Abteilung für Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover
Immunreaktionen in der Darmwand und Darmlymphe nach Gabe
bakterieller Antigene in das Darmlumen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Astrid Hoffmann-Moujahid geb. Hoffmann aus Kaiserslautern
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Hermann-Josef Rothkötter
1. Gutachter: Prof. Dr. Joachim Pohlenz 2. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Leibold
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2002
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 11
2 Literaturübersicht... 14
2.1 Darmimmunsystem... 14
2.1.1 Einordnung... 14
2.1.2 Aufbau und Bestandteile... 14
2.1.2.1 Intestinales Epithel... 14
2.1.2.2 Peyersche Plaques und mesenteriale Lymphknoten... 16
2.1.2.3 Intraepitheliale Lymphozyten und Lamina propria Lymphozyten... 16
2.1.3 Immunantworten der Darmmukosa nach Antigenaufnahme... 17
2.1.3.1 Unspezifische Immunreaktion... 17
2.1.3.2 Spezifische Immunreaktion... 18
2.1.3.3 Orale Toleranz... 19
2.2 Lymphozytenmigration in der Darmschleimhaut... 19
2.2.1 Besonderheiten beim Schwein... 19
2.3 Immunglobuline... 22
2.3.1 IgG, IgA und IgM... 23
2.4 Zytokine... 25
2.4.1 IL-2...……... 26
2.4.2 IL-4...…... 27
2.4.3 TGF-β...…... 27
2.5 Tiermodell der Untersuchungen... 28
2.6 Induktion einer Immunantwort im Modell... 29
3 Material und Methoden... 30
3.1 Versuchstiere... 30
3.2 Operative Verfahren... 31
3.2.1 Narkose... 31
3.2.2 Resektion der mesenterialen Lymphknoten... 31
3.2.3 Venae sectio... 31
3.2.4 Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis... 32
3.3 Orale Immunisierung... 33
3.4 Untersuchung des Lymphflusses und der Anzahl nukleärer Zellen in der Darmlymphe... 34
3.5 Lymphozytenseparation aus dem Blut... 34
3.6 Herstellung der Zytopräparate... 35
3.7 Zellseparation aus lymphatischen Organen... 35
3.8 Herstellung von ELISPOTS... 37
3.8.1 Verwendete Zellen... 37
3.8.2 Beschichten, Block und Inkubation... 38
3.8.3 Primärer und sekundärer Antikörper, Substrat... 38
3.8.4 Auswertung... 39
3.9 In-Situ-Hybridisierung (ISH)... 39
3.9.1 Vorbehandlung der Präparate... 39
3.9.2 Hybridisierung... 40
3.9.3 Post-Hybridisierung... 40
3.9.4 Hybrid-Nachweis... 40
3.9.5 Auswertung... 41
3.10 Statistik... 41
4 Ergebnisse... 42
4.1 Operative Eingriffe und orale Immunisierung... 42
4.2 Lymphfluss über die Versuchsdauer... 42
4.2.1 Lymphfluss bei einzelnen Tieren... 43
4.2.2 Zusammenfassung des Lymphflusses bei allen Tieren... 46
4.3 Zellfluss über die Versuchsdauer... 47
4.3.1 Lymphozytenfluss bei einzelnen Tieren... 47
4.3.2 Zusammenfassung des Lymphflusses bei allen Tieren... 48
4.3.3 Fluss an anderen nukleären Zellen bei einzelnen Tieren... 49
4.3.4 Zusammenfassung des Flusses anderer nukleärer Zellen bei allen Tieren... 49
4.4 Antikörper-sezernierende Zellen in Blut, Lymphe und lymphatischen Organen... 51
4.4.1 Absolute Anzahl antikörper-sezernierender Zellen bei einzelnen Tieren... 51
4.4.1.1 Gesamtzahl der antikörper-sezernierenden Zellen in Blut und Lymphe... 54
4.4.1.2 Choleratoxin (CT)-spezifische antikörper-sezernierende Zellen in Blut und Lymphe... 54
4.4.1.3 Gesamtzahl und CT-spezifische antikörper-sezernierende Zellen in den lymphatischen Organen... 55
4.5 mRNA-Nachweis der Zytokine IL-2, IL-4 und TGF-β in der Lymphe... 60
4.5.1 Einfluss der Immunisierung auf den Anteil mRNA positiver Zellen.. 61
5 Diskussion... 63
5.1 Untersuchung der Immunreaktionen in Darmwand und Darmlymphe durch Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis beim Schwein... 63
5.2 Mittels der ELISPOT-Technik konnten unspezifische und choleratoxin- spezifische antikörper-sezernierende Zellen wiederholt im Blut, in verschiedenen Darmkompartimenten und in der Darmlymphe nachgewiesen werden... 65
5.2.1 Antikörper-sezernierende Zellen in Blut und afferenter Darmlymphe... 65
5.2.2 Akkumulation CT-spezifischer antikörper-sezernierender Zellen in der Lamina propria des Darmes... 67
5.3 mRNA-Nachweis der Zytokine IL-2, IL-4 und TGF-β in Zytopräparaten der afferenten Darmlymphe mittels in-situ-Hybridisierung... 68
5.4 Verändern sich aus dem Darm auswandernde Zellen in Art, Menge und Teilen ihrer funktionellen Eigenschaften durch die Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen?... 70
6 Zusammenfassung... 72
7 Summary... 74
8 Literaturverzeichnis... 76
9 Anhang... 82
9.1 Tabellen... 82
9.2 Lösungen, Puffer und Medien... 87
9.3 Verwendete Substanzen, Labormaterial und Geräte... 92
10 Publikation... 97
Abkürzungsverzeichnis
ADCC antibody-dependent-cell-mediated cytotoxicity AELVIS Automated ELISA-SPOT Assay Video
ANC andere nukleäre Zellen
APS-Puffer Alkalische Phosphatase Puffer AS antisense
BCIP 5-Brom, 4-Chlor, 3-Indonylphosphat p toluidinsalz BSA bovine serum albumin
CD cluster of differentiation
C-Region konstante Region
CT Choleratoxin CTB Choleratoxin Untereinheit B DDT DL-Dithiothreitol
DEPC Diethyl Pyrocarbonat
DNAse Desoxyribonuklease EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISPOT enzyme-linked-immunospot Fab-Fragment fragment antigen binding
Fc-Rezeptor Rezeptor für Fc-Fragment der Immunglobuline FCS fetal calf serum
GALT gut associated lymphoid tissues
HEV hochendotheliale Venen
i.v. intra venös
IEL intraepithelialer Lymphozyt
IFN Interferon
Ig Immunglobulin IL Interleukin il LP ileale Lamina propria il PP ilealer Peyerscher Plaque
ISH in-situ-Hybridisierung jej LP jejunale Lamina propria
jej PP jejunaler Peyerscher Plaque LPL Lamina propria Lymphozyt m LK mesenterialer Lymphknoten mRNA messenger ribonucleic acid
NBT Nitro Blue Tetrazolium
Nll. Nodi lymphatici
PBS Phosphate Buffered Saline PFA Paraformaldehyd
rCTB rekombinantes Choleratoxin Untereinheit B RNAse Ribonuklease
S sense SFC spot forming cells SSC sodium salt chlorid
TGF transforming growth factor
TNF Tumornekrosefaktor
tRNA transfer ribonucleic acid
V. Vena V-Region variable Region
1 Einleitung
Der Gastrointestinaltrakt beherbergt das größte Kompartiment des Immunsystems des Körpers, mit mehr Lymphozyten als in allen anderen Teilen des Immunsystems zusammen (MOWAT u. VINEY 1997). Das darmassoziierte lymphatische Gewebe (gut-associated lymphoid tissues = GALT) gehört zu den peripheren lymphatischen Organen. Hier werden Antigene aufgenommen, in die subepithelialen Gewebe transportiert und Lymphozyten präsentiert, wodurch eine adaptive Immunantwort ausgelöst wird.
Die Darmwand mit ihrem durch Zotten, Falten, Krypten und durch Mikrovilli stark vergrößertem mukösen Oberflächenepithel stellt die Grenze zwischen internem Milieu und externer Umwelt dar. Sie ist somit Eintrittspforte für eine Vielzahl verschiedenster Pathogene wie Viren, Bakterien und Parasiten, möglicherweise auch Prionen. Gleichzeitig ist eine ungestörte Aufnahme von Nährstoffen lebensnotwendig. Dies erfordert eine Differenzierung zwischen Pathogenen und harmlosen Nahrungsantigenen sowie kommensalen Bakterien (MOWAT u. VINEY 1997). Folglich ist dieses Differenzierungsvermögen einer der entschiedensten Regulationsmechanismen des Darmimmunsystems.
Die Aufnahme von Antigen in das darmassoziierte lymphatische Gewebe durch spezialisierte Epithelzellen der Darmwand, den M-Zellen, kann eine humorale oder zelluläre Immunreaktion auslösen oder sie führt zur Ausbildung oraler Toleranz.
Unter Berücksichtigung der enormen Antigenmenge im Gastrointestinaltrakt ist die Toleranz die häufigste Immunreaktion des Darmimmunsystems (MAYER 1998). Die den verschiedenen Immunreaktionen zugrundeliegenden Mechanismen sind noch nicht geklärt. Es wird die Beteiligung von Zytokinen, vor allem TGF-β, und die regulierende Funktion anderer Zellen des Darmimmunsystems wie den intraepithelialen Lymphozyten und den intestinalen Epithelzellen unterschiedlich diskutiert (ABBAS et al. 1996, MOWAT u. VINEY 1997, BRANDTZAEG et al. 1989,
MAYER 1998). Auch ist die Bedeutung der Antigenaufnahme über das normale Epithel für die Immunität noch nicht geklärt (MAYER 1998, BLAND 1999).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, weitere Erkenntnisse über Immunreaktionen in der Darmwand und den daran beteiligten Immunzellen und Zytokinen zu gewinnen.
Zur Untersuchung der Immunreaktionen in der Darmwand nach Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen wurde als Tiermodell die Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis am Schwein verwendet. Zuvor war eine Resektion der mesenterialen Lymphknoten erfolgt, die zur Anastomisierung der afferenten und efferenten Lymphgefäße führte. Folglich gelangten mit der afferenten Lymphe aus dem Darm auswandernde Zellen in den Truncus lymphaticus intestinalis und wurden durch Kanülierung gewonnen. Einige Tage nach Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis wurden die Tiere im Zeitraum der Lymphsammlung oral mit Choleratoxin immunisiert, um eine Immunreaktion zu induzieren.
Vor und nach oraler Immunisierung erfolgte:
• die Bestimmung des Lymphflusses und der Anzahl an Lymphozyten und anderen nukleären Zellen (neutrophile und eosinophile Granulozyten und dendritische Zellen) in der gesammelten afferenten Darmlymphe.
• eine Untersuchung des Blutes, der gesammelten Darmlymphe, verschiedener Darmkompartimente und der mesenterialen Lymphknoten auf die Gesamtzahl antikörper-sezernierender Zellen und choleratoxin-spezifische antikörper- sezernierende Zellen.
• eine Untersuchung von Zytopräparaten der Darmlymphe auf die mRNA der Zytokine IL-2, IL-4 und TGF-β.
Folgende Fragestellungen sollten beantwortet werden:
• Kommt es nach Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen zu Immunreaktionen in der Darmwand und Darmlymphe?
• Welche Zellen wandern aus dem Darm aus und in welcher Menge? Welche Hinweise auf ihre Funktion lassen sich schließen?
• Verändern sich die auswandernden Zellen in Art, Menge und Teilen ihrer funktionellen Eigenschaften durch die Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen?
2 Literaturübersicht
2.1 Darmimmunsystem
2.1.1 Einordnung
Das darmassoziierte lymphatische Gewebe (gut-associated lymphoid tissues = GALT) zählt, neben Milz und Lymphknoten, zu den peripheren lymphatischen Organen. Zusammen mit den lymphatischen Geweben des Respirationstraktes und anderen Mukosageweben ist es Bestandteil des integrierten Mukosa-Immunsystems (CZERKINSKY et al. 1991, ABBAS et al. 1996).
Wie in anderen peripheren lymphatischen Organen werden im GALT Antigene aufgenommen, in subepitheliale Gewebe transportiert und den Lymphozyten präsentiert, um eine adaptive Immunantwort auszulösen. Die Peyerschen Plaques als organisierte lymphatische Gewebe und die Lymphozyten in Epithel und Lamina propria stellen hierbei das Induktions- und Effektorkompartiment dar (MOWAT u.
VINEY 1997).
2.1.2 Aufbau und Bestandteile (Abb.1)
2.1.2.1 Intestinales Epithel
Das Schleimhautepithel des Darmes stellt die Grenze zwischen innerer und äußerer Umgebung dar und ist die erste Verteidigungslinie. Die intestinalen Epithelzellen werden als nichtprofessionelle antigen-präsentierende Zellen eingeordnet, mit
vermutlich entscheidender Rolle bei der Regulation der Immunantwort (MAYER 1998, BLAND 1999, HERSHBERG u. MAYER 2000).
Inzwischen konnte der transzelluläre Transport flüssiger Antigene durch intakte intestinale Epithelzellen gezeigt werden sowie der parazelluläre Transport von Makromolekülen durch zerstörte tight junctions des normalen intestinalen Epithels, seine Bedeutung für die Immunität ist jedoch noch nicht geklärt (MAYER 1998, BLAND 1999).
IEL
LPL IEL
LPL T
B-Zell- Follikel
T
intestinales Epithel Lamina propria mucosae Lamina muscularis mucosae Tela submucosa
afferente Lymphgefäße
mesenterialer Lymphknoten
efferentes Lymphgefäß (Truncus lymphaticus intestinalis) Ductus thoracicus
Blutbahn
Domregion
M-Zelle Darmlumen
IEL
=intraepithelialer Lymphozyt LPL
=Lamina propria Lymphozyt
Abb.1:
Aufbau und Bestandteile des Darmimmunsystems
Das intestinale Epithel bildet die Grenze zwischen Darmwand und Darmlumen. Das follikel-assoziierte Epithel über der Domregion enthält M-Zellen (M) zur Antigen- aufna hme. Lymphfollikelanhäufungen werden als Peyersche Plaques bezeichnet und bilden mit den mesenterialen Lymphknoten das Induktionskompartiment, die intraepithelialen (IEL) und Lamina propria Lymphozyten (LPL) bilden das Effektorkompartiment. Die mesenterialen Lymphknoten drainieren die Peyerschen Plaques mittels der afferenten Lymphgefäße und sind über die efferenten Lymphgefäße und den Truncus lymphaticus intestinalis mit dem Ductus thoracicus verbunden, der in die Blutbahn mündet.
2.1.2.2 Peyersche Plaques und mesenteriale Lymphknoten
Die Peyerschen Plaques sind anatomisch klassische sekundäre Lymphorgane mit definierten B- und T-Zell-Arealen (MOWAT u. VINEY 1997). Die B-Zell-Follikel mit angrenzenden T-Zell-Arealen liegen in der Submucosa des Dünndarmes und werden von mesenterialen Lymphknoten drainiert. Hierdurch kommt es zur Verbindung des Darmimmunsystems über den Blutkreislauf mit anderen lymphatischen Mukosa- geweben, weshalb man vom integrierten Mukosa-Immunsystem spricht.
MOWAT u. VINEY (1997) definieren Peyersche Plaques und mesenteriale Lymphknoten als Induktionskompartiment im Gegensatz zum Effektorkompartiment, in Form der Lymphozyten in der Lamina propria und im Epithel. Im Induktionskompartiment kommt es zur Antigenaufnahme und Induktion einer Immunantwort der B- und T-Zellen.
Das sog. follikel-assoziierte Epithel über den Peyerschen Plaques enthält spezialisierte Epithelzellen, die M-Zellen. Diese haben an ihrer Oberfläche keine Mikrovilli, aber Falten und Spalten zur Anheftung von Antigenen, die durch die Transportfunktion der M-Zellen Zugang zum GALT erhalten (MOWAT u. VINEY 1997). In der Domregion, zwischen follikel-assoziiertem Epithel und Follikel, kommt es anschließend zur Präsentation der aufgenommenen Antigene durch professionelle antigen-präsentierende Zellen, was zur B-Zell Differenzierung und T- Zell Aktivierung führt (BRANDTZAEG et al. 1989, MCGHEE et al.1992).
2.1.2.3 Intraepitheliale Lymphozyten und Lamina propria Lymphozyten
Intraepitheliale Lymphozyten liegen zwischen den Epithelzellen an der Basalmembran und befinden sich in unmittelbarer Nähe zum Antigen im Lumen des Darmes. Es handelt sich fast ausschließlich um T-Zellen, von denen 80% CD8+ sind.
Intraepitheliale Lymphozyten sind an der Regulation der mukosalen Immunantwort beteiligt und scheinen in der Regel zur Ausbildung von Toleranz zu führen (BRANDTZAEG 1989, MOWAT u. VINEY 1997).
In der Lamina propria sind 40-60% aller lymphatischen Zellen T–Zellen, die im Gegensatz zu den intraepithelialen Lymphozyten hauptsächlich CD4+ sind; 40-60%
aller lymphatischen Zellen sind B-Zellen, hauptsächlich in Form von Plasmazellen (MCGHEE et al. 1992).
Intraepitheliale Lymphozyten und Lamina propria Lymphozyten bilden das Effektorkompartiment.
2.1.3 Immunantworten der Darmmukosa nach Antigenaufnahme
Neben unspezifischen und spezifischen Immunreaktionen kommt es im Darm, angesichts der großen Antigenmengen im Gastrointestinaltrakt, am häufigsten zur Ausbildung von oraler Toleranz (MAYER 1998). Dies beruht auf der lebensnotwendigen Differenzierung zwischen Pathogenen und harmlosen Nahrungs- antigenen sowie kommensalen Bakterien (MOWAT u. VINEY 1997).
2.1.3.1 Unspezifische Immunreaktion
Die unspezifische Immunreaktion dient der sofortigen Abwehr bis zum Einsetzen der spezifischen Immunreaktion, die sie auslösen und in ihrer Art beeinflussen kann.
Phagozytierende Makrophagen, die sich im Darm in großer Menge in der Lamina propria befinden, spielen als zelluläre Bestandteile neben neutrophilen Granulozyten eine entscheidende Rolle und induzieren als professionelle antigen-präsentierende Zellen die spezifische oder adaptive Immunantwort (JANEWAY u. TRAVERS 1997, MOWAT u. VINEY 1997). Aber auch die intestinalen Epithelzellen sind Teil der unspezifischen Immunantwort des Darmes. Sie stellen mit ihrer präepithelialen Mukusschicht eine chemisch-physikalische Barriere dar, die das Anheften und Eindringen von Krankheitserregern und Toxinen verhindert (PABST 1987).
2.1.3.2 Spezifische Immunreaktion
Die spezifische Immunreaktion dient dem Schutz vor pathogenen Mikroorganismen, die das unspezifische Abwehrsystem überwunden haben. Durch klonale Selektion kommt es zur Proliferation spezifischer Lymphozyten, die zur Vernichtung des Erregers zu Effektorzellen differenzieren. Zusätzliche Differenzierung zu Gedächtnis- zellen schützt außerdem vor erneuter Infektion (JANEWAY u. TRAVERS 1997).
In Abhängigkeit der beteiligten Komponenten unterscheidet man die humorale und die zelluläre Immunität:
Bei der humoralen Immunität erfolgt die Erkennung und Elimination von Antigenen durch Antikörper (Immunglobuline) im Serum oder anderen Körperflüssigkeiten.
Somit dient sie hauptsächlich zur Abwehr extrazellulärer Mikroorganismen (ABBAS et al. 1996). B-Zellen werden durch Antigenbindung an ihre Oberflächen- immunglobuline und Wechselwirkung mit spezifischen T-Helferzellen aktiviert, wodurch es zur Proliferation und Differenzierung zu spezifischen Effektorzellen, den antikörper-sezernierenden Plasmazellen, kommt. Außerdem differenzieren einige B- Zellen zu den oben erwähnten Gedächtniszellen.
Die zelluläre Immunität beruht auf T-Zellen, die für die Abwehr intrazellulärer Mikroorganismen verantwortlich sind. Naive T-Zellen werden durch spezifisches Antigen auf antigenpräsentierenden Zellen bei gleichzeitiger Expression eines costimulierenden Moleküls aktiviert, was sie zur IL-2 Produktion anregt. IL-2 bewirkt wiederum ihre Proliferation und Differenzierung zu T-Effektorzellen, die entweder als CD8-T-Zellen die Zielzellen abtöten oder als CD4-T-Zellen Makrophagen bzw. B- Zellen aktivieren. T-Effektorzellen scheinen so die gesamte adaptive Immunantwort zu kontrollieren. Wie bei den B-Zellen differenzieren einige T-Zellen zu Gedächtniszellen.
Im Darmimmunsystem findet die Präsentation der über M-Zellen aufgenommenen Antigene in der Domregion über den Peyerschen Plaques statt (BRANDTZAEG et al.
1989, MCGHEE et al.1992). Sie führt zur Induktion der B- und T-Zellantwort in den Peyerschen Plaques und den mesenterialen Lymphknoten, weshalb diese als Induktionskompartiment des Darmimmunsystems bezeichnet werden (MOWAT u.
VINEY 1997). Die Lymphozyten im intestinalen Epithel und in der Lamina propria sind zum größten Teil T- und B-Effektorzellen, in Form von CD8- und CD4-T-Zellen und Plasmazellen, sie bilden das Effektorkompartiment des Darmimmunsystems (MCGHEE et al. 1992).
2.1.3.3 Orale Toleranz
Die orale Verabreichung von Protein-Antigenen führt bei wiederholter Immunisierung mit dem gleichen Antigen häufig zur Hemmung der humoralen und zellulären Immunantwort. Die Bedeutung liegt wahrscheinlich in der Unterdrückung der Immunantwort gegen physiologische bakterielle Darmbewohner und Nahrungsproteine. Welche Mechanismen der Entwicklung von Toleranz zugrunde liegen, ist noch nicht geklärt. Während die Beteiligung des immunmodulierenden Zytokins TGF-β schon länger diskutiert wird, kommen immer wieder neue Ansätze hinzu (ABBAS et al. 1996, MOWAT u. VINEY 1997). MAYER (1998) geht von einer regulatorischen Funktion der intestinalen Epithelzellen aus und BLAND (1999) sieht die Induktion oraler Toleranz in Abhängigkeit von der Art der Antigenprozessierung.
SLAVIN und WEINER (1999) beschreiben die dosisabhängige Auslösung von Deletion, Anergie oder aktiver zelluärer Suppression beruhend auf der Sekretion suppressiver Zytokine wie IL-4, IL-10 und TGF-β. Durch diese unterschiedlichen Einflussfaktoren wird die komplexe Regulation deutlich.
2.2 Lymphozytenmigration in der Darmschleimhaut
Das GALT ist Bestandteil des integrierten Mukosa-Immunsystems (CZERKINSKY et al. 1991, ABBAS et al. 1996), dessen verschiedene Mukosagewebe (oral, intestinal, respiratorisch, genital) durch die Lymphozytenmigration verbunden sind, wodurch es zum immunologischen Informationsaustausch kommt. Untersuchungen von
MCDERMOTT und BIENENSTOCK (1979), die das Einwandern von B- Lymphoblasten aus mesenterialen Lymphknoten in den Respirations- und Genitaltrakt zeigen, stützen dieses Konzept wie auch der Nachweis spezifischer antikörper-sezernierender Zellen in Speichel und Tränenflüssigkeit nach oraler Immunisierung durch CZERKINSKY et al. (1987, 1991).
Nach Antigenstimulation in den Peyerschen Plaques verlassen antigenaktivierte T- und B-Zellen die Peyerschen Plaques über afferente Lymphgefäße, gelangen in die mesenterialen Lymphknoten und über efferente Lymphgefäße und den Ductus thoracicus in den systemischen Blutkreislauf. Von hier wandern sie wieder in die Lamina propria des Gastrointestinaltraktes, als größtes mukosales Effektororgan, ein (MCGHEE et al. 1992).
Die gezielte Migration im GALT, aber auch im gesamten mukosalen Immunsystem, lässt sich nach BRANDTZAEG et al. (1999 b) durch verschiedene Adhäsionsmoleküle der Gefäßendothelien sowie Effektorzellen und durch unterschiedliche lokale Zytokinprofile erklären, ist aber noch nicht vollkommen verstanden. So erwägen DAVENPORT et al. (2000) ein Modell bei dem aktivierte Lymphozyten, aufgrund ihrer verschiedenen Adhäsionsmoleküle und Zytokinrezeptoren, in verschiedene Gewebe einwandern, es aber nur am Ort ihrer Aktivierung durch erneuten Antigenkontakt zu weiterer Proliferation und Differenzierung zu Gedächtniszellen kommt.
Die Migration erfolgt zum Teil durch besondere sog. hochendotheliale Venen (HEV) in einem mehrphasigen Adhäsionsprozess mit anschließender Transmigration in Peyersche Plaques, Lymphknoten und Tonsillen. Sie wird aber in noch größerem Umfang in Organen ohne HEV beobachtet, wie Lunge, Leber und Milz (PABST u.
ROTHKÖTTER 1997). Die Migration von Lymphozyten in die intestinale Lamina propria erfolgt durch Blutgefäße im Bereich der Krypten, über ihr weiteres Schicksal ist wenig bekannt (ROTHKÖTTER et al. 1999).
Für die in das Epithel eingewanderten intraepithelialen Lymphozyten erwägen ROTHKÖTTER et al. (1999) die Möglichkeit der Remigration in die Lamina propria oder der Abgabe ins Darmlumen mit Epithelzellen; die T-Effektor-Zellen der Lamina propria scheinen nach erneutem Antigenkontakt der Apoptose zu unterliegen.
Durch Migration gelangen aktivierte Lymphozyten vom Induktionsbereich (Peyersche Plaques) bevorzugt in den dazugehörigen Effektorbereich (intestinale Lamina propria). Man bezeichnet dies als „homing“.
2.2.1 Besonderheiten beim Schwein
Beim Eintritt der Lymphozyten in die Blutzirkulation liegt beim Schwein eine Besonderheit vor. Sie erfolgt nicht, wie bei den anderen erforschten Spezies, über die efferente Darmlymphe, sondern rezirkulierende Lymphozyten gelangen bereits in den Lymphknoten ins Blut (BENNELL u. HUSBAND 1981 a, b, BINNS et al. 1985).
Dieser Speziesunterschied spiegelt sich im invertierten Aufbau der Lymphknoten des Schweins bzgl. Medulla und Cortex. LIEBICH (1993) beschreibt außerdem einen umgekehrten Lymphfluss gegenüber den anderen Haussäugetieren aufgrund des Eintritts der afferenten Lymphgefäße am Hilus und Austritts der efferenten Lymphgefäße über die Kapsel. Auch ein abweichender Verlauf der Venen, die in höherer Anzahl über die Oberfläche verteilt liegen und nicht wie bei anderen Spezies als einziges Gefäß am Hilus, wurde von BENNELL und HUSBAND (1981 a) beobachtet.
Folge dieser Besonderheiten ist eine ausgesprochen zellarme efferente Darmlymphe (BINNS et al. 1985, BENNELL u. HUSBAND 1981 a) . Hierdurch eignet sich das Schwein in besonderem Maße für das Modell der Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis nach vorheriger Resektion der mesenterialen Lymphknoten zur Gewinnung der afferenten Darmlymphe (ROTHKÖTTER et al. 1993, 1995).
2.3 Immunglobuline
Die Produktion von Immunglobulinen (Antikörpern) durch B-Zellen stellt ein Maß für die humorale Immunantwort dar und war folglich für uns zur Untersuchung der Immunreaktionen in Darmwand und Lymphe von besonderem Interesse.
Immunglobuline befinden sich in freier Form (Antikörper) im Blutplasma und im Extrazellularraum, bilden aber auch als Oberflächenimmunglobuline den Antigenrezeptor der B-Zellen. Bei Bindung von Antigen an diesen Rezeptor kommt es, durch die Funktion der B-Zellen als professionelle antigen-präsentierende Zellen, zur Differenzierung von B-Zellen zu antikörper-sezernierenden Plasmazellen. Es kann aber auch durch die Aktivierung naiver T-Zellen die zelluläre Immunantwort eingeleitet werden.
CZERKINSKY et al. (1991) fanden mit ihren Untersuchungen zu antikörper- sezernierenden Zellen im Blut und in Speicheldrüsen nach oraler Immunisierung einen weiteren Beweis für das integrierte Mukosa-Immunsystem und konnten die Entlassung aktivierter B-Zellen in die Zirkulation mit jedem Antigenkontakt der Darmmukosa zeigen. Dies deckt sich mit Befunden von THIELKE et al. (1999), die zeigen, dass proliferierende B-Zellen aus dem Darm auswandern.
Die variable Region (V-Region) der Immunglobuline dient der spezifischen Bindung des Antigens, während die konstante Region (C-Region) durch Auslösung verschiedener Effektormechanismen zur Beseitigung des Antigens führt. Die fünf verschiedenen Hauptformen der C-Region werden als Isotypen IgM, IgD, IgG, IgE und IgA bezeichnet, die über ihr Fc-Fragment unterschiedliche Immunwirkungs- mechanismen aktivieren. Die Gene für die V-Region einer B-Zelle werden bereits bei einer frühen Entwicklungsphase im Knochenmark festgelegt und verändern sich nur noch durch somatische Hypermutation. Die Gene für die C-Region wechseln über die Immunantwort während der Proliferation und Differenzierung zu B-Effektorzellen.
Zuerst entstehen immer IgM Antikörper, später IgG, IgA oder IgE. Dieser Klassenwechsel erfolgt erst nach Antigenstimulation der B-Zelle und wird durch Zytokine der T-Zellen gesteuert (JANEWAY u. TRAVERS 1997).
Ein Effektormechanismus des Darmimmunsystems ist das sekretorische Immunglobulinsystem. Es beruht auf der Kooperation zwischen dem lokalen B- Zellsystem und dem sekretorischen Mukosaepithel. Beim Menschen befinden sich 80% der immunglobulin-produzierenden Zellen in der Darmmukosa, deren hohe IgA Produktion, als sekretorisches IgA in der präepithelialen Mukusschicht, eine erste Verteidigungslinie darstellt, aber auch vor gewebsschädigenden Immunantworten gegen harmlose luminale Antigene schützt (BRANDTZAEG et al. 1989).
KETT et al. (1995) konnten einen Effekt der Darmbakterien auf die lokale Immunglobulinantwort zeigen und sehen eine entscheidende Bedeutung von sekretorischem IgA und IgM bei der Aufrechterhaltung der Darmschranke, im Gegensatz zu den entzündlichen Eigenschaften lokaler IgG-Antikörper.
Im weiteren wird auf Ausführungen zu IgE verzichtet, da diesem Isotyp im Rahmen dieser Arbeit keine weitere Bedeutung zukommt.
2.3.1 IgG, IgA und IgM:
IgG:
IgG Antikörper befinden sich vor allem im Blut und extrazellulären Flüssigkeiten.
Speziesspezifisch können sie durch Fc-Rezeptoren auf den Epithelzellen der Plazenta in den Blutkreislauf des Feten gelangen.
IgG kann Viren, Bakterien und Toxine neutralisieren. Sein Fc-Fragment wird vom Fc- Rezeptor der Phagozyten erkannt, was zur Bindung und Aufnahme IgG bedeckter Krankheitserreger führt. Durch den Antigen-Antikörper-Komplex kann es aber auch zur Aktivierung der Komplementkaskade kommen oder es werden, durch Bindung von IgG-Antikörpern an Zielzellen, im Rahmen der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC=antibody-dependend cell-mediated cytotoxizität), natürliche Killerzellen aktiviert.
Nach oraler Immunisierung dominieren im Serum IgG-Antikörper gegenüber IgA- Antikörpern bei gleicher Zeitkinetik (CZERKINSKY et al. 1991). Auch ERIKSSON et al. (1998) beobachteten die deutliche Dominanz spezifischer IgG antikörper- sezernierender Zellen gegenüber spezifischer IgA antikörper-sezernierender Zellen
im Serum nach rektaler Immunisierung mit Choleratoxin; in der rektalen Mukosa lag die Anzahl spezifischer IgG antikörper-sezernierender Zellen gering über der spezifischer IgA antikörper-sezernierender Zellen.
IgA:
IgA-Antikörper befinden sich als Dimer in Sekreten vor allem von Darm- und Respirationstrakt und exokrinen Drüsen wie Milch-, Speichel- und Tränendrüse. Sie haben neutralisierende Wirkung gegen Viren, Bakterien und Toxine auf Schleimhäuten.
Die IgA-Antikörper befinden sich vorwiegend auf epithelialen Oberflächen und sind entscheidender Bestandteil im Oberflächenschleim. Ihre Synthese erfolgt durch Plasmazellen in der darunter liegenden Lamina propria. Durch Transcytose gelangen die Antikörper auf die apikale Seite des Epithels, hierbei bleibt ein Teil des Poly-Ig- Rezeptors der Epithelzelle als sekretorische Komponente an IgA gebunden (BRANDTZAEG et al. 1989).
Aufgrund der transepithelialen Sekretion spielt IgA eine wichtige Rolle bei der Abwehr intestinaler Pathogene und macht ca. 70% der Gesamtantikörperproduktion aus (ABBAS et al. 1996). Die für den Klassenwechsel von IgM nach IgA verantwortlichen Zytokine sind TGF-β und IL-5 (JANEWAY u. TRAVERS 1997).
IgA wird in großen Mengen in der Darmmukosa produziert und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des immunologischen Gleichgewichtes in der intestinalen Lamina propria durch Dämpfung der entzündlichen IgG- und IgE-Antworten gegen harmlose luminale Antigene (BRANDTZAEG et al. 1989). Außerdem zeigen Untersuchungen von CZERKINSKY et al. (1987, 1991), dass sich nach oraler Immunisierung Vorläuferzellen der IgA- Plasmazellen im Blut befinden, die in sekretorischen Geweben zu IgA-Plasmazellen differenzieren und dort zu einem dominierenden Anstieg antigenspezifischer IgA- Antikörper führen.
IgM:
IgM-Antikörper befinden sich vor allem im Serum. Sie liegen als Pentamer vor, wodurch sie nach Antigenbindung besonders effizient auf klassischem Wege das Komplementsystem aktivieren. Bei einer Immunantwort werden IgM-Antikörper
immer zuerst gebildet, durch Klassenwechsel entstehen dann im Verlauf der Immunantwort die anderen Isotypen. THIELKE et al. (1999) bestimmten bei aus dem Darm emigrierenden Zellen und im Blut den Anteil IgM+ Zellen und proliferierender IgM+ Zellen. Über ihr Verhalten im Rahmen einer Immunantwort ist aber noch nichts bekannt.
2.4 Zytokine
Die Zytokine sollten uns ,wie schon die Immunglobuline, aufgrund ihrer T-Zell- Effektorfunktion weiteren Aufschluss über Immunreaktionen in der Darmwand und Darmlymphe geben. Gerade den an der Regulierung der spezifischen Immunantwort beteiligten Zytokinen IL-2, IL-4 und TGF-β galt unser besonderes Interesse.
Zytokine sind kleine, lösliche Proteine und Glykoproteine, die bevorzugt von Zellen des Immunsystems, aber auch von anderen Zellen, wie den intestinalen Epithelzellen, gebildet werden. Sie wirken entweder auf die freisetzende Zelle selbst oder auf andere Zellen meist lokal, wobei die Wirkung von der Zielzelle abhängt.
T-Effektorzellen setzen Zytokine polarisiert an der Stelle des Kontaktes mit der Zielzelle frei. Bei CD8-T-Effektorzellen ist dies IFN-γ, das die virale Replikation hemmt. TH1-Zellen bilden hingegen IFN-γ als wichtigstes makrophagen-aktivierendes Zytokin, während TH2-Zellen die B-Zellen aktivierenden Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 sezernieren (JANEWAY u. TRAVERS 1997). Aktivierte CD4-T-Zellen bilden IL-2 als wichtigsten autokrinen Wachstumsfaktor (ABBAS et al. 1996). Die Zytokinwirkung ist, neben der Wirkung membrangebundener Effektormoleküle und der Wirkung von Zytotoxinen, eine der T-Zell-Effektorfunktionen, aber auch für den Isotypenwechsel der Antikörper verantwortlich (JANEWAY u. TRAVERS 1997).
Zytokine und deren Rezeptoren lassen sich aufgrund ihrer Struktur in Familien einteilen: Hämatopoetine (u.a. IL-2 und IL-4), Interferone, Chemokine, Tumor- nekrosefaktoren (TNF) und der transforming growth factor-β (TGF-β).
Die Zytokine IL-2, IL-4 und TGF-β regulieren die Aktivierungsphase der spezifischen Immunantwort, sie bewirken die Proliferation und Differenzierung der Lymphozyten (ABBAS et al. 1996). Gebildet werden sie von CD4-T-Zellen, IL-4 aber auch von Mastzellen und TGF-β zusätzlich von Monozyten, Makrophagen und anderen Zellarten wie den intestinalen Epithelzellen (BLAND 1999).
2.4.1 IL-2
Der T-Zellwachstumsfaktor IL-2 wird von aktivierten T-Zellen, vor allem CD4-T- Zellen, synthetisiert, die ebenfalls die hochaffine Form des IL-2-Rezeptors exprimieren. Durch die Bindung von IL-2 kommt es zur Proliferation der aktivierten T- Zellen und Differenzierung ihrer Nachkommen zu T-Effektorzellen. Mit seiner Wirkung auf die produzierenden Zellen selbst wie auch auf benachbarte Zellen, ist es ein autokriner sowie parakriner Wachstumsfaktor. Voraussetzung für die Synthese von IL-2 sind costimulatorische Signale.
Die Hauptwirkungen von IL-2 auf Lymphozyten sind:
• IL-2 ist der wichtigste autokrine Wachstumsfaktor für T-Lymphozyten, durch seine synthetisierte Menge wird das Ausmaß der zellulären Immunantwort bestimmt. Eine unzureichende IL-2 Produktion scheint zur T-Zell-Anergie zu führen. Die Signalübetragung erfolgt durch Bindung an den IL-2 Rezeptor.
• IL-2 stimuliert die Proliferation der natürlichen Killerzellen und erhöht ihre Zytotoxizität. Synergistisch mit IL-12 induziert es die Sekretion von IFN-γ durch natürliche Killerzellen.
• IL-2 stimuliert die Proliferation und Antikörpersynthese von B-Zellen (ABBAS et al. 1996).
Bei den Lamina propria-T-Zellen des Schweins wurde bisher keine IL-2 Sekretion beobachtet, weshalb sie HAVERSON et al. (1999) unter anderem nicht den klassischen Gedächtniszellen zuordnen.
2.4.2 IL-4
IL-4 wird in erster Linie von CD4-T-Zellen, speziell TH2-Zellen, gebildet und führt zur Proliferation antigenbindender B-Zellen und somit zur Auslösung der humoralen Immunantwort. Außerdem erhöht IL-4 die Expression von MHC-II-Molekülen auf Plasmablasten, den Vorläufern der antikörper-sezernierenden Plasmazellen. Auch aktivierte Mastzellen, basophile Granulozyten und einige CD8-T-Zellen können IL-4 produzieren. Weitere Wirkungen von IL-4 sind:
• die Stimulation des Klassenwechsels von B-Zellen zu IgE.
• die Hemmung der Makrophagenaktivierung.
• die Proliferation und Differenzierung antigenstimulierter, naiver T-Zellen zu TH2-Zellen.
• die Stimulation der Expression bestimmter Adhäsionsmoleküle auf Endothel- zellen, was zur Auslösung lokaler Entzündungsreaktionen führt.
• die Stimulation der Mastzellproliferation zusammen mit IL-3 (ABBAS et al.
1996).
BLUMBERG et al. (1999) sehen die CD4-T-Zellen als die Haupteffektorzellen bei einer experimentellen Entzündung, was hier vor allem auf der IL-4 Sekretion der TH2- Zellen beruht. Im Rahmen der immunologischen Toleranzentwicklung wird IL-4 aber, zusammen mit IL-10 und TGF-β, zu den suppressiven Zytokinen gezählt, die für die zelluläre Suppression verantwortlich sind (SLAVIN u. WEINER 1999).
2.4.3 TGF-β
Die Entdeckung des transforming growth factor-β (TGF-β) wurde auf dem Gebiet der Tumorbiologie gemacht. Der transforming growth factor ermöglichte es normalen Zellen im Softagar zu wachsen. Die TGF-β Familie besteht aus eng verwandten Molekülen, die von separaten Genen codiert werden, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3. Als Zytokin wirkt TGF-β auf viele Lymphozytenreaktionen antagonistisch, so hemmt es die T-Zell-Proliferation, die Reifung zytotoxischer T-Zellen und die
Makrophagenaktivierung. Folglich liegt eine seiner Funktionen vielleicht in der Beendigung der Immunantwort (ABBAS et al.1996).
Aufgrund neuerer Erkenntnisse beschreibt man sogenannte TH3-Zellen, eine Untergruppe der CD4-T-Zellen, als TGF-β produzierende Zellen (SLAVIN u. WEINER 1999, BLUMBERG et al. 1999). BLAND (1999) sieht in TGF-β aber auch das Hauptzytokin der intestinalen Epithelzelle, das ihre Differenzierung reguliert und Epithelschäden verhindert. Aufgrund seiner Wirkung auf B-Zellen, die es zum Klassenwechsel zu IgA veranlasst, geht man von einer entscheidenden Rolle bei der Entstehung der Immunantwort in der Mukosa aus (ABBAS et al.1996).
TGF-β gehört zu den suppressiven Zytokinen, das durch seine antiinflammatorische Eigenschaft an der Entstehung oraler Toleranz beteiligt ist (SLAVIN u. WEINER 1999, BLUMBERG et al. 1999). BLUMBERG et al. (1999) nehmen an, dass TGF-β zur Aufrechterhaltung eines Suppressor-Effektes notwendig ist, aber auch als Effektormolekül selbst wirkt. Die genauen Wirkungsmechanismen und Zielzellen von TGF-β sind noch nicht bekannt.
2.5 Tiermodell der Untersuchungen
Die vorliegende Arbeit erbrachte eine Übersicht der in der Darmwand und Darmlymphe ablaufenden Immunreaktionen nach oraler Immunisierung.
Voraussetzung hierfür war die kontinuierliche Sammlung der afferenten Darmlymphe über einen längeren Zeitraum. Dies wurde durch das Tiermodell der Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis am Schwein erreicht.
Um ausschließlich afferente Darmlymphe zu erhalten, war bei den Tieren zuvor eine Resektion der mesenterialen Lymphknoten erfolgt. Dies führt zur Bildung von Anastomosen zwischen den afferenten und efferenten Lymphgefäßen und somit zur Mündung der afferenten Lymphe in den Truncus lymphaticus intestinalis (REYNOLDS 1988).
Das Schwein ist für dieses Modell besonders geeignet, da der Einfluss versehentlich belassener mesenterialer Lymphknoten aufgrund seiner ausgesprochen zellarmen efferenten Darmlymphe zu vernachlässigen ist (BINNS et al. 1985, BENNELL u.
HUSBAND 1981 a). Außerdem sprechen Parallelen zu den Verhältnissen beim Menschen bezüglich der zellulären Bestandteile des Darmimmunsystems, wie die Verteilung der T-Zell-Subpopulationen und die auftretenden Isotypen immunglobulin- positiver Zellen, für das Schwein als Versuchstier in diesem Modell (ROTHKÖTTER et al. 1991). Zudem ermöglicht die Größe der Tiere die kontinuierliche Kanülierung über mehrere Tage unter konventionellen Haltungsbedingungen. Dabei ist es nicht notwendig einen Stoffwechselkäfig zu verwenden, so dass die Tiere sich frei bewegen können.
2.6 Induktion einer Immunantwort im Modell
Auch wenn der Magen-Darm-Trakt in erster Linie darauf ausgerichtet ist auf luminale Antigene nicht zu reagieren, können oral aufgenommene Antigene durch Auslösung von Immunreaktionen abgewehrt werden. Dies ist Voraussetzung für die orale Immunisierung, die eine effektive, antigenspezifische Immunität induziert. Orale Immunisierung ist zwar mehrfach beschrieben, ihr genauer Mechanismus ist jedoch nicht bekannt (MANGANAROW et al. 1994, SHALABY 1995).
Die Kombination aus Choleratoxin (CT) und Choleratoxin Untereinheit B (CTB) haben sich in dieser Arbeitsgruppe und in dem hier verwendeten Modell zur zuverlässigen Auslösung einer Immunreaktion sehr bewährt. Das komplette Toxin als Induktor einer Immunreaktion wird durch die immunogene Komponente des CTB verstärkt.
Choleratoxin besteht aus einer α- und β-Untereinheit. Die β-Untereinheit bindet am GM1 Gangliosid, einem Molekül auf Epithelzellen, während die α-Untereinheit enzymatische Aktivität hat. Außerdem gilt Choleratoxin als das potenteste, mukosale Adjuvans (SLAVIN u. WEINER 1999).
3 Material und Methoden
(Rezepturen der verwendeten Lösungen, Puffer und Medien sowie die Herstellernachweise der verwendeten Materialien befinden sich im Anhang)
3.1 Versuchstiere
Als Versuchstiere dienten 7 Göttinger Miniaturschweine (Versuchstiergut Relliehausen der Universität Göttingen). Die Tiere waren klinisch gesund und ausschließlich weiblichen Geschlechts. Es erfolgte bei allen Tieren eine Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis nach vorheriger Resektion der mesenterialen Lymphknoten. Im Zeitraum der Lymphsammlung wurden die Tiere oral immunisiert.
Die Versuche wurden entsprechend der Tierversuchsgenehmigung der Bezirksregierung Hannover (509i-42502-98/131 vom 26. November 1998) im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.
3.2 Operative Verfahren
3.2.1 Narkose
Die Prämedikation erfolgte i.m. mit 0,5 ml Atropin und 5 ml (2 mg/kg) Stresnil. Die Narkose wurde mit 5 ml Trapanal i.v. (Ohrvene) eingeleitet und durch weitere Gaben von Trapanal aufrechterhalten.
3.2.2 Resektion der mesenterialen Lymphknoten
Im Alter von 3 Monaten wurde bei allen Tieren eine Lymphadenektomie der Nll.
jejunales und ileocolici durchgeführt. Mittels medianer Laparotomie wurde die Bauchhöhle eröffnet und nach Spaltung des Peritoneums viscerale eine Resektion der mesenterialen Lymphknoten vorgenommen. Der Verschluss der Blutgefäße erfolgte durch Elektrokoagulation. Nach Naht des Peritoneums wurde die Bauchwand schichtweise mit resorbierbaren Fäden verschlossen.
Postoperativ bilden sich Anastomosen zwischen den afferenten und efferenten Lymphgefäßen (REYNOLDS 1988). Durch anschließende Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis können mit der afferenten Lymphe aus dem Darm auswandernden Zellen gesammelt werden (REYNOLDS 1988, ROTHKÖTTER et al.
1993).
3.2.3 Venae sectio
Die Venae sectio erfolgte unmittelbar vor der Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis, um über den gesamten Versuch einen leicht zugänglichen venösen
Zugang zur Verfügung zu haben durch den parallel zu den Lymphproben Blutproben gewonnen werden konnten.
Auf der ventralen Halsseite erfolgte rechts in der Drosselrinne die Durchtrennung von Haut und Platysma, um nach stumpfer Präparation lateral des M. sternomastoideus die V. jugularis externa zur Ansicht zu bringen. Nach Freipräparation wurde die Vene cranial ligiert und caudal unterfahren, um den nach Inzision eingeführten Katheter mit dem caudalen Faden zu fixieren. Nach weiterer Fixierung des Führungsschlauches des Katheters im umgebenden Bindegewebe erfolgte der schichtweise Verschluss der Wundränder mit resorbierbaren Fäden. Der Katheter wurde am cranialen Wundende ausgeleitet und mit 4 - 5 Hautnähten an der lateralen Halswand befestigt.
3.2.4 Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis
In unmittelbarem Anschluss an die Venae sectio erfolgte die Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis. Die Minipigs waren zu diesem Zeitpunkt zwischen 6 und 11 Monaten alt und hatten ein mittleres Gewicht von 24,64 ± 4,01 kg.
Am Tag vor der Operation erhielten die Tiere kein Futter, nur Wasser. 16 h vor der Operation bekamen sie 100 ml Pflanzenöl mit wenigen Futterpellets, um eine milchig weiße Farbe der Lymphe zum Auffinden des Truncus lymphaticus intestinalis zu erreichen (BENNELL u. WATSON 1979).
Nach Eröffnung der Bauchhöhle durch mediane Laparotomie wurde das Dünn- und Dickdarmkonvolut in einen mit physiologischer NaCl-Lösung gefüllten Plastikbeutel ausgelagert. Anschließend wurde das Peritoneum parietale gespalten und der Truncus lymphaticus intestinalis links der Vena cava caudalis, in enger Nachbarschaft zu Pankreaskopf und Vena renalis sinister, dargestellt. Nach stumpfer Präparation wurde der Truncus proximal ligiert und mit einem Duroplastik-Katheter kanüliert. Der Katheter war von einem doppelten Führungsschlauch umgeben und wurde durch einen Butterfly am umgebenden Bindegewebe und mit mehreren Nähten am Peritoneum parietale der rechten Bauchwand fixiert, um im Bereich der rechten Flanke durch die Bauchwand ausgeleitet zu werden. Nach Zurückverlagerung des Darmkonvolutes erfolgte ein schichtweiser Verschluss der
Bauchhöhle mit resorbierbaren Fäden. Ein Beutel zur Aufnahme des Sammelgefäßes (250 ml Fassungsvermögen, gefüllt mit: 5 ml RPMI 1640; 0,3 ml Liquemin N (25000 I.E./ml); 0,3 ml Gentamycin (20 µg/ml); 0,3 ml Amphotericin (0,5 µg/ml); 0,6 ml Penicillin (100 I.E./ml) und Streptomycin (100µg/ml)) wurde mit mehreren Hautnähten im Bereich der rechten Flanke angebracht.
3.3 Orale Immunisierung
Im Zeitraum der Lymphsammlung 3,5 ± 0,89 Tage nach der Operation (Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis und Venae sectio) wurden alle 7 Tiere oral mit Choleratoxin (CT) und Choleratoxin Untereinheit B (CTB) immunisiert. Diese Kombination von CT und CTB beruht auf einer Empfehlung von Prof. Jan Holmgren, Göteborg, um eine verlässliche Immunität zu erreichen. Die unterschiedlichen Zeiten bis zur Immunisierung ergaben sich aus dem unterschiedlichen Allgemeinzustand und der Appetenz der Tiere postoperativ. Den Tieren wurde 8 h vor Immunisierung Futter und Wasser entzogen. Zur Immunisierung erhielten die Tieren zunächst 200 ml Natriumcitrat-Puffer (9.2.9), der freiwillig aufgenommen wurde. Unmittelbar anschließend erfolgte die Antigengabe in Form toxin-getränkter Futterpellets (100 µg CT + 500 µg CTB), die mit weiteren 100 ml Natriumcitrat-Puffer angeboten wurden.
Auch hier erfolgte die Aufnahme freiwillig.
3.4 Untersuchung des Lymphflusses und der Anzahl nukleärer Zellen in der Darmlymphe
Die intestinale Lymphe wurde kontinuierlich bis zum Versuchsende gesammelt. Die Tiere konnten sich über die gesamte Sammelperiode frei in ihrer Box bewegen und auch das tägliche Wechseln der Sammelbehälter morgens und abends erfolgte ohne Sedierung. Die erste Lymphprobe wurde intraoperativ gesammelt.
Das Volumen der Lymphproben wurde registriert, anschließend wurden die Proben zur Bestimmung des stündlichen Lymphflusses bei 400 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, die Zellen mit RPMI 1640 resuspendiert und der Vorgang wiederholt. Da die weiteren Untersuchungen jeweils morgens erfolgten, wurde die am Abend erhaltene Probe bei 4°C über Nacht gelagert.
Mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes und einer Neubauer-Zählkammer wurde die Zahl der Lymphozyten und der anderen nukleären Zellen (ANC: neutrophile und eosinophile Granulozyten, dendritische Zellen) pro ml Suspension bestimmt. Hieraus wurden die entsprechenden Zellzahlen pro ml Lymphe bestimmt sowie der stündliche Lymphfluss berechnet. Dies diente auch als Grundlage zur Anfertigung der Zytopräparate (3.6) und ELISPOTS (3.8).
3.5 Lymphozytenseparation aus dem Blut
Parallel zu bestimmten Lymphproben wurden Blutproben zur Herstellung von ELISPOTS (3.8) aus dem Venenkatheter entnommen. Das gewonnene EDTA-Blut (Ethylendiamintetraessigsäure) wurde 10 min bei Raumtemperatur lysiert (NH4Cl- Lyse-Reagenz, 9.2.11), mit 400 g für 10 min zentrifugiert und nach Dekantieren des Überstandes mit RPMI 1640 resuspendiert. Mittels eines Ficoll-Gradienten (spezif.
Dichte: 1,077 bei Raumtemperatur) mit Zentrifugation bei 400 g ohne Bremse für 30
min erfolgte die weitere Aufreinigung der Zellen. Nach Abernten der Lymphozyten wurden diese abzentrifugiert (400 g für 10 min), mit RPMI 1640 resuspendiert und mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes und einer Neubauer-Zählkammer ihre Anzahl pro ml bestimmt.
3.6 Herstellung der Zytopräparate
Von jeder zweiten Lymphprobe wurden Zytopräparate angefertigt, um später ausgewählte Proben mittels in-situ-Hybridisierung (ISH) zu untersuchen. Die Zellzahl pro Zytospot betrug 3 x 105 Zellen. Das benötigte Volumen der Zellsuspensionen ergab sich aus den Daten nach 3.4 unter Berücksichtigung der Lymphozyten und anderen nukleären Zellen.
Pro Lymphprobe wurden mindestens 8 Objektträger mit je 2 Zytospots angefertigt.
Das ermittelte Volumen an Zellsuspension wurde mit Anticlotting-Medium (9.2.1) aufgefüllt, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern. Mittels einer Zytozentrifuge erfolgte die Sedimentation der Zellen auf sialinisierte Objektträger. Anschließend wurden die Zytopräparate bei Raumtemperatur getrocknet und bei –20°C für die in- situ-Hybridisierung aufbewahrt.
3.7 Zellseparation aus lymphatischen Organen
Die Tiere wurden 4 – 5 Tage nach oraler Immunisierung mit Trapanal und T 61 eingeschläfert. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurden Proben von mesenterialen Lymphknoten (m LK), jejunaler und ilealer Lamina Propria (jej LP, il LP) und jejunalen
und ilealen Peyerschen Plaques (jej PP, il PP) entnommen. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben in Ringerlösung bei 4°C aufbewahrt.
Für die Zellseparation aus den Peyerschen Plaques wurden diese nach Abziehen der Tunica muscularis mit Scheren fein zerkleinert, über ein Sieb und eine Nylon- Gaze filtriert und in RPMI 1640 aufgenommen, gewaschen und resuspendiert (ROTHKÖTTER et al.1993).
Für die Zellseparation aus der Lamina Propria wurden die Darmstücke mit Ringerlösung und Hanks BSS-Lösung gespült und nach Abziehen der Tunica muscularis mit der Schere fein zerkleinert. Anschließend wurde das Gewebe mit EDTA-Lösung (9.2.5) 1 h bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Nach Dekantieren des Überstandes durch ein Sieb wurden die Gewebestücke nochmals mit EDTA-Lösung bei gleichen Bedingungen inkubiert. Nach wiederholter Abnahme des Überstandes erfolgte die Inkubation des Gewebes mit FCS-Lösung (9.2.6) für 30 min. und Kollagenase-Lösung (9.2.8) für 4 h. Schließlich erfolgte das Abernten des Überstandes mittels Sieb und Abzentrifugieren bei 400 g für 10 min. Die gewonnenen Zellen wurden mit Resuspensionslösung aufgefüllt.
Die Zellzahl der Zellsuspensionen aus den Peyerschen Plaques und der Lamina propria wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop und einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Zum Teil wurden die Zellen zur zusätzlichen Reinigung (Entfernung von Zelltrümmern und Bakterien für ELISPOTS) durch 5%ige BSA-Lösung bei 200 g für 10 min zentrifugiert.
3.8 Herstellung von ELISPOTS
bb.2:
LISPOT-Assay zum Nachweis antikörper-sezernierender Zellen:
erung: 39fach. Es handelt sich um CT-spezifische spots des IgG Isotyps bei ße SFC (spot
d
3.8.1 Verwendete Zellen
on allen Tieren wurden mit Lymphozyten aus Lymph- und Blutproben vor und nach A
E Vergröß
Lymphozyten aus der Darmlymphe. Ausgezählt wurden mittlere und gro
forming cells) mit Hilfe eines weitgehend automatischen Systems (AELVIS: Automate ELISA-SPOT Assay Video Analysis System).
V
Immunisierung und aus den lymphatischen Organen ELISPOTS zum Nachweis antikörper-sezernierender Zellen angefertigt (CZERKINSKY et al. 1983, 1984). Das benötigte Volumen an Zellsuspension aus Blutproben und lymphatischen Organen errechnete sich aus den in 3.5 und 3.7 erhobenen Daten. Die erhaltenen Lymphproben wurden nach der in 3.4 beschriebenen Zentrifugation und Resuspension in RPMI 1640 mittels eines Ficoll-Gradienten, mit Zentrifugation bei 400 g ohne Bremse für 30 min, weiter aufgereinigt, was sich als entscheidenden
Schritt für die kontinuierliche Nachweismöglichkeit antikörper-sezernierender Zellen in der Lymphe erwiesen hat. Nach Abernten der Lymphozyten wurden diese abzentrifugiert (400 g für 10 min), mit RPMI 1640 resuspendiert und mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes und einer Neubauer-Zählkammer ihre Anzahl pro ml bestimmt. Die Zellen aller verwendeten Proben wurden in entsprechenden Konzentrationen in antibiotika-haltigem Blocking-Medium resuspendiert.
3.8.2 Beschichten, Block und Inkubation
ie Mikrotiterplatten wurden für den Nachweis choleratoxin-spezifischer antikörper-
3.8.3 Primärer und sekundärer Antikörper, Substrat
ach gründlichem Abwaschen der Zellen und nicht gebundenen Substanzen mit D
sezernierender Zellen mit Gangliosid GM1 in der Konzentration 5 µg/ml beschichtet.
Nach 1 h bei 37°C und 500 U/min erfolgte nach Waschen mit PBS der 2. Coat mit rCTB (rekombinantes Choleratoxin Untereinheit B, freundlicher Weise von Prof. Jan Holmgren, Göteborg, zur Verfügung gestellt) in der Konzentration 2,5 µg/ml PBS. Auf CT musste hier abweichend von der Immunisierung verzichtet werden, da es sonst durch die toxische Komponente Untereinheit A zur Zerstörung der Zellen gekommen wäre. Für den Nachweis aller antikörper-sezernierenden Zellen wurde die Platte mit F(ab´)2-Fragment IgG in der Verdünnung 1:200 für 1 h bei 37°C und 500 U/min beschichtet. Nach Waschen mit PBS erfolgte dann die Inkubation der Platten mit Blocking-Medium (9.2.4), 1 h bei 37°C im Brutschrank bei 5% CO2. Die Zellen wurden in den Konzentrationen 103 bis 106 pro Well, bei den Organen z. T. auch geringer, abhängig von der zur Verfügung stehenden Menge, aufgetragen und 12 h bei 37°C im Brutschrank mit 5% CO2 inkubiert.
N
PBS-Tween (9.2.12), Aqua dest. und PBS erfolgte die Bindung der primären Antikörper gegen IgA, IgM und IgG in der Verdünnung 1:1000 in PBS für 2 h bei
37°C und 100 U/min. Anschließend wurden die Platten mehrmals mit PBS-Tween und PBS gewaschen und der sekundäre Antikörper Goat anti mouse IgG1-AP in der Verdünnung 1:1000 für 1h bei 37°C und 100 U/min aufgetragen. Schließlich erfolgte nach gründlichem Waschen mit PBS die Entwicklung der ELISPOTS mit Substrat (40 µl NBT + 33 µl BCIP / 10 ml APS-Puffer, 9.2.17). Von allen angeführten Substanzen wurden je 100 µl / Well aufgetragen.
3.8.4 Auswertung
ach mikroskopischer Beurteilung erfolgte die Auswertung der Platten mit AELVIS
3.9 In-Situ-Hybridisierung (ISH)
ytopräparate von Lymphproben vor und nach Immunisierung wurden mittels ISH auf
3.9.1 Vorbehandlung der Präparate
ie Zytopräparate wurden 1 h bei Raumtemperatur aufgetaut und getrocknet und N
(Automated ELISA-SPOT Assay Video Analysis System). Es handelt sich dabei um ein weitgehend automatisches Auswertsystem mit der Möglichkeit, die Größe der spots die gezählt werden sollen, festzulegen. Dokumentiert sind alle auswertbaren Zeitpunkte.
Z
die mRNA der Zytokine IL-2, IL-4 und TGF-β untersucht (KLEIN et al. 1995).
D
anschließend mit PFA (Paraformaldehyd 4%, 9.2.13) 1 h fixiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 0.4%igem Triton in PBS 5 min permeabilisiert und danach mit 0,25%igem Acetanhydrid in 0,1 M Triethanolamin acetyliert. Es folgte
Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (50, 70, 90 und 96% je 3 min) und Trocknen bei Raumtemperatur für 10 min.
3.9.2 Hybridisierung
ährend des Trocknens erfolgte die Herstellung der Hybridisierungslösung (9.2.7)
3.9.3 Post-Hybridisierung
ach Waschen in absteigenden SSC-Konzentrationen (2x, 1x, 0,5x, 0,4x) (9.2.7) für
3.9.4 Hybrid-Nachweis
ach erneutem Waschen mit SSC und PBS wurden die Zytopräparate 30 min mit W
aus 15 µl Dextransulfat / Formamid, 15 µl 0,3 oder 0,6x SSC (sodium salt chlorid) und 6 – 10 µl Probe (abhängig von der Konzentration), die nach Erhitzen auf 60°C für 5 min pro Zytospot aufgetragen wurde. Bei der Probe handelte es sich um Digoxigenin markierte RNA-Probe, zum Nachweis der mRNA von IL-2, IL-4 und TGF- β, die durch in vitro Transkription der linearisierten DNA templates hergestellt worden war (GOODALL et al. 1991, BAILEY et al. 1993, MULHERON et al. 1992). Die DNA templates wurden sequenziert und entsprachen den angeführten publizierten Sequenzen. Anschließend wurden die Zytopräparate für mind. 16 h bei 55°C hybridisiert.
N
je 10 min erfolgte 1 h stringentes Waschen in 0,4x SSC bei 60°C und anschließende Inkubation in RNAse (1 µg/ml RNAse-Puffer, 9.2.15) bei 37°C für 30 min.
N
Schweineserum (1% in PBS) geblockt und danach Anti-Digoxigenin-AP in der Verdünnung 1:50 in Schweineserum (1% in PBS) für 90 min aufgetragen. Es wurde
mehrfach mit PBS und APS-Puffer (9.2.2) gewaschen und schließlich Substrat (320 µl NBT + 265 µl BCIP / 80 ml APS-Puffer) aufgetragen, für 30 min – 4h bei 37°C.
3.9.5 Auswertung
Die Auswertung der Zytopräparate erfolgte mit dem Lichtmikroskop bei 312,5facher Vergrößerung (Objektiv 25x, Okular 12,5x). Bei negativer Kontrolle, sense (S)- Präparat ohne positive Zellen, die einen dunklen Zytoplasmasaum zeigen, erfolgte die Auszählung aller positiven Zellen im antisense (AS)-Präparat.
3.10 Statistik
Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine orientierende Studie, so dass sich die auswertbaren Daten häufig auf eine geringe Anzahl an Einzelwerten beschränkt. Zudem erwies sich die Tiergruppe als sehr heterogen, wodurch zum Teil eine Einzeltierdarstellung notwendig wurde, um Veränderungen über die Versuchsdauer darstellen zu können.
Bei allen Auswertungen mit n ≥ 2 Einzelwerten wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen bestimmt, wobei die Anzahl n der Einzelwerte zu jedem Zeitpunkt in der entsprechenden Legende angegeben ist sowie in entsprechender Tabelle im Anhang.
Um zu prüfen, ob es bei den Verlaufskurven eine zeitliche Veränderung gibt, wurde eine Varianzanalyse mit Messwiederholung durchgeführt, wobei p ≤ 0,05 als signifikant betrachtet wurde.
4 Ergebnisse
(Die genauen Werte zu den graphisch dargestellten Daten sind den entsprechenden Tabellen im Anhang zu entnehmen.)
4.1 Operative Eingriffe und orale Immunisierung
Nach der Resektion der mesenterialen Lymphknoten erholten sich alle Minipigs schnell und konnten bereits nach wenigen Tagen wieder in die Gruppe integriert werden. Im Zeitraum bis zur Kanülierung zeigten alle Tiere eine gute Entwicklung mit stetiger Gewichtszunahme bei ungestörtem Allgemeinbefinden. Auch die Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis wurde von allen Tieren gut toleriert.
Bereits wenige Stunden nach dem Eingriff standen die Tiere auf und nahmen selbstständig Wasser auf. Nach 1 bis 2 Tagen kam es wieder zur spontanen Futteraufnahme. Die Tiere bewegten sich frei in ihren Boxen und zeigten keine klinischen Krankheitssymptome. Ebenso waren nach oraler Immunisierung weder klinische Krankheitssymptome noch eine Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens bei den Tieren zu beobachten.
4.2 Lymphfluss über die Versuchsdauer
Die Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis (3.2.4) ermöglichte die Sammlung der intestinalen Lymphe über die gesamte Versuchsdauer. Sie betrug durchschnittlich 7,2 ± 1,4 Tage.
4.2.1 Lymphfluss der einzelnen Tiere
In den Abb.3a-f ist der Lymphfluss der einzelnen Tiere in ml/h im Verlauf des Versuches dargestellt, die genauen Werte sind Tab.1 im Anhang zu entnehmen. Es handelt sich dabei um den mittleren Lymphfluss pro Stunde der morgens und abends erhaltenen Lymphproben. Die erste Lymphprobe wurde bereits intraoperativ gewonnen und zeigte bei 5 der 6 Tiere einen deutlich erhöhten Lymphfluss. Ab dem zweiten postoperativen Tag lag bei 4 der 6 Tiere ein weitgehend konstanter Lymphfluss bis einschließlich des Tages der Immunisierung vor, bei einem Tier (Tier 5) kam es vom zweiten bis vierten Tag nach der Kanülierung zu einem vorübergehenden Anstieg, bei einem Tier (Tier 6) fiel der Lymphfluss am Tag vor der Immunisierung deutlich ab. Bei diesem Tier erfolgte bereits 12 h nach Immunisierung die letzte Auswertung der Lymphproben auf Lymph- und Zellflüsse, da aufgrund zunehmender Verlegung des Kanülierungskatheters nur noch ein intermittierender Lymphfluss vorlag. Bei 3 von 5 Tieren (Tier 1, 4 und 5) kam es 12 bis 24 h nach Immunisierung zu einer Erhöhung des Lymphflusses über 1,5 bis 3 Tage, bei 2 Tieren war keine deutliche Veränderung zu beobachten. Der durchschnittliche Lymphfluss der einzelnen Tiere lag zwischen 18,1 ± 6,9 ml/h (Tier 3) und 23,4 ± 9,5 ml/h (Tier 1).
0 10 20 30 40 50
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Zeit [d]
Lymphfluss [ml/h]
0 20 40 60 80 100 120 140
Zellen pro h [x106/h]
Lymphfluss Lymphozyten ANC
0 10 20 30 40 50
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Zeit [d]
Lymphfluss [ml/h]
0 20 40 60 80 100 120 140
Zellen pro h [x106/h]
Lymphfluss Lymphozyten ANC
0 10 20 30 40 50
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Zeit [d]
Lymphfluss [ml/h]
0 20 40 60 80 100 120 140
Zellen pro h [x106/h]
Lymphfluss Lymphozyten ANC
Abb.3a-f:
Lymphfluss und Zellfluss an Lymphozyten und ANC (anderen nukleären Zellen)
Mittlerer Lymphfluss und Zellfluss an Lymphozyten und ANC pro Stunde der morgens und abends erhaltenen Lymphprobe bei 6 verschiedenen Tieren. Der Abstand der Lymphproben betrug ungefähr 12 h. Die orale Immunisierung der Tiere erfolgte am Tage 0. Die negativen Zeitangaben beziehen sich auf die Tage vor der oralen Immunisierung, wobei der kleinste Wert jeweils der intraoperativ gewonnenen Lymphprobe entspricht. Die Skalierung der Ordinaten für Lymph- und Zellfluss wurde einheitlich vorgenommen. (vgl. Anhang 9.1, Tab.1)
a) Tier 1
b) Tier 2
c) Tier 3
0 10 20 30 40 50
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Zeit [d]
Lymphfluss [ml/h]
0 20 40 60 80 100 120 140
Zellen pro h [x106/h]
Lymphfluss Lymphozyten ANC
0 10 20 30 40 50
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Zeit [d]
Lymphfluss [ml/h]
0 20 40 60 80 100 120 140
Zellen pro h [x106/h]
Lymphfluss Lymphozyten ANC
0 10 20 30 40 50
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Zeit [d]
Lymphfluss [ml/h]
0 20 40 60 80 100 120 140
Zellen pro h [x106/h]
Lymphfluss Lymphozyten ANC d) Tier 4
e) Tier 5
f) Tier 6
4.2.2 Zusammenfassung des Lymphflusses aller Tiere
Da die orale Immunisierung der Tiere in Abhängigkeit der postoperativen Rekonvaleszenz zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgte, wurde wie in Abb.3a-f für alle Tiere d = 0 als Zeitpunkt der oralen Antigengabe festgelegt. Die negativen Zeitangaben in Abb.4 beziehen sich auf die Tage vor der oralen Immunisierung. Die Anzahl der Tiere (n) zu den verschiedenen Zeitpunkten ist in der Legende angegeben (vgl. Anhang Tab.2).
Nach Abfall des initial intraoperativ hohen Lymphflusses kam es innerhalb des ersten Tages nach Immunisierung zu einem Anstieg des Lymphflusses, bezogen auf den Lymphfluss zum Zeitpunkt der Immunisierung. Der Lymphfluss blieb bis zum Versuchsende auf erhöhtem Niveau. Der durchschnittliche Lymphfluss aller Tiere betrug 20,2 ± 2,6 ml/h.
Abb.4:
Lymphfluss aller Tiere
Die Darstellung zeigt die Mittelwerte mit Standardabweichung. Zum Zeitpunkt d=0 erfolgte die Immunisierung. Die Proben wurden in Abständen von ungefähr 12 h gewonnen. Die Anzahl der Tiere (n) betrug für den Zeitraum d < -3,5 n=2; d ≥ -3,5 bis d < -2,5 n=4; d ≥ -2,5 bis d < 1 n=6; d ≥ 1 bis d < 3 n=5; d ≥ 3 bis d < 4 n=4; d ≥ 4 n=2 (vgl. Anhang 9.1, Tab.2).
0 5 10 15 20 25 30 35 40
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Zeit [d]
Lymphfluss [ml/h]
4.3 Zellfluss über die Versuchsdauer
Über die gesamte Versuchsdauer wurden neben Lymphozyten auch andere nukleäre Zellen (ANC), neutrophile und eosinophile Granulozyten und dendritische Zellen, in den Lymphproben bestimmt.
4.3.1 Lymphozytenfluss bei einzelnen Tieren
Der Lymphozytenfluss pro Stunde der einzelnen Tiere ist ebenfalls in den Abb.3a-f dargestellt, die genauen Werte sind Tab.1 im Anhang (9.1) zu entnehmen. Es handelt sich dabei um die gemittelte Lymphozytenzahl pro Stunde der morgens und abends gewonnenen Lymphe, bzw. der intraoperativ gewonnenen ersten Lymphprobe. Bei 3 Tieren war der Lymphozytenfluss dieser ersten Lymphprobe deutlich erhöht, bei einem Tier auch noch der zweiten Lymphprobe. Ein bis zwei Tage nach der Kanülierung kam es bei 4 der 6 Tiere zu einem unterschiedlich stark ausgeprägten Anstieg des Lymphozytenflusses über 36 bis 60 Stunden, der bis zum Tag der Immunisierung wieder abfiel. Bei Tier 1 kam es zu starkem Abfall und wieder Anstieg des Lymphozytenflusses zwischen Kanülierung und Immunisierung.
Zwischen dem ersten und dritten Tag nach oraler Immunisierung ( d > 1 bis < 3) stieg der Lymphozytenfluss bei 4 von 5 Tieren über 12 bis 60 Stunden erneut an, bei 2 Tieren (Tier 4 und 5) in ähnlicher Ausprägung wie vor Immunisierung, bei 2 Tieren (Tier 1und 2) deutlicher. Bei einem Tier war die Auswertung der Lymphproben auf die Zellflüsse nur bis ca. 12 Stunden nach Immunisierung möglich (vgl. 4.2.1).
Der mittlere Lymphozytenfluss pro Stunde der einzelnen Tiere lag zwischen 9,0 ± 4,9 x 106 (Tier 2) und 64,9 ± 34,1 x 106 (Tier 1) Lymphozyten pro Stunde, so dass durchschnittlich 28,0 ± 20,4 x 106 Lymphozyten pro Stunde die Darmwand über die Lymphgefäße verließen.
