3 MATERIAL UND METHODEN
5.2 Experimentelle Infektion .1 Auswahl der Versuchstiere
5.2.3 Bakteriologische Untersuchung der Mäuse
Mit Ausnahme des Bacillus sp. konnten alle inokulierten Bakterienspezies im Kot der lebenden Tiere (Kapitel 4.5.3) bzw. post mortem in Rachen, Genitale oder Koloninhalt der Mäuse (Kapitel 4.5.4) nachgewiesen werden. Die erfolgreiche Reisolierung dieses Bacillus sp. aus der Inokulationssuspension (unmittelbar nach seiner oralen Applikation in die Mäuse) zeigt, daß er zum Zeitpunkt der Inokulation vital und vermehrungsfähig war (Kapitel 4.5.2).
Möglicherweise ist die Infektion mit diesem Keim aufgrund der Konkurrenz mit den anderen inokulierten Bakterien oder aufgrund einer hemmenden Wirkung dieser Bakterien fehlgeschlagen. Eine andere Erklärungsmöglichkeit ist, daß nicht genügend Organismen zum Nachweis des Keimes in den untersuchten Proben vorhanden waren.
5.2.4 Histologie
Die experimentell infizierten C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Mäuse wiesen zu jedem Untersuchungszeitpunkt lediglich geringgradige histopathologische Veränderungen im Zäkum und proximalen Kolon auf (Kapitel 4.5.5). Dabei war keine Zunahme der Veränderungen über den Beobachtungszeitraum von 12 Wochen erkennbar. Die keimfreien C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Mäuse und die experimentell infizierten C57BL/6J@Ztm-Mäuse wiesen zu keinem Untersuchungszeitpunkt histopathologische Veränderungen auf. Im Gegensatz zu diesen Befunden zeigten C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Mäuse, die unter konventionellen Haltungsbedingungen (im Trockenbarrieresystem) aufgewachsen waren, im Alter von 4 bis 5 Monaten eine deutliche Typhlitis und Kolitis (MEFFERT, Dissertation in Vorbereitung). Dieses Alter entspricht dem Alter der oben genannten Mäuse zum letzten Untersuchungszeitpunkt. Diese Befunde zeigen zum einen, daß auch der partiell CED-resistente Stamm C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn mit zunehmendem Alter unter bestimmten Haltungsbedingungen eine deutliche CED entwickeln kann. Zum andern lassen sie erkennen, daß andere als die hier inokulierten Bakterienarten wichtig für die Entstehung der Entzündung bei diesen Mäusen sind.
Im Gegensatz zu den vorliegenden Untersuchungen konnten KIM et al. (2001) zeigen, daß keimfreie Il10tm1Cgn-Mäuse (auf C57BL/6J;129P2/OlaHsd genetischem Hintergrund) nach Monoassoziation mit Enterococcus faecalis innerhalb von 12 bis 16 Wochen eine deutliche Kolitis entwickeln. Mögliche Ursachen für die abweichenden Resultate könnten der unterschiedliche genetische Hintergrund der verwendeten Mäuse oder eine unterschiedliche Pathogenität der inokulierten Enterococcus faecalis Isolate sein. Während in der vorliegenden Arbeit ein Mausisolat eingesetzt wurde, wurde in der Studie von KIM et al. (2001) ein Humanisolat verwendet. Des Weiteren könnte die Infektionsdauer im vorliegenden Experiment zu kurz gewesen sein, um schwerere entzündliche Veränderungen zu entwickeln.
5.2.5 Ausblick
Bei zukünftigen Infektionsversuchen sollte neben dem Stamm C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn auch der Stamm C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn eingesetzt werden, um mögliche Interaktionen zwischen dem genetischen Hintergrund der Il10tm1Cgn-Mäuse und den inokulierten
Bakterienarten in der Pathogenese der CED abzuklären. Vor diesem Hintergrund wäre eine Wiederholung der vorliegenden Experimente mit dem Stamm C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn wichtig. Ferner wäre im Rahmen weiterer Infektionsversuche eine Überprüfung der Befunde von KIM et al. (2001) unter Verwendung ihres humanen Enterococcus faecalis Isolates von großem Interesse. Dabei sollte die Infektionsdauer basierend auf den Erfahrungen von KIM et al. (2001) mindestens 16 Wochen betragen. Weiterhin wären Infektionsversuche mit bestimmten Helicobacter-Arten (H. hepaticus, H. typhlonicus, H. bilis) von Bedeutung, da ein Einfluß dieser Bakterien auf die Entwicklung der CED bei Il10tm1Cgn-Mäusen beschrieben worden ist (KULLBERG et al., 1998; FOX et al., 1999; BURICH et al., 2001; KULLBERG et al., 2001). Schließlich wären auch experimentelle Infektionen mit anaeroben Bakterien in diesem Modellsystem interessant, weil es sowohl beim Menschen (KROOK et al., 1981;
SUTHERLAND et al., 1991) als auch bei der HLA-B27-transgenen Ratte (RATH et al., 1996; RATH et al., 1999) Hinweise für eine wichtige Rolle anaerober Bakterien im Krankheitsgeschehen der CED gibt.
6 Zusammenfassung
Die Ursachen der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) des Menschen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, sind weitgehend unklar. Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren wie die Darmflora spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der CED.
Für das Studium dieser Faktoren eignet sich besonders das Modell der Interleukin-10-defizienten (Il10tm1Cgn) Maus. In diesem Modell wird der Schweregrad der CED deutlich durch den genetischen Hintergrund der Mäuse modifiziert. So erkranken Il10tm1Cgn-Mutanten, bei denen der Stamm C3H/HeJBir@Ztm den genetischen Hintergrund bildet, unter gleichen Haltungsbedingungen wesentlich schwerer als entsprechende Mutanten auf C57BL/6J@Ztm-Hintergrund.
Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die chromosomale Zuordnung von genetischen Loci, welche die Suszeptibilität für CED im Modell der Il10tm1Cgn-Maus determinieren. Zu diesem Zweck wurde die Erkrankung bei 259 Mäusen einer segregierenden Rückkreuzungspopula-tion [(C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1 x C3H/HeJBir@Ztm-l10tm1Cgn]N2 phänotypisiert. Die phänotypische Untersuchung beinhaltete die Ermittlung der absoluten Leukozytenzahl, die Bestimmung des relativen Milzgewichtes sowie die histologische Beurteilung der Darmabschnitte Zäkum und Kolon mit Hilfe eines semiquantitativen Scores. Im Anschluß an die Phänotypisierung erfolgte eine genomweite Genotypisierung der Il10tm1Cgn-Rückkreuzungsmäuse mit Hilfe von polymorphen genetischen Markern (71 Mikrosatellitenmarker und ein H2D-Marker). In der ersten Phase dieser Analyse wurden die 26 Mäuse (10%) mit den höchsten histologischen Scorewerten und die 26 Mäuse (10%) mit den niedrigsten histologischen Scorewerten mit Hilfe aller 72 Marker genotypisiert. In der zweiten Phase wurden die übrigen 207 Il10tm1Cgn-Rückkreuzungsmäuse mit den 23 Markern genotypisiert, die bei den 52 Mäusen mit histologischen Extremwerten Hinweise für eine Assoziation mit der Erkrankung lieferten. Zur Identifizierung der chromosomalen Lokalisation von CED-modulierenden Genen wurde mit Hilfe nichtparametrischer Kopplungsanalyse geprüft, ob Assoziationen zwischen den genetischen Markern und bestimmten Krankheitsmerkmalen bei den Mäusen vorlagen.
Die Kopplungsanalyse zeigte, daß mehrere Gene, die CED-Suszeptibilität im Modell der Il10tm1Cgn-Maus regulieren. Es bestanden schwach signifikante Assoziationen (p ≤ 0,0034) der Marker D1Mit215 (47,0 cM), D3Mit257 (70,3 cM), D3Mit19 (87,6 cM), D8Mit200 (58,0 cM), D8Mit280 (72,0 cM) und D19Mit1 (52,0 cM) mit einem bzw. zwei Krankheitsmerkmalen. Ferner ergaben sich Hinweise (p ≤ 0,05) für einen Einfluß dieser Loci auf weitere Krankheitsmerkmale. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß suszeptibilitäts-vermittelnde Gene im Bereich der genannten Marker auf den Chromosomen 1, 3, 8 und 19 liegen. Des Weiteren lieferte die Kopplungsanalyse Hinweise für das Vorliegen von Suszeptibilitätsloci auf den Chromosomen 6, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18 und X.
Interessanterweise trugen sowohl Allele des suszeptiblen Stammes C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn als auch Allele des partiell resistenten Stammes C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn zur CED-Suszeptibilität bei.
Im Rahmen zukünftiger Untersuchungen sollte die Feinkartierung dieser Suzeptibilitätsloci und die Identifizierung von Kandidatengenen angestrebt werden. Anschließend können homologe Regionen und Genloci im Hinblick auf ihre Relevanz bei der CED des Menschen geprüft werden.
Da die Darmflora eine wichtige Rolle bei der Entstehung der CED im Il10tm1Cgn-Mausmodell spielt, sollte in einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob bestimmte Bakterienarten der Darmflora eine CED bei Il10tm1Cgn-Mäusen auslösen können. Zu diesem Zweck wurden 13 gnotobiotische Mäuse des Stammes C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn und 6 gnotobiotische Mäuse des Stammes C57BL/6J@Ztm mit einer definierten aeroben Bakteriensuspension (Bacillus sp., Enterococcus faecalis, Enterococcus gallinarum, Escherichia coli, Pasteurella pneumotropica) experimentell infiziert. Fünf PBS-inokulierte, gnotobiotische C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Mäuse dienten als Kontrolltiere. Die Beobachtungsdauer betrug 4, 8 oder 12 Wochen. Nach Ablauf der jeweiligen Versuchs-intervalle wurden die Darmabschnitte Zäkum und Kolon histologisch untersucht.
Bei den experimentell infizierten C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Mäusen wurden lediglich geringgradige histopathologische Veränderungen (milde Hyperplasie und wenige fokale leukozytäre Zellinfiltrate) im Zäkum und proximalen Kolon festgestellt, während die
experimentell infizierten Mäuse und die PBS-inokulierten C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-Mäuse zu keinem Untersuchungszeitpunkt Veränderungen aufwiesen.
Bei zukünftigen Infektionsversuchen sollte die Rolle von bestimmten Helicobacter-Arten und von anaeroben Bakterien in diesem Modellsystem untersucht werden. Des Weiteren sollte neben dem Stamm C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn auch der Stamm C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn eingesetzt werden, um mögliche Interaktionen zwischen dem genetischen Hintergrund der Il10tm1Cgn-Mäuse und den inokulierten Bakterienarten in der Pathogenese der CED abzuklären.
7 Summary
Sybille Schmidtke:
“Genetic and microbiologic analyses on the etiology of chronic intestinal inflammation in IL-10-deficient mice.”
The mechanisms underlying the human inflammatory bowel diseases (IBD), Crohn´s disease and ulcerative colitis, are poorly understood. Genetic as well as environmental factors, such as the enteric bacterial flora, are involved in the pathogenesis of IBD. Interleukin-10-deficient (Il10tm1Cgn) mice are a very suitable model to study such factors. In this model, the severity of chronic colitis is determined by the genetic background strain of the mice. For example, Il10tm1Cgn-mutants on a C3H/HeJBir@Ztm genetic background suffer much more from chronic colitis than those on a C57BL/6J@Ztm background maintained under the same conditions.
The major aim of this thesis was to determine the chromosomal localization of genetic loci determining the susceptibility to chronic colitis in Il10tm1Cgn-mice. For this purpose, the phenotype of the disease was determined in 259 mice of a segregating backcross population [(C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn x C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn)F1 x C3H/HeJBir@Ztm-l10tm1Cgn]N2. The phenotypic investigation comprised the determination of the total leukocyte count and the relative spleen weight as well as the histologic assessment of the degree of typhlitis and colitis by means of a semiquantitative score. After phenotyping, the Il10tm1Cgn -backcross mice were genome-widely genotyped using polymorphic genetic markers (71 microsatellite markers and one H2D marker). Initially, the 26 mice (10%) showing the highest histologic scores and the 26 mice showing the lowest scores were selected and genotyped using all 72 markers. Then, the remaining 207 Il10tm1Cgn-backcross mice were genotyped with the 23 markers that were associated with the disease in the 52 phenotypic extreme mice. In order to identify the chromosomal localization of colitis-modulating genes, non-parametric linkage analysis was used to examine associations between genetic markers and disease features of the mice.
Linkage analysis showed that several genes regulate colitis susceptibility in the Il10tm1Cgn -mouse model. There were weakly significant associations (p ≤ 0,0034) of the D1Mit215 (47,0 cM), D3Mit257 (70,3 cM), D3Mit19 (87,6 cM), D8Mit200 (58,0 cM), D8Mit280 (72,0 cM), and D19Mit1 (52,0 cM) markers with one or more disease characteristics. Moreover, there was nominal evidence (p ≤ 0,05) that these loci had an influence on further disease features.
Based on these results, it can be assumed that genes mediating susceptibility to colitis are linked to the markers mentioned on chromosomes 1, 3, 8, and 19. Moreover linkage analysis showed nominal evidence for the presence of susceptibility loci on chromosomes 6, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, and X. Interestingly, alleles of the susceptible C3H/HeJBir@Ztm-l10tm1Cgn strain as well as alleles of the partially resistant C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn strain contributed to colitis susceptibility.
Future research should aim at fine mapping of these susceptibility loci and at identification of candidate genes. Homologous regions and gene loci could then be tested for their relevance to human inflammatory bowel disease.
The enteric bacterial flora plays an important role in the pathogenesis of colitis in the Il10tm1Cgn-mouse model. Therefore, the second part of this thesis was thought to examine if certain species of the enteric bacterial flora can cause colitis in Il10tm1Cgn-mice. Thirteen gnotobiotic mice of the C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn strain and 6 gnotobiotic mice of the C57BL/6J@Ztm strain, respectively, were experimentally infected with a defined aerobic bacterial suspension of the following species: Bacillus sp., Enterococcus faecalis, Enterococcus gallinarum, Escherichia coli, and Pasteurella pneumotropica. As controls, 5 gnotobiotic mice of the C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn strain were inoculated with PBS only. The mice were observed for a period of 4, 8, or 12 weeks. After these times, the caecum and colon were histologically evaluated.
The experimentally infected C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-mice developed only minor histopathologic alterations (mild hyperplasia and few focal leukocytic infiltrates) limited to the caecum and proximal colon. The infected C57BL/6J@Ztm-mice and the PBS inoculated control mice did not show any pathologic alterations at all.
In future experimental infections, the role of certain Helicobacter species and anaerobic bacteria for the development of colitis in the Il10tm1Cgn-mouse model should be examined. In addition to C57BL/6J@Ztm-Il10tm1Cgn-mice, mice of the C3H/HeJBir@Ztm-Il10tm1Cgn strain should be used in order to clarify possible interactions between the genetic background of Il10tm1Cgn-mice and the inoculated bacterial species in the pathogenesis of chronic colitis.
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