Analytische Chemie

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Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr.Martin Pabst martin.pabst@org.chem.ethz.ch

HCI D323

pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Zusammenfassung der letzten Stunde:

Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen (ca. 10–20% der bekannten org. Moleküle)

• v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle

• Derivatisierung: Überführung der Analyten in flüchtige Derivate

Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann:

z.B. kleine ungeladene Moleküle anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe

grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine)

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Zusammenfassung der letzten Stunde:

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Vorteile der GC gegenüber der LC:

• Kapillarsäulen haben sehr hohe Bodenzahlen (bis ca. 200 000)

• schmale Peaks

• hohe Peakkapazität (viele basisliniengetrennte Peaks in einem Chromatogram)

• Untersuchung komplexer Proben

• GC-Detektoren sind empfindlich

Probleme:

• Kapillarsäulen werden leicht überladen

• Überladungseffekte, asymmetrische Peaks - Split-Injektion

Zusammenfassung der letzten Stunde:

• Häufigste Trägergase:

N ₂ , He, H ₂

• Mobile Phase dient nur zum

Transport der Analyten durch die Säule

• Das Trägergas beeinflusst die Trenneffizienz bzw. die Bodenhöhe

• Viskosität:

H

₂

< He < N

₂

• Diffusionskoeffizienten der Analyten in der mobilen Phase:

N

₂

< He < H

₂

• Beste Trenneffizienz um ca. u = 1 ml/min mit H

₂

und He. N

₂

ist kostengünstiger . H = A + B

u + C u

B ∝ D

_M

^C

M

∝ 1 D

_M

breites Optimum

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Zusammenfassung der letzten Stunde:

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Polare Phasen: Neben dem Siedepunkt ist auch die Polarität der Moleküle ein Trennkriterium .

Apolare Phasen: In der Regel verwendet man apolare Phasen. Hier trennt man die Analyten gemäss ihrer Flüchtigkeit (Siedepunkt)

GC: Optimierung

Ziel der Optimierung ist es, eine effektive Peakauflösung (R _S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

R _S = α −1 α



  

  k ₂ 1 + k ₂



  

  N 4



  

 

α = f k,K ( _C )

k = f ( β ,K _C )

N = f L,H ( )

• Polarität der stationären Phase k, α

• Säulenlänge L N (und Analysenzeit)

• Säuleninnendurchmesser  _k

• Filmdicke  _k

• Säulentemperatur T K _C k

Gradientenelution (Temperaturprogramm):

Erhöhung der Temperatur entspricht Erhöhung der Elutionskraft

Je höher α , k und N, desto besser die Auflösung R _S

Aber: Je höher k und L, desto

länger die Analysendauer

(4)

Einfluss der Säulentemperatur

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Trennung zweier Substanzen bei verschiedenen Säulentemperaturen. Eine geringere Temperatur bewirkt höhere Verteilungskonstanten K

_C

und damit höhere Retentionsfaktoren k und eine höhere Auflösung R

_S

. Höhere Retentionsfaktoren bewirken aber auch längere Retentions- und Analysenzeiten. Das Ziel der Optimierung, nämlich eine effektive Trennung (R

_S

> 1.5) in kurzer Zeit, wäre hier bei einer Temperatur um 55 ° C erreicht.

R

_S

= α− 1 α



  

  k

₂

1+ k

₂



  

  N 4



  

 

K

_C

= c

_S

c

_M

= f T ( )

k = t

_R

′

t

_M

= K

_C

V

_S

V

_M

= K

_C

β

Einfluss der Säulentemperatur

Gradientenelution

Höhere Temperatur höhere Elutionskraft

Wie in der LC: meist Erhöhung der Elutionskraft während der Gradiententrennung

Temperatur-Gradienten-Programm 70 ° C

70 ° C

220 ° C isotherme Bedingungen

Zeit

GC-Trennung bei konstanter Temperatur (oben) und mit einem Temperaturgradienten (unten). Die Probleme der langen Analysenzeit und der Peakverbreiterungen im oberen Beispiel werden durch die ansteigende Säulentemperatur im unteren Beispiel verringert.

5 min

10 ° C/min

15 min

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Gaschromatographie (GC) Detektoren

Flammenionisationsdetektor (FID)

(1) C-haltige Analyten reagieren zu CH ₄ (2) Umsetzung über

Radikale zu CHO ⁺

• Häufig eingesetzter GC-Detektor

• Erfasst alle kohlenstoffhaltigen Analyten (fast universal)

• Je mehr C-Atome im Molekül, desto emfpindlicher wird es detektiert!

(aber an Heteroatome gebundene C-Atome werden seltener, Carbonyl-C gar nicht zu CH

₄

umgesetzt)

Messung der Leitfähigkeit

der Knallgasflamme zwischen

den zwei Elektroden

(6)

Wärmeleitfähigkeitsdetektor

(WLD, thermal conductivity detector = TCD)

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Referenzzelle Messzelle

Trägergas mit Analyten

Trägergas

(1) Beheizter Draht misst Wärmeleitfähigkeit (WL)

von Trägergas + Analyten

(im Vergleich zu einer Referenzzelle) (2) Abnahme der WL Zunahme des elektr.

Widerstandes

(3) Signal = Änderung der Wärmeleitfähigkeit gegenüber reinem Trägergas

…Universeller Detektor!

• Empfindlichkeit mit den Trägergasen H

₂

und He hoch, mit N

₂

deutlich geringer

• Schwierig zu kombinieren mit Kapillarsäulen (nur “wide bore” Säulen mit 0.5-1 µm ID)

• Meist nur für Analyten eingesetzt die vom FID nicht erfasst werden (z.B. SiH

₄

)

Elektroneneinfangdetektor

(electron capture detector = ECD)

(1) Strahler gibt Elektronen ab (2) e

^–

reagieren mit Trägergas-

molekülen, Entstehung eines Grundstroms

(3) Diese setzen thermische e

^–

frei (4) Thermische e

^–

reagieren mit

Analyten mit hoher Elektronen- affinität

Signal = Abnahme des Stroms (1) Selektiver Detektor

• Nur Analyten, die leicht Elektronen aufnehmen können, werden detektiert (1) Halogenierte (z.B. –Cl, –Br) und nitrierte (–NO2) Analyten,

daneben auch andere N- und O-haltige Verbindungen

• Empfindlichkeit und Nachweisgrenzen extrem verbindungsabhängig

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Atomemissionsdetektor (AED)

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(1) Analyten werden in mikrowellen-induziertem Plasma atomisiert (und ionisiert)

Atome im angeregten Zustand (2) Übergang in den Grundzustand

Emission elementspezifischer Strahlung (3) Aufteilung mittels eines Prismas oder Gitters

in die einzelnen Wellenlängen

(4) Simultane Detektion aller Wellenlängen mittels eines Diodenarraydetektors Signal = Intensität von Atomemissionslinien

• Selektiver Detektor (elementselektiv, praktisch alle Elemente werden detektiert)

• Für jedes Element kann ein Chromatogram aufgezeichnet werden (parallel)

• Kohlenstoff-Spur: universeller Detektor

Massen(selektiver) Detektor

Ionisationsmethode:

Elektronenstossionisation (EI)

• EI-MS-Spektren zur Strukturaufklärung

• Gesamtionenstrom (total ion current = TIC): universelle Detektion

• Single (oder selected) ion mode (oder monitoring) (SIM): massenselektive Detektion Analysator:

Quadrupole

Ionenquelle: Detektor

Massenanalysator:

oft Quadrupol oder Ionenfalle

relativ kompakte Tischgeräte

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Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Pabst martin.pabst@org.chem.ethz.ch 15 http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/qit-massspec.html

Quadrupol

AnalytIonen mit passenden m/z werden durch das oszillierende elektrische Feld duch den Analysator transportiert

IonTrap (quadrupole ion trap) Gleichspannung

und oszillierende Radiofrequenz Ringförmiger Aufbau, Analytionen mit passender Masse werden in der trap gefangen

Massenanalysatoren

TOF (time of flight) In Abhängigkeit von m/z brauchen die Analytmoleküle unterschiedlich lang für dieselbe Strecke

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tof-massspec.html

Massenanalysatoren

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GC-Detektoren

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Detektor Selektivität Nachweisgrenze Linearität

Flammenionisations- C-haltige Moleküle 1 pg C/s > 10

⁶

detektor (FID) ⇒ fast universell

Wärmeleitfähigkeits- universell 400 pg/ml 10

⁴

detektor (WLD bzw. TCD)

Elektroneneinfang- selektiv (z.B. stark verbindungsabhängig 10

⁶

detektor (ECD) –Cl, –Br, –NO

₂

)

Flammenphotometrischer selektiv 20 pg S/s 10

³

(S)

Detektor (FPD) (S, P, Sn) 1 pg P/s 10

⁴

(P / Sn)

Atomemissionsdetektor (AED) universell / stark elementabhängig 10

²

–10

⁵

elementselektiv

Massenselektiver universell / verbindungsabhängig

Detektor (MSD) massenselektiv 10 pg–10 ng 10

⁵

Gaschromatographie (GC)

Beispiele

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Elektroneneinfangdetektor (ECD)

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Bestimmung der Metaboliten von polychlorierten Biphenylen (PCB) in Blutserum-Proben von Bewohnern der Färöer-Inseln

Das dortige traditionelle Nahrungsmittel “Walspeck” (Fettgewebe von Walen, Robben, Fischen) ist häufig kontaminiert mit PCBs und anderen fettlöslichen Umweltgiften

(1) Überführung der Hydroxy-PCBs in leicht flüchtige Methylether (2) Analyse mittels GC-ECD

Atomemissionsdetektor (AED)

Chlorpyrifos

(Insektizid)

• Kohlenstoff: universelle Detektorspur

• Zusätzlich heteroelement-spezifische Detektorspuren

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GC-Detektorkombination

Flammenionisationsdetektor FID und

Flammenphotometrischer Detektor FPD im S-Modus

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Gaschromatogram eines Schieferöls.

Nach der Säule wurde der Trägergasstrom 1:1 auf einen FID und einen im S-Modus betriebenen FPD verteilt.

F P D -S ig n a l F ID -S ig n a l

Massenselektiver Detektor

2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin (2,3,7,8-TCDD)

MS: 2,3,7,8-TCDD mit M

⁺

· ^bei ³²⁰

MS

TCDD

¹³

C

₁₂

-TCDD

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C-markierter interner Standard

Bestimmung von Dioxinen mittels GC-MS GC-Trennung (auch Isomere werden getrennt) mit massenselektiver Detektion

SIM für jede Masse ein Chromatogram Interne Standards: z.B.

¹³

C-markierte Dioxine (werden aufgrund des Massenunterschieds unabhängig von den entsprechenden Analyten getrennt)

Selected ion monitoring (SIM)

Gas-Chromatrogramm

bei m/z = 320

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Massenselektiver Detektor (MSD)

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