weitere Krankheitsmerkmale. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß suszeptibilitäts-vermittelnde Gene im Bereich der genannten Marker auf den Chromosomen 1, 3, 8 und 19 liegen. Des Weiteren lieferte die Kopplungsanalyse Hinweise für das Vorliegen von Suszeptibilitätsloci auf den Chromosomen 6, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18 und X.

Interessanterweise trugen sowohl Allele des suszeptiblen Stammes C3H/HeJBir@Ztm-Il10^tm1Cgn als auch Allele des partiell resistenten Stammes C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn zur CED-Suszeptibilität bei. Dies entspricht den Befunden bei der von MOST (2001) untersuchten Rückkreuzungspopulation auf C57BL/6J@Ztm-Il10^tm1Cgn und den von FARMER et al. (2001) untersuchten (C3H/HeJBir -Il10^tm1Cgn × C57BL/6J -Il10^tm1Cgn)F2- und (C57BL/6J -Il10^tm1Cgn × C3H/HeJBir -Il10^tm1Cgn)F2-Populationen.

Ein Vergleich der oben genannten Suszeptibilitätsloci mit den in diesen Populationen ermittelten Suszeptibilitätsloci unterstreicht das Vorkommen eines CED-modulierenden Gens auf Chromosom 3. Sowohl in der hier untersuchten Rückkreuzungspopulation auf C3H/HeJBir@Ztm-Il10^tm1Cgn als auch in den am Jackson Laboratory untersuchten

F2-Populationen (FARMER et al., 2001) wurde ein signifikanter Zusammenhang zwischen Markern auf Chromosom 3 und dem Schweregrad der CED festgestellt. Dabei betrug die Distanz zwischen dem Marker (D3Mit257, 70,3 cM), der in der Rückkreuzungspopulation die deutlichste Assoziation mit der CED aufwies, und dem Marker (D3Mit348, 61,8 cM), der in den F2-Populationen am deutlichsten mit der CED assoziiert war, lediglich 8,5 cM. Das suszeptibilitätsvermittelnde Allel war in beiden Untersuchungen auf den Stamm C3H/HeJBir@Ztm-Il10^tm1Cgn bzw. C3H/HeJBir-Il10^tm1Cgn zurückzuführen und wurde vermutlich additiv vererbt. Ein interessantes Kandidatengen, das in der Nähe dieser Markerloci lokalisiert ist und für die Modifikation der Krankheitsschwere bei der Il10^tm1Cgn -Maus verantworlich sein könnte, ist Nfkb1 (68,9 cM). Es codiert das NF-κB-Vorläuferprotein p105. NF-κB ist ein pleiotroper Transkriptionsfaktor, der die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokine hochreguliert und dem somit eine wichtige Funktion bei Immun- und Entzündungsreaktionen im Darm zukommt (NEURATH et al., 1998). In diesem Zusammenhang ist hervorzuheben, daß NF-κB u. a. durch den an der Ätiologie des Morbus Crohn beteiligten Lipopolysaccharid-Rezeptor NOD2 (HAMPE et al., 2001; HUGOT et al., 2001; OGURA et al., 2001) aktiviert wird. Der genaue Ablauf dieses Pathogeneseweges ist jedoch noch unklar.

Wie beim Menschen und der Il10^tm1Cgn-Maus wird die Suszeptibilität für CED im DSS-induzierten Kolitismodell bei der Maus durch mehrere Gene kontrolliert. Dabei konnten MÄHLER et al. (1999) mit Hilfe segregierender F2- und N2-Populationen zeigen, daß in diesem Modell analog zu den Befunden bei der Il10^tm1Cgn-Maus sowohl Allele des DSS-suszeptiblen Stammes C3H/HeJ als auch Allele des partiell DSS-resistenten Stammes C57BL/6J zur Kolitissuszeptibilität beitragen. Ein Vergleich der im Il10^tm1Cgn-Mausmodell gefundenen Suszeptibilitätsregionen mit den im DSS-Modell ermittelten Suszeptibilitätsregionen zeigt allerdings keine Übereinstimmungen und läßt somit eine unterschiedliche Regulation der CED-Suszeptibilität in diesen beiden Tiermodellen vermuten.

Im Hinblick auf die große genetische Heterogenität, die der CED des Menschen zugrunde liegt, ist dieser Befund nicht sonderlich überraschend.