Einfluss der Proteinversorgung auf
einige mikrobielle Metaboliten im Darmlumen und Harn sowie die Histologie des Kolons bei Katzen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Susanne Oldenhage
aus Hilden
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. J. Zentek
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Zentek
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer
Tag der mündlichen Prüfung: 6. Juni 2003
Meinen Familien
1. EINLEITUNG 15
2. SCHRIFTTUM 16
2.1. Proteinverdauung und -verdaulichkeit bei der Katze 16
2.1.1. Proteinbedarf 16
2.1.2. Proteinverdauung und –resorption 17
2.1.2.1. Proteinverdauung im Magen 18
2.1.2.2. Proteinverdauung im Dünndarm 18
2.1.2.3. Resorption von Aminosäuren 20
2.1.2.4. Resorption von Di- und Tripeptiden 20
2.1.2.5. Resorption von Proteinen 20
2.1.2.6. Proteinverdauung im Dickdarm 21
2.1.3. Scheinbare Verdaulichkeit verschiedener Proteine 22 2.2. Fütterungsbedingte Ursachen für chronische Darmerkrankungen
bei der Katze 26
2.2.1. Futtermittelunverträglichkeiten 26
2.2.1.1. Proteine als alimentäre Allergene 27
2.2.2. Idiopathische chronische Darmentzündung 29
2.3. Histologie des Katzendarms und Veränderungen bei intestinalen
Erkrankungen 30
2.3.1. Histologie des Dünndarms 31
2.3.2. Histologie des Dickdarms 32
2.3.3. Immunsystem des Darms 32
2.3.4. Pathohistologische intestinale Befunde bei
Futtermittelunverträglichkeiten sowie bei chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen 33
3.1.1. Versuchsziel 36
3.1.2. Versuchstiere 38
3.1.3. Futtermischungen 38
3.1.4. Versuchstechnik 40
3.1.5. Prüfparameter 41
3.1.6. Probenvorbereitung zur Analyse 41
3.1.7. Angewandte Untersuchungsmethoden 43
3.1.7.1. Rohnährstoffgehalte im Futter und Kot 43
3.1.7.2. Aminosäuren 43
3.1.7.3 Kotkonsistenz 43
3.1.7.4. Trockensubstanzgehalt der Kotproben 44
3.1.7.5. pH-Wert 44
3.1.7.6. Ammoniak 44
3.1.7.7. Flüchtige Fettsäuren 45
3.1.7.8. Indikan 45
3.1.7.9. Freie Phenolkörper 45
3.1.7.10. Histologische Untersuchung der Kolonbioptate 46
3.1.8. Statistische Auswertung der Ergebnisse 49
3.2.2. Allgemeine Beobachtungen 53 3.2.2.1. Allgemeinbefinden der Tiere, Körpermasseentwicklung 53
3.2.2.2. Futteraufnahme und Akzeptanz 54
3.2.2.3. Kotabsatz, -konsistenz, -menge 55
3.2.2.4. Wasseraufnahme und –ausscheidung 56
3.2.2.4.1. Wasseraufnahme über Trinkwasser und Futter 56 3.2.2.4.2. Harnvolumen, fäkale Wasserexkretion und insensibler
Wasserverlust 58
3.2.3. Spezielle Untersuchungen 60
3.2.3.1. Untersuchungen zur Verdaulichkeit der Rohnährstoffe 60 3.2.3.1.1. Scheinbare Verdaulichkeit der Rohnährstoffe 60 3.2.3.1.2. Rohproteingehalte in den Fäzes und scheinbare Verdaulichkeit
des Rohproteins 61
3.2.3.2. Untersuchungen zum Gehalt an mikrobiellen Stoffwechselprodukten
im Darmlumen 63
3.2.3.2.1. Kotuntersuchungen 63
3.2.3.2.1.1. Ammoniak 63
3.2.3.2.1.2. Flüchtige Fettsäuren 64
3.2.3.2.2. Harnuntersuchungen 66
3.2.3.2.2.1. Indikan 66
3.2.3.2.2.2. Phenolkörper 67
3.2.3.3. Fäkaler pH-Wert 68
3.2.3.4. Histologische Untersuchung der Kolonbioptate 69
4.2. Ergebnisse 76 4.2.1. Einfluss der Proteinversorgung auf die Verdaulichkeit des
Rohproteins 76
4.2.2. Einfluss der Proteinversorgung auf Parameter mikrobieller
Aktivität in den Fäzes und im Urin 77
4.2.3. Einfluss der Proteinversorgung auf die histologische Struktur
des Kolons 80
4.3. Schlussfolgerungen 83
5. ZUSAMMENFASSUNG 84
6. SUMMARY 86
7. LITERATURVERZEICHNIS 88
8. ANHANG 96
Tab. 1 Ermittelter Rohproteinbedarf adulter Katzen in g Rp/kg KM/d 17 Tab. 2 Überblick über die an der Proteinverdauung beteiligten Enzyme,
deren Funktion und Spaltprodukte 19
Tab. 3 Scheinbare Verdaulichkeit von Rohprotein bei isolierter
Fütterung verschiedener Futtermittel bzw. aus Differenzversuchen 22 Tab. 4 Scheinbare Verdaulichkeit von Rohprotein in Futtermischungen
mit bekannten Proteinquellen 24
Tab. 5 Scheinbare Verdaulichkeit von Rohprotein bei der Fütterung
kommerzieller Alleinfutter 25
Tab. 6 Terminologie der Futtermittelunverträglichkeiten 27 Tab. 7 Proteine in Futtermitteln, die in der Literatur als Verursacher
von FM-Unverträglichkeiten bei der Katze angegeben sind 28 Tab. 8 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen bei Katzen - Befunde
und Diagnosen 35
Tab. 9 Versuchsplan 37
Tab. 10 Versuchstiere 38
Tab. 11 Rohnährstoffgehalte der verwendeten proteinreichen Futtermittel
in g/kg uS 39
Tab. 12 Zusammensetzung der Versuchsfuttermischungen [%] 39
Tab. 13 Beurteilungsschema der Kolonbioptate 48
Tab. 14 Nährstoff- und Energiegehalt der Futtermischungen 50 Tab. 15 Aminosäurengehalte im Versuchsfutter in g/kg TS 51 Tab. 16 Körpermasseentwicklung während der Bilanzen 53 Tab. 17 Durchschnittliche Futter- und Energieaufnahme 54 Tab. 18 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für die Kotmenge
(TS) und die Trockensubstanz der Fäzes 55
Tab. 19 Kotmenge und Trockensubstanz der Fäzes 56
von Trinkwasser, Futterwasser und Gesamtwasser 57 Tab. 22 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für das
Harnvolumen und die fäkale Wasserausscheidung 58 Tab. 23 Wasserabgabe über Harn und Kot und insensibler Wasserverlust 59 Tab. 24 Scheinbare Verdaulichkeit von organischer Substanz,
Rohnährstoffen (außer Rp) und Bruttoenergie in % 60 Tab. 25 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für die Verdaulichkeit
der Rohnährstoffe, der organischen Substanz und der Bruttoenergie 61 Tab. 26 Rohproteingehalte im Kot in Abhängigkeit von der Fütterung
und scheinbare Verdaulichkeit des Rohproteins 62 Tab. 27 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für den Rohproteingehalt
im Kot und die scheinbare Verdaulichkeit des Rohproteins 62 Tab. 28 Ammoniakkonzentration im Kot in mmol pro l Kotwasser 63 Tab. 29 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für den Ammoniakgehalt
in den Fäzes 63
Tab. 30 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für den
Gesamtgehalt an flüchtigen Fettsäuren in den Fäzes 64 Tab. 31 Gesamtgehalt und Verteilung der flüchtigen Fettsäuren im Kotwasser 65 Tab. 32 Indikanausscheidung über den Harn in mg/kg KM/d 66 Tab. 33 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für die renale
Indikanausscheidung 66
Tab. 34 Phenolkörperausscheidung über den Harn in mmol/kg KM/d 67 Tab. 35 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für die renale
Phenolkörperausscheidung 67
Tab. 36 pH-Werte im Kot 68
Tab. 37 p-Werte der zweifaktoriellen Varianzanalyse für den pH-Wert der Fäzes 68 Tab. 38 Durchschnittliche Beurteilung der Kolonbioptate 70
Tabellen im Anhang
Tab. I KM-Entwicklung während der Bilanzperioden GR 1 und GR 2 96 Tab. II KM-Entwicklung während der Bilanzperioden SO 1 und SO 2 97 Tab. III KM-Entwicklung während der Bilanzperioden PFD 1 und PFD 2 98 Tab. IV Futter- und Energieaufnahme bei Verabreichung von
Griebenmehlmischungen 99
Tab. V Futter- und Energieaufnahme bei Verabreichung von Sojamischungen 100 Tab. VI Futter- und Energieaufnahme bei Verabreichung von
Pferdefleischmischungen 101
Tab. VII Kotmenge, Kot-Trockensubstanz und scheinbare Verdaulichkeit der Trockensubstanz der Fäzes bei Verabreichung von
Griebenmehlmischungen 102
Tab. VIII Kotmenge, Kot-Trockensubstanz und scheinbare Verdaulichkeit der
Trockensubstanz der Fäzes bei Verabreichung von Sojamischungen 103 Tab. IX Kotmenge, Kot-Trockensubstanz und scheinbare Verdaulichkeit der
Trockensubstanz der Fäzes bei Verabreichung von
Pferdefleischmischungen 104
Tab. X: Trockensubstanz und Rohnährstoffe im Kot (außer Rp) in
Abhängigkeit von der Fütterung 105
Tab. XI: Gesamtgehalt (g/kg TS) und Verteilung (%) der Aminosäuren
im Versuchsfutter 106
Tab. XII Grad der Beurteilung aller ausgewerteten Bioptate nach
Verabreichung von Griebenmehlmischungen 107
Tab. XIII Grad der Beurteilung aller ausgewerteten Bioptate nach
Verabreichung von Sojamischungen 108
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN
Nr. Titel Seite
Abb. 1 Ausschnitt aus einem Bioptat mit Beurteilungsgrad 0 71 Abb. 2 Ausschnitt aus einem Bioptat mit Beurteilungsgrad 0,5 72 Abb. 3 Ausschnitt aus einem Bioptat mit Beurteilungsgrad 1 72 Abb. 4a Ausschnitt aus einem Bioptat mit Beurteilungsgrad 0,5 73 Abb. 4b Ausschnitt aus Abb. 4a in 350facher Vergrößerung 73 Abb. 5 Vergleich der fäkalen pH-Werte in den verschiedenen
Versuchsabschnitten 77
Abb. 6 Vergleich der fäkalen NH3-Werte in den verschiedenen
Versuchsabschnitten 78
Abb. 7 Beziehung zwischen dem fäkalen NH3-Gehalt und dem pH-Wert 78 Abb. 8 Vergleich der renalen Phenolausscheidung in den verschiedenen
Versuchsabschnitten 79
Abb. 9 Vergleich der renalen Indikanausscheidung in den verschiedenen
Versuchsabschnitten 79
Abb. 10 Vergleich der Bioptat-Beurteilung in den verschiedenen
Versuchsabschnitten 80
AS Aminosäuren
APUD Amine precursor uptake decarboxylase BSM Bürstensaummembran
bzw. beziehungsweise
d Tag
dest. destilliert d. h. das heißt Diff. Differenz
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E.-Nr. Einsendungsnummer
et al. et alii evtl. eventuell
Fa. Firma
FM Futtermittel
GALT Gut-associated lymphoid tissue GE Bruttoenergie
Ges.aufn. Gesamtaufnahme GIT Gastrointestinaltrakt
GR Griebenmehl
ggr. geringgradig
H Wasserstoff
H.E. Hämalaun-Eosin
IBD Inflammatory bowel disease
Ig Immunglobulin
J. Jahre
K Katze
kD Kilodalton
kJ Kilojoule
KM Körpermasse
M. Monat
max. maximal
Max Maximum
ME umsetzbare Energie
Min Minimum
MJ Megajoule
mod. modifiziert MW/x Mittelwert
n Anzahl
N Stickstoff
Na Natrium
n.a. nicht auswertbar
NfE stickstofffreie Extraktstoffe NGZ neutrophile Granulozyten
PFD Pferdefleisch pH Potentia hydrogenii R2 Bestimmtheitsmaß
Ra Rohasche
Rfa Rohfaser
Rfe Rohfett
Rp Rohprotein
s. siehe
S Stickstoff
SO Sojaproteinisolat Std./?s Standardabweichung sV scheinbare Verdaulichkeit Tab. Tabelle
TS Trockensubstanz
u. und
u. a. unter anderem
uS ursprüngliche Substanz vRp verdauliches Rohprotein z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
1. EINLEITUNG
Erkrankungen des Darmtraktes gehören zu den häufigeren Beschwerden, mit denen Katzen in der Kleintierpraxis vorgestellt werden. Aufgrund der Vielzahl an möglichen Ursachen ist deren Pathogenese bislang nicht hinreichend bekannt. Neben infektiösen, chronisch entzündlichen und immunologischen Ursachen wird auch die Fütterung als wichtiger Faktor angesehen, wobei spezifische Untersuchungen an dieser Tierart kaum vorliegen (WALTON et al. 1968, NELSON et al. 1984).
Als mögliche Einflussfaktoren fütterungsbedingter Unverträglichkeiten kommen die im Darmlumen ablaufenden mikrobiellen Fermentationsprozesse in Frage, die zur Bildung potentiell schädlicher Metaboliten führen. Weiterhin kommt der Interaktion von Peptiden aus unvollständig verdautem Futtereiweiß mit der Darmwand möglicherweise eine Bedeutung für die Auslösung chronischer Verdauungsstörungen zu. Entsprechende Hinweise liegen sowohl für den Menschen (POWELL et al. 1989, LAKE 1991, GRYBOWSKI 1991) als auch für Hunde (DOBESH u. CLEMENS 1988, JEFFERS et al. 1996) vor. Auch bei Katzen werden entsprechende klinische Beobachtungen mitgeteilt (GILLESPIE u. FOWLER 1984, GUILFORD et al. 2001).
So erscheint es denkbar, dass über futterinduzierte immunologische Mechanismen Entzündungsreaktionen in der Darmwand und Störungen der Absorptionsmechanismen ausgelöst werden können.
In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Proteinträger in unterschiedlichen Dosierungen als Futtermittel bei Katzen vergleichend getestet. Ziel ist die Überprüfung der möglichen Konsequenzen für die mikrobiellen Fermentationsvorgänge sowie die Untersuchung möglicher Interaktionen mit der Darmwand des Kolons bei Katzen.
2. SCHRIFTTUM
2.1. Proteinverdauung und –verdaulichkeit bei de r Katze
2.1.1. Proteinbedarf
In der Ernährung der Katzen als Karnivoren spielen Proteine eine bedeutende Rolle. Zum einen dienen sie der Zufuhr essentieller Aminosäuren, zum anderen auch als Stickstofflieferant zur Synthese nicht essentieller Aminosäuren und stickstoffhaltiger Verbindungen (SMALLEY et al. 1985, MORRIS u. ROGERS 1991). In der älteren Literatur wird der Proteinbedarf der Katze im Vergleich zu den übrigen Haustieren als relativ hoch beschrieben (ROGERS u. MORRIS 1978, MEYER u. HECKÖTTER 1986), was mit der fehlenden Adaptationsfähigkeit an unterschiedliche Proteinaufnahmen mit der Nahrung der beim Aminosäurenabbau beteiligten Enzyme in der Leber begründet wird (ROGERS et al.
1977). Dies führt bei der Katze im Gegensatz zu den meisten anderen Säugetieren, bei denen eine geringere Proteinzufuhr mit der Nahrung eine Abnahme der Leberenzymaktivität induziert, auch bei niedrigen Proteinaufnahmen oder während des Hungerns zu einem permanent hohen Stickstoffverlust (BAKER u. CZARNECKI-MAULDEN 1991).
Angaben zum Proteinbedarf der adulten Katze sind in der Literatur nur spärlich vorhanden und weisen eine große Spannweite von 1,3 bis 5,0 g Rp/kg KM/d auf (Tab. 1). Da die Empfehlungen alle mit derselben Methodik (N-Bilanz) ermittelt wurden, lassen sich die Diskrepanzen zumindest teilweise durch die unterschiedliche biologische Wertigkeit und Verdaulichkeit der Proteine in den verschiedenen Versuchsfuttern erklären. So kam DEKEYZER (1997) zu dem Schluss, dass der Proteinbedarf der adulten Katze bei hochwertiger Proteinqualität mit 1 g vRp/kg KM/d gedeckt werden kann. Bei weniger günstiger Qualität sollte die Zufuhr auf 2,2 g vRp/kg KM/d erhöht werden. Zu dieser Thematik wird in den NRC-Empfehlungen von 1986 darauf hingewiesen, dass ein Teil des Proteins in kommerziell hergestelltem Katzenfutter schwerer verdaulich ist und dass die Herstellungsverfahren die biologische Wertigkeit der Proteine vermindern können.
Auch SCOTT stellte 1975 fest, dass Proteine während des Erhitzens mit Aldosen teilweise N- glycosidische Verbindungen bilden, die durch Proteasen nicht gespalten und daher mit den Fäzes ausgeschieden werden.
Tab. 1: Ermittelter Rohproteinbedarf adulter Katzen in g Rp/kg KM/d
Autoren Rohproteinbedarf
MILLER UND ALLISON 1958 GREAVES UND SCOTT 1960
SCOTT 1981 BURGER et al. 1984
RADICKE 1995 DEKEYZER 1997
STIEFEL 1999
3,1 5,0 3,1 1,75 1,5–2,8 1,3–2,7
2,7
2.1.2. Proteinverdauung und –resorption
Die Verdauung des Nahrungsproteins findet hauptsächlich im Magen und dem vorderen Abschnitt des Dünndarms statt. Die anschließende Resorption von Aminosäuren erfolgt, wenngleich im gesamten Dünndarm möglich, vornehmlich in dessen proximalen Abschnitt, die Aufnahme von Di- und Tripeptiden ist im vorderen Jejunum lokalisiert. Die distale Hälfte des Dünndarmes dient in gewissem Umfang als Reserve und weist eine nachweisbare mukosale Enzymaktivität sowie resorptionsfähige Oberfläche auf (STROMBECK 1996, S.
330, 341). Im Dickdarm werden präzäkal unverdaute Proteine und Peptide durch mikrobielle Enzyme zu zahlreichen Produkten verstoffwechselt, die entweder resorbiert oder ausgeschieden werden (STROMBECK 1996, S. 343).
2.1.2.1. Proteinverdauung im Magen
Nach SCHARRER u. WOLFRAM (2000) beginnt die Verdauung der Nahrungsproteine bereits im Magen: das saure Milieu bewirkt eine Denaturierung der Proteine und begünstigt die proteolytische Wirkung der Endopeptidase Pepsin (pH-Optimum 1-3), das in Form seiner inaktiven Vorstufe Pepsinogen von den Hauptzellen der Fundusdrüsenregion sezerniert wird.
Als Spaltprodukte fallen neben Peptiden auch Aminosäuren an, da Pepsin in geringem Umfang auch endständige Aminosäuren abspalten kann. Pepsin ist auch im Duodenum noch wirksam, da der pH-Wert des Darminhaltes proximal der Einmündung des Ductus pancreaticus sauer ist. In quantitativer Hinsicht scheint Pepsin für die Proteinverdauung allerdings nicht sehr bedeutsam zu sein, da nach Ausfall der Pepsinproduktion im Magen die Proteinverdauung nicht nennenswert vermindert ist. Offenbar vermögen somit die Endopeptidasen des Pankreas den Ausfall von Pepsin zu kompensieren.
2.1.2.2. Proteinverdauung im Dünndarm
Die über das Pankreassekret als Proenzyme in das Dünndarmlumen gelangenden Endo- und Exopeptidasen hydrolysieren nach ihrer Aktivierung die Nahrungsproteine zu Oligopeptiden (max. 7 Aminosäuren) und Aminosäuren. Die wandständigen Peptidasen der Bürstensaummembran spalten die Oligopeptide zu Di- und Tripeptiden und Aminosäuren auf, so dass als resorptionsfähige Endprodukte der Proteinverdauung im Dünndarm Di- und Tripeptide sowie Aminosäuren anfallen. Die in Form von Di- und Tripeptiden zur Resorption gelangenden Aminosäuren übertreffen die freien Aminosäuren um etwa das Doppelte und werden von intrazellulären Peptidasen ebenfalls zu Aminosäuren hydrolysiert (SCHARRER u. WOLFRAM 2000). Einen Überblick über die an der Proteinverdauung im Dünndarm beteiligten Enzyme, deren Funktion und Spaltprodukte gibt Tabelle 2 (mod. nach MEYER 1990 und SCHARRER u. WOLFRAM 2000).
(mod. nach MEYER 1990 und SCHARRER u. WOLFRAM 2000)
Enzyme Vorstufe Bildungsort Wirkungsort pH-Optimum Spaltprodukte
Endopeptidasen1)
Pepsin Pepsinogen Magenschleimhaut Magenlumen 1 - 3 Peptide (AS3))4)
Trypsin Trypsinogen Pankreas Dünndarmlumen 7 - 9 Peptide (AS)
Chymotrypsin Chymotrypsinogen Pankreas Dünndarmlumen 7 - 9 Peptide (AS)
Elastase Proelastase Pankreas Dünndarmlumen > 7 Peptide (AS)
Exopeptidasen2)
Carboxy- Procarboxy- Pankreas Dünndarmlumen > 7 AS, Peptide
peptidase A + B peptidasen
Carboxypeptidase BSM5) Oberfläche und 7 AS, Peptide
Aminopeptidase BSM Epithel der Dünn- 7 AS, Peptide
darmmukosa
Sonstige Peptidasen
?-Glutamyl-Transpeptidase BSM Oberfläche und 7 AS, Dipeptide
Dipeptidyl-Peptidase BSM Epithel der Dünn- 7 Dipeptide, Peptide
Dipeptidasen BSM darmmukosa 7 AS
1) Spaltung der Peptidbindungen durch Hydrolyse im mittleren Bereich der Proteinmoleküle
2) Abspaltung endständiger Aminosäuren der Proteinmoleküle (Aminosäuren mit freier Carboxylgruppe = Carboxypeptidase; Aminosäuren mit freier Aminogruppe = Aminopeptidase)
3) AS = Aminosäuren
4) Aminosäuren in geringer Menge 5) BSM = Bürstensaummembran
SCHRIFTTUM
19
2.1.2.3. Resorption von Aminosäuren
Für die Resorption der im Darmlumen freigesetzten Aminosäuren stehen, je nachdem ob es sich um neutrale, saure, basische, ?- oder Imino-Aminosäuren handelt, verschiedene Na+- Cotransport-Systeme zur Verfügung, mit deren Hilfe die Aminosäuren gegen ein Konzentrationsgefälle durch die Bürste nsaummembran in die Enterozyten aufgenommen werden. Basische Aminosäuren können auch Na+-unabhängig resorbiert werden. Der Austritt von Aminosäuren aus der Epithelzelle durch die basolaterale Membran in das Interstitium erfolgt „bergab“ durch carriervermittelte erleichterte Diffusion, wobei auch hier separate Carrier für verschiedene Aminosäuren-Gruppen (neutrale, saure bzw. basische Aminosäuren) existieren. Anschließend werden die Aminosäuren über das Pfortaderblut abtransportiert (SCHARRER u. WOLFRAM 2000).
2.1.2.4. Resorption von Di- und Tripeptiden
Die Resorption von Di- und Tripeptiden erfolgt gegen ein Konzentrationsgefälle durch H+- Cotransport im Austausch mit Na+. Nachfolgend werden die Di- und Tripeptide durch Di- und Tripeptidasen des Zytoplasma s weitgehend zu freien Aminosäuren hydrolysiert, welche durch die basolaterale Membran per erleichterter Diffusion in das Interstitium übertreten und über das Pfortaderblut abtransportiert werden. Allerdings kommt in der basolateralen Membran auch ein Peptidcarrier vor, durch den in geringem Umfang auch Di- und Tripeptide ausgeschleust werden können (SCHARRER u. WOLFRAM 2000).
2.1.2.5. Resorption von Proteinen
Nach GARDNER (1988) können auch intakte Proteinmoleküle aus dem Dünndarm resorbiert werden, in dem sie an Rezeptoren der Bürstensaummembran binden und per Pinozytose in die Enterozyten aufgenommen werden. Während der überwiegende Teil dieser Proteine von zytoplasmatischen sowie lysosomalen Proteasen zu Aminosäuren gespalten werden,
wiederstehen einige Proteine diesem Abbau und gelangen über die basolaterale Membran in das Pfortaderblut. Normalerweise werden solche intakt aufgenommenen Proteine von dem mononukleären Phagozyten-System der Leber beseitigt. Fehler in diesem System verursachen die Produktion von Antikörpern, die gegen die im Darm resorbierten Antigene gerichtet sind.
Somit kann eine erneute Resorption des gleichen Proteins eine Sensibilisierung des Organismus mit nachfolgender immunologischer Reaktion hervorrufen (GUILFORD 1996, S.
341). SAMPSON wies 1999 darauf hin, dass die Barrierefunktion der Mucosa auch bei intaktem Epithel nie absolut sei. Er nimmt an, dass bis zu 2 % der aufgenommenen Nahrungsallergene systemisch in einer Form absorbiert werden, in der sie gegebenenfalls auch eine Immunantwort auslösen könnten.
2.1.2.6. Proteinverdauung im Dickdarm
Die Proteine, welche den Dickdarm erreichen, bestehen überwiegend aus nicht oder nur unvollständig verdauten Proteinen aus dem Magen- und oberen Dünndarmbereich, sind aber z. T. auch endogenen Ursprungs (z. B. endogene Sekrete oder abgeschilferte Epithelien) (SCHARRER u. WOLFRAM 2000). Da die Aktivität körpereigener proteolytischer Enzyme im Dickdarm rasch abnimmt, teils weil die pH-Werte nicht mehr optimal sind, teils weil sie dem mikrobiellen Abbau unterliegen (MEYER 1990), übernehmen unterschiedliche mikrobielle Enzyme wie Proteasen, Desaminasen, Decarboxylasen und Ureasen die weitere Verdauung. Aus dem Proteinabbau werden Ketosäuren, Amine, CO2 sowie Ammoniak freigesetzt, die über die Dickdarmwand resorbiert bzw. mit dem Kot ausgeschieden werden können. Ammoniak ist zugleich eine wichtige Stickstoffquelle für die Synthese mikrobieller Aminosäuren und damit der mikrobiellen Proteinsynthese (SCHARRER u. WOLFRAM 2000).
2.1.3. Scheinbare Verdaulichkeit verschiedener Proteine
Die Tabellen 3 bis 5 zeigen die von verschiedenen Untersuchern eingesetzten Proteinquellen und –gehalte in Futterrationen für Katzen und die ermittelten scheinbaren Verdaulichkeiten des Rohproteins.
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, ließen sich nach isolierter Fütterung von Fleisch bzw. Organen verschiedener Spezies hohe Proteinverdaulichkeiten von 94 bis 98 % beobachten.
Tab. 3: Scheinbare Verdaulichkeit des Rohproteins bei isolierter Fütterung verschiedener Futtermittel bzw. aus Differenzversuchen
proteinhaltige Rp-Gehalt sV (%) Autor
Komponente % TS
Hackfleisch (Rind) 53,9 95,7 KENDALL et al. 1982
Hackfleisch (Rind) 55,4 96,2 SCHNEIDER 1988
Hornmehl1) 78,7 45,9
Federmehl1) 77,0 82,9
Leber (Rind) 64,0 96,7 FIGGE 1989
Lunge (Rind) 51,1 94,8
Herz (Rind) 42,9 93,9
Pansen (Rind) 46,4 96,1
Fischmehl 64,4 90,5
Thunfisch 84,2 96,7
Sojaproteinisolat1) 92,2 87,0
Eier, gekocht1) 48,3 95,9
1) nach Differenzberechnung
KANE et al. stellten 1981 für ein Sojaproteinisolat in Kombination mit Stärke eine scheinbare Verdaulichkeit von 95 % fest (Tab. 4). In Rationen mit erhöhten Stärkezulagen ging die Proteinverdaulichkeit zurück, ein Zusammenhang, der von mehreren Untersuchern bei den verschiedensten Proteinq uellen (MORRIS et al. 1977, deWILDE u. JANSEN 1985, KIENZLE 1989) beobachtet wurde. BURGER et al. berichteten 1984 bei Sojaproteinisolaten
wurde, kam es auch hier zu einem Rückgang der Eiweißverdaulichkeit. Die Unterschiede zwischen den beiden Untersuchern können auf die verschiedenen Protein- sowie Stärkegehalte der Rationen zurückgeführt werden. Während bei den Untersuchungen von BURGER et al. (1984) nur 16 % Protein in der Trockensubstanz und entsprechend mehr Stärke (14,2 %) enthalten waren, wies die von KANE et al. (1981) verfütterte Ration einen Eiweißgehalt von 40 % und einen Stärkegehalt von 0,5 % auf.
DEKEYZER (1997) bot Katzen Futtermischungen mit jeweils vier Dosierungen von Rinderherz, Griebenmehl oder Geflügelfleischmehl an und stellte eine Verbesserung der scheinbaren Verdaulichkeit bei Zunahme der Proteingehalte in den Rationen fest.
SCHNEIDER (1988) verfütterte schwerverdauliche Eiweiße (Federmehl bzw. Hornme hl) in Kombination mit Hackfleisch. Die Proteinverdaulichkeit dieser Mischungen war wesentlich geringer als die von Fleisch (Tab. 3 und 4), wobei Hornmehl mit 46 % eine deutlich geringere Verdaulichkeit aufwies als Federmehl mit 83 % (nach Differenzberechnungen).
KIENZLE (1989) prüfte die Proteinverdaulichkeit von Fleischmehl und Geflügelabfallmehl in Kombination mit Fischöl und beobachtete für das Fleischmehl eine höhere Proteinverdaulichkeit als für Geflügelabfallmehl.
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, ergaben sich bei den kommerziellen Katzenalleinfuttermitteln für die Proteinverdaulichkeit sehr unterschiedliche Werte. Auffallend ist eine Zunahme der Proteinverdaulichkeit in Trockenalleinfuttern, die in älteren Untersuchungen zwischen 74 und 80 % lag, in ne ueren jedoch Werte von bis zu 87 % erreicht und mit dem Bestreben der Futtermittelhersteller begründet werden kann, immer hochwertigere Produkte auf den Markt zu bringen.
BROWN (1997) bot Katzen verschiedene „No name“- sowie Markentrockenfutter an und stellte für die Proteinverdaulichkeit keinen deutlichen Unterschied fest.
Tab. 4: Scheinbare Verdaulichkeit von Rohprotein in Futtermischungen mit bekannten Proteinquellen
proteinhaltige andere Rp-Gehalt sV (%) Autor
Komponente Komponenten % TS
Sojaproteinisolat Getreidestärke 39,8 94,8 KANE et al. 1981
Sojaproteinisolat Rohrzucker, Stärke 16,4 86,0 BURGER et al. 1984
Hackfleisch + Hornmehl 61,6 78,0 SCHNEIDER 1988
Hackfleisch + Federmehl 65,2 91,0
Fleischmehl Fischöl, Schmalz 57,5 90,7 KIENZLE 1989
Geflügelabfallmehl Fischöl, Schmalz 40,8 86,9
Herz + Sojaproteinisolat 60,7 89,9 FIGGE 1989
Herz + Eier, gekocht 43,4 94,5
Herz (Rind) Reis, Schmalz 15,1-55,8 79,2-95,2 DEKEYZER 1998
Griebenmehl Reis, Schmalz 16,2-60,7 78,4-89,1
Geflügelfleischmehl Reis, Schmalz 14,9-54,7 73,3-82,8
SCHRIFTTUM
24
Tab. 5: Scheinbare Verdaulichkeit des Rohproteins bei der Fütterung kommerzieller Alleinfutter
Art des Futters Rp-Gehalt sV (%) Autor
% TS
Trockenalleinfutter 36,2 77,3 THRALL u. MILLER 1976
Trockenalleinfutter 36,9 79,3
Feuchtalleinfutter 27,0 81,0 MÜLLER-SCHLÖSSER 1977
Feuchtalleinfutter 37,4 68,3 DAMMERS 1980
Trockenalleinfutter 31,0 74,0
Feuchtalleinfutter 1 58,8 81,1 KENDALL et al. 1982 Feuchtalleinfutter 2 52,1 83,3
Trockenalleinfutter 22,4 76,6
Trockenalleinfutter 34,1 83,4 ZENTEK 1987
Trockenalleinfutter 26,7 79,6
+ Fischöl
Trockenalleinfutter (CO-1) 35,2 87,4 BROWN 1997 Trockenalleinfutter (CO-2) 32,3 82,2
Trockenalleinfutter (CO-3) 33,1 80,6 Trockenalleinfutter (CM-6) 34,6 83,7 Trockenalleinfutter (CM-1) 33,0 84,5 Trockenalleinfutter (CM-5) 34,3 82,6
2.2. Fütterungsbedingte Ursachen für chronische Darmerkrankungen bei der Katze
2.2.1. Futtermittelunverträglichkeiten
Um eine einheitliche Terminologie für die verschiedenen Arten der Futtermittelunverträglichkeit zu schaffen, werden häufig die von der American Academy of Allergy and Immunology für den humanmedizinischen Bereich vorgeschlagenen Definitionen (ANDERSON 1984) herangezogen, die nach HALLIWELL (1992) und GUILFORD (1994) auch auf Haustiere übertragen werden können. Somit entspricht der allgemeine Begriff der
„Futtermittelunverträglichkeit“ dem der Futtermittelsensibilität und bezeichnet eine klinisch auffällige Reaktion auf Futter oder Futterzusatzstoffe, die entweder mit (Futtermittelallergie oder Futtermittelhypersensitivität) oder ohne Beteiligung des Immunsystems (Futtermittelintoleranz) ablaufen. Die Futtermittelintoleranz kann durch pharmakologische, metabolische oder toxische Wirkung des Futters bzw. durch idiosynkratische Vorgänge ausgelöst werden (Tab. 6) und im Gegensatz zur Allergie schon nach einer Erstexposition auftreten.
Für Katzen liegen keine konkreten Angaben vor, ob Allergien oder Intoleranzen häufiger vorkommen (ROUDEBUSH u. GUILFORD 1999). Dies begründen die Autoren damit, dass die Begriffe in der Literatur oft wahllos für jedwede Art der FM-Unverträglichkeit verwendet werden, zumal sich die beiden Komplexe klinisch kaum voneinander unterscheiden. HALL (2002) vermutet, dass bei der Katze, ähnlich wie beim Menschen, eine FM-Intoleranz häufiger als eine FM-Allergie vorkommt.
Einigkeit herrscht bei den Autoren zum einen darüber, dass Katzen keine Rasse- oder Geschlechtsdisposition zeigen und Symptome in jeder Altersgruppe auftreten können (WHITE u. SEQUOIA 1989, TOWELL 1992, BALLAUF 1993). Weiterhin stimmen sie überein, dass FM-Unverträglichkeiten bei Katzen relativ selten vorkommen (BURGER 1987, TOWELL 1992).
Reaktionen auf eiweißhaltige Futterkomponenten können sich in diversen Organs ystemen zeigen. Der Häufigkeit der Literaturangaben zufolge stellt die Haut das Hauptmanifestationsorgan für FM-Unverträglichkeiten dar. Seltener ist der Gastrointestinaltrakt in Mitleidenschaft gezogen und in ganz vereinzelten Fällen sind
respiratorische bzw. neurologische Symptome auf FM-Unverträglichkeiten zurückgeführt worden (TOWELL 1992, BALLAUF 1993, WILLS u. HARVEY 1994).
Tab. 6: Terminologie der Futtermittelunverträglichkeiten (GUILFORD 1996, S. 437)
Futtermittelunverträglichkeit Allgemeiner Begriff für eine klinisch auffällige (=FM-Sensibilität) Reaktion auf Futter oder Zusatzstoffe
Futtermittelallergie Adverse Reaktion auf Futter oder Zusatzstoffe mit (=FM-Hypersensibilität) nachweislich immunologischer Basis
Futtermittelintoleranz Allgemeiner Begriff zur Beschreibung einer adversen Reaktion auf Futter oder Zusatzstoffe ohne Beteiligung des Immunsystems
FM-Idiosynkrasie Quantitativ abnorme Reaktion auf Futter oder
Zusatzstoffe ähnlich einer Hypersensibilität, aber ohne Beteiligung des Immunsystems
Metabolische Reaktion Adverse Reaktion auf Futter aufgrund der Wirkung auf Futter einer Substanz auf den Stoffwechsel des Patienten oder
aber Ergebnis einer defekten Metabolisierung eines Nährstoffes
Pharmakologische Adverse Reaktion auf einen natürlichen oder Reaktion auf Futter synthetischen Zusatzstoff mit pharmakologischer
Wirkung
FM-Intoxikation Adverse Reaktion auf Futter durch direkte Toxinwirkung
2.2.1.1. Proteine als alimentäre Allergene
Daten über die spezifischen Eigenschaften von FM-Allergenen, die zu Problemen bei Katzen führen, sind in der Literatur äußerst spärlich dokumentiert und die gegenwärtigen Kenntnisse beruhen überwiegend auf dem humanmedizinischen Gedankengut. Hier werden hauptsächlich lösliche Proteine oder Glykoproteinmoleküle mit einem Molekulargewicht von 10-60 kD als Nahrungsmittelallergene beschrieben, die der Behandlung mit Hitze, Säure und Proteasen widerstehen. Andere physiochemische Eigenschaften, welche die Allergenität einiger Proteine
erklären, sind weniger gut verstanden (ROUDEBUSH u. GUILFORD 1999) und werden von einigen Autoren nur vermutet: nach PERLMAN (1977) beeinflusst auch der Herstellungsprozess die Allergenität eines Futters. Demnach könnte die Denaturierung der Proteine durch Hitze vorhandene Epitope zerstören und neue freisetzen, wodurch sich die Allergenität sowohl abschwächen als auch verstärken kann. ELEY (1992) nimmt an, dass auch während des Verdauungsvorganges weitere antigene Epitope entstehen. So haben nach ROUDEBUSH (1995) unvollständig verdaute Futterproteine aufgrund der vorhandenen antigenen Proteine und Polypeptide eine größere allergische Potenz als vollständig verdaute.
Tab. 7: Proteine in Futtermitteln, die in der Literatur als Verursacher von FM- Unverträglichkeite n bei der Katze angegeben sind
Proteine Autor
Kuhmilch WALTON et al. 1968
Kuhmilch, Rindfleisch, Fisch BURGER et al. 1987 Kuhmilch, Molke, Fisch, Eier, ACKERMANN 1988 Fleisch (Rind, Schwein, Huhn)
Soja, Mais
Kuhmilch, Fisch, Eier, WILLS u. HARVEY 1994 Fleisch (Rind, Hammel, Pferd
Schwein, Huhn, Kaninchen) Feucht- u. Trockenfutter
Fisch, Milchprodukte GUILFORD 1994 Feucht- u. Trockenfutter, GUILFORD et al. 2001 Fleisch (Rind, Huhn, Lamm),
Innereien, Sardinen
Tabelle 7 zeigt die Futtermittel, deren Proteine in der Literatur nach dem Einsatz von Eliminationsdiäten als Verursacher von FM-Unverträglichkeiten bei der Katze aufgedeckt werden konnten. Der Verzehr von Kuhmilch bzw. Kuhmilchprodukten führt bei Katzen
bekanntlich relativ häufig zu Intoleranzen. Bei den anderen aufgeführten Eiweißquellen wie Fisch, den diversen Fleischsorten oder Innereien handelt es sich gerade um diejenigen Komponenten, die, da besonders häufig in Mischfuttern verarbeitet, von Katzen regelmäßig aufgenommen werden und somit auch eher eine Unverträglichkeit hervorrufen können (GUILFORD 1996, S. 439).
2.2.2. Idiopathische chronische Darmentzündung
Die idiopathischen entzündlichen Darmerkrankungen (idiopathic inflammatory bowel disease
= idiopathische IBD) zeichnen sich durch die Infiltration des Gastrointestinaltraktes mit Entzündungszellen sowie durch ihre Chronizität aus. Sie werden klassifiziert nach der Art des Infiltrates in der Mukosa (Plasmazellen, Lymphozyten, Histiozyten, eosinophile bzw.
neutrophile Granulozyten) und nach der Lokalisation im GIT (Magen, Dünndarm und/oder Kolon). Bei der Katze dominiert die lymphoplasmazelluläre (Gastro-)Enteritis als Ursache für chronischen Brechdurchfall (WILLARD et al. 1985, DENNIS et al. 1992, GERHARDT 2000). Seltener findet man die chronische lymphoplasmazelluläre Colitis (NELSON et al.
1984, DENNIS et al. 1993) sowie die eosinophilen entzündlichen Darmerkrankungen (HENDRICK 1981, MOORE 1983). Vereinzelt werden granulomatöse (van KRUININGEN et al. 1983) sowie neutrophile Colitiden (LEIB et al. 1986) beobachtet.
Die Erkrankung betrifft Tiere jeglicher Rasse und Altersklasse sowie beiderlei Geschlechts (NELSON et al. 1984, JERGENS et al. 1992, BAEZ et al. 1999). Hinsichtlich einer Rassedisposition konnten lediglich DENNIS et al. (1992, 1993) in ihren Studien feststellen, dass von jeweils 14 Katzen signifikant häufiger reinrassige Tiere an lymphoplasmazellulärer Gastroenteritis bzw. Kolitis erkrankt waren.
Die Ätiopathogenese der idiopathischen IBD ist bis heute nicht vollständig geklärt. In der älteren Literatur finden sich einige Hinweise darauf, dass die FM-Allergie eine Rolle in der Pathogenese der IBD spielt. So hielten sowohl NELSON et al. (1984) als auch GILLESPIE und FOWLER (1984) eine FM-Allergie für die Ursache einer lymphoplasmazellulären Colitis bei sechs Katzen bzw. zwei Leoparden, da in beiden Fällen eine Futterumstellung zur
Genesung der Tiere führte. Anderen Studien zufolge reichte eine Futterumstellung alleine nicht aus, um die Symptome einer lymphoplasmazellulären Gastroenteritis zu kontrollieren (DENNIS et al. 1992, HART et al. 1994). JERGENS et al. (1992) beobachteten 26 an IBD erkrankte Katzen, die auf diätetische Maßnahmen nicht ansprachen. Somit sind FM- Unverträglichkeiten als alleinige Ursache für chronisch entzündliche Darmerkrankungen auszuschließen.
Heute nimmt man an, dass in der Pathogenese der entzündlichen Veränderungen vermutlich Hypersensitivitätsreaktionen auf luminale oder in der Mukosa befindliche Antigene eine Rolle spielen. So finden sich Hinweise darauf, dass Futterinhaltsstoffe und die zur physiologischen Flora gehörenden Mikroorganismen, weniger jedoch ihre pathogenen Vertreter, als Antigene ursächlich eine Rolle spielen können. Auch ist es denkbar, dass über eine Erhöhung der Mukosapermeabilität, z. B. verursacht durch transiente virale Infektionen, eine IBD initial ausgelöst werden könnte. Ebenso könnte eine gestörte Immunregulation innerhalb des GALT an der Entstehung der IBD beteiligt sein (GUILFORD 1996, S. 451-486).
2.3. Histologie des Katzendarms und Veränderungen bei intestinalen Erkrankungen
Nach LIEBICH (1999) weisen sämtliche Abschnitte des Katzendarms (Duodenum, Jejunum, Ileum, Zäkum, Kolon, Rektum) einen gleichartigen Grundbauplan auf, der aus geschichtetem Gewebe besteht, nämlich vom Lumen ausgehend:
> Tunica mucosa: - Epithelium mucosae - Lamina proria mucosae - Lamina muscularis mucosae
> Tela submucosa
> Tunica muscularis:- Stratum circulare - Stratum longitudinale
> Tunica serosa
2.3.1. Histologie des Dünndarms
Die Tunica mucosa, die sekretorische sowie resorptive Aufgaben wahrnimmt, stellt eine Barriere zwischen Umwelt und dem Inneren des Körpers dar. Zwecks Oberflächenvergrößerung bildet die Dünndarmmukosa Zotten aus, die fingerförmige Ausstülpungen der Lamina propria darstellen. Zusätzlich weist die Schleimhaut Einstülpungen in die Tiefe in Form von schlauchförmigen, geraden und unverzweigten Darmdrüsen (Glandulae intestinales, Lieberkühn-Drüsen, Krypten) auf. Deren basale Epithelzellen unterliegen ständigen mitotischen Teilungen, differenzieren sich auf ihrer zweitägigen Wanderung zur Zottenspitze aus und erneuern die sich ständig abschilfernden Epithelzellen. Das der Basalmembran aufliegende einschichtige, hochprismatische Epithel der Zotten sowie der Krypten schließt resorptionsaktive Enterozyten, sekretorisch tätige Becherzellen sowie endo- und parakrin sezernierende Zellen ein. Die Enterozyten weisen luminal einen aus einer Vielzahl von Mikrovilli bestehenden Bürstensaum auf, der die für die Verdauung und Resorption zur Verfügung stehende Oberfläche vergrößert und Verdauungsenzyme enthält. Überzogen wird der Bürstensaum von einer ausgeprägten Glykokalix, deren Funktion unbekannt ist. Sie kann jedoch weder durch proteolytische noch durch mukolytische Enzyme aufgelöst werden. Das Syntheseprodukt der Becherzellen ist ein glykoprotein- und glykolipidreicher Schleim, der merokrin auf die Oberfläche der Mukosa abgegeben wird. Der Schleim wirkt zum einen in hohem Maße zytoprotektiv, d. h. er schützt vor enzymatischer Eigenverdauung und vor pathogener Keimbesiedlung der Epithelzellen, zum anderen direkt bakterizid durch seinen Lysozymgehalt. Im Intestinum nehmen die Becherzellen an Zahl nach kaudal hin ständig zu. Endokrin sowie parakrin sezernierende Zellen liegen intraepithelial in den Kryptwänden: Neben APUD- (Amine precursor uptake decarboxylase) Zellen, die biogene Amine (z. B. Serotonin) und biologisch aktive Peptide (z.
B. vasoaktives intestinales Peptid) synthetisieren und sezernieren, findet sich eine Vi elzahl Peptidhormon-produzierender Zellen (z. B. Somatostatin). Diese endo- als auch parakrin wirkenden Produkte beeinflussen hemmend bzw. stimulierend die Abgabe von Verdauungsenzymen und die Darmmotorik. Unterhalb der Basalmembran schließt sich die Lamina propria an, deren lockeres Bindegewebe die Grundlage der Dünndarmzotten bildet sowie die Zwischenräume der Krypten ausfüllt. Die Propria beinhaltet Blut- und
Lymphgefäße, Nervenfasern, Myofibroblasten, glatte Muskelzellen sowie lymphoretikuläres Gewebe. Letzteres wird in seiner intestinalen Gesamtheit als GALT (Gut-associated lymphoid tissue) zusammengefasst. Die Schleimhaut schließt gegen die Tela submucosa mit einer geschlossenen Lamina muscularis mucosae aus glatten Muskelzellen ab.
Die Tela submucosa wird von lockerem Bindegewebe gebildet, das neben zahlreichen Blut- und Lymphgefäßen Nervengeflechte (Plexus nervorum submucosus, Meißner-Plexus) einschließt.
Die Tunica muscularis des Dünndarms besteht aus glatter Muskulatur, die in einer inneren Zirkulär- und einer äußeren Längsschicht angeordnet ist. Zwischen den Muskelschichten verlaufen Blut- sowie Lymphgefäße, und vegetative Nerven bilden autonome Ganglien (Plexus nervorum myentericus, Auerbach-Plexus). Abschließend wird der Dünndarm von einer Tunica serosa überzogen (STROMBECK 1996, S. 320-324, LIEBICH 1999).
2.3.2. Histologie des Dickdarms
Die wegen fehlender Ausprägung von Darmzotten glatte Dickdarmmucosa wird von einem einschichtigen, hochprismatischen Epithel bedeckt, dessen Enterozyten regelmäßig Mikrovilli entwickeln. In die Tiefe senken sich im gesamten Dickdarm bis zur Muscularis mucosae Glandulae intestinales, die gestreckt, lang und unverzweigt sind und dicht nebeneinander liegend wesentliche Anteile der Lamina propria ausfüllen. Während die Lieberkühnschen Krypten an ihrer Oberfläche zu gleichen Teilen die im Dickdarm vorkommenden Zellformen Enterozyten und Becherzellen beinhalten, nimmt die Anzahl der sezernierenden Becherzellen von proximal nach distal innerhalb der Kryptenwand ständig zu (STROMBECK 1996, S. 324, LIEBICH 1999). Die restlichen Dickdarmschichten entsprechen denen des Dünndarms.
2.3.3. Immunsystem des Darms
Das mit dem Gastrointestinaltrakt verbundene lymphoide System (GALT = Gut associated lymphoid tissue) besteht aus drei Kompartimenten: Als erstes sind die organisierten,
unbekapselten lymphoiden Aggregate der Peyer`schen Platten zu nennen, die aus follikulären (B-Lymphozyten) und parafollikulären (T-Lymphozyten) Zonen bestehen. Sie treten vornehmlich in der ilealen Sub mucosa auf und schieben sich bis weit in die Mucosa vor, wo sie sich oftmals in das Darmlumen vorwölben. Zweitens gehört zum GALT das diffus in der Lamina propria verteilte lymphoide Gewebe, das T- und B-Lymphozyten, Plasmazellen, Monozyten, Makrophagen, Mastzellen sowie eosinophile Granulozyten enthält. Drittens beinhaltet das GALT eine große Population intraepithelialer Lymphozyten.
Die Mukosa des Kolons enthält ebenfalls lymphoide Aggregate sowie Zellpopulationen der Lamina propria und intraepitheliale Lymphozyten (LIEBICH 1999, DAY 2002).
2.3.4. Pathohistologische intestinale Befunde bei Futtermittelunverträglichkeiten sowie bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
Mehrere Autoren stimmen überein, dass diese beiden Krankheitskomplexe allein aufgr und einer pathohistologischen Beurteilung entnommener Bioptate aus dem GIT nicht voneinander unterschieden werden können. So stellten BAHNA (1988) sowie GRYBOWSKI (1991) fest, dass keine pathognomonischen histologischen Merkmale vorhanden sind, um eine FM- Allergie von den anderen Ursachen für eine chronische intestinale Entzündung zu differenzieren. GUILFORD et al. (2001) konnten bei 16 von insgesamt 55 Katzen mit chronischen idiopathischen gastrointestinalen Problemen nachweislich eine FM- Unverträglichkeit feststellen, wobei die Tiere aufgrund einer pathohistologischen Beurteilung der entnommenen Bioptate nicht zu unterscheiden waren. Nach HALL (2002) finden sich bei einer FM-Allergie dieselben histologischen Veränderungen, die bei der idiopathischen IBD auftreten können.
Allerdings finden sich in der diesbezüglichen Literatur insbesondere hinsichtlich der FM- Unverträglichkeiten weit mehr Übersichtsarbeiten als kontrollierte Studien. Bei einer auf Milch allergisch reagierenden Katze konnten WALTON et al. (1968) mit der entsprechenden Fütterung neben einer Dermatitis auch eine Enteritis hervorrufen, deren Symptome nach Absetzen der Milchgaben verschwanden. In den entnommenen Bioptaten ließen sich
ödematisierte Bereiche in der Lamina propria und Submukosa, Epitheldegenerationen an den Zottenspitzen mit Blutungen ins Darmlumen sowie eine enorme Zunahme an Plasmazellen mit einer geringgradigen Zunahme an neutrophilen und eosinophilen Granulozyten im Dünndarm sowie im Kolon feststellen.
NELSON et al. (1984) diagnostizierten bei sechs Katzen eine lymphoplasmazelluläre Colitis, deren Ursache in einer FM-Allergie zu finden war. Dieselbe Beobachtung machten GILLESPIE und FOWLER (1984) bei zwei Leoparden. In beiden Fällen zeigte sich pathohistologisch eine Infiltration von Lymphozyten und Plasmazellen mit individuell variablem Auftreten von neutrophilen Granulozyten, Ödemen und Fibrosierungen in der Lamina propria des Kolon sowie Becherzellhyperplasie.
Tabelle 8 zeigt die von verschiedenen Untersuchern beobachteten Befunde und die daraus resultierende Diagnose chronisch entzündlicher Darmerkrankungen bei Katzen. Neben Unterschieden im Zelltyp der Infiltrate sowie der Lokalisation im GIT können in unterschiedlichem Grade Zottenatrophien, intraepitheliale lymphozytäre Infiltrationen, Hyperämisierungen, Fibrosierungen und Ödematisierungen in der Mukosa beobachtet werden (DENNIS 1992, 1993, HALL 2002).
Tab. 8: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen bei Katzen – Befunde und Diagnosen
Diagnose Befunde Autor
Eosinophile Enteritis
Granulomatöse Colitis
Lymphoplasmazelluläre Enteritis
Suppurative Colitis
Lymphoplasmazelluläre Gastroenteritis Lymphoplasmazelluläre
Colitis
Lymphoplasmazelluläre Enteritis
Dünndarm/Kolon: eosinophile Infiltrate
Kolon: Epithelerosionen;
granulomatöse Infiltrate aus Eosinophilen, Lymphozyten, Plasmazellen;
Kryptatrophie bzw. –dilatation Dünndarm: lymphoplasmazelluläre
Infiltrate; Zottenatrophie und –verschmelzung Kolon: neutrophile, z. T. lympho-
plasmazelluläre Infiltrate GIT1): lymphoplasmazelluläre
Infiltrate
Kolon: lymphoplasmazelluläre Infiltrate
Dünndarm/Kolon: lymphoplasma - zelluläre Infiltrate
HENDRICK 1981
van KRUININGEN et al. 1983
WILLARD et al. 1985
LEIB et al. 1986
DENNIS et al. 1992
DENNIS et al. 1993
GERHARDT 2000
1)GIT = Gastrointestinaltrak
SCHRIFTTUM
35
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1. MATERIAL UND METHODEN
3.1.1. Versuchsziel
Das Ziel der eigenen Untersuchungen war die Prüfung der Verträglichkeit einer qualitativ und quantitativ variierenden Proteinaufnahme bei Katzen unter Berücksichtigung folgender Aspekte:
1) Effekte auf die scheinbare Verdaulichkeit der Rohnährstoffe unter besonderer Berücksichtigung des Rohproteins,
2) Einfluss auf die histologische Struktur der Darmwand sowie
3) Auswirkungen auf den Gehalt von mikrobiellen Stoffwechselprodukten im Darmlumen.
Dazu wurden Fütterungs- und Bilanzversuche mit adulten Katzen durchgeführt. Verwendet wurden selbst hergestellte Futtermischungen mit Proteinquellen unterschiedlicher Qualität (Griebenmehl, Sojaproteinisolat, Muskelfleisch), die jeweils in zwei unterschiedlichen Dosierungen in ein Mischfutter verarbeitet wurden, so dass jeweils eine proteinreiche bzw. – arme Rationsvariante zum Einsatz kam.
Das Futterangebot erfolgte restriktiv nach dem energetischen Erhaltungsbedarf, um möglichst das Gewicht der Tiere konstant zu halten. Nach einer Adaptationsphase von 14 Tagen wurden in einer achttägigen Bilanzperiode Kot und Harn gesammelt. Am Ende der Bilanz wurden den nüchternen Katzen unter einer kur z wirksamen Injektionsnarkose Bioptate aus dem Kolon entnommen.
Der Versuchsplan ist aus Tabelle 9 ersichtlich.
Tab. 9: Versuchsplan
Versuchsabschnitt eingesetzter Proteinträger eingesetzte Dosierung Dauer
Versuchsabschnitt I:
GR 1 GR 2
Griebenmehl proteinreich proteinarm
4 Wochen 4 Wochen
Zwischenperiode Kommerzielles Feucht- und Trockenfutter
Versuchsabschnitt II:
SO 1 SO 2
Sojaproteinisolat proteinreich proteinarm
4 Wochen 4 Wochen
Zwischenperiode Kommerzielles Feucht- und Trockenfutter
Versuchsabschnitt III:
PFD 1 PFD 2
Pferdemuskelfleisch proteinreich proteinarm
4 Wochen 4 Wochen
3.1.2. Versuchstiere
Für die Untersuchungen standen 8 klinisch gesunde Europäisch Kurzhaarkatzen zur Verfügung (Tab. 10). Die Katzen K 1 bis 7 nahmen an den Bilanzversuchen teil, die Tiere, die zusätzlich bzw. nur (K 8) für die Bioptatentnahme verwendet wurden, sind aus der Tabelle ersichtlich. Die Körpermasse der Katzen betrug zwischen 3,0 und 5,3 kg, das Alter variierte zwischen zwei und fünf Jahren. Die Katzen wurden regelmäßig entwurmt und gegen Katzenschnupfen und –seuche geimpft.
Tab. 10: Versuchstiere
Versuchs- katzen
Bioptat- entnahme
Geschlecht Alter bei Versuchsbeginn
durchschnittl.
Gewicht [kg]
K 1 K 2 K 3 K 4 K 5 K 6 K 7 K 8
ja nein
ja nein nein ja ja ja
weiblich weiblich männlich männlich weiblich weiblich weiblich weiblich
4 J. und 11 M.
4 J. und 11 M.
2 Jahre 4 J. und 11 M.
4 J. und 11 M.
4 J. und 11 M.
4 J. und 11 M.
4 J. und 11 M.
3,3 3,5 5,1 4,8 3,1 3,5 4,5 2,9
3.1.3. Futtermischungen
Die Futtermittel für die Versuchsreihen wurden frisch präpariert unter Verwendung von Griebenmehl, Sojaproteinisolat und Pferdefleisch, die bei Eingang mittels Weender Analyse nach NAUMANN und BASSLER (1993) untersucht wurden (Tab. 11).
Tab.11: Rohnährstoffgehalte der verwendeten proteinreichen Futtermittel in g/kg uS
TS Ra Rp Rfe NfE
Griebenmehl Sojamin 90 Pferdefleisch
965 39,5 762 132,6 7,7
941 44,3 826 42,8 22,4
277 10,9 208 46,0 1,3
Die Zusammensetzung der Gesamtrationen ist aus Tab. 12 ersichtlich. Bei den Futtermitteln auf Griebenmehl- und Sojabasis wurde zusätzlich 1 g Taurin (Fa. Fluka, Deisenhofen) pro kg Futter-uS zugefügt. Die Futteranalysen ergaben die in den Tabellen 14 und 15 aufgeführten Ergebnisse. Die Pferdefleischrationen wurden nach dem Mischen in kleinen Portionen bei – 20°C tiefgefroren und je nach Bedarf aufgetaut, die anderen beiden Futtermittel gekühlt aufbewahrt, so dass die benötigten Mengen direkt zu entnehmen waren. Alle Futtermischungen außer PFD 1 wurden zur Akzeptanzsicherung unter Zusatz von destilliertem Wasser verabreicht. Die Herkunft aller Futtermittel sowie die Zusammensetzung des vitaminierten Mineralfutters sind dem Anhang 8.1. und 8.2. zu entnehmen.
Tab. 12: Zusammensetzung der Versuchsfuttermischungen [%]
eingesetzte
Proteinquelle Ration
Protein- Reis Schweine- Schweine- Zellu- vitaminiertes quelle schmalz leber lose Mineral-
futter1)
Griebenmehl GR 1 GR 2
85 9 0 0 3 3
25 50 19 0 3 3
Sojamin 90 SO 1 SO 2
25 45 19 5 3 3
70 9 10 5 3 3
Pferdefleisch PFD 1 PFD 2
95,45 2,75 0 0 0,9 0,9
55 30 11,32) 0 1,9 1,8
1)Vitakalk® 2) Pferdefett
3.1.4. Versuchstechnik
Die Katzen waren in einem geschlossenen Raum bei Temperaturen zwischen 18 und 22°C untergebracht. Während der 14-tägigen Anfütterungsphase wurden die Tiere in zwei Gruppen gehalten und gemeinsam gefüttert. Die 8-tägige Bilanzperiode verbrachten die Katzen einzeln in Stoffwechselkäfigen, die aus Kunststoff bestanden und ein selektives Auffangen von Kot und Harn ermöglichten. Die Reinigung der Käfige erfolgte einmal täglich, so dass die Tiere Gelegenheit zu freiem Auslauf hatten. Zusätzlich wurden die Bilanzen in zweimal vier Tage eingeteilt mit einer Pause von zwei Tagen, in denen die Katzen in ihren gewohnten Gruppen gehalten wurden.
In allen Versuchsabschnitten erfolgte die Fütterung morgens, wobei die tägliche Futtermengenzuteilung auf der Grundlage des kalkulierten energetischen Erhaltungsbedarfes (KAMPHUES et al. 1999) erfolgte. Futterreste wurden am nächsten Morgen gesammelt und zurückgewogen. Destilliertes Wasser stand den Tieren ad libitum zur Verfügung, wobei der Trinkwasserverbrauch täglich erfasst wurde. Zur Kontrolle der KM-Entwicklung wurden die Katzen wöchentlich und jeweils am Anfang und am Ende einer Bilanzperiode gewogen.
Den Harnsammelbehältern wurde täglich 10 ml 1 N HCl-Lösung zugesetzt, um bakterielle Zersetzungen des anfallenden 24-Stunden-Harns zu verhindern. Der Kot wurde mehrmals am Tag gesammelt. Während einer Bilanzperiode wurden pro Tier drei NH
3- und pH-Messungen im frischen Kot vorgenommen, weiterhin wurden Proben zur Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren vorbereitet. Der restliche Kot wurde bis zur weiteren Untersuchung bei –20°C tiefgefroren.
Am Ende jeder Bilanzperiode wurden den Katzen nach einer 36stündigen Hungerperiode unter einer kurz wirksamen Injektionsnarkose jeweils 5 Biopsien aus dem Kolon entnommen, die bis zur weiteren Verarbeitung in 4%igem Formalin fixiert wurden.
3.1.5. Prüfparameter
Neben der Erfassung von Futter- und Wasseraufnahme, Harn- und Kotabsatz sowie KM- Entwicklung wurden folgende Parameter laborchemisch untersucht:
Futter: Rohnährstoffe nach der Weender Analyse (Rohwasser-Trockensubstanz, Rohasche Rohfett, Rohprotein, Rohfaser, N-freie Extraktionsstoffe), Energiegehalt (kalkulierte ME, Basis Nährstoffanalysen und Verdaulichkeitsuntersuchungen), Aminosäuren
Kot: pH-Wert, NH3-Gehalt, flüchtige Fettsäuren, Rohnährstoffe nach der Weender Analyse, Trockensubstanzgehalt
Harn: Indikan, freie Phenolkörper
Zusätzlich wurden am Ende jeder Bilanz per Endoskopie Bioptate aus dem Kolon entnommen, deren pathohistologische Beurteilung nach Schnittherstellung und Färbung mit Hämalaun-Eosin nach einem festgelegten Schema erfolgte.
3.1.6. Probenvorbereitung zur Analyse
Futter
Von jedem Versuchsfutter wurde eine Probe entnommen und zunächst für –20°C tiefgefroren.
Anschließend wurden diese Proben in einer Vakuumgefriertrocknungsanlage (Christ Delta IA, Fa. Christ, Osterode am Harz) dehydriert, gewogen und mit Hilfe der ZM 1000 auf eine Partikelgröße von 0,5 mm vermahlen (Fa. Retsch GmbH & Co. KG, Haan). Die erhaltene Probe wurde in fest verschlossenen Plastikbehältern bis zur weiteren Analyse aufbewahrt.
Kot
Die Bestimmung des NH3-Gehaltes, des pH-Wertes sowie der flüchtigen Fettsäuren erfolgte aus Frischkot. Für die NH3-Bestimmung wurden 0,5 g Frischkot mit 9,5 g destilliertem Wasser (Verdünnung 1:20) gut vermischt. Zur pH-Messung wurde eine Kotverdünnung von 1:10 verwendet (1 g Kot wurden mit 9 g destilliertem Wasser homogenisiert). Die Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren erfolge aus 1 g Frischkot, der mit 4 ml destilliertem Wasser homogenisiert und bei 3000 U/min für 15 min zentrifugiert wurde. Es wurde jeweils 1 ml des Überstandes abpippettiert, mit 100 µl Innerer Standardlösung (10 ml Ameisensäure und 100 µl 4-Methylvaleriansäure) versetzt und bis zur gaschromatographischen Bestimmung tiefgefroren.
Für alle weiteren Laboruntersuchungen wurde das tiefgefrorene Kotmaterial als Sammelprobe für jede Katze in einer Vakuumgefriertrocknungsanlage (Christ Delta IA, Fa. Christ, Osterode am Harz) dehydriert, auf eine Partikelgröße von 0,5 mm vermahlen und bis zur Analyse in fest verschlossenen Plastikbehältern aufbewahrt.
Harn
Der 24-Stunden Harn wurde in einem Behälter mit einer Vorlage von 10ml 1 N HCl aufgefangen, täglich gesammelt und in festverschlossenen Plastikbehältern tiefgefroren. Am Ende der Bilanz wurde für jede Katze eine Sammelprobe aus aliquoten Teilen hergestellt.
Kolonbioptate
Nach Entnahme der Bioptate erfolgte eine Fixierung in 4%igem Formalin bis zur weiteren Bearbeitung.
3.1.7. Angewandte Untersuchungsmethoden
3.1.7.1. Rohnährstoffgehalte im Futter und Kot
Die Bestimmung der Rohnährstoffgehalte wurde in getrocknetem und ge mahlenen Material nach den Vorschriften der Weender Futtermittelanalyse in der Fassung von NAUMANN und BASSLER (1993) durchgeführt.
3.1.7.2. Aminosäuren
Die Futterproben wurden zunächst einer sauren Hydrolyse (0,5 g Probe wurden mit 80 ml 6 M HCl versetzt) und einem Oxidationsaufschluß unterzogen, wobei letzterer für die Bestimmung der Aminosäuren Cystein und Methionin notwendig war und aus der Reaktion von 0,2 g Probe mit 5 ml Perameisensäure (72 ml 88%ige Ameisensäure und 8 ml 30%iges H2O2) bestand. Zur Untersuchung des aufgeschlossenen Probenmaterials wurde ein Aminosäureanalysator LC 3000 (Fa. Biotronic, Maintal) verwendet. Das Prinzip der Analyse ist eine Ionenaustauscherchromatographie in einer Trennsäule (Länge 21 cm, Durchmesser 3,2 mm), in der die Aminosäuren entsprechend ihrer Dissoziationsfähigkeit getrennt und durch ein Detektorsystem nach Anfärbung mit Ninhydrin photometrisch gemessen wurden.
3.1.7.3. Kotkonsistenz
Die Konsistenz der Fäzes wurde visuell nach folgender Skala beurteilt:
1. Grad: trocken/krümelig 2. Grad: fest geformt 3. Grad: weich geformt 4. Grad: schmierig/breiig 5. Grad: flüssig
3.1.7.4. Trockensubstanzgehalt der Kotproben
Für die TS-Bestimmung wurden die Kotproben bei –20°C tiefgefroren und dann in einer Vakuumgefriertrocknungsanlage (Christ Delta IA, Fa. Christ, Osterode am Harz) getrocknet.
3.1.7.5. pH-Wert
Elektrometrische Messung mit einem digitalen pH-Meter (Knick-pH-Meter, Fa. Knick, Berlin). Als Eichlösungen dienten gebrauchsfertige Lösungen der Fa. Merck, Darmstadt.
3.1.7.6. Ammoniak
3 ml einer 1:20 verdünnten Kotprobe wurden mit 0,3 ml Reagenz (1 mol NaOH/l und 0,1 mol EDTA/l) versetzt. Mit einer ammoniaksensitiven Messelektrode (Fa. Merck) wurde die Potentialdifferenz bestimmt. Eine hydrophobe, gasdurchlässige Membran trennte die Probelösung und die in der Elektrode befindliche Fülllösung. Durch Zugabe von NaOH und EDTA wurde in der Probe Ammoniak freigesetzt, welches bis zum Erreichen eines auf beiden Seiten gleichen Partialdruckes durch die Membran diffundierte. Dann war die Konzentration des gelösten Ammoniaks der Konzentration der OH-Ionen proportional, die über eine unmittelbar hinter der Membran angebrachte Elektrode gemessen wurde. Aus der Eichkurve, die vor den Messungen mit NH4Cl-Lösungen in den Konzentrationen 10-4 mol/l, 10-3 mol/l und 10-2 mol/l bestimmt wurde, ließ sich dann die NH3-Konzentration ermitteln.
3.1.7.7. Flüchtige Fettsäuren
Zur Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren wurden die nach 3.1.6. vorbereiteten Proben verwendet.
Die gaschromatographische Auftrennung der einzelnen Fettsäuren erfolgte in einem Gaschromatographen (GC-14 A, Fa. Shimadzu) unter Verwendung einer Glassäule von 2m Länge und 2mm innerem Durchmesser. Die Säule war mit GP 10% / SP 1000 / 1% H3PO4 auf 100/120 Chromosorb WAW (Supelco) gefüllt; Stickstoff diente als Trägergas. Bei dem Detektor handelt es sich um einen Flammenionisationsdetektor.
3.1.7.8. Indikan
Zur Indikanbestimmung im Harn wurde die Methode von CURZON und WALSH (1962) angewandt. Nach 15minütiger Einwirkung von p-Dimethylaminobenzaldehyd auf eine 1:2 verdünnte Harnprobe erfolgte eine Zugabe von NaOH und Hexanol. Nach 30minütigem Schütteln und kurzem Abzentrifugieren wurde der gelbrote Überstand photometrisch (Photometer UV-1602, Fa. Shimadzu, Duisburg) bei 464 nm gegen Wasser gemessen. Die Konzentrationsberechnung erfolgte anhand einer Eichkurve.
3.1.7.9. Freie Phenolkörper
Die Bestimmung erfolgte nach HOLLOWAY et al. (1980), modifiziert nach FLASSHOFF (1983) mit dem Folin-Ciocalteus-Reagenz (Fa. Fluka, Deisenhofen), das zu einer 1:10 verdünnten Harnprobe gegeben wurde. In Gegenwart von Phenolkörpern wurden die im Reagenz enthaltenen komplexen Polyphosphorwolframsäureverbindungen gelb bis farblos.
Nach Zugabe von 10%igen Natriumkarbonat entstand eine Blaufärbung, die mit einem Photometer (UV-1602, Fa. Shimadzu, Duisburg) bei 578 nm gemessen wurde. Mit Hilfe einer Eichkurve konnten die Konzentrationen ermittelt werden.
3.1.7.10. Histologische Untersuchung der Kolonbioptate
Gewinnung und Fixation
Nach Abschluss jedes Bilanzversuches wurden die Katzen einem mindestens 36-stündigen Nahrungsentzug unterzogen, um einen möglichst vollständig geleerten Dickdarm zur Bioptatentnahme vorzufinden. Eine kurze Allgemeinuntersuchung mit besonderem Augenmerk auf das Herz-Kreislauf-System erfolgte vor jeder Narkose, die in Kombination von Ketamin und Xylazin in einer Dosierung von 10 bzw. 2mg/kg KM vorgenommen wurde.
Bei den in Narkose liegenden Katzen wurde zum Schutz vor Austrocknung der Bulbi eine Augensalbe (Regepithel®, Alcon) in den Bindehautsack eingebracht.
Die Gewebeproben aus dem Kolon wurden mit Hilfe einer Bioptatfasszange entnommen, die über den Führungskanal eines an einen Generator (5005 Prox., Richard-Wolf-GmbH, Knittlingen) angeschlossenen flexiblen Sigmoidoskops (F91-S der Firma Wappler International GmbH) von rektal in das Kolon eingebracht wurde. Von jeder Katze wurden fünf Proben aus unterschiedlichen Lokalisationen des Kolon gewonnen. Die Gewebeproben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 4%igem Formalin fixiert, anschließend in Biopsiekapseln umgebettet und innerhalb von 24 Stunden weiter bearbeitet.
Die Aufwachphase verbrachten die Tiere in Einzelkäfigen, nach etwa 6 Std. wurden sie wieder in ihre Gruppen gelassen und erhielten etwa 12 Std. nach dem Eingriff feste Nahrung.
Paraffineinbettung und Schnittherstellung
Die weitere, ca. 14 Stunden dauernde Bearbeitung der sich in den Biopsiekapseln befindlichen Proben übernahm ein unter Vakuum stehendes Automatensystem (Patchcentre, Fa. Shandon, Frankfurt). Zuerst wurden die Proben mit Leitungswasser gespült, um das Formalin auszuwaschen. Dann erfolgte eine Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%iges, 80%iges und 96%iges Ethanol, 100%iger Isopropylalkohol) sowie ein Aushärten der Bioptate in Essigsäure-n-Butylester als Intermedium. Zum Schluss
durchliefen die Proben mehrere Paraffinbäder, damit das Gewebe mit Paraplast Plus (Fa.
Shandon, Frankfurt) durchtränkt wurde.
Anschließend wurden die Bioptate mit Hilfe einer Ausgießstation (Tissue Tek, Fa. Miles Scientific., Naperville, IL) in flüssiges Paraplast Plus eingebettet und nach dem Aushärten als schnittfertige Blöcke ausgekapselt.
Dann erfolgte die Herstellung von 2 µm dicken Schnittpräparaten auf einem Schlittenmikrotom (HM 400, Fa. Microm, Heidelberg). Die Schnitte wurden in einem 40°C heißem Wasserbad mit Zusatz von Eiweiß-Glycerin (Chroma-Gesellschaft, Münster), das der besseren Haftung der Schnitte auf dem Objektträger dient, gestreckt und auf Objektträger aufgezogen, die zum Trocknen und Ablaufen des Paraffins für 10 min in einen Wärmeschrank (Tissue drying oven 50, Fa. Medite, Burgdorf) verbracht wurden.
Färbung der Paraffinschnitte mit Hämalaun-Eosin (H.E.-Färbung) und Eindecken
Die Färbung der Paraffinschnitte mit Hä malaun-Eosin übernahm ein Rondellfärbeautomat (Varistain 24-3, Fa. Shandon, Frankfurt): nach dem Entparaffinieren der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe (Xylol, Isopropanol, 96%iges, 70%iges, 50%iges Ethanol) und Waschen mit Aqua dest. wird 10 min mit Hämalaun nach P. Mayer gefärbt. Dann zweimalige Spülung mit Aqua dest. und dazwischen liegende Färbung mit Eosin (2 min). Eine aufsteigende Alkoholreihe diente dem Entwässern. Die Zusammensetzung der Färbelösungen finden sich im Anhang.
Zum Schluss wurden die Schnitte im Eindeckautomat (Promounter RCM 2000, Coverslipping Machine, Fa. Medite, Burgdorf) unter Einsatz von Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel) mit Deckgläschen versehen.
Lichtmikroskopische Beurteilung der nach H.E.-gefärbten Schnittpräparate
Die lichtmikroskopische Beurteilung aller entnommenen Bioptate erfolgte mit einem Standard-Binokular-Lichtmikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen) nach einem festgelegten Schema (Tab. 13), und zwar in willkürlicher Reihenfolge ohne Kenntnis der Katze oder des Versuchsabschnittes. So konnte jedem Einzelbioptat eine Gradzahl zugeordnet werden. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf das Vorkommen von Lymphozyten und Plasmazellen sowie der Beschaffenheit des Epithels und der Lieberkühn-Krypten gerichtet. Zusätzlich wurde auf das Auftreten von Hyperämie, Ödem oder Fibrose geachtet. Das Vorhandensein neutrophiler Granulozyten wurde gesondert vermerkt. Für den Fall, dass nicht alle Kriterien pro Gradeinteilung für ein Bioptat zutreffend waren, wurde ein halber Grad vergeben.
(Beispiel: Kryptdilatation und Ödem, aber kein vermehrtes Infiltrat ? 0,5 oder ggr.
Infiltration, sonst o. b. B. ? 0,5). Eine Kontrolluntersuchung erfolgte durch einen geübten Pathologen.
Tab. 13: Beurteilungsschema der Kolonbioptate (modifiziert nach JERGENS et al. 1992)
Grad Pathologisch-histologische Parameter
0
1
2
3
Keine pathologisch- histologischen Veränderungen
Geringgradige Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen, hochprismatisches Epithel, geringgradiges Ödem und Hyperämie, geringgradige Kryptdilatation (mit Abflachung des Epithels), normale Mikroarchitektur, evtl. geringgradige Fibrose
mittelgradige Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen, fokal
Epithelabflachungen, mittelgradige Kryptdilatation, mittelgradiges Ödem und Hyperämie, evtl. Fibrose
hochgradige Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen, hochgradige Kryptdilatation, Epithelerosionen, hochgradiges Ödem und Hyperämie, Fibrose, Mikroarchitektur weitestgehend zerstört
Fotografische Dokumentation
Die fotografische Dokumentation erfolgte mit einem Mikroskop Axiophot (Fa. Zeiss, Oberkochen) und mit Pan F 50 Filmen (Fa. Ilford Imaging Ltd., Mobberley Cheshire, England).
3.1.8. Statistische Auswertung der Ergebnisse
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Programme EXCEL 2000® und SAS®.
Berechnet wurden Mittelwert (x) und Standardabweichung (±Std.) bei der Zusammenfassung mehrerer Einzelwerte, wobei für die in den Kolonbioptaten erhobenen Parameter zusätzlich der Median mit Minimum/Maximum angegeben wurde. Zur Ermittlung statistisch signifikanter Differenzen zwischen mehreren Mittelwerten wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse (Proteindosierung und Proteinqualität) mit anschließendem gepaarten t-Test durchgeführt. In den Tabellen wurden zur Kennzeichung signifikanter Differenzen beim Mittelwertsvergleich Buchstaben benutzt. Mittelwerte, die nicht mit dem gleichen Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant. Die Irrtumswahrscheinlichkeit (p) wurde mit < 5 % als signifikant angesehen.
