• Keine Ergebnisse gefunden

2.2 DNS-Vakzine

2.2.2 Hundestaupe DNS-Vakzine

Die genetische Immunisierung wurde zunächst bei der Maus anhand des Grippevirus getestet und führte dort zu guten Ergebnissen. Für die DNS-Vakzine wird eine Plasmid-DNS, die ein Immunogen codiert, z.B. ins Muskelgewebe injiziert. Die DNS wird in unterschiedlichen Zellen (u.a. Muskelzellen und antigenpräsentierende Zellen) als Protein exprimiert, was zu einer Antikörperreaktion und der Entwicklung zytotoxischer T-Zellen führt. Für die Ausbildung der T-Zell Antwort sind vor allem dendritische Zellen und andere

antigenpräsentierende Zellen verantwortlich. Eine spätere Infektion durch vollständige Viren kann so erfolgreich bekämpft werden. Vorteil der DNS-Vakzine ist vor allem ihre große Sicherheit, da bei der Herstellung nur ein bestimmtes Epitop des Wildtypstammes, nicht jedoch ein infektiöses Agens eingesetzt wird (ULMER et al. 1993; JANEWAY u. TRAVERS 1995). Bei Einsatz eines hoch konservierten Virus-Proteins kann eine derartige Vakzine, trotz antigenetischer Veränderungen im Bereich der Hüllproteine des Feldvirus, erfolgreich vor einer Infektion mit diesem schützen (ULMER et al. 1993).

Die Forschung wurde seit dem Erfolg von ULMER et al. (1993) stark vorangetrieben und auch in Bezug auf das CDV konnte eine DNS-Vakzine erfolgreich in der Maus getestet werden (SIXT et al. 1998). CHERPILLOD et al. (2000) entwickelten eine Staupe-DNS-Vakzine, welche Plasmide mit dem N (Nukleokapsid)-, F (Fusion)- und H (Hämagglutinin)-Gen eines virulenten CDV-Stammes enthält. Eine erste Belastungsinfektion hat die Wirksamkeit dieser Vakzine bereits bewiesen.

Verschiedene Untersucher zeigten, dass nur Tiere, die auch Antikörper gegen die Hüllproteine F und H der Morbilliviren bilden, in der Lage sind, eine virale Infektion (systemisch und/oder zentralnerval) erfolgreich abzuwehren (MERZ et al. 1981; GREENE u. APPEL 1998; SIXT et al. 1998). Weiterhin scheinen zirkulierende IgG Antikörper gegen das H-Glykoprotein, den Ausbruch einer ZNS-Infektion verhindern zu können (RIMA et al. 1991). Das H- und das F- Protein sind also unbedingte Bestandteile einer effektiven Vakzine. Die für die schützende Wirkung gegen eine Challenge-Infektion mit CDV (mausadaptiert) bei der Maus durchaus ausreichende Expression dieser beiden Proteine (SIXT et al. 1998), scheint beim Hund nicht ausreichend zu sein (CHERPILLOD et al. 2000). Da CDV infizierte Hunde eine frühe Immunantwort (IgM) gegen das N-Protein entwickeln (TIPOLD et al. 1999) und dieses wenigstens ein T-Zell Epitop besitzt (BEAUVERGER et al. 1993; TIPOLD et al. 1999), wurde das N-Protein zusätzlich zu dem H und dem F Protein in die Vakzine integriert. Ein weiterer Grund für die Einbeziehung dieses Proteins war die Tatsache, dass das N-Protein das während der Virusreplikation am meisten produzierte virale Antigen ist (BARBEN et al.

1999) und die stärkste Immunantwort bei allen Morbillivirusinfektionen hervorruft (VON MESSLING et al. 1999).

Abb. 1: Schematische Darstellung eines Morbillivirions.

Dargestellt ist die Lage der Nukleokapsid-, Haemagglutinin- und Fusionsproteine, sowie die vorwiegend gegen sie gerichteten Abwehrmechanismen des Immunsystems (CTL = zytotoxische T-Zellen; neutr. Ab

= neutralisierende Antikörper).

Die mit der von CHERPILLOD et al. (2000) hergestellten DNS-Vakzine geimpften Hunde entwickelten nach der Revakzination, bzw. nach der Infektion mit dem virulenten Virus neutralisierende Antikörper. Eine T-Zell Antwort war bei den im Vorfeld mit der Vakzine immunisierten Mäusen deutlich messbar, konnte jedoch aufgrund technischer Probleme bei der Durchführung eines Lymphozytenproliferationstests bzw. eines Zytotoxizitätstestes (CTL) in den immunisierten Hunden nicht untersucht werden. Das virulente Virus, abgetötetes virulentes Virus, sowie einige Gewebekultur-adaptierte Stämme hatten die kultivierten Lymphozyten abgetötet (TIPOLD 2000)2.

2 Persönliche Mitteilung Frühjahr 2000

2.3 Lymphozytenproliferationstest 2.3.1 Grundlagen

Lymphozyten werden durch die Bindung von präsentiertem Antigen an spezifische Rezeptoren, sowie durch costimulierende Signale aktiviert. Nach ihrer Umwandlung in Lymphoblasten durchlaufen sie eine klonale Expansion mittels wiederholter Zellteilung. Die so gebildeten Zellen werden zu Effektorzellen ausdifferenziert, welche entweder Antikörper sezernieren (B-Zellen) oder infizierte Zellen zerstören bzw. andere Zellen des Immunsystems aktivieren (T-Zellen) (JANEWAY u. TRAVERS 1995).

Nachdem bis jetzt noch keine zelluläre Immunantwort nach Staupe-DNS-Vakzinierung beim Hund gemessen werden konnte, sollte der Einsatz eines Lymphozytenproliferationstestes neue Erkenntnisse bringen. Der dabei gewählte Ansatz führte zu der Entwicklung einer alternativen Methode zu den herkömmlichen Lymphozytenproliferationstests. Diese arbeiten größtenteils mit radioaktiven Markern, d.h. als Zeichen des Zellwachstums wird der Einbau von 3 H-Thymidin in die zelluläre DNS gemessen. Hierfür werden die Zellen unter Zusatz eines Mediums mit oder ohne Mitogen kultiviert, nach 48-72 Stunden wird 3H-Thymidin zugegeben und nach einer weiteren Inkubationszeit (6-18 Stunden: KRISTENSEN et al.

1982b; ECKELS et al. 1999; WAGNER et al. 1999) werden die Zellen geerntet und der Einbau des 3H-Thymidin in die DNS gemessen. Mit beginnender DNS Synthese ist ein Größenwachstum der Zellen zu beobachten. Die DNS Synthese nimmt jedoch im Verlauf der Kultivierung ab, obwohl weiterhin proliferierende bzw. sich teilende Lymphozyten vorhanden sind. Es kann also eine Diskrepanz zwischen 3H-Thymidin Einbau und der Proliferationsrate der Lymphozyten auftreten (SHU et al. 1978). KRISTENSEN et al. (1982a) zeigten eine starke Variation des nach PHA-Stimulation gemessenen 3H-Thymidin Einbaus in periphere Blut-Lymphozyten (PBL, Peripheral blood lymphocytes) des Hundes, sowie im Gegensatz zu den Ergebnissen mit PBL`s anderer Tierarten, insgesamt eher unbefriedigende Resultate.

Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Interpretation eines Lymphozytenproliferationstests auf alleiniger Basis der 3H-Thymidin Inkorporation zu falschen, bzw. ungenauen Ergebnissen führen kann (KRISTENSEN et al. 1982b; MARMER et al. 1983). Als Ursache wurde die

Produktion von „kaltem“ Thymidin durch in der Kultur enthaltene Makrophagen vermutet (KRISTENSEN et al. 1982b), aber auch eine kompetitive Hemmung der 3H-Thymidin Aufnahme durch andere in der Zellkultur enthaltene Substanzen ist möglich (MARMER et al.

1983). Obgleich diese Probleme in den letzten Jahren größtenteils durch Verbesserung und Standardisierung der Zellkulturen beseitigt werden konnten und auch mit caninen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (canine PBMC`s) in der radioaktiven Messung gute Ergebnisse erzielt werden (DANIEL et al. 1990; TIPOLD et al. 1996), liegen heute auftretende Nachteile in der Methode selbst. So sind teure Spezialgeräte für die Messung des in die DNS eingebauten 3H-Thymidin nötig und bei jeder Messung fällt radioaktiver Abfall an. Weiterhin sind die erzielten Ergebnisse von der spezifischen Aktivität und der Menge des eingesetzten 3H-Thymidin, aber auch von der Länge der Inkubationszeit nach 3H-Thymidin Zugabe abhängig. Diese Tatsachen machen es nur schwer möglich, die Ergebnisse zweier Arbeitsgruppen zu vergleichen, und so sind in der Humanmedizin sowie für die Messung von Nagerzellen bereits nicht-radioaktive Alternativen auf der Basis von kolorimetrischen Methoden etabliert worden (WAGNER et al. 1999).

Ein von WAGNER et al. (1999) durchgeführter Vergleich des radioaktiven 3 H-Thymidin-Tests mit drei verschiedenen kolorimetrischen Methoden zeigte, dass der 5-Bromo-Deoxyuridin (BrdU) Test eine geeignete nicht-radioaktive Alternative zum Nachweis der Blastogenese caniner Lymphozyten ist. Hierbei wird das BrdU anstelle des Thymidins in neu synthetisierte DNS eingebaut und anhand eines BrdU-Antikörpers nachgewiesen. Der Test konnte sich jedoch für den Hund nicht durchsetzen, da die Unterscheidung zwischen in die Apoptose eintretende Zellen und Zellen, die weiterhin proliferieren, nicht zuverlässig möglich ist (LEIBOLD)3. Eine Aussage über die Funktionsfähigkeit der Zellen kann also nicht auf alleiniger Basis dieses Tests getroffen werden.

Durch die Aktivierung der Lymphozyten treten diese in den Zellzyklus ein, wodurch es zu einer starken Vergrößerung des Zellvolumens und zur Verdopplung des DNS-Gehaltes in der Zelle kommt. Die Gesamtheit der mit diesem Prozess einhergehenden Veränderungen wird auch als blastische Transformation bezeichnet (SHU et al. 1978; KRISTENSEN et al. 1982a;

3 Persönliche Mitteilung Winter 1999

JANEWAY u. TRAVERS 1995). Wie bereits beschrieben (s. 2.3.1), können diese Zellaktivierungsvorgänge z.B. radiometrisch gemessen werden. Aber auch morphologische Veränderungen der Zellen (erhöhtes Zellvolumen) als Antwort auf eine in vitro Stimulation finden bereits seit längerem Anwendung und wurden als sichere und reproduzierbare Alternative zur 3H-Thymidin Inkorporation beschrieben (SHU et al. 1978; BEGARA et al.

1995).