Beobachtungen während des Vakzine-Versuches

Für den DNS-Vakzine-Versuch wurden 20 SPF-Hunde in vier Versuchsgruppen mit jeweils 5 Hunden unterteilt. Drei Gruppen wurden mit 50, 100 oder 200µg DNS-Vakzine je Plasmid intramuskulär immunisiert. Zusätzlich wurden alle Hunde inklusive der Kontrollhunde mit polyvalenten, konventionellen Impfkomponenten (Canines Adenovirus Typ 1 u. 2 [inaktiviert], Parainfluenzavirus Typ 2 [inaktiviert] sowie Leptospira [L. canicola, L.

icterohaemorrhagiae; attenuierte Lebendvakzine]) und einer Parvovirus DNS-Vakzine (JIANG et al. 1998) inokuliert (s. 3.2.1). Vier Wochen nach der ersten Immunisierung wurden alle Hunde einmalig revakziniert und nach weiteren vier Wochen einer Belastungsinfektion mit virulentem Staupevirus unterzogen. Die nach der Belastungsinfektion durchgeführten Untersuchungen (s. 4.2) deuteten auf eine klinische Erkrankung aller Versuchshunde hin. Ab Tag drei nach Challenge-Infektion hatten alle Hunde unterschiedlich schwerwiegende Symptome einer Staupeerkrankung gezeigt. Leitsymptome waren Fieber, Inappetenz und katarrhalische Entzündungen der oberen Luftwege. Zusätzlich wurde eine hochgradige Lymphopenie (s. 4.2.1.2) gesehen. Sowohl die klinischen Befunde als auch die Ausbildung der Lymphopenie und der Grad der Pleozytose in der Zerebrospinalflüssigkeit (s. 4.2.1.4) korrelierten vor allem bei den schwer erkrankten Hunden (immunisierte Hunde: 1, 2, 7; nicht immunisierte Hunde: 15, 17, 19 und 20) deutlich mit dem Prozentsatz Staupevirus-positiver Lymphozyten (s. 4.2.1.3). Aufgrund der histopathologischen Befunde konnte eine Einteilung in Hunde ohne Staupeläsionen und Hunde mit gering-, mittel- oder hochgradigen Staupeläsionen erfolgen (s. 4.2.1.5). Der Vergleich dieser Einteilung mit der Zugehörigkeit der einzelnen Hunde zu den vier Versuchsgruppen (50µg, 100µg und 200µg DNS-Vakzine sowie Kontrollgruppe) bestätigte die Vermutung, dass ein Großteil der geimpften Hunde klinisch einen partiellen Schutz gegen das Staupevirus über die Impfung aufgebaut hatte. In Gruppe I (keine staupebedingte Läsionen) konnten Hunde aus den drei vakzinierten Gruppen

eingestuft werden, in Gruppe II (geringgradige staupebedingte Läsionen) wurden, bis auf Hund 18 aus der Kontrollgruppe, ebenfalls nur vakzinierte Tiere eingestuft. In Gruppe III (mittelgradige staupebedingte Läsionen) wurde je ein Hund aus den drei vakzinierten Gruppen sowie Hund 20 aus der Gruppe der Kontrollhunde eingestuft. Bei den histopathologisch in die Gruppe IV (hochgradige staupebedingte Läsionen) eingeteilten Hunden handelte es sich ausschließlich um nicht-immunisierte Tiere. Die geimpften Hunde zeigten somit eine Erholung nach anfänglich systemischer Staupeerkrankung. Dies deutet an, dass ein partieller Schutz vor der Infektion durch eine vorangegangene, derzeit nicht messbare Immunantwort gegeben war. Zwar war die T-Zell Antwort nicht messbar, die Ausbildung einer Immunantwort zeigte sich jedoch deutlich in der Bildung von neutralisierenden Antikörpern. Erstmalig waren diese Antikörper an Tag 6 nach der zweiten Immunisierung nachweisbar und stiegen nach der Challenge-Infektion auf das bis zu 16fache der Ausgangswerte an. Die nicht-immunisierten Kontrollhunde hingegen blieben während des gesamten Versuches im Virusneutralisationstest negativ (ZURBRIGGEN 2000)⁵. Ein Hund der nicht-immunisierten Kontrollgruppe (Hd. 18) erholte sich im Verlauf der Beobachtungszeit ebenfalls sehr gut und wurde histopathologisch als nur geringgradig erkrankt eingestuft. Dies ist kein erstaunlicher Befund, da aus früheren experimentellen Staupeversuchen bekannt ist, dass Einzeltiere wahrscheinlich aus genetisch bedingten Gründen genesen können (TIPOLD et al. 1999). Bei den geimpften Hunden war das Zahlenverhältnis umgekehrt: jeweils ein Hund (Hd. 1, 2, 7) aus jeder Impfgruppe erkrankte schwerer als die anderen vier Hunde derselben Impfgruppe.

Die infolge histopathologischer Gesichtspunkte vorgenommene Einteilung korrelierte mit den Befunden der Virusfärbung von Lymphozyten des peripheren Blutes. Hunde der Gruppen III und IV hatten den stärksten Virusbefall der Lymphozyten gezeigt und bei der histopathologischen Beurteilung des ZNS zeigten nur Hunde dieser Gruppen klassische Befunde einer nervalen Form der Hundestaupe. Neben einem Zusammenhang zwischen klinischen Symptomen, histopathologisch erhobenen Befunden und Virusbefall der Lymphozyten war auch die Anzahl der Lymphozyten per se an der Entwicklung der staupebedingten Läsionen beteiligt. Es bestand für die am Tag der Euthanasie der einzelnen

5 Persönliche Mitteilung, Resultate nicht gezeigt.

Hunde erhobenen Werte ein signifikanter Unterschied (p <0,05) zwischen der eher milden T-Zell Depletion bei Hunden die histopathologisch keine Befunde aufwiesen und solchen mit mittel- bis hochgradigen staupebedingten Läsionen (s. 4.2.2.1).

Die DNS-Vakzine wurde nicht wie bei einem ersten Vakzine-Versuch (CHERPILLOD et al.

2000) einzeln, sondern in Kombination mit konventionellen Impfkomponenten verabreicht (s.

oben). Es stellte sich heraus, dass es durch die Mischung der verschiedenen Komponenten zu einer Verunreinigung mit DNAsen und infolge dessen zu einer teilweisen Zerstörung der DNS-Vakzine gekommen war. Dies konnte nach Ende des Versuches im Southern Blot nachgewiesen werden (ZURBRIGGEN 2000)⁶. Nachdem die Hunde also nicht die angestrebte Dosierung von 50, 100 oder 200µg DNS-Vakzine erhalten hatten, sondern eine je nach Zerstörung durch die DNAsen entsprechend geringere Dosierung bzw. unvollständige Komponenten, waren die immunisierten Hunde nur partiell gegen eine Belastungsinfektion geschützt. Dies zeigte sich zum einen in den oben beschriebenen klinischen Befunden, zum anderen auch in der Messung der Leukozyten-Oberflächenantigene (s. unten). Zwar konnte während des Versuches kein dosisabhängiger Effekt der Vakzine nachgewiesen werden, im Vergleich der immunisierten zu den nicht-immunisierten Kontrolltieren wurde jedoch eine unterschiedlich stark ausgeprägte Immunsuppression deutlich.

Bei allen Hunden war eine Lymphopenie festgestellt worden und daher auch eine Abnahme der mit spezifischen T- und B-Zellmarkern gekennzeichneten Zellen. Für die Auswertung dieser Marker wurde die infolge der histopathologischen Befunde durchgeführte Einteilung (s.

4.2.1.5) in Hunde ohne Befund bzw. mit gering-, mittel- oder hochgradig ausgeprägten staupebedingten Läsionen (Gruppe I-IV) verwendet. Dadurch sollte eine bessere Charakterisierung der systemischen Immunantwort bei unterschiedlich starker klinischer und histopathologischer Ausprägung der Staupeläsionen ermöglicht werden, um dem Phänomen der frühen T-Zell Antwort im ZNS nachgehen zu können. Bei allen Hunden war an Tag 3 p.i.

ein unterschiedlich starker Rückgang der T-Zellen (CD 3, CD 4, CD 8α), weniger der B-Zellen (CD 21), zu beobachten (s. 4.2.2). Bei den Hunden der Gruppen III und IV konnte keine Erholung der Lymphozytenwerte mehr beobachtet werden. In Gruppe I und II war eine

6 Persönliche Mitteilung, Resultate nicht gezeigt.

deutliche Erholung der Werte feststellbar, wenngleich die Ausgangswerte bis zum Ende der Beobachtungszeit nicht mehr erreicht wurden. Bei einem Vergleich der am Tag der Euthanasie für CD 4 erhobenen Werte konnte ein signifikanter Unterschied (p <0,05) zwischen den Hunden ohne histopathologisch nachgewiesene Staupeläsionen gegenüber Hunden mit gering- bis hochgradigen staupebedingten Läsionen gezeigt werden. Für CD 3 war ein signifikanter Unterschied zwischen den Hunden ohne staupebedingte Läsionen und den Hunden mit mittel- bis hochgradigen staupebedingten Läsionen nachweisbar, für CD 8α nur beim Vergleich der Gruppe I zu den Hunden mit hochgradigen staupebedingten Läsionen (Gruppe IV). Es konnte somit in vorliegender Arbeit gezeigt bzw. bestätigt werden, dass es vorwiegend zu einer Depletion CD 4 positiver Lymphozyten kommt. Das Verhältnis CD 4:

CD 8α war nach der Belastungsinfektion deutlich erhöht (s. 4.2.2.1.1). Aus technischen Gründen war es bedauerlicherweise nicht möglich eine Doppelfärbung der CD 4 bzw. CD 8 positiven Lymphozyten mit einer Virusfärbung durchzuführen. Die unterschiedlichen Färbemethoden ließen dies nicht zu. IWATSUKI et al. (1995) konnten jedoch bereits in Lymphknoten zeigen, dass vor allem CD 4 positive Zellen virusinfiziert sind. Ein Zusammenhang zwischen der Depletion vorwiegend CD 4 positiver Zellen und dem Virusbefall dieser Zellpopulation wäre durchaus möglich .

Der für die Oberflächenmarker CD 3, CD 4 und CD 8α gezeigte Verlauf der Werte konnte so auch für den relativen prozentualen Anteil MHC-I Rezeptor positiver Lymphozyten nachgewiesen werden. Die mittlere Fluoreszenzintensität zeigte jedoch keine relevanten Unterschiede zwischen den Hunden der Gruppen I-IV, eine tendenzielle Erhöhung der MHC-I Expression während des Versuchsverlaufs war bei allen Gruppen zu beobachten und spricht dafür, dass Virusantigen auch präsentiert wird.

Die Aufregulation der mittleren Fluoreszenzintensität CD 44 positiver Zellen konnte bei allen Hunden, besonders deutlich jedoch in den Gruppen III und IV beobachtet werden (s. 4.2.2.3).

Damit konnte zum einen eine Aktivierung der Zellen nachgewiesen werden, zum anderen bestätigen diese Befunde die von ALLDINGER et al. (2000) gemachten Beobachtungen (s.

5.2.1). Bei den Hunden, bei denen die stärkste Aufregulation der CD 44 positiven Zellen nachgewiesen wurde, konnte zum Zeitpunkt der Euthanasie der Befund einer nervalen Staupe

bzw. einer Pleozytose im Liquor zerebrospinalis erhoben werden (Gruppe III u. IV). Dies spricht dafür, dass CD 44 auch beim Hund ein Aktivitätsmarker der in das ZNS einwandernden Entzündungszellen ist bzw. die Aufregulation dieses Rezeptors auf den Zellen die Einwanderung der Leukozyten in das ZNS unterstützt oder erst möglich werden lässt. Je nach Stärke der Aufregulation dieses Markers auf den mononukleären Zellen des peripheren Blutes könnten somit bei staupekranken Hunden prognostische Aussagen für den Verlauf dieser Erkrankung möglich werden. Dafür sind jedoch sicherlich weitere Studien nötig.

Die insgesamt sehr niedrige Expression von CD 69 stieg kurzfristig und geringgradig im Verlauf der bis zum Tag 17 p.i. durchgeführten Messungen an (s. 4.2.2.4). Aufgrund der niedrigen Expressionsrate ist die Aussagekraft dieses frühen Aktivitätsmarkers für diese Studie jedoch fraglich und der Marker wurde nicht für die weitere Bewertung der Immunantwort herangezogen. Er unterstützt jedoch die Befunde, die mit der Färbung von CD 44 und IL-2-R gemacht wurden. RUTELLA et al. (1999) stellten in ihrer Studie an humanen peripheren Blut-Lymphozyten fest, dass es sich bei den CD 69 positiven T-Lymphozyten um eine sehr heterogene Zellpopulation handelt, bei der nicht geklärt ist, ob sie im weiteren Verlauf proliferiert oder aber apoptotisch wird. Weiterhin konnten sie so gut wie kein CD 69 auf ruhenden CD 4 und CD 8 positiven Zellen nachweisen. Auch HUTCHINSON et al.

(1999) stellte den Nutzen der CD 69 Messung zur Bestimmung der T-Zell Kompetenz in Frage.

Die Messung des IL-2-R (s. 4.2.2.6) ergab vor der ersten Immunisierung (Mittelwert aller vier Gruppen 21,2 %), vor allem im Vergleich zu den Ergebnissen nach der ersten (4,6 %) aber auch nach der zweiten Immunisierung (12,3 %), relativ hohe Werte. Es ist fraglich, ob es aufgrund des geringen Alters der Tiere (10 Wochen) bei der ersten Blutentnahme zu den relativ hohen Werten gekommen ist oder ob die nach der ersten Immunisierung erhobenen niedrigen Werte als impfbedingt anzusehen sind. HULSTAERT et al. (1994) beschrieben für humane Blut-Lymphozyten eine Altersabhängigkeit der IL-2-R Expression. So wurde ein Anstieg des Prozentsatzes IL-2-R positiver Zellen, bei sich ändernden absoluten Zellzahlen, von der Kindheit bis ins Erwachsenenalter beobachtet. SOMBERG et al. (1992) gaben in ihrer Studie für ruhende, nicht aktivierte Zellen einen durchschnittlichen Wert von 21 % IL-2-R

positiver Lymphozyten an. Dies würde für eine impfbedingte Suppression der IL-2-R Expression nach der ersten Immunisierung sprechen. Andererseits beobachteten HELFAND et al. (1992) in ihrer Studie, dass die Bindung von IL-2 an ruhende Blut-Lymphozyten unbedeutend ist. Dies würde wiederum dafür sprechen, dass der relativ hohe Prozentsatz IL-2-R positiver Lymphozyten vor der ersten Immunisierung doch altersbedingt war oder aber durch eine Aktivierung der Lymphozyten hervorgerufen wurde. Bei den Hunden handelte es sich um SPF-Hunde, die etwa zwei Wochen vor der ersten Blutentnahme in das Versuchslabor verbracht wurden. Mögliche Ursache für eine eventuelle Aktivierung der Lymphozyten könnte also der Kontakt mit einer für die Hunde „neuen“ Keimflora gewesen sein. Trotz dieser vor der Challenge-Infektion aufgetretenen und nicht abschließend beurteilbaren stark schwankenden Werte konnte p.i. bei deutlicher Lymphopenie ein Anstieg IL-2-R positiver Lymphozyten und damit eine Aktivierung der T-Lymphozyten beobachtet werden. Die geringste Zunahme IL-2-R positiver Lymphozyten wurde in Übereinstimmung mit der aufgetretenen Lymphopenie bei den Hunden der Gruppe IV beobachtet. Eine an Tag drei p.i. bei allen Hunden nachgewiesene Zunahme der mittleren Fluoreszenzintensität war vor allem bei den Hunden der Gruppe III stark ausgeprägt. Diese Befunde sprechen dafür, dass es zu einer in vivo Aktivierung der Lymphozyten aller Hunde nach der Challenge-Infektion gekommen ist. Obwohl ein starker Schwund der Lymphozyten aus dem peripheren Blut vorlag, wurde ein Teil der verbliebenen Lymphozyten ausreichend aktiviert. Dies vor allem bei den geimpften Hunden, die eine rasche Erholung der klinischen Symptome aufwiesen und histopathologisch keine Staupeläsionen mehr zeigten. Eine Aktivierung des IL-2-R scheint also zur Erholung von staupekranken Hunden beizutragen.

5.2.3 Lymphozytenproliferationstest

Vor der ersten Immunisierung der Hunde, nach der ersten und der zweiten Immunisierung sowie an Tag 3 und 6 nach Challenge-Infektion wurden Lymphozytenproliferationstests mit frisch isolierten caninen PBMC`s angesetzt (s. 3.2.6). Die durchflusszytometrische Messung der Zellen fand an Tag 5 und 8 der Inkubation statt. Der vor der ersten Immunisierung angesetzte Proliferationstest wurde nur an Tag 8 der Inkubation geerntet. Die Hunde waren zu diesem Zeitpunkt 10 Wochen alt und wogen weniger als 3 kg, wodurch die Menge des zu

gewinnenden Blutes und damit der PBMC`s sehr eingeschränkt war. Die zweimalig im Abstand von vier Wochen immunisierten Hunde zeigten zu keinem Zeitpunkt eine eindeutige staupespezifische (Nukleokapsidprotein) Stimulation der Lymphozyten, insgesamt eher niedrige Proliferationsraten nach PHA-Zugabe und eine deutliche Immunsuppression nach der Challenge-Infektion.

Bei der ersten Blutentnahme könnte die Ursache für die niedrigen Proliferationsraten nach PHA-Zugabe im Alter der Hunde zu suchen sein. So stellten GERBER u. BROWN (1974) eine altersabhängige proliferative Antwort inkubierter T-Lymphozyten unter PHA-Zugabe fest. Es konnte eine signifikant höhere Proliferationsrate bei Hunden im Alter von 6-12 Wochen gegenüber unter 4 Wochen alten Hunden beobachtet werden. Die höchsten Proliferationsraten waren im Alter von 6 Wochen bis 6 Monaten nachweisbar, wobei sehr große Standardabweichungen als Ausdruck individueller Schwankungen beobachtet wurden.

Auch bei den zum Zeitpunkt der ersten Blutentnahme 10 Wochen alten Hunden der DNS-Vakzine-Studie waren starke individuelle Schwankungen der Lymphozytenproliferation nach PHA-Zugabe zu beobachten (s. 4.2.3.1.1). KRAKOWKA u. KOESTNER (1976) beobachteten ebenfalls eine Altersabhängigkeit der Lymphozytenproliferation nach PHA-Zugabe. Diese zeigte sich jedoch vor allem bei unter einer Woche alten Hunden.

KRISTENSEN et al. (1982b) beschrieben außerdem, dass anscheinend auch die Blutentnahme bei durch äußere Einflüsse (z.B. Lärm) verängstigten Tieren zu einer verminderten Mitogen-induzierten Proliferation führen kann.

Nach der zweiten Vakzinierung war, im Verhältnis zu dem nach der ersten Immunisierung durchgeführten Proliferationstest, anhand der herabregulierten zellulären Immunantwort nach PHA-Zugabe eine geringgradige Immunsuppression zu beobachten. Gemessen wurde dies über die Interleukin-2-Rezeptor Expression (s. 4.2.3.1.3) sowie die Expression von CD 4 (s.

4.2.3.2.1) in der Durchflusszytometrie. Diese Immunsuppression war vermutlich impfbedingt.

SEREDA et al. (1999) wiesen beispielsweise bei konventionell gegen Staupe geimpften Welpen (Impfstoff: Vanguard 5/L) einen bis zu zwei Wochen nach Immunisierung anhaltenden immunsuppressiven Effekt auf Lymphozyten nach. Auch nach einer Röteln-Impfung konnte an kultivierten humanen PBMC`s eine herabgesetzte proliferative Antwort

nach PHA-Zugabe beobachtet werden (ARNEBORN et al. 1982). Da alle Hunde gleichermaßen eine herabregulierte zelluläre Immunantwort aufwiesen und die nicht mit DNS-Vakzine immunisierten Hunde genau wie die immunisierten Hunde mit den konventionellen polyvalenten Impfstoffen (s. 3.2.1) geimpft worden waren, wurde vermutet, dass es sich auch in diesem Fall um eine impfbedingte Immunsuppression handeln könnte.

Technische Probleme wurden weitgehend ausgeschlossen, da dieselben Zellen an Tag 8 eine gute Antwort auf PHA gezeigt hatten.

Die an Tag drei und sechs nach Belastungsinfektion der immunisierten Hunde mit einem virulenten Staupevirus angesetzten Proliferationstests zeigten eine hochgradig herabgesetzte zelluläre Immunantwort. Diese wurde vor allem in der mit PHA durchgeführten Positivkontrolle deutlich. Sowohl die Expression des Interleukin-2-Rezeptors (s. 4.2.3.1.4 u.

4.2.3.1.5), als auch die CD 4 Expression (s. 4.2.3.3.2) waren stark herabgesetzt. Diese Ergebnisse spiegeln die von allen Hunden durchgemachte Staupeinfektion wieder und bestätigen die durch andere Untersucher beschriebene staupebedingte zelluläre Immunsuppression. Diese war vor allem über eine herabgesetzte Reaktionsfähigkeit von Lymphozyten unter Zusatz von PHA nachgewiesen worden (KRAKOWKA et al. 1975;

KRAKOWKA u. KOESTNER 1977; KRAKOWKA et al. 1980; KRISTENSEN et al. 1982a;

VANDEVELDE et al. 1982). KRAKOWKA et al. (1980) konnten zudem auch für konventionell geimpfte Hunde nach Inokulation mit virulentem Staupevirus einen Verlust sowohl der in vivo (Intrakutantest), als auch der in vitro Immunantwort auf PHA bis zu 21 Tage p.i. nachweisen. Auch in einem Langzeitversuch mit einer rekombinanten Vakzine gegen das nah verwandte Rinderpestvirus konnte als Folge der Belastungsinfektion bei geimpften Tieren eine Immunsuppression durch Messung der Mitogen-induzierten Lymphozytenproliferation nachgewiesen werden. Diese hielt trotz Impfschutz bis zu 14 Tagen p.i. an (OHISHI et al. 2000). Somit ist die Ursache der herabgesetzten zellulären Immunität zum einen in dem nur partiellen Impfschutz zu sehen, zum anderen kann nicht ausgeschlossen werden, dass entsprechend der in den erwähnten Untersuchungen gemachten Beobachtungen 14 Tage p.i. eine proliferative Reaktion messbar gewesen wäre. Der Versuchsaufbau ließ jedoch zu Beginn einen kompletten Impfschutz der Hunde erwarten und da sich Tag drei und Tag sechs p.i. während des ersten Versuches (CHERPILLOD et al.

2000) als besonders geeignet zum Nachweis einer DNS-Vakzine induzierten Immunität herausgestellt hatten, wurden die nach der Challenge-Infektion angesetzten Tests auch nur an diesen beiden Tagen durchgeführt.

Tendenziell waren die vier histopathologisch unterscheidbaren Gruppen (Hunde ohne Befund und gering-, mittel- oder hochgradige staupebedingte Läsionen) nach der Challenge-Infektion auch durch die Messung der IL-2-R Expression nach PHA-Zugabe zu unterscheiden. In der Gruppe, die zum Zeitpunkt der Euthanasie keine staupebedingte Läsionen aufwies (Gruppe I) konnte zwar im Verhältnis zu den anderen drei Gruppen die höchste Rate IL-2-R positiver Lymphozyten nach PHA-Zugabe durchflusszytometrisch gemessen werden, statistisch signifikant waren diese Ergebnisse jedoch nicht. Mögliche Ursache dieses Phänomens kann der bei den untersuchten Hunden nur partiell ausgeprägte Impfschutz sein, jedoch machten andere Autoren ähnliche Beobachtungen. In dem bereits erwähnten Langzeitversuch nach Immunisierung von Rindern mit einer rekombinanten Vakzine gegen das Rinderpestvirus von OHISHI et al. (2000) konnte vor der Belastungsinfektion ebenfalls keine virusspezifische Lymphozytenproliferation gezeigt werden. Auch nach der Belastungsinfektion konnte an den Lymphozyten der komplett oder partiell geschützten Tiere erst nach 14 bis 21 Tagen p.i. eine signifikante virusspezifische Proliferation gezeigt werden. Wie bereits erwähnt wurde erwartet, dass die CD 4 positiven Zellen eine antigenspezifische Proliferation zeigen. Auch HAN et al. (1999) erwarteten nach DNS-Vakzinierung vorwiegend eine über CD 4 positive T-Zellen, weniger über CD 8 positive Zellen, vermittelte Immunantwort. Durch den infektionsbedingten Abfall und die Funktionsbeeinträchtigung vorwiegend CD 4 positiver Zellen konnte die erwartete antigenspezifische Proliferation in diesem Versuch nicht nachgewiesen werden. Im peripheren Blut der Hunde war es zu einem hochgradigen Abfall der CD 4 positiven Zellen gekommen und die Lebensfähigkeit der ex vivo gewonnenen Zellen war von 98 % auf 70 % abgesunken. Dementsprechend wurden keine bzw. nur eine sehr geringe Anzahl CD 4 positiver Zellen in Kultur gesetzt und die erwartete Proliferation musste ausbleiben. Dies wird auch durch die von MOORE et al. (1992) gemachte Beobachtung bestätigt, dass eine Depletion CD 4 positiver Zellen unter gleichzeitiger Zunahme CD 8 positiver Zellen mit einer herabgesetzten proliferativen Antwort auf den Zusatz von Mitogenen oder Alloantigenen korreliert.

5.3 Bedeutung der im Vakzine-Versuch erhobenen Befunde für den Lymphozytenproliferationstest sowie die DNS-Vakzine

Die Funktionsfähigkeit des Lymphozytenproliferationstestes konnte also während des Vakzine-Versuches zum einen anhand der Zunahme IL-2-R positiver Lymphozyten nach PHA-Zugabe, zum anderen anhand der nach Zugabe des rekombinanten Campylobacter rectus Proteins gemessenen Proliferation nachgewiesen werden. Zwar konnte Campylobacter rectus nicht als negative Proliferationskontrolle eingesetzt werden, nachdem ein Befall der Hunde mit spiraligen Bakterien nachgewiesen wurde und eine Kreuzreaktion mit diesen nicht auszuschließen war, die proliferative Antwort der Lymphozyten auf dieses Protein zeigte jedoch deutlich die Einsatzfähigkeit des Tests. Die antigenspezifische Lymphozytenproliferation konnte infolge des teilweise hochgradigen Virusbefalles der Lymphozyten sowie der damit einhergehenden Funktionsstörung der Zellen nicht nachgewiesen werden. Diese Tatsache bestätigte einige durch andere Untersucher gemachte Beobachtungen. Die besondere Affinität des Virus zu Lymphozyten ist bereits seit längerem bekannt (KRAKOWKA et al. 1980) und auch die vorwiegende Depletion von T-Zellen in Lymphknoten wurde bereits in einigen Bereichen erforscht (IWATSUKI et al. 1995;

WÜNSCHMANN et al. 2000). Vermutlich wird die Ausbreitung des Virus im Körper durch die Depletion der T-Zellen und die daraus folgende mangelhafte Immunantwort erleichtert.

Während des Vakzine-Versuches konnte bei den partiell durch die Immunisierung geschützten Hunden nachgewiesen werden, dass neutralisierende Antikörper produziert werden. Die viral bedingte Funktionsstörung der T-Zellen, die durch die mangelhafte Proliferation nach PHA-Zugabe verdeutlicht wurde, konnte somit nicht bei B-Zellen nachgewiesen werden. Paradox ist die Tatsache, dass trotz ausgeprägter T-Zell-Suppression

Während des Vakzine-Versuches konnte bei den partiell durch die Immunisierung geschützten Hunden nachgewiesen werden, dass neutralisierende Antikörper produziert werden. Die viral bedingte Funktionsstörung der T-Zellen, die durch die mangelhafte Proliferation nach PHA-Zugabe verdeutlicht wurde, konnte somit nicht bei B-Zellen nachgewiesen werden. Paradox ist die Tatsache, dass trotz ausgeprägter T-Zell-Suppression