Rekombinantes Campylobacter rectus Protein

Um eine in rekombinanten Proteinen mögliche geringfügige Kontamination durch E. coli und eine dadurch bedingte unspezifische Lymphozytenproliferation auszuschließen, wurde das aus Campylobacter rectus gewonnene rekombinante Protein CsxB. C His (s. 3.1.7) als Proliferationskontrolle (parallel zu den Ansätzen mit Staupe-NP, PHA bzw. nur Medium) eingesetzt. Das Protein wurde ausgewählt, da es sich bei Campylobacter rectus (gram negativ, Gattung innerhalb der Familie der Spirillaceae) laut einer persönlichen Mitteilung von FREY (2000) um ein beim Hund nicht vorkommendes Bakterium handelt. Im Verlaufe der Versuchsdurchführung und der späteren Auswertungen des Proliferationstests zeigte sich jedoch eine sehr deutliche proliferative Antwort der eingesetzten mononukleären Zellen auf den Zusatz dieses rekombinanten Proteins. Die dabei ermittelten Werte lagen sowohl bei der Messung der CD 4 positiven Lymphozyten, als auch bei der Beurteilung der IL-2-R positiven Lymphozyten zumeist deutlich über den Ergebnissen der als Negativkontrolle (d.h. ohne Zusatz) eingesetzten Zellen. Desweiteren war bei diesen als Proliferationskontrolle eingesetzten Zellen die proliferative Antwort ebenso hoch, oder aber sogar höher als die unter Staupe-NP Zugabe gemessene. Der post mortem an allen 20 Versuchshunden erhobene Befund eines hochgradigen Befalles des Verdauungstraktes mit spiraligen Bakterien (s.

4.2.1.5) sowie die mit diesem Befall einhergehende Infiltration der entsprechenden Bereiche mit Entzündungszellen ließ vermuten, dass es sich somit bei der proliferativen Reaktion nicht um eine unspezifische, sondern infolge des Bakterienbefalles spezifische Proliferationsreaktion auf den Einsatz des rekombinanten Proteins handelte. Eine Kreuzreaktion von Campylobacter rectus mit den nachgewiesenen spiraligen Bakterien konnte nicht ausgeschlossen werden. In einer 1996 durchgeführten Studie (RENVERT et al.) wurden an der Gingiva von Beagle-Hunden regelmäßig geringe Mengen von Campylobacter rectus gefunden, ohne eine signifikante Veränderung des Gesundheits- bzw. Krankheitsstatus hervorzurufen. Diese Tatsachen führten dazu, dass die als negative Proliferationskontrolle gedachten Ergebnisse für diesen Einsatz als ungeeignet bewertet werden mussten, jedoch zeigten, dass der entwickelte Lymphozytenproliferationstest einsatzfähig ist.

5 Diskussion

Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele. Zum einen sollte ein nicht-radioaktiver Lymphozytenproliferationstest entwickelt werden. Mit Hilfe dieses Tests sollte anschließend ein Teil der zellulären Immunantwort nach Staupe-DNS-Impfung untersucht werden. Eine Messung der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation nach Staupe-DNS-Vakzinierung war bis dato beim Hund nicht möglich, da in vitro die Lymphozyten durch Zugabe von virulentem und auch inaktiviertem Staupevirus abstarben. Ein rekombinantes Protein des Hundestaupevirus (Nukleokapsidprotein) sollte bei der Entwicklung des neuen Testsystems eingesetzt werden. Zusätzlich wurde nach einer Alternative zu den herkömmlichen und größtenteils auch heute noch mit radioaktiven Markern (³H-Thymidin) arbeitenden Proliferationstests gesucht. Der zu entwickelnde Test sollte neben dem Nachweis einer antigenspezifischen Proliferation die Möglichkeit zur Analyse der jeweilig proliferierenden Zellpopulation geben und so mehr Informationen über die zelluläre Immunität vermitteln. Die in den letzten Jahren zunehmend an Relevanz gewinnende Durchflusszytometrie bot hier eine bereits etablierte Alternative. So hatten verschiedene Untersucher eine gute Korrelation zwischen der ³H-Thymidin Inkorporation und der durchflusszytometrischen Messung aktivierter Lymphozyten bei diversen Tierarten aufgezeigt (LANGE 1995; HENDRICKS 1998; SCHARSACK et al. 2000). Auch in der Funktionsprüfung unterschiedlicher Zellpopulationen ist die Durchflusszytometrie bereits seit längerem etabliert (SHU et al. 1978;

BEGARA et al. 1995; SCHUBERTH et al. 1996; BEER 1998). Ein von ECKELS et al.

(1999) beschriebener Proliferationstest wurde Grundlage für den in dieser Studie entwickelten Lymphozytenproliferationstest.

Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf dem Einsatz dieses neuen Tests während einer DNS-Vakzine Studie an Hunden. Im Verlauf dieser Studie wurde eine Challenge-Infektion mit virulentem Staupevirus durchgeführt. Eine staupespezifische Lymphozytenproliferation nach Vakzinierung und/oder Challenge-Infektion sollte neue Erkenntnisse über die Wirksamkeit der DNS-Vakzine beim Hund liefern. Eine Challenge-Infektion im Rahmen einer Impfstoffüberprüfung bietet auch die Möglichkeit neben der Lymphozytenproliferation die Immunantwort von Hunden näher zu charakterisieren, die mit dem virulenten Staupevirus

in Kontakt kommen. Bei der akuten Form der Hundestaupe wurde eine frühe T-Zell Antwort im Gehirn gefunden, die trotz starker Immunsuppression auftritt (TIPOLD et al. 1999). Dieses Paradoxon bedarf noch weiterer Abklärung. Daher wurde bei immunisierten und nicht-immunisierten Hunden bzw. bei Hunden mit unterschiedlich starker Ausprägung von Staupeläsionen verschiedene Oberflächenmarker auf Zellen des peripheren Blutes im Verlauf untersucht.

In der Diskussion wird zunächst auf die methodischen Aspekte des Lymphozytenproliferationstestes eingegangen. Anschließend werden der Einsatz des Testes und die während des Vakzine-Versuches erhobenen Ergebnisse bewertet sowie die während des Belastungsversuches erhobenen Parameter im Hinblick auf die Wirksamkeit der Vakzine erörtert.

5.1 Entwicklung eines nicht-radioaktiven Lymphozytenproliferationstestes zur Beurteilung der zellulären Immunantwort

Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden die Voraussetzungen für einen funktionsfähigen Lymphozytenproliferationstest festgelegt. In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen (SOMBERG et al. 1992, 1995) wurde eine PHA Konzentration von 5µg/ml Zellkulturmedium als Positivkontrolle ausgewählt (s. 4.1.1). Ein übermäßiges Wachstum der als Negativkontrolle eingesetzten Zellen ließ sich durch den Einsatz einer V-Boden-Mikrotiterplatte vermeiden (s. 4.1.2). Geeignete Leukozyten-Oberflächenmarker sollten die nähere Analyse der antigenspezifisch proliferierenden Zellen ermöglichen (s. 3.2.5.5). Bei einer antigenspezifischen Proliferation wurde erwartet, dass die CD 4 positiven Zellen im Gegensatz zu den CD 8 positiven Zellen (zytotoxische T-Zellen) proliferieren. In früheren Untersuchungen war festgestellt worden, dass die hauptsächlich von CDV befallenen Zellen in Lymphknoten CD 4 positiv sind, wenngleich auch in CD 8 und CD 21 positiven Zellen ein Virusbefall nachgewiesen werden konnte (IWATSUKI et al. 1995; WÜNSCHMANN et al.

2000). Durch die Messung von CD 4 und CD 8α positiven Zellen sollte herausgefunden werden, ob die CD 4 positiven Zellen trotz vermuteten Virusbefalls proliferieren oder ob ein

eventuell kompensatorischer Anstieg CD 8 positiver Zellen bei staupeinfizierten Hunden gezeigt werden kann.

Der IL-2-R wurde als wichtigster Aktivitätsmarker für T-Zellen eingesetzt. IL-2 dient, vermittelt über den IL-2-R, als Wachstums-, Differenzierungs- und Aktivierungs-Stimulus für T-Zellen, wird durch (von Mitogenen oder Antigenen) stimulierte T-Zellen gebildet (SOMBERG et al. 1992) und ist an der Bildung seines eigenen Rezeptors autoregulatorisch beteiligt (WAKASUGI et al. 1985). Somit spielt IL-2 eine zentrale Rolle in der Regulation der zellvermittelten Immunität (MIZUNO et al. 1996). Nachdem SOMBERG et al. (1992) die Einsatzfähigkeit des hrIL-2 für den Nachweis des caninen IL-2-R in der Durchflusszytometrie bereits erfolgreich getestet hatten, stellte sich hrIL-2 auch in der Voruntersuchung zu dieser Arbeit als sehr guter Proliferationsmarker zur Überprüfung der T-Zell Aktivierung heraus (s.

4.1.4.2). Der Einsatz dieses Proliferationsmarkers scheint beim Hund immer nötig zu sein, da die Umwandlung der kultivierten Lymphozyten in Lymphoblasten und die damit einhergehende Größenzunahme der Zellen nicht, wie bei anderen Spezies beschrieben (SCHARSACK et al. 2000), in jedem Fall eindeutig in der Durchflusszytometrie nachweisbar war. Anhand der IL-2-R positiven Lymphozyten sowie der Aufregulation dieses Rezeptors auf den Zellen wurde eine genauere Kontrolle der T-Zell Aktivierung unabhängig von einer Größenzunahme möglich. Da die Größenzunahme der Lymphoblasten eine sehr starke Variation zwischen den Hunden gezeigt hatte und die Auswertung der Zunahme des IL-2-R zuverlässigere Ergebnisse brachte, wurde auf eine weitere beschriebene Quantifizierung der proliferativen Reaktion mit Hilfe von Referenzzellen (BEER 1998; HENDRICKS 1998) verzichtet.

Die für den Proliferationstest kultivierten mononukleären Zellen sollten an Tag 5 und Tag 8 der Proliferation geerntet werden. Dies ergab sich aus den während der Verlaufskontrollen gemachten Beobachtungen. Unter PHA-Zugabe konnte in der Durchflusszytometrie erstmalig ab Tag 4-5 der Inkubation eine deutliche Zunahme IL-2-R positiver Lymphozyten sowie eine Aufregulation des IL-2-R auf den Zellen gezeigt werden. Weiterhin wurde an Tag 8 der Inkubation ein Maximum der IL-2-R Expression beobachtet (s. 4.1.4.3 u. 4.1.6). Diese Ergebnisse bestätigten die von HELFAND et al. (1992) bei der Untersuchung von caninen

Lymphozyten gemachten Beobachtungen. Dort zeigten sich, bedingt durch individuelle Schwankungen, maximale Proliferationswerte nach PHA-Zugabe an Tag 2 bis 7 der Inkubation, jedoch ebenfalls noch sehr hohe Werte an Tag 8-10 der Inkubation. Zusätzlich konnten diese Autoren nach Stimulation der Zellen mit IL-2 eine proliferative Antwort ab Tag 5-6 mit einem Maximum an Tag 8-10 der Inkubation messen. Dies führte zu der Hypothese, dass nur ein geringer Prozentsatz ruhender Lymphozyten IL-2-R exprimieren und es nach einer Stimulation der Zellen mindestens 5, maximal 10 Tage dauert, um eine korrekte Aussage über die zelluläre Immunantwort machen zu können. Nach Auswertung der eigenen Vorversuche und in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von HELFAND et al. (1992), wurden die Tage 5 und 8 der Inkubation gewählt, um die Zellen zu ernten. Auf diese Weise würde eine mögliche frühe antigenspezifische T-Zell Antwort erkannt werden. Sollte an Tag 5 jedoch keine proliferative Antwort vorliegen, so könnte am Tag der maximalen Stimulation (Tag 8) noch eine eventuell vorliegende antigenspezifische Lymphozytenproliferation gesehen werden. Der frühe Messzeitpunkt (Tag 5) wurde zudem gewählt, um falsch negative Resultate durch eine einmalige Messung an Tag 8 der Inkubation zu vermeiden. Dies könnte durch frühzeitiges Absterben stimulierter bzw. virusinfizierter Lymphozyten nach Challenge-Infektion auftreten.

Verschiedene Untersucher hatten die Relevanz des Nukleokapsid-Proteins für die protektive Immunantwort während einer Staupeinfektion hervorgehoben (s. 2.2.2). CDV infizierte Hunde zeigen eine frühe Immunantwort (IgM) gegen dieses Protein (TIPOLD et al. 1999), es besitzt wenigstens ein T-Zell Epitop (BEAUVERGER et al. 1993; TIPOLD et al. 1999), ist das während der Virusreplikation am meisten produzierte virale Antigen (BARBEN et al.

1999) und ruft die stärkste Immunantwort hervor (VON MESSLING et al. 1999). Die Voruntersuchungen zeigten hier sehr vielversprechende Ergebnisse. Es konnte eine proliferative Reaktion von Lymphozyten revakzinierter, konventionell geimpfter Hunde auf den Einsatz von 2µg/ml Zellkulturmedium des rekombinanten Nukleokapsid-Proteins nachgewiesen werden (s. 4.1.5). Die Eignung dieses Proteins zum Auslösen der antigenspezifischen Proliferation war somit bestätigt und durch seinen Einsatz im neu entwickelten Lymphozytenproliferationstest während des Vakzine-Versuches sollte eine

mögliche Unterscheidung zwischen immunisierten und nicht-immunisierten Hunden aufgezeigt werden.

Bei einem Vergleich des ³H-Thymidin Einbaus in die zelluläre DNS mit der entwickelten nicht-radioaktiven Methode (IL-2-R Messung) waren insgesamt eher mäßige Proliferationsergebnisse zu verzeichnen (s. 4.1.6). Zwar konnte eine Korrelation beider Methoden gezeigt werden, es traten jedoch Differenzen der Inkubationstage, an denen die höchsten Proliferationsraten mit der jeweiligen Methode messbar waren, auf. Diese können mit der in der ³H-Thymidin Messung auftretenden Diskrepanz zwischen Proliferationsrate und ³H-Thymidin Einbau zusammenhängen. So beobachteten SHU et al. (1978) einen starken Rückgang der ³H-Thymidin Inkorporation nachdem der Höhepunkt des Einbaus überschritten war, gleichzeitig war jedoch eine Zunahme der absoluten Zellzahl nachweisbar. Diese Tatsache ließ sie vermuten, dass es während der weiterhin stattfindenden Zellproliferation zu keinem Einbau des exogenen ³H-Thymidin mehr kommt. Die Vermutung, dass die Aufnahme des exogenen ³H-Thymidin durch einen von Makrophagen freigesetzten Faktor verhindert wird, wurde auch von KRISTENSEN et al. (1982b) vertreten. Diese nahmen eine Produktion von „kaltem“ Thymidin durch Makrophagen an. KABELITZ et al. (1994) konnten eine deutliche Diskrepanz zwischen dem ³H-Thymidin Einbau und der Entwicklung der Zahl vitaler Zellen nach allogener Restimulation von T-Zellen aufzeigen. Somit konnte während der Vorarbeiten eine zufriedenstellende Korrelation beider Methoden gezeigt werden, die Messung der Aufregulierung des IL-2-R bietet jedoch eine sensitivere Methode zum Nachweis relativ spät einsetzender Proliferation. Ein weiterer Vorteil der Durchflusszytometrie gegenüber der ³H-Thymidin Messung besteht darin, dass kein gesonderter Arbeitsplatz nötig ist und kein radioaktiver Abfall anfällt. Eine höhere Sensitivität des durchflusszytometrischen Tests, die aufgrund der Arbeiten bei anderen Spezies vermutet wurde, konnte während der Vorarbeiten beim Hund jedoch nicht abschließend bewiesen werden. Trotz der vielleicht geringeren Sensitivität bietet die Durchflusszytometrie jedoch die Möglichkeit simultan mehrere zelluläre Parameter wie z.B. die Größenzunahme der proliferierenden Lymphozyten und die Expression eines Rezeptors oder Oberflächenproteins messen zu können. Die zusätzliche Phänotypisierung (z.B. CD 4 und CD 8, s. oben) von Zellen ist ohne viel Mehraufwand möglich und damit die gezielte Untersuchung einzelner

proliferierender Lymphozyten-Subpopulationen. In der ³H-Thymidin Messung ist dagegen nur die Proliferationsreaktion der gesamten Kultur, nicht aber einzelner Zellpopulationen, beurteilbar. Zusammenfassend liegen die Vorteile somit eindeutig auf der Seite der durchflusszytometrischen Messungen und der entwickelte Lymphozytenproliferationstest stellt eine sehr gute Alternative dar, die durch Variation der eingesetzten Antigene aber auch der Oberflächenmarker eine breite Einsatzmöglichkeit bietet.