3 Material und Methoden
9.2 Lösungen, Puffer und Medien
9.2.1 Anticlotting-Medium
,9% NaCl-Lösung 100 ml
0
EDTA 100 g
BSA 5%
auf pH 7,2 einstellen
9.2.2 APS-Puffer (Alkalische Phosphatase)
Tris 1,21 g
NaCl 0,88 g
Aqua bidest. ad 100 ml, pH 9,5 einstellen
M 1,02
9.2.3 BC 5-Brom, 4-Chlor ndo ho p to ins
BC mg
Dim ylformam (100% ml
9.2.4 Blocking-Medium RPMI 1640
FCS
Pen n und St tomyc 5%
Gentamycin 1%
DTA-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure)
EDTA 1,26 mmol/l
Penicillin 100 I.E./ml
Streptomycin 100 µg/ml
Gentamycin 20 µg/ml
Amphotericin 0,5 µg/ml
gCl2 g
IP ( , 3-O nylp sphat luid alz)
IP 50
eth id ) 1
5%
icilli rep in 2,
9.2.5 E
Zellseparation aus lymphatischen Organen
Hanks´BSS 200 ml
DDT 0,94 mmol/l
9.2.6 F Lö (F lf serum)
Zellseparation aus lymphatischen Organen
RPMI 1640 m
FCS Hepes
Penicillin I.E./ml
Streptomycin 100 µg
Gentamycin 20 g/
Am ot n µg
9.2.7 Hybridisierungsl ung Dextransulfat/Formamid:
20% De fat
in 100% Formamid ion
l
0,3 od. 0,6x Hybridisierungspuffer: 15 µl 0,3x Hybridisierungs ffer:
Tris (0,5 7,5
20x SSC (sodium sa chlo EDTA (0,1 m) 20x SSC (sodium sa chlorid
NaCl Na-citrat
EPC-Wasser
44,1 g
ad 500 ml, pH 7,2 CS- sung etal ca
100 l
9.2.8 Kollagenase-Lösung
(Zellseparation aus lymphatischen Organen)
RPMI 1640 l
Streptomycin 100 µ
Gentamycin 20 g
Amphot µ
9.2.9 Natriumcitrat-Puffer fü un ng NaHCO
Aqua bi 00
9.2.10 NB itro Blu Tetra m NBT Dimethylformamid (70%) 1 ml
Reagenz
9.2.11 NH4
Cl-Lyse-NH4Cl 8,3 g
EDTA
9.2.12 PBS (Phosphate Buffered Saline)-Tween
Tween in P
9.2.1 PFA a hyd)
Paraformaldeh 4 g
PBS ad 100 ml
9.2.14 Resuspensionslösung
RPMI 164 200 ml
DNAse 0,1 mg/ml
.2.15 RNAse-Puffer
EDTA 9,31 g
Aqua bidest. ad 500 ml
3–Aminopropyl–Thriethoxylsilane 5 ml
Aceton ad 250 ml
0,05% BS
3 (P raformalde
yd
0
9
NaCl 11,69 g
Tris 6,06 g
9.2.16 Sialinisierungslösung
9.2.17 Substrat für ELISPOTS und ISH
APS-Puffer l Dimethylformamid) (7,5 mg / 500 µl Dimethylformamid)
9.3 erial und Geräte
Acetanhydrid A – 6404, Sigma, Steinheim
AELV
Automated ELISA-SPOT Assa
AELVIS GmbH, Hannover
A 2610, Seromed, Berlin
274, Roche Mannheim
(primärer Antikörper)
Mouse anti porcine IgA, MCA 638, Serotec, U.K.
Anti-(primärer Antikörper)
Mouse anti porcine IgG, MCA 636, Serotec, U.K.
Anti-(primärer Antikörper)
Mouse anti porcine IgM, MCA 637, Serotec, U.K.
10 ml
NBT
(15 mg / 500 µ
40 µl
BCIP 33 µl
Verwendete Substanzen, Labormat
IS
y Video Analysis System Amphotericin
Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente, Nr. 1 093 Anti-IgA
IgG
IgM
Atropin Atropinsulfat 0,5 mg, B. Braun, Melsungen
BCIP 5-Brom, 4-Chlor, 3-Indonylphosphat p toluidinsalz Art. 6368.3, Roth, Karlsruhe
BSA Albumin bovine fraction V, Nr. 11930, Serva, Heidelberg
Collagenase Collagenase A, Nr. 103578, Boehringer, Mannheim DDT DL-Dithiothreitol, D-0632, Sigma, Steinheim
x konzentriert, D 2535, Sigma, Steinheim DEPC Diethyl Pyr nat, D 5758, Sigma, Steinheim
Dext largew. 500 000, D 2532, Sigma, Steinheim
DNAse Nr. 104159 Boehringer, Mannheim
Duroplastik-Katheter Vinyl-Katheter-Diameter 1,6 mm, Dural Plastics &
Engineering, Dural Australia
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Nr. 11280, Serva, Heidelberg
F(ab gment IgG
(Coa mmun-
glob
Affine Pure -Fragment goat anti swine IgG (H +L), 41962, Dianova, Hamburg
Dexon, Braun-Dexon GmbH, Spangenberg FCS Fetal calf serum S 0113, Seromed, Berlin Denhardts Lösung 50
ocarbo
ransulfat Moleku
´)2-Fra t für alle I uline)
F(ab´)2
Fäden resorbierbar
Ficoll Separating Solution, Seromed, Berlin
Formamid Analytisch, deionisiert, J.T. Baker, Deventer, Holland
Führungsschlauch Duroplastik-Katheter
Silastic, Dow Corning GmbH, Meerbusch
Führungsschlauch für Venenkatheter
Silastic, Dow Corning GmbH, Kehl/Rhein
Gangliosid GM1 (1. spezif. Coat)
Monosialogangliosid GM1, G7641, Sigma, Steinheim
cin A 2712, Seromed, Berlin
er Antikörper)
rn Biotechnology Associates, Birmingham, USA
Hanks BSS-Lösung Hanks´Salz e Phenolrot, ohne Ca++ und Mg++, Nr. L2045, Seromed, Berlin
Wundverschluss:
Befes
Vicryl, Ethicon, Norderstedt Seide, Ethicon, Norderstedt Supramid, B. Braun, Melsungen
kensubstanz, Nr. L1603, Seromed, Berlin KHC Kaliumhydrogencarbonat, 4852, Merck, Darmstadt Liquemin N 25000 Nr. 47197, Roche, Grenzach-Whylen
Gentamy
Goat anti mouse IgG1-AP Nr. 1070-40, Southe (sekundär
lösung ohn
Hautnähte
tigung Venenkatheter Befestigung Sammelgefäß
Hepes Troc
O3
MgCl2 Magnesiumchlorid, MgCl2⋅ 6H2OArt. 5833, Merck, Darmstadt
96-Well-Platte mit Nitrocellulose-Membran, größe 0,45 µm Millipore MAHA N 4550 NaCl Natriumchlorid, 1064041000, Darmstadt
siolog.) Natrium-Chlorid, Nr. 0278, Deventer, Niederlande ydrogencarbonat, 6329, Merck, Darmstadt NBT Nitro Blue Tetrazolium, N-6876, Sigma, Steinheim
4CL Ammoniumchlorid, 101145 Merck, Darmstadt
9,55 g Phosphate Buffered Saline ad 1 l Aqua dest., Seromed, B
Penicillin und Streptomycin A2212, Ser erlin
Paraformaldehyd, P-6148, Sigma
(2. spezif. Coat)
antes Choleratoxin-Untereinheit B, freundlicher Weise von Prof. Jan Holmgren,
, z rfügung gestellt
Ringerspüllösung Delta-Pharma, Boehringer Ingelheim, Pfullingen RNAse Ribonuklease A, R 6513, Sigma, Steinheim RPMI 1640 Instamed F 1215, Seromed, Berlin
Mikrotiterplatten
Poren
NaCl-Lösung (phy
NaHCO3 Natriumh
NH
PBS
erlin omed, B PFA
rCTB rekombin
Göteborg ur Ve
Sialinisierungslösung 3 – Aminopropyl – Thriethoxylsilane, Sigma,
Stres Azaperon, Janssen, Neuss
T 61 Embutramid, Mebezoniumjodit,
Tetracainhydrochlorid, Hoechst Veterinär, Unterschleißheim, München
Trapanal Thiopental-Natrium, T1189, Byk Gulden, Konstanz
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 37190, Serva, lberg
Chemie, CH –9471 uchs
NA R 8508, Sigma, Steinheim
Trypsininhibitor r. T9003, Sigma, Steinheim Tween r. 37470, Serva, Heidelberg
uers Lock, B. Braun, Melsungen
iere
niversität Göttingen fuge
Steinheim nil
Triethanolamin T – 9534, Sigma, Steinheim
Tris
Elektrophoresis GmbH, Heide Triton Triton x – 100, 93426, Fluka
B tR
N N
Venenkatheter L
Versuchst Minipigs vom Versuchstiergut Relliehausen der U
Zytozentri Heraeus Sepatech, Osterode/Harz
10 Publikation
BALTES, N., W. TONPITAK, G.
ANN-MOUJAHID, M. GANTER, und H. J. ROTHKOTTER (2001):
Actinobacillus pleuropneumoniae iron transport and urease activity: effects on virulence and ho
Infect. Immun. 69
F. GERLACH, I. HENNIG-PAUKA, A. HOFFM
bacterial st immune response.
PABST, W. HO UND H.J. ROTHKÖTTER:
T
th eripheral blood.
, 472 - 478
THIELKE, K.-H., A. HOFFMANN-MOUJAHID, C. WEISER, E. WALDKIRCH, R.
LTMEIER
Proliferating intestinal γ/δ cells recirculate rapidly and are a major source of e γ/δ T cell pool in the p
zur Veröffentlichung eingereicht
Danksagung
M Prof. Dr. phäre und
die ausgezeichneten Voraussetzungen in der Abteilung für Funktionelle und Angewandte Anatomie, in der diese Arbeit entstehen konnte.
Bedanken möchte ich mich bei Frau A. Herden, Frau S. Schlecht und Herrn A. Kues
f nd Hilfsbere mgang in
L
H Klaus Otto dan ung bei der medizinischen
Versorgung der Tiere und seine stete Ansprechbarkeit.
B te e
V auß phasen bedanken.
B chte ich
Rechner und für ihre hilfreichen
Herrn P. Claus danke ich für die Arbeitsmöglichkeiten im S1-Labor und seine stets freundliche und unkomplizierte Unterstützung dabei.
H chte ich für szählung der
ELISPOT-P
B rs bedanken möchte ic ter für
die Überlassung des Themas und die bemerkenswerte Unterstützung in allen Phasen der Arbeit.
Die Tätigkeit in der Arbeitsgruppe war ausgesprochen vielfältig und lehrreich, ich habe sehr davon profitiert.
ein Dank gilt Herrn Reinhardt Pabst für die freundliche Atmos
ür ihre Mitarbeit u itschaft, aber auch für den freundlichen U abor und OP.
errn Prof. Dr. ke ich für seine Unterstütz
ei den Tierpflegern möch ich mich für die umsichtige und aufmerksam erhalb der Versuchs
ersorgung der Tiere auch
ei Frau M. Peter mö mich für das freundliche Klima bei der Arbeit am Anregungen bedanken.
errn St. Ulrich mö sein Engagement bei der Au latten danken.
esonde h mich bei Herrn Prof. Dr. Hermann-J. Rothköt