(done) Flüssigchromatographie (LC)
à Gaschromatographie (GC)
Gaschromatographie (GC)
2
Mobile Phase: gasförmig
Stationäre Phase: flüssig
Gaschromatographie (GC)
Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen (ca. 10–20% der bekannten org. Moleküle)
v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle
Die Betriebstemperatur des Gaschromatographen muss aber nicht über dem Siedepunkt der Analyten liegen.
Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann:
kleine ungeladene Moleküle
anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe
Polymere
Grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine)
Gaschromatographie (GC)
Vorteile GC gegenüber LC:
• Kapillarsäulen haben sehr hohe Bodenzahlen (bis ca. 200 000)
• scharfe Peaks
• hohe Peakkapazität (viele basisliniengetrennte Peaks in einem Chromatogram)
• Untersuchung komplexer Proben
• GC-Detektoren sind sehr empfindlich (keine flüssige mobile phase)
• Quantifizierung im Bereich sehr kleiner Konzentrationen möglich
• Spurenanalytik
Typisches Problem:
• Kapillarsäulen werden leicht überladen
• Überladungseffekte, asymmetrische Peaks
• Abhilfe: Verdünnung der Proben oder Split-Injektion
Gaschromatographie (GC)
Derivatisierung:
Überführung von Analyten mit hohem Siedepunkt in leichtflüchtige Derivate
è „Absättigung“ polarer funktioneller Gruppen (z.B. –OH, –NH 2 , –COOH) mit apolaren Gruppen (z.B. –Si(CH 3 ) 3 , –CH 3 )
Beispiele
Silylierung von Alkoholen, Aminen und Thiolen
R OH +
CH
3Si Cl
CH
3CH
3- HCl
CH
3Si O
CH
3CH
3R
R OH +
CH
3Si O
CH
3CH
3R
H
3C
O
N
Si(CH
3)
3Si(CH
3)
3+ H
3C
OH
NSi(CH
3)
3 Trimethylchlorsilan (TMCS)N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid (BSA)
R COOH +
- N
2Diazomethan
N
+H
H
N
-R COOCH
3Alkylierung von Carbonsäuren
Gaschromatographie (GC)
Hauptbestandteile: Kapillarsäule, Trägergas, Säulenofen und Detektor
Kapillaren sind weniger als 1mm im Durchmesser, aber oft mehrere Meter lang.
GC: Injektor
Splitless-Split-Injektion
• Mikroliterspritze durchstösst ein Septum
• Injektion der Probe (Analyten + Lösungsmittel) in geheiztes Rohr (Verdampfer, Liner)
• Schlagartiges Verdampfen der Probe
• Trägergas transportiert die Probenmoleküle zur Säule
(A) Trägergas
(B) Septumspülung
(C) Splitfluss
GC: Injektor
Splitless-Split-Injektion
Splitverhältnis = Splitfluss Säulenfluss
• Bei der Split-Injektion gelangen weniger Probenmoleküle zur Säule
• Verringerung von Überladungseffekten
• Äquivalent zur Verdünnung der Probe
(Verdünnung ist zusätzlicher Arbeitsschritt è Fehlerquelle)
GC: Injektor
Headspace-Technik
(1) Beprobung der Gasphase
(headspace) über einer flüssigen Probenlösung
(2) Injektion der
flüchtigen Analyten in die Säule
• Analyse flüchtiger Substanzen, direktes Gasförmiges auftragen
• Abtrennung nicht flüchtiger Matrixbestandteile
• Beispiel: Bestimmung des Blutalkoholgehaltes
GC: Mobile Phase
• Häufigste Trägergase:
N 2 , He, H 2
• Mobile Phase wechselwirkt nicht mit stationärer Phase oder Analyten
• Mobile Phase dient nur zum
Transport der Analyten durch die Säule
• Das Trägergas beeinflusst die
Trenneffizienz bzw. die Bodenhöhe
• Viskosität:
H 2 < He < N 2
• Diffusionskoeffizienten der Analyten in der mobilen Phase:
N 2 < He < H 2
• Beste Trenneffizienz um ca. u = 1 ml/min mit H 2 und He. N 2 ist kostengünstiger.
H = A + B
u + C u
B ∝ D M C
M∝ 1
D
MGC: Stationäre Phase
• Bei Betriebstemperatur flüssige stationäre Phasen (type A,B)
• Gepackte Säule: Partikel im 100-µm-Bereich beschichtet mit stationärer Phase
• Kapillarsäule: stationäre Phase als dünner Film auf der Innenwand einer Kapillare
Die 10–60 m langen Kapillarsäulen haben um 1–2 Grössenordnungen höhere Bodenzahlen è schmalere Peaks è höhere Auflösung
Heute werden in der analytischen GC fast ausschliesslich Kapillarsäulen eingesetzt
gepackte Säule
Kapillarsäule
GC: Stationäre Phase
Zeit Zeit
Gepackte Säule: Kapillarsäule:
Chromatogram eines bei einer Brandstiftung gefundenen Brandbeschleunigers
Vergleich der GC-Trennungen mit einer gepackten Säule und einer Kapillarsäule
GC: Stationäre Phase
• Polarität der stationären Phase häufig ähnlich der Polarität der Analyten
• Analyten häufig flüchtige, unpolare Moleküle
• Standardphasen: apolare Dimethylsiloxan-Phasen
• Auf apolaren Phasen werden apolare Analyten gemäss ihren Siedepunkten getrennt.
• Elutionsreihenfolge / Retentionszeit: niedriger Siedepunkt < hoher Siedepunkt
Si O
Si O Si
O Si
O Si
O Si O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3
CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3
... ...
GC: Stationäre Phase
Polare Phasen: Neben dem Siedepunkt ist auch die Polarität der Moleküle ein Trennkriterium.
O Si CH3
CH3 100%
O Si Si
CH3
CH3 O
5%
95%
O Si Si
CH3
CH3 O CN
14%
86%
O
100%
Poly(dimethylsiloxan)
Poly(5%-diphenyl-95%-dimethylsiloxan)
Poly(14%-cyanopropylphenyl- 86%-dimethylsiloxan)
Polyethylenglykol
X-1
X-5
X-1701
X-Wax
apolar
polar
Zunahme der Polarität
Struktur Name Kürzel Polarität
Gaschromatographie (GC)
http://www.youtube.com/watch?v=08YWhLTjlfo
Optimierung einer GC-Trennung
Ziel der Optimierung (wie bei LC):
Effiziente Trennung (mit R S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit
R S = α− 1 α
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ k 2 1 + k 2
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ N 4
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟
Einfluss der stationären Phase
Trennung von (1) p-Xylen, (2) m-Xylen, (3) Decan und (4) Undecan auf (a) einer apolaren Polydimethylsiloxan- und (b) einer polaren Polyethylenglycol-Phase.
R S = α − 1 α
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ k 2 1 + k 2
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ N 4
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟
k = t
R− t
Mt
M= t
R′ t
Mα = t R ′ 2
′
t R1 = K C 2 K C1
Trennung nur nach Siedepunkt!
Trennung nach
Siedepunkt
und Polarität!
Einfluss der Säulenlänge
Trennung verschiedener Kohlenwasserstoffe mit unterschiedlich langen GC-Säulen. Analyten: (A) n-Nonan, (B) 2-Octanon, (C) n-Decan, (D) 1-Octanol, (E) 2,6-Dimethylphenol, (F) n-Undecan, (G) 2,4-Dimethylanalin, (H) Naphthalen, (I) n-Dodecan. Stationäre Phase: Poly(dimethylsiloxan).
R S = α − 1 α
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ k 2 1 + k 2
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ N 4
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟
L = 2.5 m
L = 5 m
L = 12 m
L = 25 m
N = L H
R S ∝ N bzw. R S ∝ L
Analysendauer ∝ L
Einfluss des Säuleninnendurchmessers
Zwei Trennungen, die – bei sonst gleichen Bedingungen – mit zwei Säulen mit unterschiedlichem Innendurchmesser (ID = 0.1 und 0.25 mm) durchgeführt wurden. Der geringere Säuleninnendurchmesser im oberen Chromatogram bewirkt eine höhere Auflösung.
R
S= α − 1 α
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ k
21 + k
2⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ N 4
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟
k = t ′
Rt
M= K
Cβ
k ∝ 1 β β = V
MV
SGC-Trennungen, die mit verschiedenen Filmdicken der stationären Phase durchgeführt wurden (0.25 µm, 0.5 µm und 1 µm). Ein dickerer Film bewirkt niedrigeres Phasenverhältnis und damit höhere Retentionsfaktoren und Auflösungen, was jeweils exemplarisch an zwei Peaks gezeigt ist.
R
S= α − 1 α
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ k
21 + k
2⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ N 4
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟
k = t ′
Rt
M= K
Cβ
k ∝ 1 β β = V
MV
SEinfluss der Filmdicke
GC: Optimierung
Ziel der Optimierung ist es, eine effektive Peakauflösung (R S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.
R S = α − 1 α
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ k 2 1 + k 2
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ N 4
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟
α = f k, ( K C )
k = f ( β ,K C )
N = f L, ( H )
• Polarität der stationären Phase è k, a
• Säulenlänge L è N (und Analysenzeit)
• Säuleninnendurchmesser è β è k
• Filmdicke è β è k
• Säulentemperatur T è K C è k
Gradientenelution (Temperaturprogramm):
Erhöhung der Temperatur entspricht Erhöhung der Elutionskraft
Je höher a, k und N, desto besser die Auflösung R S
Aber: Je höher k und L, desto
länger die Analysendauer
Einfluss der Säulentemperatur
Trennung zweier Substanzen bei verschiedenen Säulentemperaturen. Eine geringere Temperatur bewirkt höhere Verteilungskonstanten K
Cund damit höhere Retentionsfaktoren k und eine höhere Auflösung R
S. Höhere Retentionsfaktoren bewirken aber auch längere Retentions- und Analysenzeiten. Das Ziel der Optimierung, nämlich eine effektive Trennung (R
S> 1.5) in kurzer Zeit, wäre hier bei einer Temperatur um 55°C erreicht.
R
S= α − 1 α
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ k
21 + k
2⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟ N 4
⎛
⎝ ⎜ ⎞
⎠ ⎟
K
C= c
Sc
M= f T ( )
k = t ′
Rt
M= K
CV
SV
M= K
Cβ
Einfluss der Säulentemperatur
Gradientenelution
Höhere Temperatur è höhere Elutionskraft
Wie in der LC: meist Erhöhung der Elutionskraft während der Gradiententrennung
Temperatur-Gradienten-Programm 70°C
70°C
220°C isotherme Bedingungen
Zeit
GC-Trennung bei konstanter Temperatur (oben) und mit einem Temperaturgradienten (unten). Die Probleme der langen Analysenzeit und der Peakverbreiterungen im oberen Beispiel werden durch die
ansteigende Säulentemperatur im unteren Beispiel verringert.
5 min
10°C/min
15 min
Gaschromatographie (GC)
Detektoren
Flammenionisationsdetektor (FID)
(1) C-haltige Analyten reagieren zu CH 4 (2) Umsetzung über
Radikale zu CHO +
• Häufig eingesetzter GC-Detektor
• Erfasst alle kohlenstoffhaltigen Analyten (fast universal)
• Je mehr C-Atome im Molekül, desto emfpindlicher wird es detektiert!
(aber an Heteroatome gebundene C-Atome werden seltener, Carbonyl-C gar nicht zu CH
4umgesetzt)
Messung der Leitfähigkeit
der Knallgasflamme zwischen
den zwei Elektroden
Wärmeleitfähigkeitsdetektor
(WLD, thermal conductivity detector = TCD)
Referenzzelle Messzelle
Trägergas mit Analyten
Trägergas
(1) Beheizter Draht misst Wärmeleitfähigkeit (WL)
von Trägergas + Analyten
(im Vergleich zu einer Referenzzelle) (2) Abnahme der WL è Zunahme des elektr.
Widerstandes
(3) Signal = Änderung der Wärmeleitfähigkeit gegenüber reinem Trägergas
…Universeller Detektor
• Empfindlichkeit mit den Trägergasen H 2 und He hoch, mit N 2 deutlich geringer
• Schwierig zu kombinieren mit Kapillarsäulen (nur “wide bore” Säulen mit 0.5-1 µm ID)
• Meist nur für Analyten eingesetzt die vom FID nicht erfasst werden (z.B. SiH 4 )
Elektroneneinfangdetektor
(electron capture detector = ECD)
(1) Strahler gibt Elektronen ab (2) e
–reagieren mit Trägergas-
molekülen, Entstehung eines Grundstroms
(3) Diese setzen thermische e
–frei (4) Thermische e
–reagieren mit
Analyten mit hoher Elektronen- affinität
Signal = Abnahme des Stroms (1) Selektiver Detektor
• Nur Analyten, die leicht Elektronen aufnehmen können, werden detektiert (1) Halogenierte (z.B. –Cl, –Br) und nitrierte (–NO2) Analyten,
daneben auch andere N- und O-haltige Verbindungen
• Empfindlichkeit und Nachweisgrenzen extrem verbindungsabhängig
Atomemissionsdetektor (AED)
(1) Analyten werden in mikrowellen-induziertem Plasma atomisiert (und ionisiert)
è Atome im angeregten Zustand (2) Übergang in den Grundzustand
è Emission elementspezifischer Strahlung (3) Aufteilung mittels eines Prismas oder Gitters
in die einzelnen Wellenlängen
(4) Simultane Detektion aller Wellenlängen mittels eines Diodenarraydetektors Signal = Intensität von Atomemissionslinien
• Selektiver Detektor (elementselektiv, praktisch alle Elemente werden detektiert)
• Für jedes Element kann ein Chromatogram aufgezeichnet werden (parallel)
• Kohlenstoff-Spur: universeller Detektor
Massen(selektiver) Detektor
Ionisationsmethode:
Elektronenstossionisation (EI)
• EI-MS-Spektren zur Strukturaufklärung
• Gesamtionenstrom (total ion current = TIC): universelle Detektion
• Single (oder selected) ion mode (oder monitoring) (SIM): massenselektive Detektion
Analysator:
Quadrupole
Ionenquelle: Detektor
Massenanalysator:
oft Quadrupol oder Ionenfalle
è relativ kompakte Tischgeräte
http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/qit-massspec.html
Quadrupol
AnalytIonen mit passenden m/z werden durch das
oszillierende elektrische Feld duch den Analysator transportiert
IonTrap (quadrupole ion trap)
Gleichspannung
und oszillierende Radiofrequenz Ringförmiger Aufbau, Analytionen mit passender Masse werden in der trap gefangen
Massenanalysatoren
TOF (time of flight)
In Abhängigkeit von m/z brauchen die Analytmoleküle
unterschiedlich lang für dieselbe Strecke
http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tof-massspec.html
Massenanalysatoren
GC-Detektoren
Detektor Selektivität Nachweisgrenze Linearität
Flammenionisations- C-haltige Moleküle 1 pg C/s > 10
6detektor (FID) fast universell
Wärmeleitfähigkeits- universell 400 pg/ml 10
4detektor (WLD bzw. TCD)
Elektroneneinfang- selektiv (z.B. stark verbindungsabhängig 10
6detektor (ECD) –Cl, –Br, –NO
2)
Flammenphotometrischer selektiv 20 pg S/s 10
3(S)
Detektor (FPD) (S, P, Sn) 1 pg P/s 10
4(P / Sn)
Atomemissionsdetektor (AED) universell / stark elementabhängig 10
2–10
5elementselektiv
Massenselektiver universell / verbindungsabhängig
Detektor (MSD) massenselektiv 10 pg–10 ng 10
5Gaschromatographie (GC)
Beispiele
Elektroneneinfangdetektor (ECD)
Bestimmung der Metaboliten von polychlorierten Biphenylen (PCB) in Blutserum-Proben von Bewohnern der Färöer-Inseln
Das dortige traditionelle Nahrungsmittel “Walspeck” (Fettgewebe von Walen, Robben, Fischen) ist häufig kontaminiert mit PCBs und anderen fettlöslichen Umweltgiften
(1) Überführung der Hydroxy-PCBs
in leicht flüchtige Methylether
(2) Analyse mittels GC-ECD
Atomemissionsdetektor (AED)
Chlorpyrifos
(Insektizid)
• Kohlenstoff: universelle Detektorspur
• Zusätzlich heteroelement-spezifische Detektorspuren
GC-Detektorkombination
Flammenionisationsdetektor FID und
Flammenphotometrischer Detektor FPD im S-Modus
Gaschromatogram eines Schieferöls.
Nach der Säule wurde der Trägergasstrom 1:1 auf einen FID und einen im S-Modus betriebenen FPD verteilt.
F PD -Si g n al F ID -Si g n al
Massenselektiver Detektor
2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin (2,3,7,8-TCDD)
MS: 2,3,7,8-TCDD mit M
+· bei 320
MS
TCDD
13C
12-TCDD
13