DNS-Vakzine kodierend für Staupevirus-Proteine und antigenspezifische Lymphozytenproliferation
beim Hund
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Nicole Melanie Sascha Schreiner aus Recklinghausen
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. A. Tipold
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. A. Tipold 2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder
Tag der mündlichen Prüfung: 28. Mai 2001
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen und Termini technici
1 Einleitung 13
2 Literaturübersicht 15
2.1 Hundestaupevirus 15
2.1.1 Taxonomie 15
2.1.2 Morphologie 16
2.1.2.1 Proteine 16
2.1.3 Wirtsspektrum 18
2.1.4 Epidemiologie 18
2.1.5 Pathogenese 19
2.1.5.1 Neurologische Form der Hundestaupe 20
2.1.5.2 Symptome bei CDV-Infektionen 22
2.1.6 Immunantwort 23
2.1.7 Diagnose 24
2.2 DNS-Vakzine 25
2.2.1 Gründe für die Entwicklung einer DNS-Vakzine bei Hundestaupe 25
2.2.2 Hundestaupe DNS-Vakzine 27
2.3 Lymphozytenproliferationstest 30
2.3.1 Grundlagen 30
2.3.2 Lymphozytenproliferation nach Zugabe von PHA 32
2.3.3 Antigenspezifische Lymphozytenproliferation 33
2.3.4 Interleukin-2-Rezeptor 35
2.3.5 Differenzierungsantigene 35
2.3.5.1 CD 3 36
2.3.5.2 CD 4 37
2.3.5.3 CD 8 37
2.3.5.4 CD 14 37
2.3.5.5 CD 21 38
2.3.5.6 CD 44 38
2.3.5.7 CD 69 38
2.3.6 Weitere in dieser Studie verwendete mAk 39
2.3.6.1 MHC-I 39
2.3.6.2 T-Zell-Rezeptor α/β 40
2.3.7 Spezifische Lymphozytenproliferation beim Hund und
Staupe-DNS-Vakzine 40
3 Material und Methoden 41
3.1 Ort der Untersuchung, Versuchstiere, Materialien und Geräte 41
3.1.1 Zeitraum und Ort der Untersuchung 41
3.1.2 Versuchstiere 41
3.1.3 Zellen 41
3.1.4 DNS-Vakzine 42
3.1.5 Virus 42
3.1.6 Antikörper, Interleukin-2 und humanes Immunglobulin 42
3.1.7 Rekombinante Proteine 44
3.1.8 Geräte, Laborbedarf, Reagenzien, Puffer und Medien 44
3.1.8.1 Geräte 44
3.1.8.2 Laborbedarf 45
3.1.8.3 Reagenzien 46
3.1.8.4 Puffer, Medien und Lösungen 47
3.1.8.4.1 Puffer 47
3.1.8.4.2 Medien 48
3.1.8.4.3 Lösungen 48
3.2 Methoden 49
3.2.1 Vakzination der Hunde 49
3.2.2 Challenge-Infektion/Testinfektion 49
3.2.2.1 Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) 50
3.2.3 Gewinnung und Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Blut 50
3.2.3.1 Blutentnahme 50
3.2.3.2 Blutuntersuchung 51
3.2.3.3 Isolierung der mononukleären Zellen aus dem peripheren
Blut (PBMC) 51
3.2.3.4 Zellzahlbestimmung 52
3.2.4 Durchflusszytometrie 52
3.2.4.1 Markieren der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen 52 3.2.4.2 Protokoll für die Färbung des IL-2-Rezeptors 53 3.2.4.3 Messung der Zellen in der Durchflusszytometrie 54 3.2.4.3.1 Zellvitalität in der Durchflusszytometrie 55 3.2.4.3.2 Leukozytendifferenzierung in der Durchflusszytometrie 56 3.2.4.4 Staupevirusnachweis in peripheren mononukleären Zellen 57
3.2.5 Entwicklung des Lymphozytenproliferationstests 57
3.2.5.1 Kultivierung der caninen PBMC`s 57
3.2.5.2 Ermittlung der optimalen PHA Konzentration 57 3.2.5.3 Vergleich verschiedener Mikrotiterplatten 58 3.2.5.4 Ausschluss der mikrobiellen Kontamination 58 3.2.5.5 Test der in der Durchflusszytometrie einsetzbaren Antikörper
für die Lymphozytenproliferation 59
3.2.5.5.1 CD 69 Verlaufskontrolle 59
3.2.5.6 Der IL-2-Rezeptor als Proliferationsmarker 60 3.2.5.6.1 Test der einzusetzenden rhIL-2 Konzentration 60 3.2.5.6.2 Messung der Lymphozytenproliferation per IL-2-Rezeptor in der
Durchflusszytometrie 60 3.2.5.7 Bestimmung der geeigneten Konzentration des rekombinanten
Staupe-Nukleoproteins für die spezifische Proliferation 60 3.2.5.8 Vergleich der Durchflusszytometrie mit der 3H-Thymidin
Messung für die Beurteilung der NP-spezifischen Proliferation 61
3.2.5.8.1 Vergleichende Messungen 61
3.2.5.8.2 3H-Thymidin Inkorporation 62
3.2.6 Lymphozytenproliferationstests im Vakzine-Versuch 62
3.2.7 Ernte der Zellkulturen 63
3.2.8 Auswertung der Oberflächenmarker im peripheren Blut 63 3.2.9 Auswertung der Versuchsergebnisse nach Gruppen 64
3.2.10 Statistische Auswertungsverfahren 64
4 Ergebnisse 66
4.1 Methodische Vorarbeiten 66
4.1.1 Ermittlung der optimalen PHA Konzentration 66
4.1.2 Vergleich verschiedener Mikrotiterplatten 66
4.1.3 Ausschluss der mikrobiellen Kontamination 66 4.1.4 Test der in der Durchflusszytometrie einsetzbaren
Antikörper für die Lymphozytenproliferation 67
4.1.4.1 CD 69 Verlaufskontrolle 67
4.1.4.2 Der IL-2-Rezeptor als Proliferationsmarker 68 4.1.4.2.1 Test der einzusetzenden rhIL-2 Konzentration 68 4.1.4.3 Messung der Lymphozytenproliferation per IL-2-Rezeptor
in der Durchflusszytometrie 69
4.1.5 Bestimmung der geeigneten Konzentration des rekombinanten
Staupe-Nukleoproteins für die spezifische Proliferation 70 4.1.6 Vergleich der Durchflusszytometrie mit der 3H-Thymidin Messung
für die Beurteilung der NP-spezifischen Proliferation 72
4.2 Challenge-Infektion/Testinfektion 74
4.2.1 Klinik, Blutbild, Virusnachweis, Zerebrospinalflüssigkeit und
Pathologie 74 4.2.1.1 Klinische Anzeichen nach Challenge-Infektion mit CDV 74
4.2.1.1.1 Nicht-immunisierte Hunde 75
4.2.1.1.2 Immunisierte Hunde 75
4.2.1.2 Blutuntersuchung 79
4.2.1.3 Staupevirusnachweis in peripheren mononukleären Zellen 80
4.2.1.4 Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) 84
4.2.1.5 Histopathologie 84
4.2.2 Oberflächenmarker im peripheren Blut 86
4.2.2.1 CD 3, CD 4 und CD 8α 87
4.2.2.1.1 Verhältnis CD 4 : CD 8α 90
4.2.2.2 CD 21 92
4.2.2.3 CD 44 93
4.2.2.4 CD 69 96
4.2.2.5 MHC-I 97
4.2.2.6 IL-2-R 101
4.2.3 Lymphozytenproliferationstest im Vakzine-Versuch 103 4.2.3.1 Lymphozytenproliferation nach Zugabe von PHA 104 4.2.3.1.1 Lymphozytenproliferation vor der ersten Immunisierung 104 4.2.3.1.2 Lymphozytenproliferation nach der ersten Immunisierung 104 4.2.3.1.3 Lymphozytenproliferation nach der zweiten Immunisierung 104 4.2.3.1.4 Lymphozytenproliferation Tag 3 nach Challenge-Infektion 105 4.2.3.1.5 Lymphozytenproliferation Tag 6 nach Challenge-Infektion 105
4.2.3.2 Staupe-NP spezifische Proliferation des Interleukin-2-Rezeptor 108 4.2.3.2.1 Lymphozytenproliferation vor der Challenge-Infektion 108 4.2.3.2.2 Lymphozytenproliferation nach der Challenge-Infektion 108 4.2.3.3 Staupe-NP spezifische Zunahme der CD 4 positiven Lymphozyten 111 4.2.3.3.1 Lymphozytenproliferation vor der Challenge-Infektion 111 4.2.3.3.2 Lymphozytenproliferation nach der Challenge-Infektion 111 4.2.3.4 Staupe-NP spezifische Zunahme der CD 8α positiven Lymphozyten 113 4.2.3.5 Rekombinantes Campylobacter rectus Protein 114
5 Diskussion 115
5.1 Entwicklung eines nicht-radioaktiven
Lymphozytenproliferationstestes zur Beurteilung der
zellulären Immunantwort 116
5.2 DNS-Vakzine-Versuch 120
5.2.1 Lymphozyten-Oberflächenantigene ex vivo 120
5.2.2 Beobachtungen während des Vakzine-Versuches 121
5.2.3 Lymphozytenproliferationstest 126
5.3 Bedeutung der im Vakzine-Versuch erhobenen Befunde für
den Lymphozytenproliferationstest sowie die DNS-Vakzine 130
6 Zusammenfassung 132
7 Summary 135
8 Literaturverzeichnis 137
Abkürzungen und Termini technici
Abb. Abbildung Ak Antikörper
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) BrdU 5-Bromo-Deoxyuridin
BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise
ca canine (Abkürzung für Hunde-spezifische Differenzierungscluster)
CD cluster of differentiation (System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene)
CDV Canine distemper virus
Challenge-Infektion Belastungsinfektion/Belastungsversuch/Testinfektion nach einer Immunisierung
Ci Curie (Physikal. Größe zur Kennzeichnung der Umwandlungsrate eines radioaktiven Nuklids, heute gebräuchlich Bq = Becquerel)
CO2 Kohlendioxid
CSF cerebrospinalfluid (Zerebrospinalflüssigkeit) CTL cytotoxic T lymphocytes (zytotoxische T-Zellen) d.h. das heisst
DMV Dolphin (Fam. Delphinidae) Morbillivirus
DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNS Desoxyribonukleinsäure
dpm disintegrations per minute (Zerfall pro Minute) EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme-linked Immunosorbant Assay EMV Equines Morbillivirus
Fa. Firma
FACS fluorescence-activated cell sorter (Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät und „Zellsortierer“, Durchflusszytometer)
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL 1,2,3 Fluoreszenz (1 = grün/gelb, 2 = gelb/orange, 3 = rot ) FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht) g Gramm
ggr./mgr./hgr. geringgradig/mittelgradig/hochgradig HBSS Hanks’ balanced salt solution Hd. Hund
HEPES Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure HuIgG Humanes Immunglobulin G
IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M IL-2 Interleukin-2 IL-2-R Interleukin-2-Rezeptor INF Interferon
ISCOM immune-stimulating complexes (immunstimulatorische Komplexe)
ISH In-situ-Hybridisation
kDa Kilo-Dalton = Molekülmasse (Atomphysikal. Masseneinheit, auf die Masse eines hypothetischen Atoms vom Molekulargewicht 1 zurückgeführt)
l Liter
LBP lipopolysaccharid-bindendes Protein
m milli (× 10-3)
mAk monoklonaler Antikörper MFI Mittlere Fluoreszenzintensität
MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitäts- komplex)
min Minute
mmol Molarität, milli mol/l
mRNA messenger ribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure) MV Masernvirus
neutr. Ab neutralisierende Antikörper (Antibodies)
nm Nanometer ( = 10 -9 m)
Nr. Nummer
o.b.B. ohne besonderen Befund
PBMC peripheral blood mononuclear cells (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes = Monozyten, Lymphozyten )
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) PDV Phocine distemper virus (phocid = zu den Robben gehörig) PE R-Phycoerythrin
Pellet durch Zentrifugation gewonnener Bodensatz PHA Phytohämagglutinin ( Mitogen)
PI Propidiumiodid
p.i. post infectionem (nach Infektion)
PMV Porpoise (Tümmler: Fam. Phocoenidae) Morbillivirus PPRV Peste des Petits Ruminants Virus
re. Rechts
rhIL-2 rekombinantes humanes Interleukin-2
rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) RPV Rinderpestvirus
RT Raumtemperatur
RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction (Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion)
s. siehe
SH Schleimhäute
SPF spezifisch pathogen-frei
SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht) Tab. Tabelle
TCRα/β T-cell-receptor (T-Zell-Rezeptor) α/β U Unit (Einheit)
v/v percent volume in volume (Volumenprozent)
Well Vertiefung in der Mikrotiterplatte
xg multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81m/s2) z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
α alpha
β beta
γ gamma
δ delta
ε epsilon
ζ zeta
η eta
µ mikro (×10-6)
1 Einleitung
Bei der Staupe handelt es sich um eine hoch infektiöse Viruserkrankung, welche durch ein mit dem menschlichen Masernvirus und dem Rinderpestvirus verwandtes Morbillivirus der Familie Paramyxoviridae verursacht wird. Sie tritt weltweit sowohl bei Caniden (Hund, Dingo Fuchs, Kojote, Wolf und Schakal), als auch bei Procyoniden (z.B. Waschbär, Nasenbär, Panda), Musteliden (Wiesel, Frettchen, Nerz, Skunk, Dachs, Hermelin, Marder und Otter) und seit einiger Zeit auch bei Großkatzen (z.B. Löwen, Tiger und Leoparden) auf (APPEL u.
GILLESPIE 1972; APPEL et al. 1994; APPEL u. SUMMERS 1995; HARDER et al. 1996).
Die zur Zeit auf dem Markt erhältlichen attenuierten Staupe-Impfstoffe konnten das Vorkommen von schwerwiegenden CDV (Canine distemper virus) Erkrankungen beim Hund eindämmen. Jedoch treten bei der Hundestaupeimpfung zunehmend Probleme auf:
Staupeausbrüche trotz Immunisierung und postvakzinale Enzephalitis (HARTLEY 1974;
CORNWELL et al. 1988; BLIXENKRONE-MØLLER et al. 1993; GEMMA et al. 1996;
TIPOLD 1996). Impfdurchbrüche werden vor allem durch inkomplette Immunisierung infolge von Aminosäuresequenz-Unterschieden zwischen Impfstämmen und Wildtypvirus gesehen (STETTLER u. ZURBRIGGEN 1995; BOLT et al. 1997; IWATSUKI et al. 1997;
CHERPILLOD et al. 1999). Ein weiteres zunehmend größer werdendes Problem stellen durch konventionelle Lebendimpfstoffe verursachte Todesfälle bzw. Staupeausbrüche innerhalb diverser, für CDV empfängliche Wildtierarten (z.B. Graufuchs, Schwarzfuß Frettchen oder Kleiner Panda), dar (APPEL u. SUMMERS 1995; GREENE u. APPEL 1998). Eine Möglichkeit, diese Nachteile zu vermeiden, wäre der Einsatz neuer Impfstrategien, wie z.B.
eine DNS-Vakzine.
CHERPILLOD et al. (2000) entwickelten eine DNS-Vakzine, die Plasmide mit dem N (Nukleokapsid)-, F (Fusion)- und H (Hämagglutinin)-Gen enthält. Eine erste Belastungsinfektion (Challenge-Infektion) hat die Wirksamkeit dieser Vakzine bereits bewiesen. Die geimpften Hunde entwickelten nach der 2. Immunisierung bzw. nach der Infektion mit dem virulenten Virus neutralisierende Antikörper. Eine T-Zellantwort konnte aufgrund technischer Probleme (Lymphozytenproliferation, CTL) in diesem Versuch nicht untersucht werden. Das virulente Virus, abgetötetes virulentes Virus sowie einige
Gewebekultur-adaptierte Stämme hatten die kultivierten Lymphozyten abgetötet (TIPOLD 2000)1. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen neuen Lymphozytenproliferationstest beim Hund zu entwickeln. Dieser sollte eine alternative Methode zu den herkömmlichen, größtenteils noch mit radioaktiven Markern (3H-Thymidin-Einbau) arbeitenden, Lymphozytenproliferationstests darstellen. Eine vielversprechende Möglichkeit bot hier die Messung der T-Zell Antwort in der Durchflusszytometrie. Zum einen ist diese Methode für andere Spezies bereits weitgehend etabliert (LANGE 1995; SCHUBERTH et al. 1996; BEER 1998; HENDRICKS 1998; SCHARSACK et al. 2000), zum anderen bietet sie die Möglichkeit, gleichzeitig mehrere zelluläre Parameter beurteilen zu können. Durch den Einsatz eines rekombinanten Nukleokapsid-Proteins (Staupeprotein mit T-Zell Epitop) sollte das virusbedingte Absterben der kultivierten Lymphozyten umgangen werden und der Nachweis einer antigenspezifischen Proliferation möglich werden.
Der entwickelte Lymphozytenproliferationstest sollte zunächst in Vorversuchen an mononukleären Zellen konventionell gegen Staupe geimpfter Hunde getestet werden. Vor allem die antigenspezifische Proliferation nach Zugabe des rekombinanten Staupeproteins war hier von Interesse. Im Anschluss an diese Vorversuche war der Einsatz des neuen Tests während eines DNS-Vakzine-Versuches geplant. Zum einen sollte die Praxistauglichkeit des Tests geprüft werden, zum anderen sollte die antigenspezifische Lymphozytenproliferation immunisierter und nicht-immunisierter Hunde vor und nach einer Belastungsinfektion mit virulentem Staupevirus überprüft werden. Durch eine zusätzlich durchgeführte durchflusszytometrische Verlaufskontrolle von Lymphozyten-Oberflächenmarkern sollte die Charakterisierung der Immunantwort geimpfter und nicht-geimpfter Hunde bei Hundestaupe verbessert werden. Dies sollte einen Hinweis darauf bringen, weshalb es bei der Hundestaupe trotz starker Immunsuppression zu einer frühzeitigen intrathekalen T-Zell Antwort kommt.
1 Persönliche Mitteilung Frühjahr 2000
2 Literaturübersicht
2.1 Hundestaupevirus 2.1.1 Taxonomie
Die Hundestaupe wurde erstmalig 1809 von Jenner beschrieben. Der Krankheitskomplex umfasste damals noch verschiedenste Krankheiten wie z.B. die Hepatitis contagiosa canis, die Leptospirose, aber auch die Panleukopenie der Katze. Carrè konnte bereits 1905 als Ursache der Hundestaupe ein filtrierbares Agens nachweisen (FANKHAUSER 1982).
Staupe wird durch ein Morbillivirus verursacht, welches mit den Genera Respiro- und Rubulavirus die Subfamilie Paramyxovirinae der Familie Paramyxoviridae, Ordnung Mononegavirales bildet (MURPHY et al. 1999). Neben dem Hundestaupevirus („Canine distemper virus“, CDV ) sind das humane Masernvirus (MV), das Rinderpestvirus (RPV) sowie das Peste des Petits Ruminants Virus (PPRV) Mitglieder des Genus Morbillivirus. In den letzten Jahren kamen einige neu entdeckte Morbilliviren hinzu, so das „Phocine distemper virus“ (PDV), das „Dolphin distemper virus“ (DMV), das „Porpoise distemper virus“ (PMV) und das Equine Morbillivirus (EMV) (TRUDGETT et al. 1991; DOMINGO et al. 1995;
OSTERHAUS et al. 1995; OSTERHAUS et al. 1997; GREENE u. APPEL 1998; MURPHY et al. 1999). In verschiedenen Untersuchungen konnte eine hohe Antigenverwandtschaft des Hundestaupevirus mit dem Masernvirus und dem Rinderpestvirus, später aber auch mit dem
„Phocinen distemper virus“ nachgewiesen werden. Die Vermutung, dass sich sowohl das Masernvirus als auch das Staupevirus aus dem Rinderpestvirus als sogenanntes „Archevirus“
entwickelt haben, konnte bestätigt werden. Spätere Untersuchungen erweiterten diese These dahingehend, dass sich das Phocine distemper virus aus dem Hundestaupevirus (oder vice versa) abgespalten, bzw. entwickelt hat (ÖRVELL u. NORRBY 1974;
SHESHBERADARAN et al. 1986; ÖRVELL u. SHESHBERADARAN 1991).
2.1.2 Morphologie
Das sphärische bis pleomorphe Hundestaupevirus besteht wie alle Morbilliviren aus einem negativ polarisierten, linearen RNA-Einzelstrang (15-16 Kilobasen). Es hat einen Durchmesser von etwa 150-300 nm und sein helikales Nukleokapsid ist von einer Lipidhülle umgeben (DIALLO 1990; MURPHY et al. 1999). Das Virus ist aus sechs Strukturproteinen, dem Nukleokapsidprotein (N), dem Phosphoprotein (P), dem Matrixprotein (M), dem Fusionsprotein (F), dem Haemagglutininprotein (H) und dem „Large“-Protein aufgebaut.
Zusätzlich besteht es aus zwei nicht-strukturellen Proteinen, dem C- und dem V-Protein, über deren Funktion nur wenig bekannt ist (HALL u. MARTIN 1974; KINGSBURY 1991).
Wichtige Hüllproteine sind die transmembranen Glykoproteine H (Haemagglutinin) und F (Fusion), welche als regelmäßig angeordnete „Spikes“ über die Oberfläche der Lipiddoppelmembran hinausragen (s. Abb. 1, S. 29). Das auf der Innenseite der Membran befindliche M-Protein (Matrixprotein) verleiht dem Virion durch eine Bindung zwischen dem Nukleokapsid und den Glykoproteinen Stabilität (HALL u. MARTIN 1974). Die N- (Nukleokapsid-), P- (Phospho-) und L -(„Large“-) Proteine sind am Aufbau des Nukleokapsids beteiligt. Die Abfolge der diese Proteine kodierenden Gene auf der viralen RNA ist hoch konserviert und folgendermaßen beschrieben: 3` - N - P/C/V - M - F - H - L - 5` (BARRETT et al. 1991; MURPHY et al. 1999).
2.1.2.1 Proteine
Das wichtigste virale Protein ist das phosphorylierte Nukleokapsidprotein (N), welches das Genom schützt, aber auch an dem viralen RNA-Polymerase-Komplex beteiligt ist (OGLESBEE et al. 1989; KOLAKOFSKY et al. 1998). Die Bestimmung seiner Molekülmasse, die im Bereich von 60-62 kDa liegt, ist durch die hohe Empfindlichkeit gegenüber Proteasen erschwert (OGLESBEE et al. 1989; DIALLO 1990).
Das ebenfalls phosphorylierte P-Protein ist (wie das N-Protein) sehr anfällig für Proteolyse und ein wichtiger Bestandteil des RNA-Polymerase-Komplexes (BARRETT et al. 1985;
GALINSKY 1991). Seine Molekülmasse liegt zwischen 73 und 80 kDa, weicht damit jedoch von der aus der Nukleotidsequenz errechneten Molekülmasse von etwa 50 kDa erheblich ab (BARRETT et al. 1985; DIALLO 1990). Das P-Gen kodiert nicht nur für das P-Protein, sondern mittels eines alternierenden Leserasters ebenfalls für das nicht-strukturelle C-Protein.
Dieses besitzt eine Molekülmasse von etwa 19 kDa und ihm wird ein Anteil an den Regulationsmechanismen der RNA-Synthese zugesprochen (BELLINI et al. 1985; DIALLO 1990; MURPHY et al. 1999). Ein weiteres auf dem P-Gen kodiertes Protein ist das nicht- strukturelle V-Protein, welches in weiten Teilen mit dem P-Protein identisch ist. Seine Molekülmasse beträgt etwa 40-42 kDa (BARON et al. 1993).
Das Matrixprotein (M) liegt an dritter Stelle auf dem Genom der Morbilliviren. Neben der Aufgabe als stabilisierendes Verbindungsglied zwischen dem Nukleokapsidprotein und den beiden Oberflächenproteinen (H und F), kommt ihm eine bedeutende Funktion während der Virusreifung zu. Seine Molekülmasse beträgt 34 kDa, es ist somit das kleinste Strukturprotein (DIALLO 1990; BARRETT et al. 1991; GREENE u. APPEL 1998).
Als eines der Oberflächenglykoproteine vermittelt das Fusionsprotein (F) die Fusion zwischen Virus und der infizierten Zelle, bzw. der infizierten Zelle und einer ihr benachbarten Zelle. So kommt ihm eine wesentliche Rolle bei der Ausbreitung des Virus innerhalb des Wirtes zu. Aus dem originären Genprodukt F0 entstehen durch Spaltung mittels einer zellulären Protease die Proteine F1 (40 kDa) und F2 (20-30 kDa). Diese biologisch aktiven Proteine sind durch eine Disulfidbrücke verbundenen (DIALLO 1990; GREENE u. APPEL 1998; MURPHY et al. 1999).
Das Haemagglutininprotein (H) ist ein weiteres Membranglykoprotein und dient der Anheftung des Virus an die Wirtszelle. Es hat eine Molekülmasse von 76-85 kDa und besteht aus durch Disulfidbrücken verbundenen Di- und Trimeren, welche mit dem Amino-Ende in der Lipidmembran verankert sind (RIMA 1983; DIALLO 1990).
Die Molekülmasse des „Large“-Proteins (L) beträgt 180-200 kDa. Es wird nur in geringen Konzentrationen gebildet und ist ein Bestandteil des Nukleokapsids. Gemeinsam mit dem P-
Protein ist es ein Hauptbestandteil der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (DIALLO 1990; GREENE u. APPEL 1998).
2.1.3 Wirtsspektrum
Das Wirtsspektrum des Hundestaupevirus ist sehr breit und hat sich in den letzten Jahren deutlich ausgeweitet. So sind nicht mehr nur Caniden (Hund, Dingo, Fuchs, Kojote, Wolf und Schakal), Procyoniden (z.B. Waschbär, Nasenbär, Panda) und Musteliden (Wiesel, Frettchen, Nerz, Skunk, Dachs, Hermelin, Marder und Otter) betroffen, sondern auch Großkatzen (z.B.
Löwen, Tiger, Leoparden) (APPEL u. GILLESPIE 1972; APPEL et al. 1994; APPEL u.
SUMMERS 1995; HARDER et al. 1996; BARRETT 1999). Darüber hinaus können andere Spezies experimentell infiziert werden. In Mäusen und Hamstern können nach intrazerebraler Inokulation ZNS-Symptome ausgelöst werden, Schweine und Katzen sind infizierbar, ohne jedoch klinisch zu erkranken. Natürlich infizierte Pekaris (Nabelschweine Fam. Tayassuidae) entwickelten eine Enzephalitis und auch die Erkrankung von Baikalrobben (Phoca sibirica) in den späten 80er Jahren konnte auf eine Infektion mit CDV zurückgeführt werden (APPEL et al. 1994; OSTERHAUS et al. 1995; HARDER et al. 1996; GREENE u. APPEL 1998). Erst kürzlich wurde über ein durch CDV ausgelöstes Massensterben unter Kaspischen Robben (Phoca caspica) in der Zeit von April bis August 2000 berichtet (KENNEDY et al. 2000). Die Möglichkeit eines weit größeren Wirtsspektrums als bisher für CDV bekannt ist also durchaus gegeben (HARDER u. OSTERHAUS 1997).
2.1.4 Epidemiologie
Das Virus kann reichlich aus den Exsudaten des Respirationstraktes, aber auch aus diversen Körpergeweben und sämtlichen Exkreten von infizierten Hunden isoliert werden. Es wird vorwiegend durch Aerosole von Hund zu Hund verbreitet, wobei die Ausscheidung etwa 7 Tage nach Virusexposition beginnt. Sie kann bis zu 60-90 Tage nach Infektion anhalten, typisch sind jedoch kürzere Perioden. Eine chronische Ausscheidung ist bisher nicht bekannt.
In der Außenwelt ist das Virus nur kurz lebensfähig, die Ansteckungsgefahr ist daher um so höher, je dichter die Hundepopulation in einem bestimmten Lebensraum ist (GREENE u.
APPEL 1998; APPEL 1987).
Die nach einer überstandenen Infektion erlangte Immunität ist zwar sehr langlebig, jedoch nicht unbedingt lebenslang. Eine unregelmäßige Immunisierung oder eine Immunsuppression bzw. Stress, Kontakt zu hoch virulentem Virus und hoher Infektionsdruck können zu einer erneuten Infektion mit dem Staupevirus führen. Schätzungsweise erkranken 25-75% aller für das Virus empfänglichen Hunde nur subklinisch, was auf ein gewisses Maß an natürlicher bzw. Vakzine-induzierter Immunität hinweist. Die höchste Rate an spontanen Staupeinfektionen ist bei Junghunden etwa ab der 12. Lebenswoche festzustellen. Dies ist vor allem durch den bis ungefähr zu diesem Zeitpunkt gegebenen Schutz durch maternale Antikörper erklärbar (GREENE u. APPEL 1998; APPEL 1987).
Die Virulenz des betroffenen Virusstammes ist ein weiterer Parameter, welcher die Schwere und den Grad oder Typ der klinischen Erkrankung bestimmt. Hoch virulente und neuropathogene Stämme sind beispielsweise A75/17 und R252 (GREENE u. APPEL 1998).
2.1.5 Pathogenese
Die Infektion mit dem Staupevirus findet zumeist nach Tröpfcheninfektion über die Schleimhaut des oberen Respirationstraktes statt. Innerhalb der ersten 24 Stunden vermehrt sich das Virus in Gewebsmakrophagen und breitet sich mit ihrer Hilfe in den Tonsillen und den Bronchiallymphknoten aus. Innerhalb von 2-4 Tagen nach Infektion steigt die Anzahl an Viruspartikeln in diesen Lymphknoten sowie in den Retropharyngeallymphknoten stark an (APPEL 1969; GREENE u. APPEL 1998).
Ab Tag 4 bis 6 nach aerogener Infektion gelangt das Virus über infizierte Makrophagen und Lymphozyten in sämtliche lymphatische Organe (z.B. Milz, Thymus, Lymphknoten, Lamina propria des Magens und des Dünndarmes, Kupffer` Sternzellen der Leber, Knochenmark).
Die hochgradige Virusvermehrung in den lymphoiden Organen geht mit einer ersten
Erhöhung der Körpertemperatur sowie einer Leukopenie einher. In erster Linie handelt es sich hierbei um eine durch die direkte virale Zerstörung von B- und T-Zellen verursachte Lymphopenie (APPEL 1987; GREENE u. APPEL 1998). Die dadurch hervorgerufene Schädigung der lymphatischen Organe zeigt sich in der Sektion deutlich in einer Thymusatrophie und histologisch anhand von Lymphozytendepletionen in den Lymphknoten (KRAKOWKA et al. 1980).
Die an Tag 8-9 post infectionem (p.i.) vorkommende zellassoziierte Virämie führt zu einer weiteren Verbreitung des Virus in Epithelien und in das zentrale Nervensystem. Die Virusausscheidung beginnt mit der Besiedelung der Epithelien und erfolgt über sämtliche Körperexkrete (APPEL 1970; GREENE u. APPEL 1998).
Zeigen die Tiere an Tag 7-14 p.i. eine adäquate Immunantwort, so erholen sie sich ohne Anzeichen einer Erkrankung, da neben einer zellulären Immunantwort spezifische IgG-CDV Antikörper in der Lage sind, effektiv extrazelluläres CDV zu neutralisieren und die interzelluläre Weiterverbreitung zu verhindern (APPEL 1969; GREENE u. APPEL 1998).
Fehlt jedoch eine zellvermittelte Immunantwort und ist die humorale Immunantwort nur unzureichend, so kommt es entweder zu einer akuten, subakuten oder aber chronischen Erkrankung. Bei diesen Hunden breitet sich das Virus in diversen Geweben wie der Haut, den exokrinen und endokrinen Drüsen, den Epithelien des Gastrointestinal-, Respirations- und Urogenitaltraktes, sowie dem ZNS aus. Das klinische Bild ist sehr schwerwiegend.
Krankheitssymptome können aber mit steigendem Antikörpertiter nachlassen und die gesteigerte Antikörperproduktion kann zu Virusfreiheit einiger Körpergewebe führen. Nicht selten persistiert das Virus jedoch in der Uvea, im ZNS, in Integumenten wie z.B. den Fußballen, selten auch in der Lunge (APPEL 1969; APPEL 1987; GREENE u. APPEL 1998).
2.1.5.1 Neurologische Form der Hundestaupe
Die Virusausbreitung in das ZNS beginnt etwa ab Tag 10 - 14 p.i. mit der Ausbreitung in epitheliales Gewebe. Es wird vermutet, dass antivirale Antikörper und daraus resultierende Immunkomplex-Ablagerungen die Verbreitung des Virus in das vaskuläre Endothelium des
ZNS durch Schädigung desselben erleichtern. Freies oder zellassoziiertes Virus kann so die Endothelzellen der meningealen Gefäße, die Epithelialzellen des Plexus chorioideus (Adergeflecht) des vierten Ventrikels, sowie die das ventrikuläre System auskleidenden Ependymzellen befallen (GREENE u. APPEL 1998). Das virale Antigen ist im ZNS zunächst im Endothel der Kapillaren und Venulen und den perivaskulären Ausläufern der Astrozyten (VANDEVELDE 1985; GREENE u. APPEL 1998) nachweisbar. Innerhalb des Epithels des Plexus chorioideus wird vermutlich während der gesamten Zeit der Infektion weiterhin Virus produziert und über die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) periventrikulär und subpial frei oder zellassoziiert verbreitet. Prädilektionsstellen für virale Veränderungen sind der Tractus opticus, das Kleinhirn und das Rückenmark (GREENE u. APPEL 1998).
Während der akuten Phase der CDV-Infektion kommt es vermutlich durch direkte virale Schädigung zu einer nicht-entzündlichen Demyelinisierung des ZNS (VANDEVELDE et al.
1982). Histologische Veränderungen befinden sich vor allem in der weißen Substanz. Diese sind durch virusinduzierte Schädigung des Myelins charakterisiert und gehen mit einer Virusreplikation innerhalb der Gliazellen einher (VANDEVELDE et al. 1985; GREENE u.
APPEL 1998). Der Grad der Myelinzerstörung korreliert mit der vorhandenen Virusmenge (VANDEVELDE et al. 1985). Gegenteilig zu der bisherigen Annahme, dass in den betroffenen Bereichen als Zeichen der Immunsuppression keinerlei lokale Immunantwort zu sehen ist (VANDEVELDE et al. 1982; GREENE u. APPEL 1998), konnten neuere Untersuchungen eine T-Zell Einwanderung in frühe demyelinisierte Läsionen und eine diffuse Aufregulation der T-Zellen innerhalb des gesamten ZNS nachweisen. Diese frühe, virusinduzierte T-Zell Antwort ist etwa zeitgleich mit dem Auftreten der ersten N-Protein spezifischen IgM-Antikörper feststellbar (TIPOLD et al. 1999).
Die im chronischen Stadium der Erkrankung auftretende CDV-Enzephalitis ist neben der Demyelinisierung durch massives Auftreten von perivaskulären Rundzellinfiltraten („perivaskuläres cuffing“), Infiltration des umgebenden Gewebes mit mononukleären Entzündungszellen, Astrozytenproliferation sowie Gliose gekennzeichnet (BOLLO et al.
1986; TIPOLD 1996) und geht aus der nichtentzündlichen Läsion hervor. Ursache dieser Entzündungsreaktion ist die infolge der nachlassenden Immunsuppression auftretende
antivirale Immunantwort (VANDEVELDE et al. 1982). Intrathekal gebildete Antikörper (VANDEVELDE et al. 1986) richten sich nicht nur gegen das Staupevirus, sondern auch gegen Myelinantigene. Zwar können Antikörper zu einer Virusfreiheit des Gehirns führen (VANDEVELDE et al. 1985), durch Virus-Antikörper-Komplexe aktivierte Makrophagen setzen jedoch Sauerstoffradikale frei und führen so ihrerseits zu einer Zerstörung der Oligodendrozyten bzw. des Myelin („bystander effect“) (BÜRGE et al. 1989; BOTTERON et al. 1992).
2.1.5.2 Symptome bei CDV-Infektionen
Dauer und Schweregrad einer Staupeerkrankung sind abhängig von dem beteiligten Virusstamm, Sekundärerregern, dem Alter und der individuellen Resistenzlage des betroffenen Tieres (APPEL 1969). Bei etwa zwei Dritteln der erkrankten Hunde werden eine biphasische Fieberkurve, Rhinitis, Konjunktivitis, Tonsillitis, Pharyngitis und Anorexie beobachtet. Neben den meist durch sekundäre Infektionen verstärkten gastrointestinalen (Diarrhoe/Vomitus) und respiratorischen (Dyspnoe/Pneumonie) Symptomen können Pyodermien, in einigen Fällen auch eine Keratokonjunktivitis sicca und Veränderungen des Augenhintergrundes diagnostiziert werden (APPEL 1987; TIPOLD 1996).
Neurologische Symptome können in Verbindung mit einer systemischen Erkrankung, aber auch isoliert auftreten und sind sehr unterschiedlich (APPEL 1987; TIPOLD 1996; GREENE u. APPEL 1998). Möglich sind Symptome im Sinne einer Großhirnläsion (Anfallsleiden, fehlender Drohreflex, verzögerte Propriozeption), Hirnstammläsion (Bewusstseinsstörungen, multiple Kopfnervenausfälle, Gangstörung, gestörte Propriozeption) oder auch einer Kleinhirnläsion (Ataxie mit Hypermetrie und Tremor). Häufig konnten zentral vestibuläre Störungen (Kopfschiefhaltung, Nystagmus, vestibuläre Ataxie, Kopfnerven- und Propriozeptionsausfälle), seltener solitäre Schädigungen des Nervus opticus (Blindheit, dilatierte Pupillen) beobachtet werden. Eine klinisch-pathologische Korrelation liegt oft nicht vor (TIPOLD 1996).
Hunde, die sich klinisch erholen, können einen lokalen Myoklonus zurückbehalten. Aber auch die sogenannte „Hard pad disease“, eine Hyperkeratose des Nasenspiegels und/oder des Fußballens, kann Zeichen einer Erkrankung sein. Welpen, die vor Durchbruch der permanenten Zähne an Staupe erkranken, können Zahnschmelzhypoplasien zurückbehalten (BITTEGKO 1995; GREENE u. APPEL 1998).
2.1.6 Immunantwort
Neutralisierende Antikörper treten etwa ab Tag 10-20 p.i. auf und erreichen schnell maximale Titer (APPEL 1969; APPEL 1987). Anfänglich kommt es vorwiegend zur Bildung von Antikörpern der IgM-Klasse, die im weiteren Verlauf der Infektion von Antikörpern der IgG- Klasse abgelöst werden (NOON et al. 1980; WINTERS et al. 1983; APPEL 1987). Die nach Vakzination mit einer modifizierten Lebendvakzine auftretenden IgM-Antikörper sind etwa 3- 4 Wochen lang nachweisbar (BLIXENKRONE-MØLLER et al. 1993). Infolge einer Infektion auftretende IgM-Klasse Antikörper sind über 5 Wochen bis zu 3 Monaten p.i. nachweisbar (APPEL 1987). Während einer persistierenden CDV-Infektion ist ein niedriger IgG Antikörpertiter zu finden (WINTERS et al. 1983). Aus diesen Tatsachen lassen sich Rückschlüsse für die Diagnostik ziehen: hohe IgM Antikörpertiter weisen auf eine kürzlich stattgefundene Infektion, bzw. Vakzination hin, hohe IgG-Titer auf Immunität infolge vorangegangener Infektion oder Immunisierung (NOON et al. 1980; BLIXENKRONE- MØLLER et al. 1993).
BARBEN et al. (1999) entwickelten einen Test, welcher die N-Protein spezifische IgM Antwort gegen CDV nachweist. Diese N-Protein spezifische Immunantwort tritt nur bei erkrankten Tieren und nicht bei geimpften Tieren (Revakzinierung) auf und ermöglicht somit im Gegensatz zu einer gepaarten Serumprobe eine schnelle Diagnostik (s. 2.2.2). Andere Untersucher (VON MESSLING et al. 1999) erkannten ebenfalls die Dominanz der N-Protein spezifischen Immunantwort erkrankter Hunde. Da der Nachweis N-spezifischer Antikörper noch möglich ist, wenn die H- und F-spezifischen (neutralisierenden) Antikörper bereits unter ihre Nachweisgrenze gefallen sind, wurde ein rekombinantes N-Protein verwendet, um einen
ELISA zum Nachweis von IgG- oder IgM-Klasse Antikörpern zu entwickeln. Vor allem der IgM-spezifische ELISA ist teilweise für die Diagnose einer akuten Staupeinfektion hilfreich (VON MESSLING et al. 1999).
Die zellvermittelte Immunantwort ist über zirkulierende, virusspezifische, zytotoxische T- Zellen ab Tag 10-14 p.i. mit einem Maximum an Tag 14-21 p.i. messbar (APPEL et al.
1982).
Die humorale Immunität bleibt im Gegensatz zu der zellvermittelten Immunität über Jahre hinweg erhalten. Hunde, die innerhalb von 2-4 Wochen p.i. sterben, haben in der Regel keine oder nur äußerst niedrige Titer neutralisierender Antikörper. Auch die zellvermittelte Immunantwort, welcher für die Elimination des Virus eine entscheidende Bedeutung beigemessen wird, ist nicht vorhanden bzw. setzt nur verzögert ein (APPEL 1987; GREENE u. APPEL 1998). Nur eine humorale und T-Zell-vermittelte Immunantwort (Zytotoxizität) führen gemeinsam zu einer effektiven Bekämpfung der Infektion (APPEL et al. 1982).
2.1.7 Diagnose
Die klinische Untersuchung eines erkrankten Hundes führt nur selten zu einer fundierten Diagnose. Zumeist ist aufgrund der großen Bandbreite der Symptome nur eine Verdachtsdiagnose möglich (MORITZ et al. 1998). Besonders während der akuten Phase einer Staupeinfektion kann im Blutbild eine Lymphopenie eventuell in Verbindung mit einer Leukopenie oder aber auch mit einer Leukozytose und Linksverschiebung (chronische Infektion) diagnostiziert werden. Monozytose, Anämie oder Thrombozytopenie sind nur selten auftretende Blutbildabweichungen (TIPOLD 1996; GREENE u. APPEL 1998). Die Veränderungen im Differentialblutbild sind nicht nur Folge der Virusinfektion, sondern zumeist auch Ausdruck einer gleichzeitig bestehenden Sekundärinfektion. Aus diesem Grund ist das Differentialblutbild nur in Kombination mit anderen Testverfahren aussagekräftig (MORITZ et al. 1998).
Bei unklarer Symptomatik eines erkrankten Tieres, bzw. bei begründeter Verdachtsdiagnose
„Staupe“, bedarf es zur Absicherung der ätiologischen Diagnose eines direkten Virusnachweises (MORITZ et al. 1998). Während der Virämie können virale Einschlusskörperchen innerhalb der Leukozyten nach Färbung eines Blutausstriches sichtbar werden (GREENE u. APPEL 1998), der Nachweis von Virusantigen ist jedoch auch mittels mono- oder polyklonaler Antikörper in Abklatschpräparaten (z.B. Konjunktivalabstrich) oder Blutausstrichen möglich. Eine größere Sicherheit wird durch den Nachweis virusspezifischer Nukleinsäuren im Vollblut durch die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT- PCR) ermöglicht (MORITZ et al. 1998).
Bei der neurologischen Verlaufsform der Staupe zeigt die Liquoruntersuchung während der akuten Phase kaum Abweichungen von der Norm. Selten wird eine geringgradige Pleozytose diagnostiziert, das Zellbild ist rein mononukleär. Bei der chronischen Form der Hundestaupe kann eine meist mononukleäre Pleozytose oder ein erhöhter Proteingehalt, gemeinsam oder als Einzelbefunde, diagnostiziert werden. Der Virusnachweis ist bei ausreichender Zellausbeute aus dem Liquor mittels der indirekten Immunfluoreszenz (TIPOLD 1996), der Nachweis der Staupevirus-Nukleinsäure mit Hilfe der RT-PCR möglich (MORITZ et al.
1998).
2.2 DNS-Vakzine
2.2.1 Gründe für die Entwicklung einer DNS-Vakzine bei Hundestaupe
Die ersten gegen Hundestaupe gerichteten Impfstoffe wurden aus inaktiviertem CDV hergestellt, waren jedoch nicht in der Lage die Ausbreitung der Krankheit zu kontrollieren (APPEL et al. 1984; APPEL u. SUMMERS 1995). Erst die seit den 50er Jahren erhältlichen modifizierten Lebendvakzinen konnten Neuinfektionen drastisch reduzieren. Zwei dieser Vakzinen sind noch heute gebräuchlich (APPEL und SUMMERS 1995), so der Hühnerembryo-, später Hühnerzell-adaptierte CDV-Stamm Onderstepoort aus Südafrika (HAIG 1956) und ein zuerst in Schweden (ROCKBORN 1959) beschriebener Hundezell-
adaptierter CDV-Stamm. Zwar induziert der Hundezell-adaptierte Stamm eine bessere Immunität, konnte jedoch in einigen Fällen als Auslöser einer postvakzinalen Enzephalitis nachgewiesen werden (HARTLEY 1974; CORNWELL et al. 1988; APPEL u. SUMMERS 1995). Weiterhin besteht bei diesem Impfstamm eine größere Gefahr der Rückmutation (APPEL 1987) und es konnten Todesfälle, bzw. Staupeausbrüche, innerhalb diverser für CDV empfänglicher Wildtierarten (z.B. Graufuchs, Schwarzfuß Frettchen oder Kleiner Panda) auf den Einsatz des Hundezell-adaptierten CDV Impfstammes zurückgeführt werden. Aber auch die Ei-adaptierte CDV-Vakzine kann für verschiedene Spezies fatal sein (APPEL u.
SUMMERS 1995; GREENE u. APPEL 1998).
Neben den modifizierten Lebendvakzinen wurde die heterotypische Masern-Vakzine, kombinierte Vakzinen oder auch eine ISCOM-Vakzine (immunstimulatorische Komplexe) als Möglichkeiten zur Verbesserung des Impfschutzes getestet. Die Vakzination mit dem Masernvirus (MV) war ein Versuch, die bei Welpen durch maternale Antikörper auftretende Neutralisation der Vakzine zu verhindern. Das Masernvirus wird nicht durch maternale CDV- Antikörper neutralisiert, schützt jedoch nur vor dem klinischen Ausbruch der Erkrankung, nicht aber vor einer Infektion (APPEL et al. 1984; CHAPPUIS 1995). Auch eine Kombination aus abgeschwächtem MV und CDV brachte nicht den erhofften Erfolg (CHAPPUIS 1995). Die immunstimulatorischen Komplexe (ISCOMs) sind kleine aus dem Detergens Quil A bestehende Micellen. Sie sind in der Lage Antigene in das Zytosol der Zelle zu bringen und können neben der humoralen Immunantwort eine zytotoxische T-Zell Antwort erzeugen (DE VRIES et al. 1988; JANEWAY u. TRAVERS 1995). Die von DE VRIES et al.
(1988) durchgeführten Untersuchungen zeigten nicht nur einen protektiven Erfolg dieser CDV-Komplexe, sondern ebenfalls die Notwendigkeit, mehrere Virusproteine in einer derartigen Vakzine zu vereinen, um nicht nur vor dem Ausbruch der Erkrankung, sondern auch vor der Infektion schützen zu können.
Seit den 80er Jahren kommt es nicht nur in Europa trotz Immunisierung immer wieder zu Staupeausbrüchen durch klassisches CDV (BLIXENKRONE-MØLLER 1993; GEMMA 1996; TIPOLD 1996). Eine Erklärung derartiger Ausbrüche kann eine nachlassende Impfmoral unter Hundebesitzern sein (APPEL u. SUMMERS 1995). Da jedoch nicht nur
ungeimpfte Tiere von diesen Ausbrüchen betroffen sind, ist eine andere Vermutung sehr viel wahrscheinlicher. Diese spricht für eine inkomplette Immunisierung als Folge von Aminosäuresequenz-Unterschieden zwischen Impfstämmen und Wildtypvirus. IWATSUKI et al. (2000) zeigten deutliche Unterschiede zwischen den H-Proteinen verschiedener heutiger japanischer CDV-Feldisolate und dem Impfstamm, bzw. einem 1977 isolierten CDV-Stamm.
Die Unterschiede traten in einer mit der Neutralisation in Beziehung stehenden antigenetischen Region des Proteins auf. Auch in anderen Untersuchungen (BLIXENKRONE-MØLLER 1993; HARDER et al. 1996; BOLT et al. 1997; IWATSUKI et al. 1997) wurde der antigenetische und phylogenetische Unterschied zwischen Feldisolaten und Impfstämmen als hauptsächlicher Mechanismus für die steigende Anzahl an Impfdurchbrüchen gesehen (IWATSUKI et al. 2000). Für das N-Protein konnten ebenfalls Unterschiede zwischen den Nukleotiden und daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen des virulenten A75/17 CDV-Stammes und eines attenuierten Vakzine-Stammes nachgewiesen werden (STETTLER u. ZURBRIGGEN 1995).
Aufgrund der weltweiten Verbreitung und großen Vielfalt empfänglicher Spezies ist die Ausrottung des CDV so gut wie unmöglich geworden. Bekämpfungsstrategien müssen also auf eine Verbesserung der Impfung sowohl für Haus-, als auch für Wild-, und Zootiere hinauslaufen (APPEL 1987; BARRETT 1999). Eine vielversprechende Möglichkeit ist der Einsatz neuer Impfstrategien, bzw. Technologien, wie z.B. eine DNS-Vakzine (CHAPPUIS 1995).
2.2.2 Hundestaupe DNS-Vakzine
Die genetische Immunisierung wurde zunächst bei der Maus anhand des Grippevirus getestet und führte dort zu guten Ergebnissen. Für die DNS-Vakzine wird eine Plasmid-DNS, die ein Immunogen codiert, z.B. ins Muskelgewebe injiziert. Die DNS wird in unterschiedlichen Zellen (u.a. Muskelzellen und antigenpräsentierende Zellen) als Protein exprimiert, was zu einer Antikörperreaktion und der Entwicklung zytotoxischer T-Zellen führt. Für die Ausbildung der T-Zell Antwort sind vor allem dendritische Zellen und andere
antigenpräsentierende Zellen verantwortlich. Eine spätere Infektion durch vollständige Viren kann so erfolgreich bekämpft werden. Vorteil der DNS-Vakzine ist vor allem ihre große Sicherheit, da bei der Herstellung nur ein bestimmtes Epitop des Wildtypstammes, nicht jedoch ein infektiöses Agens eingesetzt wird (ULMER et al. 1993; JANEWAY u. TRAVERS 1995). Bei Einsatz eines hoch konservierten Virus-Proteins kann eine derartige Vakzine, trotz antigenetischer Veränderungen im Bereich der Hüllproteine des Feldvirus, erfolgreich vor einer Infektion mit diesem schützen (ULMER et al. 1993).
Die Forschung wurde seit dem Erfolg von ULMER et al. (1993) stark vorangetrieben und auch in Bezug auf das CDV konnte eine DNS-Vakzine erfolgreich in der Maus getestet werden (SIXT et al. 1998). CHERPILLOD et al. (2000) entwickelten eine Staupe-DNS- Vakzine, welche Plasmide mit dem N (Nukleokapsid)-, F (Fusion)- und H (Hämagglutinin)- Gen eines virulenten CDV-Stammes enthält. Eine erste Belastungsinfektion hat die Wirksamkeit dieser Vakzine bereits bewiesen.
Verschiedene Untersucher zeigten, dass nur Tiere, die auch Antikörper gegen die Hüllproteine F und H der Morbilliviren bilden, in der Lage sind, eine virale Infektion (systemisch und/oder zentralnerval) erfolgreich abzuwehren (MERZ et al. 1981; GREENE u. APPEL 1998; SIXT et al. 1998). Weiterhin scheinen zirkulierende IgG Antikörper gegen das H-Glykoprotein, den Ausbruch einer ZNS-Infektion verhindern zu können (RIMA et al. 1991). Das H- und das F- Protein sind also unbedingte Bestandteile einer effektiven Vakzine. Die für die schützende Wirkung gegen eine Challenge-Infektion mit CDV (mausadaptiert) bei der Maus durchaus ausreichende Expression dieser beiden Proteine (SIXT et al. 1998), scheint beim Hund nicht ausreichend zu sein (CHERPILLOD et al. 2000). Da CDV infizierte Hunde eine frühe Immunantwort (IgM) gegen das N-Protein entwickeln (TIPOLD et al. 1999) und dieses wenigstens ein T-Zell Epitop besitzt (BEAUVERGER et al. 1993; TIPOLD et al. 1999), wurde das N-Protein zusätzlich zu dem H und dem F Protein in die Vakzine integriert. Ein weiterer Grund für die Einbeziehung dieses Proteins war die Tatsache, dass das N-Protein das während der Virusreplikation am meisten produzierte virale Antigen ist (BARBEN et al.
1999) und die stärkste Immunantwort bei allen Morbillivirusinfektionen hervorruft (VON MESSLING et al. 1999).
Abb. 1: Schematische Darstellung eines Morbillivirions.
Dargestellt ist die Lage der Nukleokapsid-, Haemagglutinin- und Fusionsproteine, sowie die vorwiegend gegen sie gerichteten Abwehrmechanismen des Immunsystems (CTL = zytotoxische T-Zellen; neutr. Ab
= neutralisierende Antikörper).
Die mit der von CHERPILLOD et al. (2000) hergestellten DNS-Vakzine geimpften Hunde entwickelten nach der Revakzination, bzw. nach der Infektion mit dem virulenten Virus neutralisierende Antikörper. Eine T-Zell Antwort war bei den im Vorfeld mit der Vakzine immunisierten Mäusen deutlich messbar, konnte jedoch aufgrund technischer Probleme bei der Durchführung eines Lymphozytenproliferationstests bzw. eines Zytotoxizitätstestes (CTL) in den immunisierten Hunden nicht untersucht werden. Das virulente Virus, abgetötetes virulentes Virus, sowie einige Gewebekultur-adaptierte Stämme hatten die kultivierten Lymphozyten abgetötet (TIPOLD 2000)2.
2 Persönliche Mitteilung Frühjahr 2000
2.3 Lymphozytenproliferationstest 2.3.1 Grundlagen
Lymphozyten werden durch die Bindung von präsentiertem Antigen an spezifische Rezeptoren, sowie durch costimulierende Signale aktiviert. Nach ihrer Umwandlung in Lymphoblasten durchlaufen sie eine klonale Expansion mittels wiederholter Zellteilung. Die so gebildeten Zellen werden zu Effektorzellen ausdifferenziert, welche entweder Antikörper sezernieren (B-Zellen) oder infizierte Zellen zerstören bzw. andere Zellen des Immunsystems aktivieren (T-Zellen) (JANEWAY u. TRAVERS 1995).
Nachdem bis jetzt noch keine zelluläre Immunantwort nach Staupe-DNS-Vakzinierung beim Hund gemessen werden konnte, sollte der Einsatz eines Lymphozytenproliferationstestes neue Erkenntnisse bringen. Der dabei gewählte Ansatz führte zu der Entwicklung einer alternativen Methode zu den herkömmlichen Lymphozytenproliferationstests. Diese arbeiten größtenteils mit radioaktiven Markern, d.h. als Zeichen des Zellwachstums wird der Einbau von 3H- Thymidin in die zelluläre DNS gemessen. Hierfür werden die Zellen unter Zusatz eines Mediums mit oder ohne Mitogen kultiviert, nach 48-72 Stunden wird 3H-Thymidin zugegeben und nach einer weiteren Inkubationszeit (6-18 Stunden: KRISTENSEN et al.
1982b; ECKELS et al. 1999; WAGNER et al. 1999) werden die Zellen geerntet und der Einbau des 3H-Thymidin in die DNS gemessen. Mit beginnender DNS Synthese ist ein Größenwachstum der Zellen zu beobachten. Die DNS Synthese nimmt jedoch im Verlauf der Kultivierung ab, obwohl weiterhin proliferierende bzw. sich teilende Lymphozyten vorhanden sind. Es kann also eine Diskrepanz zwischen 3H-Thymidin Einbau und der Proliferationsrate der Lymphozyten auftreten (SHU et al. 1978). KRISTENSEN et al. (1982a) zeigten eine starke Variation des nach PHA-Stimulation gemessenen 3H-Thymidin Einbaus in periphere Blut-Lymphozyten (PBL, Peripheral blood lymphocytes) des Hundes, sowie im Gegensatz zu den Ergebnissen mit PBL`s anderer Tierarten, insgesamt eher unbefriedigende Resultate.
Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Interpretation eines Lymphozytenproliferationstests auf alleiniger Basis der 3H-Thymidin Inkorporation zu falschen, bzw. ungenauen Ergebnissen führen kann (KRISTENSEN et al. 1982b; MARMER et al. 1983). Als Ursache wurde die
Produktion von „kaltem“ Thymidin durch in der Kultur enthaltene Makrophagen vermutet (KRISTENSEN et al. 1982b), aber auch eine kompetitive Hemmung der 3H-Thymidin Aufnahme durch andere in der Zellkultur enthaltene Substanzen ist möglich (MARMER et al.
1983). Obgleich diese Probleme in den letzten Jahren größtenteils durch Verbesserung und Standardisierung der Zellkulturen beseitigt werden konnten und auch mit caninen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (canine PBMC`s) in der radioaktiven Messung gute Ergebnisse erzielt werden (DANIEL et al. 1990; TIPOLD et al. 1996), liegen heute auftretende Nachteile in der Methode selbst. So sind teure Spezialgeräte für die Messung des in die DNS eingebauten 3H-Thymidin nötig und bei jeder Messung fällt radioaktiver Abfall an. Weiterhin sind die erzielten Ergebnisse von der spezifischen Aktivität und der Menge des eingesetzten 3H-Thymidin, aber auch von der Länge der Inkubationszeit nach 3H-Thymidin Zugabe abhängig. Diese Tatsachen machen es nur schwer möglich, die Ergebnisse zweier Arbeitsgruppen zu vergleichen, und so sind in der Humanmedizin sowie für die Messung von Nagerzellen bereits nicht-radioaktive Alternativen auf der Basis von kolorimetrischen Methoden etabliert worden (WAGNER et al. 1999).
Ein von WAGNER et al. (1999) durchgeführter Vergleich des radioaktiven 3H-Thymidin- Tests mit drei verschiedenen kolorimetrischen Methoden zeigte, dass der 5-Bromo- Deoxyuridin (BrdU) Test eine geeignete nicht-radioaktive Alternative zum Nachweis der Blastogenese caniner Lymphozyten ist. Hierbei wird das BrdU anstelle des Thymidins in neu synthetisierte DNS eingebaut und anhand eines BrdU-Antikörpers nachgewiesen. Der Test konnte sich jedoch für den Hund nicht durchsetzen, da die Unterscheidung zwischen in die Apoptose eintretende Zellen und Zellen, die weiterhin proliferieren, nicht zuverlässig möglich ist (LEIBOLD)3. Eine Aussage über die Funktionsfähigkeit der Zellen kann also nicht auf alleiniger Basis dieses Tests getroffen werden.
Durch die Aktivierung der Lymphozyten treten diese in den Zellzyklus ein, wodurch es zu einer starken Vergrößerung des Zellvolumens und zur Verdopplung des DNS-Gehaltes in der Zelle kommt. Die Gesamtheit der mit diesem Prozess einhergehenden Veränderungen wird auch als blastische Transformation bezeichnet (SHU et al. 1978; KRISTENSEN et al. 1982a;
3 Persönliche Mitteilung Winter 1999
JANEWAY u. TRAVERS 1995). Wie bereits beschrieben (s. 2.3.1), können diese Zellaktivierungsvorgänge z.B. radiometrisch gemessen werden. Aber auch morphologische Veränderungen der Zellen (erhöhtes Zellvolumen) als Antwort auf eine in vitro Stimulation finden bereits seit längerem Anwendung und wurden als sichere und reproduzierbare Alternative zur 3H-Thymidin Inkorporation beschrieben (SHU et al. 1978; BEGARA et al.
1995).
2.3.2 Lymphozytenproliferation nach Zugabe von PHA
Phytohämagglutinin (PHA, Lektin aus Phaseolus vulgaris) ist in der Lage als sogenanntes polyklonales Mitogen bei Lymphozyten unterschiedlicher Spezifität eine Mitose auszulösen.
Diese können so auf die Fähigkeit, auf unspezifische Reize reagieren zu können, überprüft werden. Auch für canine mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC`s) hat sich der Einsatz von PHA als Positivkontrolle bei Lymphozytenproliferationstests durchgesetzt (KRISTENSEN et al. 1982a; JANEWAY u. TRAVERS 1995). Bei verschiedenen Untersuchungen konnte eine herabgesetzte Reaktionsfähigkeit von Lymphozyten an Staupe erkrankter Hunde beim Einsatz von PHA festgestellt werden (KRAKOWKA et al. 1975;
KRAKOWKA u. KOESTNER 1977; KRAKOWKA et al. 1980; KRISTENSEN et al. 1982a;
VANDEVELDE et al. 1982).
KRAKOWKA et al. (1975) beschrieben eine herabgesetzte zelluläre Immunantwort auf den Einsatz von Mitogenen in Zellkulturen CDV-infizierter, gnotobiotischer Hunde. Diese war unabhängig vom Schweregrad der Erkrankung. Die Immunsuppression trat mit Beginn der Lymphopenie und Virämie auf, blieb jedoch auch nach Normalisierung des Blutbildes bestehen. Bei fatal infizierten Tieren kehrte die zelluläre Immunantwort nicht mehr zurück.
Auch bei vakzinierten Tieren konnte eine vorübergehend herabgesetzte zelluläre Immunantwort als Folge einer Challenge-Infektion nachgewiesen werden (KRAKOWKA et al. 1980). Das nah verwandte Masernvirus erzeugt in vitro ebenfalls eine herabgesetzte zelluläre Immunantwort auf den Einsatz von Mitogenen. Es konnte gezeigt werden, dass
dieses Phänomen von der Expression der Oberflächenglykoproteine H und F abhängig ist (NIEWIESK et al. 1997).
2.3.3 Antigenspezifische Lymphozytenproliferation
Antigene werden neben den Mitogenen schon seit längerem erfolgreich für die Überprüfung der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation eingesetzt. Sie sind nicht nur hilfreich, um die Fähigkeit der Lymphozyten auf Antigene reagieren zu können, zu überprüfen, sondern auch um potentielle Krankheitsverursacher zu studieren (TIPOLD et al. 1996). Zusätzlich kann die Grundlagenforschung im Bereich der Immunologie und Erkrankungen des Immunsystems vorangetrieben (SCHUBERTH et al. 1996; POITOUT et al. 1997) oder die Wirksamkeit einer vakzineinduzierten Immunität getestet werden (HAN et al. 1999). Auch bei der Entwicklung neuer Trägerproteine z.B. für niedrig immunogene Peptide, bzw. der Untersuchung von T-Zell Epitopen rekombinanter Proteine finden sie Einsatz (HAEUW et al.
1998). Erst in den letzten Jahren werden derartige Proliferationstests nicht mehr nur mittels des 3H-Thymidin Einbaus in die zelluläre DNS, sondern auch in der Durchflusszytometrie durch Messung der Größenzunahme der Lymphozyten durchgeführt.
SCHARSACK et al. (2000) führten eine Untersuchung der Aktivierung peripherer Blut- Leukozyten des Karpfens durch und konnten eine hohe Korrelation zwischen den mit der radioaktiven Methode (3H-Thymidin Inkorporation) und den in der Durchflusszytometrie (Größenzuwachs der Zellen) erzielten Ergebnissen aufzeigen. Die Beurteilung der Blastogenese nach Lymphozytenstimulation, z.B. nach Zugabe von Superantigenen, wird beim Rind schon länger mit guten Ergebnissen in der Durchflusszytometrie durchgeführt.
Auch hier konnte eine hohe Korrelation mit der Messung der 3H-Thymidin Inkorporation nachgewiesen werden (LANGE 1995; HENDRICKS 1998). Für das Schwein zeigte sich beim Vergleich der Durchflusszytometrie und einem auf dem BrdU Einbau in die DNS basierenden ELISA–System, dass in der Durchflusszytometrie qualitativ und quantitativ differenziertere Aussagen über die Blastogenese, die Proliferation und den Zelltod möglich sind (FREIGOFAS 1999). SCHUBERTH et al. (1996) führte Proliferationstests mittels der
Durchflusszytometrie durch, um monoklonale Antikörper (mAk) zu charakterisieren und deren Bindung an durch verschiedene Antigene stimulierte Zellen zu überprüfen. Die beim Hund durchgeführte durchflusszytometrische Prüfung mAk an in vitro stimulierten Zellen fand unter Zugabe von Mitogenen statt, zeigte aber auch hier das Potential der Durchflusszytometrie in der Darstellung der Lymphozytenaktivierung (BEER 1998). Die Durchflusszytometrie ist somit in der Funktionsprüfung verschiedenster Zellpopulationen durchaus etabliert.
ECKELS et al. (1999) entwickelten einen Proliferationstest, um die T-Zell Antwort von Hepatitis C Virus positiven Menschen auf ein nicht-strukturelles rekombinantes Protein (NS3) des Virus zu testen. Hierzu wurden PBMC`s erkrankter Patienten mit verschiedenen Konzentrationen des Proteins stimuliert. Die proliferative Antwort wurde über die 3H- Thymidin Inkorporation, der Anteil bzw. der Typ der proliferierenden Zellen in der Durchflusszytometrie gemessen. Dieser Ansatz wurde Grundlage für den in dieser Studie entwickelten Lymphozytenproliferationstest.
Wie bereits beschrieben (s. 2.2.2), wurde das N-Protein in die DNS-Vakzine mit einbezogen, da CDV infizierte Hunde eine frühe und sehr starke Immunantwort gegen das N-Protein (TIPOLD et al. 1999; VON MESSLING et al. 1999) entwickelten. Das Protein besitzt wenigstens ein T-Zell Epitop (BEAUVERGER et al. 1993; TIPOLD et al. 1999) und ist das während der Virusreplikation am meisten produzierte virale Antigen (BARBEN et al. 1999).
Daher wurde das N-Protein für den Einsatz im Lymphozytenproliferationstest und somit zum Nachweis CDV-spezifischer Lymphozytenproliferation ausgewählt. Bereits bei der Entwicklung anderer DNS-Vakzinen wurden virale Proteine erfolgreich zur Überprüfung der zellvermittelten Immunität in Lymphozytenproliferationstests eingesetzt. Der Nachweis der Proliferation fand jedoch mittels der 3H-Thymidin Inkorporation statt (ENCKE et al. 1998;
ELAHI et al. 1999; HAN et al. 1999; REDDY et al. 1999).
2.3.4 Interleukin-2-Rezeptor
Die Funktion von Interleukin-2 (IL-2) ist bei vielen Spezies in sehr weiten Bereichen erforscht. Es dient, vermittelt über den IL-2-Rezeptor (IL-2-R), als Wachstums-, Differenzierungs- und Aktivierungs-Stimulus für T-Zellen (SOMBERG et al. 1992) und wird von durch Mitogene (z.B. PHA) oder Antigene stimulierten T-Zellen gebildet. Das Lymphokin (Polypeptid, 15kDa; HELFAND et al. 1992) spielt durch Stimulation der Lymphozytenproliferation und Anregung zur Bildung anderer Zytokine, wie z.B. Interferon γ (INFγ), eine zentrale Rolle in der Regulation der zellvermittelten Immunität (MIZUNO et al.
1996). Zusätzlich ist IL-2 autoregulatorisch an der Expression des eigenen Rezeptors beteiligt (WAKASUGI et al. 1985). Aber auch PHA ist in der Lage die Expression des IL-2-R zu stimulieren (MIZUNO et al. 1996). Dieser Rezeptor besitzt eine hohe Affinität für IL-2 und besteht aus einer α-, einer β- sowie einer γ-Kette (SOMBERG et al. 1992; JANEWAY u.
TRAVERS 1995).
SOMBERG et al. (1992) überprüften die Verwendbarkeit eines humanen, rekombinanten, mit Phycoerythrin konjugierten IL-2 (rhIL-2-PE) zum Nachweis des caninen Interleukin-2- Rezeptors (IL-2-R) in der Durchflusszytometrie. Da canine T-Zellen bei Zugabe von humanem IL-2 proliferieren, wurde eine Interaktion zwischen caninem IL-2-R und humanem IL-2 vermutet (FENWICK et al. 1988). Der von SOMBERG et al. (1992) beschriebene hochgradige Anstieg der IL-2-R positiven Zellen nach PHA-Stimulation und die höhere Rezeptordichte auf diesen Zellen im Gegensatz zu ruhenden PBMC`s, zeigte deutlich die Einsatzmöglichkeit des rhIL-2 für die Untersuchung der Lymphozytenproliferation beim Hund.
2.3.5 Differenzierungsantigene
Untersuchungen von Lymphozytenpopulationen zeigten bestimmte Kombinationen von Oberflächenproteinen (ursprünglich Differenzierungsantigene genannt), welche Lymphozyten mit unterscheidbaren Funktionen kennzeichneten. Gruppen monoklonaler Antikörper, die
dieselben Zelloberflächenmoleküle erkennen, definieren sogenannte Differenzierungscluster (clusters of differentiation, CD). Diese Differenzierungscluster wurden willkürlich numeriert und bilden die Grundlage für die Nomenklatur der lymphozytischen Zelloberflächenantigene (JANEWAY u. TRAVERS 1995). Bis vor einigen Jahren standen für die Untersuchungen des caninen Immunsystems nur humane oder murine monoklonale Antikörper (mAK) zur Verfügung. In den letzten Jahren wurden jedoch vermehrt mAk gegen Hunde Leukozyten- Oberflächenantigene entwickelt, und die Spezifität und Charakterisierung vieler dieser Antikörper wurde im ersten internationalen Workshop über canine Leukozyten-Antigene (siehe COBBOLD u. METCALFE 1994) definiert (RABANAL et al. 1995). Bei Hunde- spezifischen Differenzierungsclustern wird der entsprechenden Bezeichnung ein „ca“ für canine vorangestellt (z.B. caCD 3). Die in dieser Studie verwendeten Differenzierungscluster werden im Folgenden kurz erläutert (siehe auch Material und Methoden 3.1.6).
2.3.5.1 CD 3
CD 3 ist die kollektive Bezeichnung für eine Reihe von Proteinen, die als Signalvermittler mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR) assoziiert sind und für dessen Oberflächenexpression nötig sind.
Diese Glykoproteine (16-28 kDa) sind nur auf T-Zellen zu finden (JANEWAY u. TRAVERS 1995; TIZARD 2000). Der CD 3-Komplex besteht vor allem aus den drei Proteinen CD3γ, CD3δ und CD3ε. Diese weisen eine schwache Aminosäurehomologie mit Immunglobulindomänen auf und besitzen kleine zytoplasmatische Domänen. Zwei weitere an der Bildung des CD 3-Komplexes beteiligte Proteine sind ζ und η. Weder die ζ- noch die η- Polypeptide ragen weit aus der Zelle heraus, die Hauptanteile dieser Proteine liegen im Zytoplasma. Beide Ketten besitzen identische Aminosäuren in ihren extrazellulären und transmembranen Domänen, ihre zytoplasmatischen Ausläufer unterscheiden sich jedoch. Die γ-, δ- und ε-Ketten kommen als Monomere, die ζ- und η-Ketten als ζζ Homodimere oder als ζη Heterodimere vor. Besonders wichtig für die Signalübertragung über Tyrosinkinasen sind die zytoplasmatischen Domänen der ζ- und der CD 3ε-Kette (ABBAS et al. 1994;
JANEWAY u. TRAVERS 1995, 1997). In dieser Studie wurden die extrazellulären Anteile des CD 3-Komplexes gemessen.
2.3.5.2 CD 4
CD 4 ist ein spezifischer Co-Rezeptor für MHC-Klasse-II-Moleküle. Er ist vor allem an der Antigenerkennung durch T-Helferzellen beteiligt. Das Glykoprotein (59 kDa) ist auf T- Helferzellen (TH2) und inflammatorischen T-Zellen (TH1), Thymozyten und beim Hund auch auf Granulozyten zu finden (COBBOLD u. METCALFE 1994; JANEWAY u. TRAVERS 1995; TIZARD 2000). Monozyten und Makrophagen sind beim Hund anders als beim Menschen caCD 4 negativ (MOORE et al. 1992; COBBOLD u. METCALFE 1994).
2.3.5.3 CD 8
Bei diesem Glykoprotein (32 kDa) handelt es sich um einen MHC-Klasse-I-Molekül spezifischen Co-Rezeptor auf zytotoxischen T-Zellen (etwa ein Drittel der peripheren T- Zellen). Es besteht aus α- und β-Ketten, die durch eine Disulfidbrücke kovalent verbunden sind. Die α- und β-Ketten enthalten eine immunglobulinähnliche Domäne, welche durch eine Polypeptidkette mit der Zellmembran verknüpft ist. Das αβ Heterodimer ist hauptsächlich an der Erkennung endogener Antigene (Viren und einige Bakterien) durch zytotoxische T-Zellen beteiligt (COBBOLD u. METCALFE 1994; JANEWAY u. TRAVERS 1995; TIZARD 2000). Auf großen granulären Lymphozyten bzw. auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) können auch CD 8α-Homodimere exprimiert werden (COBBOLD u. METCALFE 1994;
JANEWAY u. TRAVERS 1995). In dieser Studie wurde CD 8α gemessen.
2.3.5.4 CD 14
CD 14 (55kDa) findet sich auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten. Das Protein ist ein Rezeptor für den Komplex aus Lipopolysaccharid und lipopolysaccharid-bindendem Protein (LBP) und ist zu großen Teilen an der Regulation der biologischen Aktivität des LBP beteiligt (JANEWAY u. TRAVERS 1995; TIZARD 2000).
2.3.5.5 CD 21
Bei diesem Glykoprotein (145 kDa) handelt es sich um einen Rezeptor für die Komplementkomponente C3d. Zu finden ist CD 21 (auch als CR2 bezeichnet) auf B-Zellen, aber auch auf einigen wenigen T-Zellen und dendritischen Zellen. Seine verschiedenen Liganden umfassen auch CD 19 und CD 23, die hauptsächliche Aufgabe liegt in der Regulation der B-Zell Antwort (COBBOLD u. METCALFE 1994; JANEWAY u. TRAVERS 1995; TIZARD 2000).
2.3.5.6 CD 44
CD 44 ist ein 90 kDa Glykoprotein, welches in großen Mengen auf T- und B-Zellen, Monozyten, Granulozyten und vielen anderen Zellen wie Epithelialzellen exprimiert wird. CD 44 bindet Hyaluronsäure, vermittelt die Adhäsion der Leukozyten an vaskuläres Endothel und ist an intra- und extrazellulären Vorgängen durch Interaktionen zwischen Proteinen des Zytoskeletts und der zellulären Oberfläche beteiligt. Während der frühen Aktivierungsphase der T-Zellen ist eine Aufregulation von CD 44 feststellbar (HAYNES et al. 1989; COBBOLD u. METCALFE 1994; JANEWAY u. TRAVERS 1995; TIZARD 2000). ALLDINGER et al.
(2000) konnten eine Aufregulation von CD 44 in akuten, vor allem jedoch in subakuten demyelinisierten ZNS Läsionen an Staupe erkrankter Hunde nachweisen. Desweiteren konnte die Expression dieses Oberflächenmoleküls auf Astrozyten nachgewiesen werden. CD 44 scheint durch die Induktion von Chemokinen und Zytokinen an den Prozessen der frühen Demyelinisierung beteiligt zu sein, im weiteren Verlauf der ZNS Schädigung ist das Oberflächenmolekül vermutlich als Aktivitätsmarker der einwandernden Entzündungszellen tätig.
2.3.5.7 CD 69
Das Homodimer CD 69 (ca. 25 kDa), auch als frühes Aktivierungsantigen bezeichnet, ist auf aktivierten T- und B-Zellen, aktivierten Makrophagen, natürlichen Killerzellen, aber auch auf Thrombozyten zu finden (COBBOLD u. METCALFE 1994; JANEWAY u. TRAVERS 1995;
HUTCHINSON et al. 1999). Die Funktion der CD 69 Expression ist noch ungeklärt, es konnten noch keine spezifischen Liganden identifiziert werden (HUTCHINSON et al. 1999).
2.3.6 Weitere in dieser Studie verwendete mAk 2.3.6.1 MHC-I
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) wird von einer Gruppe von Genen gebildet, welche für die MHC-Moleküle I und II codieren. Der MHC-Komplex beeinflusst die Antigenerkennung durch T-Zellen, die Entwicklung der T- Zellen, die Abstoßung von übertragenem Gewebe und die Anfälligkeit für viele immunologische Erkrankungen. Die MHC-Klasse-I-Moleküle präsentieren den CD8-T-Zellen Peptide, welche im Zytosol aus Antigenen abgespalten wurden. Bei diesen Antigenen handelt es sich um Krankheitserreger, die sich im Zytosol vermehren, d.h. vor allem Viren und einige Bakterienarten. MHC-I ist ein Heterodimer, welches aus einer α-Polypeptidkette besteht, die nicht kovalent mit einer weiteren Polypeptidkette, dem β2-Mikroglobulin, assoziiert ist.
MHC-Klasse-I-Moleküle werden auf fast allen kernhaltigen Zellen exprimiert, am höchsten ist die Expression in hämatopoetischen Zellen (JANEWAY u. TRAVERS 1995). Eine Ausnahme bilden ausdifferenzierte Neuronen, auf welchen MHC-Klasse-I-Moleküle nicht exprimiert werden (ADA 1995).
Einige der erhältlichen MHC-I mAk binden neben dem MHC-I an ein weiteres Molekül, das CD 1, wodurch die spezifische Erkennung des MHC-I-Moleküls erschwert werden kann. Das CD 1 (Heterodimer, 49/12 kDa) ist ein MHC-Klasse-I-ähnliches Molekül, welches eine besondere Bedeutung bei der Antigenpräsentation von Lipiden und Glykolipiden hat. Es kommt auf Thymozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen und auf einigen B-Zellen vor, und ist mit dem β2-Mikroglobulin assoziiert (JANEWAY u. TRAVERS 1995; TIZARD 2000).
2.3.6.2 T-Zell-Rezeptor αααα/ββββ
Der T-Zell-Rezeptor α/β (TCRα/β) ist ein Heterodimer aus je einer hochvariablen α- und β- Kette, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden und im Komplex mit den CD3 Ketten in die Zellmembran eingelagert sind. Diese Rezeptoren sind in der Lage auf spezifische MHC-präsentierte Antigene zu reagieren und werden durch verschiedene Co-Rezeptoren (CD 4 und CD 8 s. 2.3.5.2 u. 2.3.5.3) unterstützt (JANEWAY u. TRAVERS 1995).
2.3.7 Spezifische Lymphozytenproliferation beim Hund und Staupe-DNS-Vakzine
Der im vorhergehenden erläuterte Stand der Forschung im Hinblick auf den Einsatz neuer Impfstrategien und deren Wirkungsweise, sowie die Untersuchung der antigenspezifischen zellulären Immunantwort, war Ausgangspunkt für die Entwicklung eines nicht-radioaktiven Lymphozytenproliferationstestes. Der Test sollte im Rahmen einer DNS-Vakzine Studie eingesetzt werden, in deren Verlauf eine Challenge-Infektion mit virulentem Staupevirus durchgeführt werden sollte. Nachdem bis jetzt noch keine zelluläre Immunantwort nach Staupe-DNS-Vakzinierung beim Hund gemessen werden konnte, sollte der Einsatz des neu entwickelten Tests Erkenntnisse auf diesem Gebiet bringen. Neben der staupespezifischen Lymphozytenproliferation nach Vakzinierung sollte die nähere Charakterisierung der Immunantwort von nicht-immunisierten und mit Staupe infizierten Hunden im Vordergrund stehen. Von dem Einsatz des Lymphozytenproliferationstests bei diesen erkrankten Tieren wurden Erkenntnisse über die virusinduzierte zelluläre Immunsuppression erwartet.
