Gewinnung und Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Blut .1 Blutentnahme

Die Blutentnahme wurde durch Punktion der gestauten Vena cephalica antebrachii durchgeführt, das Blut wurde in EDTA-Blutröhrchen (s. 3.1.8.2) möglichst kontaminationsfrei aufgefangen und bis zur weiteren Verarbeitung bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die erste Blutentnahme fand vor der ersten Immunisierung statt, zwei weitere folgten nach der ersten und zweiten Immunisierung. Nach der Challenge-Infektion wurde wie unter 3.2.2 beschrieben zweimal wöchentlich eine Blutentnahme durchgeführt.

3.2.3.2 Blutuntersuchung

Die Blutuntersuchung umfasste die Zählung der weißen und roten Blutkörperchen und die Differenzierung der weißen Blutzellen aus dem gerinnungsgehemmten Blut (Methode siehe BAUMGARTNER 1999). Die Auszählung der Leukozyten wurde nach Blutverdünnung mit Türkscher Lösung (s. 3.1.8.3) in der Zellzählkammer nach Türk (s. 3.1.8.1) durchgeführt, die Differenzierung der Leukozyten in einem mit Diff-Quick (s. 3.1.8.3) gefärbten Blutausstrich.

3.2.3.3 Isolierung der mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC)

Um eine optimale Zellausbeute zu gewährleisten, wird die Isolation der mononukleären Zellen bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Aus diesem Grunde sollten auch die verwendeten Reagenzien wie die Hanks’ balanced salt solution (HBSS), das Pancoll 1.077 und das Histopaque 1.119 (s. 3.1.8.3) Raumtemperatur haben. Die besten Isolationsergebnisse werden bei sofortiger Separation nach Blutentnahme erreicht. In dieser Studie wurde die von SOMBERG et al. (1992) modifizierte Methode nach WUNDERLI u. FELSBURG (1989) angewandt und weiter modifiziert. Statt des Hypaque-Ficoll 1.066 wurde Pancoll 1.077 verwendet.

Das Blut wird unter der sterilen Werkbank (s. 3.1.8.1) in ein 15 ml fassendes, steriles Zentrifugenröhrchen (s. 3.1.8.2) gefüllt, 1:1 mit HBSS verdünnt und vorsichtig durch wiederholtes Aufziehen in einer Pipette (s. 3.1.8.2) mit diesem vermischt. In ein weiteres 15 ml fassendes, steriles Zentrifugenröhrchen (eines für jeweils 10 ml verdünntes Blut) wird nun erst 2 ml Histopaque 1.119 vorgelegt und dieses vorsichtig tropfenweise mit 2 ml Pancoll 1.077 überschichtet. Anschließend werden wieder tropfenweise 10 ml des verdünnten Blutes über das Pancoll 1.077 geschichtet. Das Röhrchen wird bei 1500 rpm (revolutions per minute, Umdrehungen pro Minute) für 35 min bei Raumtemperatur ( 20°C ) zentrifugiert.

Die Plasma- und Blutplättchen-enthaltende oberste Schicht des Röhrcheninhaltes wird abpipettiert und verworfen. Nun wird mit Hilfe einer 1 ml Pipette (oder sterilen Pasteur Pipette) das, in der Interphase zwischen der Plasmaschicht und der durch Pancoll 1.077

gebildeten Schicht befindliche, Lymphozytenband abgenommen. Dieses besteht nicht nur aus Lymphozyten, sondern auch aus anderen mononukleären Zellen und Thrombozyten. Die in der 1.077/1.119-Interphase befindlichen Granulozyten, sowie die unter dem Histopaque 1.119 auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens liegenden Erythrozyten werden verworfen. Die mononukleären Zellen werden in ein weiteres steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt, vorsichtig mit 10 ml HBSS vermischt und bei 750 rpm 10 min bei RT zentrifugiert, um kontaminierende Blutplättchen zu entfernen. Der Überstand wird abpipettiert, bzw.

abgeschüttet und das Zellpellet erneut mit 10 ml HBSS resuspendiert und bei 1000 rpm über 5 min zentrifugiert. Wenn nötig wird dieser Schritt wiederholt. Zuletzt wird der Überstand erneut abpipettiert und das Zellpellet in einem Zehntel der originären Blutmenge mit Kulturmedium (s. 3.1.8.4.2) resuspendiert.

3.2.3.4 Zellzahlbestimmung

Zehn µl der bei der Isolation der mononukleären Zellen erhaltenen Zellsuspension (s. 3.2.3.3) werden 1:10 mit Trypanblau (s. 3.1.8.3) verdünnt, gut durchmischt und kurz bei Raumtemperatur inkubiert. Nun wird eine Türk-Zählkammer mit dieser Mischung befüllt, die Zellen werden mikroskopisch unter Berücksichtigung der toten Zellen ausgezählt und die Zellsuspension zum Erzielen der gewünschten Konzentration von 5 × 10⁵ lebende Zellen/ml mit Zellkulturmedium (s. 3.1.8.4.2) eingestellt.

3.2.4 Durchflusszytometrie

3.2.4.1 Markieren der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen

Zum Nachweis von Zelloberflächenantigenen wird die indirekte Membranimmunfluoreszenz eingesetzt. Diese beruht auf der Markierung eines bereits an der Zelle gebundenen Antikörpers (Primärantikörper) durch einen mit einem Fluorochrom gekoppelten zweiten Antikörper (Sekundärantikörper).

Das Markieren der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen wurde wie bereits beschrieben durchgeführt (TIPOLD et al. 1998). Die über die Dichtegradienten isolierten mononukleären

Zellen werden zu je 50 µl/Well mit etwa 5 × 10⁵ Zellen (bei geringerer Zellausbeute entsprechend weniger Zellen) in 96-Loch-Rundboden-Mikrotiterplatten (s. 3.1.8.2) pipettiert.

Der Fc-Rezeptor wird durch die Zugabe von 10 mg/ml humanem IgG (1:16 Verdünnung; s.

3.1.6) blockiert und es werden jeweils 10 µl (CD3, CD4, CD8α, TCR α/β und CD21), 5µl (CD44, CD69) bzw. 3µl (MHC-I) der primären Antikörper (s. 3.1.6) in das entsprechende Well pipettiert. Die Zellen werden für 30 Minuten bei 4°C inkubiert und anschließend wird nicht gebundener primärer Antikörper weggewaschen. Dies geschieht mit 200 µl Waschlösung (MIF-Puffer, s. 3.1.8.4.1) pro Well. Nach Zugabe dieses Waschpuffers werden die Zellen in der Mikrotiterplatte über 2 Min. bei 2000 rpm und 4°C (5′ 500g 4°C) zentrifugiert und der Überstand durch kurzes, einmaliges Ausschlagen der Mikrotiterplatte verworfen. Das Waschen wird wiederholt und der sekundäre mit PE konjugierte Antikörper (s. 3.1.6) in einer Verdünnung von 1:100 und einer Menge von 50 µl pro well zu den resuspendierten Zellen hinzugegeben. Der direkt PE konjugierte CD 14 Antikörper (10µl/well) wird erst in diesem Schritt in das entsprechende Well pipettiert. Die Zellen werden erneut für 30 Minuten bei 4°C inkubiert und nach zweimaligem Waschen (siehe oben) wird das Zellpellet in 0,1 ml (100 µl) FACSFlow^ (Sheath, s. 3.1.8.3) resuspendiert, in Falcon-Röhrchen (s. 3.1.8.2) überpipettiert und mit 100-400µl (je nach Zelldichte) Sheath verdünnt. Die Röhrchen können bis zur Messung bei 4°C über wenige Stunden gelagert werden.

3.2.4.2 Protokoll für die Färbung des IL-2-Rezeptors

Die in dem Protokoll des Testkits (FLUOROKINE, R&D Systems, s. 3.1.8.3) beschriebene Färbemethode wurde geringgradig modifiziert.

Zu den wie oben beschrieben mit humanem Immunglobulin geblockten Zellen werden 5µl des biotinilierten rhIL-2 (humanes rekombinantes Interleukin-2) und zu der Negativkontrolle 5µl des biotinilierten Kontrollreagenz gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 60 min bei 4°C werden 5µl Avidin-FITC als färbendes Reagenz zu jeder Probe pipettiert und nach weiteren 30 min Inkubationszeit bei 4°C (dunkel gelagert) das überschüssige Avidin-FITC mit dem im FLUOROKINE Testkit enthaltenen RDF1 Waschpuffer durch zweimaliges Waschen (siehe oben) entfernt. Anschließend werden die Zellen in etwa 0,2 ml FACS-Flow resuspendiert.

Spezifität der Färbung

Um die Spezifität der IL-2-Rezeptor Färbung zu ermitteln werden die zu färbenden Zellen über 15 min mit dem HuIgG inkubiert. Währenddessen werden 20µl eines ebenfalls im Testkit enthaltenen IL-2 blockierenden Antikörpers (anti-human) mit 10 µl des biotinilierten rhIL-2 bei Raumtemperatur inkubiert. Zu dieser Mischung werden nach Ablauf von 15 min die geblockten Zellen und nach einer Inkubationszeit von 60 min bei 4°C das Avidin-FITC gegeben. Die weiteren Schritte entsprechen der oben beschriebenen Färbemethode.

3.2.4.3 Messung der Zellen in der Durchflusszytometrie

Die gefärbten Zellen wurden in einem FACSCalibur^ gemessen und über die CellQuest -Software (s. 3.1.8.1) ausgewertet. Negativkontrollen wurden nur mit sekundärem Antikörper gefärbt, da käuflich erhältliche Isotypenkontrollen sich als ungenauere Negativkontrolle erwiesen. Die Analyse-Gates wurden auf 0,5% positive Färbung der Negativkontrollen eingestellt. In jedem Probenröhrchen wurden 10.000 Zellen gemessen.

Das Durchflusszytometer bietet die Möglichkeit, einzelne Zellen schnell und zuverlässig zu untersuchen. Die Zellen werden einzeln durch den Strahl eines Argon-Ionen-Lasers (Wellenlänge 488 nm; optional ist das FACSCalibur^ mit einem zweiten 635 nm Laser ausgestattet) geführt. Dabei kommt es zu einer Lichtstreuung an der Zelle, bei farbstoffmarkierten Zellen ebenfalls zu einer Fluoreszenz (FL) der gebundenen Farbstoffmoleküle. Neben der Größe der Zelle kann so ihre Granularität und die Menge der an ihr gebundenen fluoreszierenden Farbstoffmoleküle dargestellt werden. Die Größe der Zelle wird durch das Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FCS), ihre Granularität durch das Seitwärtsstreulicht (side scatter SSC) wiedergegeben. Diese Daten werden von Photodetektoren mit jeweils 1024 Kanälen erfasst und so verarbeitet, dass die morphologische Charakterisierung der Zelle möglich wird. Bei der Messung von Zellen verwendete Fluorochrome werden durch den Laserstrahl angeregt und emittieren Lichtquanten mit einer für jedes Fluorochrom charakteristischen Wellenlänge ( FL 1 = 530/30 nm [Grün/Gelb, FITC]; FL 2 = 585/42 nm [Gelb/Orange, PE/PI]; FL 3 = >650 nm [Rot, PerCP = Peridinin Chlorophyll Protein; PI] ). Die Anzahl der Fluorochrommoleküle pro Zelle wird über die

Fluoreszenzintensität wiedergegeben. Die Auswertung bzw. Darstellung der Messergebnisse erfolgt über spezielle Software (CellQuest^) und ist unter anderem als Histogramm oder als

„Dot Plot“ (Punktgraph) möglich. Einzelne Zellpopulationen lassen sich durch das Setzen von sogenannten „Gates“ (Fenster) innerhalb von Zwei-Parameter-Diagrammen beurteilen.

Bestimmte Messergebnisse können so einzelnen Zellpopulationen zugeordnet werden und mittels der Software ist eine statistische Auswertung jeder gewählten Zellpopulation möglich (PARKS et al. 1989; JANWAY u. TRAVERS 1995).

Abb. 2: Differenzierung caniner mononukleärer Zellen anhand der durchflusszytometrischen Analyse (s. 3.2.4.3.2).

Zweiparameterdiagramm der Größe (FSC) gegen die Granularität (SSC). Es lassen sich Lymphozyten (LZ) von Monozyten (MZ) und Debris (D) unterscheiden.

3.2.4.3.1 Zellvitalität in der Durchflusszytometrie

Zellschädigungen sind in der Durchflusszytometrie durch Veränderungen der Größe und Komplexität der Zellen messbar. Zur weiteren Unterscheidung von Zellen mit geschädigter Membranintegrität und vitaler Zellen wurde der Suspension der zu messenden Zellen 2µg/ml Propidiumiodid (s. 3.1.8.3 u. 3.1.8.4.3) zugesetzt. Dieses Fluorochrom gelangt bei Membrandefekten in das Zellinnere und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNS.

D

L Z M Z

Propidiumiodid-positive Zellen sind durch Fluoreszenzsignale in der FL 2 und der FL 3 (s.

3.2.4.3) messbar, wodurch eine Unterscheidung toter DNS-haltiger Zellen von vitalen Zellen möglich wird.

3.2.4.3.2 Leukozytendifferenzierung in der Durchflusszytometrie

Zellen streuen einfallendes Licht in der Durchflusszytometrie je nach Größe und Komplexität unterschiedlich stark. Da Lymphozyten und Monozyten sich sowohl in der Größe (Vorwärtsstreulicht, FSC), als auch in der Granularität (Seitwärtsstreulicht, SSC) und in der Eigenfluoreszenz unterscheiden, bilden sie gut voneinander abzugrenzende Zellpopulationen (Punktewolken, Abb. 2, S. 55). So wird eine getrennte Beurteilung und Auswertung der Messergebnisse möglich (s. 3.2.4.3). Desweiteren lassen sich Lymphoblasten von ruhenden Lymphozyten aufgrund ihres größeren FSC, aber auch SSC, unterscheiden (s. unten, Abb. 3).

Abb. 3: Unterscheidung ruhender Lymphozyten von Lymphoblasten.

Canine mononukleäre Zellen wurden in vitro 8 Tage mit PHA (5µg/ml) stimuliert, in der Durchflusszytometrie gemessen und als Zweiparameterdiagramm (Größe (FSC) gegen Granularität (SSC)) dargestellt.

1: Zellen ohne PHA-Zusatz (Mediumkontrolle); A = kleine Zyten, B =