Methodische Vorarbeiten

Während der Vorarbeiten im Forschungslabor der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden die Bedingungen für einen im klinischen Versuch einsetzbaren Lymphozytenproliferationstest untersucht und die Methode festgelegt.

4.1.1 Ermittlung der optimalen PHA Konzentration

Der Vergleich von 2,5 und 5µg PHA pro ml Zellkulturmedium (s. 3.2.5.2) sowie der Vergleich der Proliferation unter Zugabe von verschiedenen PHA Konzentrationen kultivierter caniner PBMC`s (0µg, 0,3µg, 1µg, 3,167µg und 10µg/ml Zellkulturmedium), zeigte in Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen (SOMBERG et al. 1992, 1995) anhand der IL-2-R Expression ein PHA Optimum von 5µg/ml Zellkulturmedium.

4.1.2 Vergleich verschiedener Mikrotiterplatten

Nach Vergleich von drei verschiedenen Mikrotiterplatten (s. 3.2.5.3) erwies sich die spezielle V-Boden-Mikrotiterplatte (Fa. Brand, Wertheim) für den Einsatz im Lymphozytenproliferationstest als geeignet. Das Wachstum der als Negativkontrolle eingesetzten Zellen war in den beiden Rundbodenplatten aufgrund der zu dicht nebeneinanderliegenden Zellen, im Vergleich zu der V-Boden-Platte, gesteigert. Der Einsatz dieser Zellen als Negativkontrolle war somit erschwert.

4.1.3 Ausschluss der mikrobiellen Kontamination

Die kulturelle Untersuchung steril entnommenen Zellkulturüberstandes auf bakterielle Kontamination im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover (s. 3.2.5.4) ergab keinerlei bakteriellen Keimgehalt.

4.1.4 Test der in der Durchflusszytometrie einsetzbaren Antikörper für die Lymphozytenproliferation

Im Rahmen der Entwicklung der nicht radioaktiven Lymphozytenproliferation wurden verschiedene Antikörper ausgetestet, um eventuell proliferierende und damit an Größe zunehmende Zellen näher identifizieren zu können (s. 3.2.5.5). Dabei zeigte sich, dass CD 4 bereits nach 24 Stunden Inkubation der mit PHA in Kultur gesetzten PBMC`s nicht mehr in der Durchflusszytometrie messbar war. In der Negativkontrolle und nach Zugabe von rekombinantem Staupe-NP war CD 4 weiterhin nachweisbar. CD 8α war sowohl nach PHA- als auch nach Staupe-NP-Zugabe in das Zellkulturmedium in Verlaufsuntersuchungen beurteilbar. Sowohl anti-CD 4 als auch anti-CD 8α konnten somit in vitro zur Zellfärbung eingesetzt werden und sollten Erkenntnisse über die während der antigenspezifischen Proliferation vorherrschende T-Zell Population bringen.

Die zudem ausgetesteten Antikörper (CD 3, CD 14, CD 21, CD 44, CD 69, TCRα/β und MHC-I) zeigten für die Auswertung des Lymphozytenproliferationstests keinerlei Relevanz.

CD 3, CD 4, CD 8α, CD 21, CD 44, CD 69 und MHC-I wurden für die Messung der Lymphozyten-Oberflächenantigene ex vivo aus den mononukleären Zellen des peripheren Blutes ausgewählt. Durch den Einsatz dieser Oberflächenmarker während des Vakzine-Versuches wurden Erkenntnisse über den Krankheitsverlauf der ungeimpften Kontrolltiere, sowie die eventuelle Beeinflussung bestimmter Zellpopulationen durch die Challenge-Infektion auch bei den geimpften Tieren erwartet.

4.1.4.1 CD 69 Verlaufskontrolle

Um eine eventuell vorhandene Kreuzreaktion zwischen dem humanen anti-CD 69 und dem caninen Oberflächenmolekül auszutesten, wurde eine Verlaufskontrolle durchgeführt (s.

3.2.5.5.1). Die über einen Zeitraum von 4,5 Stunden hinweg (beginnend nach 30 Minuten Inkubation mit PHA) in 30minütigen Abständen durchgeführten Messungen, zeigten einen Anstieg der CD 69 positiven Lymphozyten bis etwa 2,5 Stunden nach Inkubationsbeginn.

Daran schloss sich ein Rückgang der Werte bis auf die Ausgangswerte an. Zwar konnten bei

einzelnen Hunden Schwankungen der Anzahl CD 69 positiver Lymphozyten nachgewiesen werden (Abb. 4, s. unten), tendenziell war jedoch nach 2,0-2,5 Stunden Inkubationszeit ein Höhepunkt, nach 4,5 Stunden ein Rückgang nachweisbar. Aufgrund dieser Befunde wurde CD 69 nur bei der durchflusszytometrischen Messung frisch isolierter Zellen eingesetzt, da nicht erwartet wurde nach 3-8 Tagen Inkubation der Zellen eine aussagekräftige Messung für den antigenspezifischen Test zu erhalten.

Abb. 4: CD 69 Verlaufskontrolle, Prozentsatz CD 69 positiver Lymphozyten.

Frisch isolierte canine PBMC`s wurden nach der Kultivierung mit PHA in 30minütigen Abständen in der Durchflusszytometrie auf die Expression des frühen Aktivitätsmarkers CD 69 überprüft.

4.1.4.2 Der IL-2-Rezeptor als Proliferationsmarker 4.1.4.2.1 Test der einzusetzenden rhIL-2 Konzentration

Um die geeignetste rhIL-2-Konzentration feststellen zu können wurden 10 und 5µl rhIL-2 pro Probe (s. 3.2.5.6.1) durchflusszytometrisch verglichen. Dabei zeigte sich, dass der Einsatz von 5µl rhIL-2 dem Einsatz von 10µl rhIL-2/Probe vorzuziehen ist, bzw. ausreicht (s. Abb. 5, S.

69, schwarze Linien).

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5

0 ,5 1 1 ,5 2 2 ,5 3 3 ,5 4 4 ,5

S tu n d e n n a c h in v itr o S tim u la tio n

CD 69 positive Lymphozyten (%)

Abb. 5: Histogramm: Vergleich von 10 und 5µl rhIL-2 je Probe.

Durchflusszytometrische Messung des IL-2-R (FL-1/Zellzahl). Dargestellt sind die Negativkontrollen sowie die IL-2-R positiven Lymphozyten (s. Abb.). Graue Linien: 10 µl rhIL-2; schwarze Linien: 5 µl rhIL-2.

4.1.4.3 Messung der Lymphozytenproliferation per IL-2-Rezeptor in der Durchflusszytometrie

Die Bindung von rhIL-2 an ruhende und an aktivierte canine Lymphozyten sowie die Spezifität der IL-2-R Färbung wurde überprüft (s. 3.2.5.6.2). Es konnte eine Bindung sowohl an ruhende, als auch an aktivierte Lymphozyten nachgewiesen werden. Das Blockieren des rhIL-2 und der Zusatz dieses blockierten Antikörpers zu den zu messenden Zellen zeigte die Spezifität der rh2 Bindung an den caninen 2-R (s. Abb. 6, S. 70). Die Messung des IL-2-R an mit PHA stimulierten Zellen zeigte nicht nur einen deutlichen Anstieg der IL-IL-2-R positiven Zellen, sondern auch eine höhere Rezeptordichte auf diesen positiven Zellen (s.

Abb. 7, S. 71). Diese Ergebnisse entsprechen im wesentlichen den von SOMBERG et al.

(1992) gemachten Feststellungen. Wie in Abbildung 7 dargestellt, war eine erste deutliche Zunahme IL-2-R positiver Lymphozyten ab Tag 4-5 nach Inkubationsbeginn nachweisbar.

Ein Maximum der Expression konnte an Tag 8 der Proliferation (hier nicht dargestellt) gezeigt werden. Die Messung der IL-2-R Expression in der Durchflusszytometrie erwies sich somit als geeignete Methode zur Überprüfung der T-Zell Aktivierung eines Hundes.

I L -2 -R p o s itiv I L -2 -R n e g a tiv

Abb. 6: Spezifität der rhIL-2 Bindung an den caninen IL-2-R.

Linke Abbildung: Negativkontrolle der IL-2-R Messung. Rechte Abbildung: IL-2 blockierender Antikörper zur Messung der Spezifität der IL-2-R Färbung.

Schwarze Linie: Messung der Zellen vor Proliferationsbeginn.

Dunkelgraue Linie: Messung der Zellen an Tag 3 der Inkubation mit PHA.

4.1.5 Bestimmung der geeigneten Konzentration des rekombinanten Staupe-Nukleoproteins für die spezifische Proliferation

Die Überprüfung der geeigneten Konzentration des rekombinanten Staupe-Nukleoproteins für die spezifische Proliferation (s. 3.2.5.7) zeigte, dass für eine antigenspezifische Proliferation der Einsatz von 2µg Staupe-NP pro Milliliter Zellkulturmedium nötig war. Die mit 0,5µg Staupe-NP in Kultur gesetzten Zellen zeigten keinerlei proliferative Antwort, bei einem Zusatz von 1,0 µg Staupe-NP waren nur geringgradige proliferative Antworten nachweisbar.

Bei zwei mit einem praxisüblichen Kombinationsimpfstoff geboosterten Hunden konnte an Tag 3 bzw. 6 der Inkubation anhand der in der Durchflusszytometrie IL-2-R positiven Lymphozyten eine proliferative Antwort nachgewiesen werden. Der um 10% höher als in der nur mit Medium kultivierten Negativkontrolle liegende Anteil IL-2-R positiver Lymphozyten konnte nur bei einem Zusatz von 2µg Staupe-NP pro Milliliter Zellkulturmedium nachgewiesen werden (Beispiel s. Abb. 8, S. 72). Die zudem während dieses Versuches in der Durchflusszytometrie gemessenen Oberflächenmarker CD 3, CD 4, CD 8α und CD 69 ließen

Negativkontrolle IL-2 blockierender

Antikörper

in diesen Messungen keinen Rückschluss auf das Vorherrschen einer bestimmten T-Zell Population während der antigenspezifischen Zunahme IL-2-R positiver Lymphozyten zu.

Abb. 7: Messung des IL-2-R nach PHA-Stimulation der inkubierten Zellen.

Messung der IL-2-R positiven Lymphozyten in der Durchflusszytometrie (FL-1/Zellzahl). Von oben nach unten: Tag 0 (direkt nach Isolierung) bis Tag 5 der Inkubationszeit.

Abb. 8: IL-2-R Messung an stimulierten mononukleären Zellen (Tag 3 der Inkubationszeit).

Durchflusszytometrische Messung der IL-2-R positiven Zellen. Dargestellt sind die IL-2-R Negativkontrolle (Kontrolle der Färbung), die IL-2-R Färbung der unter Zusatz von 2µg Staupe-NP/ml Zellkulturmedium kultivierten Zellen sowie die IL-2-R Färbung der unter Zusatz von 5µg PHA/ml Zellkulturmedium kultivierten Zellen. Die nur mit Medium kultivierte, und um 10% unter dem nach