Entwicklung und Einsatz eines Tränkewasserzusatzes aus organischen Säuren als Campylobacter-Minimierungsstrategie in der Geflügelmast und Untersuchungen zur bakteriellen Adaptation

(1)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Entwicklung und Einsatz eines Tränkewasserzusatzes aus organischen Säuren als Campylobacter-Minimierungsstrategie in der Geflügelmast und Untersuchungen zur bakteriellen Adaptation

INAUGURAL – DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Elisa Peh (geb. Thunhorst) Ostercappeln

Hannover 2020

(2)

(3)

(4)

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;

detaillierte bibliografische Daten sind im Internet abrufbar über http://dnb.ddb.de

Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-571-2 1. Auflage 2021

Verlag:

DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen Tel.: 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de

(5)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Entwicklung und Einsatz eines Tränkewasserzusatzes aus organischen Säuren als Campylobacter-Minimierungsstrategie in der Geflügelmast und Untersuchungen zur bakteriellen Adaptation

INAUGURAL – DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Elisa Peh (geb. Thunhorst) Ostercappeln

Hannover 2020

(6)

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Carsten Krischek

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit

Prof. Dr. Corinna Kehrenberg, PhD Justus-Liebig-Universität Gießen

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde

1. Gutachter: gemeinsames Gutachten von:

PD Dr. Carsten Krischek

Prof. Dr. Corinna Kehrenberg, PhD

2. Gutachter: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD

Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2020

Gefördert im Rahmen des Projektes „PAC-Campy“ durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung.

(7)

Publikationsverzeichnis

Die Dissertation basiert auf den folgenden Manuskripten:

Peh, E., Kittler, S., Reich, F., Kehrenberg, C. (2020)

Antimicrobial activity of organic acids against Campylobacter spp. and development of combinations- a synergistic effect?

PLOS ONE, DOI: 10.1371/journal.pone.0239312

Peh, E., Kittler, S., Seinige, D., Valero, A. Kehrenberg, C. (2021)

Adaptation of Campylobacter field isolates to propionic acid and sorbic acid is associated with fitness costs

Journal of Applied Microbiology, DOI: 10.1111/jam.15057

Teilergebnisse der Dissertation wurden außerdem im Rahmen folgender Veranstaltungen präsentiert:

Poster

Thunhorst, E., Kittler, S., Reich, F., Kehrenberg, C. (2018)

In-vitro-Untersuchungen zur Wirksamkeit organischer Säuren im Rahmen von Campylobacter-Minimierungsstrategien in der Geflügelmast

DVG, Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene, Garmisch- Partenkirchen

Thunhorst, E., Kittler, S., Reich, F., Kehrenberg, C. (2018)

In vitro study on the antimicrobial effect of organic acids on Campylobacter spp. to develop a drinking water additive

National Symposium on Zoonoses Research, Berlin

(8)

Vorträge

Thunhorst, E. (2020):

Entwicklung eines Tränkewasserzusatzes aus organischen Säuren im Rahmen von Campylobacter-Minimierungsstrategien in der Geflügelmast

Vortrag am 27.02.2020 im Rahmen des Doktorandenseminars am Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Thunhorst, E., Steffan, S., Kittler, S., Plötz, M., Kehrenberg, C. (2019):

Spezifische Minimierungsstrategien zur Reduktion von Campylobacter entlang der Lebensmittelkette

Vortrag am 13.06.2019 im Rahmen der Fachtagung des Sachverständigenlabors Stanlab vom 13.06.2019 bis 14.06.2019, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Thunhorst, E. (2018):

In-vitro-Untersuchungen zur Wirksamkeit organischer Säuren im Rahmen von Campylobacter-Minimierungsstrategien in der Geflügelmast

Vortrag am 21.11.2018 im Rahmen des Doktorandenseminars am Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover

(9)

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ... 1

2. Literaturübersicht ... 3

2.1. Campylobacter spp. ... 3

2.1.1. Taxonomie ... 3

2.1.2. Morphologie ... 3

2.1.3. Wachstumseigenschaften ... 4

2.1.4. Campylobacter spp. beim Menschen... 4

2.1.5. Campylobacter spp. in der Hähnchenmast ... 5

2.1.6. Minimierungsstrategien in der Primärproduktion ... 8

2.2. Organische Säuren... 9

2.2.1. Chemische Eigenschaften ... 9

2.2.2. Einsatz von organischen Säuren in der Hähnchenmast ... 13

2.2.3. Antimikrobielle Wirkung ... 15

2.2.4. Mechanismen der Adaptation von Campylobacter spp. ... 16

3. Material und Methoden ... 19

3.1. Antimikrobielle Wirksamkeit organischer Säuren ... 19

3.1.1. Untersuchungen in vitro ... 19

3.1.1.1. Auswahl der organischen Säuren und Campylobacter spp.-Isolate 19 3.1.1.2. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration ... 22

3.1.1.3. Zusammenstellung von Säurekombinationen ... 23

3.1.1.4. Untersuchungen zu synergistischen Interaktionen ... 26

3.1.2. Untersuchungen in vivo ... 27

3.1.2.1. Ethik ... 27

3.1.2.2. Auswahl und Herstellung des Säurecocktails ... 27

3.1.2.3. Aufbau des Tierversuchs ... 28

3.1.2.4. Applikation der Säurekombination ... 30

3.1.2.5. Probennahme und Untersuchung ... 30

3.1.2.6. Statistik ... 31

3.2. Nachweis möglicher Adaptationen nach Säurebehandlungen von Campylobacter spp. ... 32

(10)

3.2.1. Untersuchungen in vitro ... 32

3.2.1.1. Auswahl der organischen Säuren und Campylobacter spp.-Isolate 32 3.2.1.2. Adaptationsversuche ... 33

3.2.1.3. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration und Stabilität der Adaptation ... 34

3.2.1.4. Wachstumsverhalten der Isolate in Co-Kultur ... 35

3.2.1.5. Wachstumsverhalten der Isolate in Reinkultur ... 37

3.2.1.6. Statistik ... 37

3.2.2. Untersuchungen in vivo ... 38

3.2.2.1. Gewinnung von Re-Isolaten ... 38

3.2.2.2. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration der Re-Isolate .... 39

4. Publikationen ... 41

4.1. Publikation 1 ... 41

4.2. Publikation 2 ... 43

5. Ergebnisse, die bisher noch nicht zur Publikation vorbereitet sind ... 45

5.1. Einsatz der Säurekombination in vivo... 45

5.1.1. Antimikrobielle Wirksamkeit der Säurekombination in vivo ... 45

5.1.2. Empfindlichkeiten der Campylobacter-Reisolate im In-vivo-Versuch . 46 5.1.3. Gewichtsentwicklung ... 47

6. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion ... 49

6.1. Antimikrobielle Wirksamkeit der organischen Säuren... 49

6.1.1. Einfluss der Wahl der organischen Säuren ... 53

6.1.2. Einfluss der Konzentration ... 55

6.1.3. Einfluss des pH-Wertes ... 58

6.2. Auftreten von Adaptationen ... 60

6.2.1. Einfluss der Wahl der organischen Säuren ... 63

6.2.2. Einfluss der Konzentration ... 64

6.2.3. Einfluss des pH-Wertes ... 65

7. Schlussfolgerungen... 67

8. Zusammenfassung... 69

9. Summary ... 73

10. Literaturverzeichnis ... 77

(11)

10.1. Rechtstexte und EU-Verordnungen ... 92

11. Anhang ... 93

11.1. Tabellenverzeichnis ... 93

11.2. Abbildungsverzeichnis... 93

12. Danksagung ... 95

(12)

Abkürzungsverzeichnis

°C Abb.

ATCC C.

CAMHB CLSI CO2

dpi EFSA E.

FIC g KbE Log10

mCCD-Agar m

MCFA MHA MHK µL mL mol/L n N2

NaCl O2

SCFA spp.

VBNC Verd.

Grad Celsius Abbildung

American Type Culture Collection Campylobacter

Cation adjusted Mueller-Hinton broth Clinical and Laboratory Standards Institute Kohlenstoffdioxid

Days post inoculation

European Food Safety Authority Escherichia

Fractional inhibitory concentration Gramm

Kolonie bildende Einheiten Dekadischer Logarithmus

Modifizierter Aktivkohle Cefoperazon Desoxycholat Agar Masse

Medium chain fatty acid Mueller-Hinton Agar

Minimale Hemmkonzentration Mikroliter

Milliliter Mol pro Liter Anzahl Stickstoff Natriumchlorid Sauerstoff

Short chain fatty acids Spezies

viable but non-culturable Verdünnung

(13)

1. Einleitung 1

1. Einleitung

Organische Säuren wie Sorbinsäure und Benzoesäure werden auf Grund ihrer antibakteriellen Wirksamkeit bereits seit vielen Jahren als Konservierungsmittel in der Lebensmittelproduktion eingesetzt (THERON u. LUES 2011). Darüber hinaus bieten organische Säuren auch auf weiteren Stufen der Lebensmittelkette vielfache Einsatzmöglichkeiten.

Ein in den letzten Jahren vermehrt in den Fokus gerückter Aspekt ist der Einsatz organischer Säuren zur Reduktion von Campylobacter spp. in der Primärproduktion.

Die Campylobacteriose ist seit Jahren die am häufigsten gemeldete gastrointestinale Erkrankung in der Europäischen Union (EFSA 2020). Campylobacter spp. kolonisieren den Geflügeldarm und gelangen während des Schlachtvorgangs vom Darm auf den Schlachttierkörper (EFSA 2011; HERMANS et al. 2012b). Eine Infektion des Menschen erfolgt neben der Zubereitung, dem Umgang und dem Verzehr von kontaminiertem Geflügelfleisch auch durch direkten Kontakt zu Geflügel (SHANE 2000; SKARP et al. 2016). Um die Kontamination der Hähnchenschlachtkörper in der Europäischen Union zu senken, trat am 01.01.2018 die Verordnung (EU) 2017/1495 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 in Kraft, in der ein Prozesshygienekriterium für Campylobacter spp. eingeführt wurde. Gemäß der Verordnung dürfen höchstens 30 % der Hautproben von Geflügelschlachtkörpern Campylobacter-Keimzahlen von über 1000 koloniebildenden Einheiten pro Gramm (KbE/g) aufweisen. Die anhaltend hohen Fallzahlen an Erkrankungen zeigen, dass es trotz dieser Bemühungen um eine Reduktion der Erkrankung bis heute keine ausreichend wirksamen Bekämpfungsstrategien gibt. Nach Einschätzung der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) ist eine Reduktion des Erregers auf der Ebene der Primärproduktion der aussichtsreichste Ansatz für eine effiziente Bekämpfung der Campylobacteriose (EFSA 2011). So würde eine Reduktion der Campylobacter spp.-Konzentrationen im Darm der Masthähnchen zu einem deutlichen Rückgang der Infektionszahlen führen (EFSA 2011).

Die Ergebnisse früherer In-vitro-Studien und In-vivo-Untersuchungen in Hähnchen- Tiermodellen weisen darauf hin, dass die Anwendung verschiedener organischer

(14)

1. Einleitung 2

Säuren in Kombination vorteilhaft gegenüber einer Einzelanwendung ist (CHAVEERACH et al. 2002; SKÅNSENG et al. 2010). Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse gibt es kaum Daten zur Anwendung von Säurekombinationen, die speziell für die Behandlung in der Hähnchenmast zur Reduktion der Campylobacter spp.- Konzentrationen im Darm der Tiere entwickelt wurden. Darüber hinaus gibt es wenige Studien dazu, inwieweit nach einer Behandlung von Campylobacter spp. mit organischen Säuren die bakteriellen Wachstumseigenschaften im Sinne einer Adaptation beeinflusst werden und ob eine solche Toleranzbildung in vivo eine Rolle spielt.

Ziel dieser Dissertation war es deswegen,

1. in einem systematischen In-vitro-Ansatz Säurekombinationen zu evaluieren, die anschließend in vivo zur Reduktion von Campylobacter spp. bei Masthähnchen eingesetzt werden könnten,

2. die antibakterielle Wirksamkeit einer ausgewählten Säurekombination in vivo bei Masthähnchen nach Applikation über das Tränkewasser zu evaluieren, 3. In-vitro-Untersuchungen zur Adaptationsfähigkeit von Campylobacter spp. nach

Behandlung mit organischen Säuren unter Berücksichtigung möglicher Auswirkungen auf die Fitness durchzuführen,

4. die Empfindlichkeit des inokulierten C. jejuni-Stamms im zeitlichen Verlauf des Tierversuchs zu untersuchen und damit mögliche Adaptationen an die Säurekombination aufzudecken.

(15)

2. Literaturübersicht 3

2. Literaturübersicht

2.1. Campylobacter spp.

2.1.1. Taxonomie

Die Gattung Campylobacter (C.) umfasst derzeit 28 Spezies und wird der Familie der Campylobacteraceae zugeordnet, zu der auch die Gattungen Arcobacter und Sulfurospirillum gezählt werden (WILKINSON et al. 2018). Die taxonomische Einteilung von Bakterienspezies in die Gattung Campylobacter ist dabei einem stetigen Wandel unterworfen (NGULUKUN 2017). Im Jahr 2015 wurde mit C. hepaticus eine neue Campylobacter-Spezies identifiziert, die bei Masthähnchen die sogenannte

„spotty liver disease“ verursacht (CRAWSHAW et al. 2015; VAN et al. 2017).

2.1.2. Morphologie

Campylobacter spp. sind korkenzieherförmige Stäbchenbakterien und gehören zu den gramnegativen, nicht-sporenbildenden Bakterien. Sie sind zwischen 0,2 bis 0,8 µm breit und 0,5 bis 5 µm lang (KAAKOUSH et al. 2015). Je nach Spezies besitzen sie entweder unipolar eine einzelne Geißel an einem Ende, bipolar an beiden Enden der Zelle jeweils eine Geißel, oder sind unbegeißelt und unbeweglich (KAAKOUSH et al.

2015). Ungünstige Umweltbedingungen wie eine suboptimale Temperatur, Nährstoffmangel oder osmotischer Stress können dazu führen, dass Campylobacter spp. eine kokkoide Form annehmen (IKEDA u. KARLYSHEV 2012). Infolgedessen verlieren die Bakterien ihre Beweglichkeit und zeigen eine deutlich reduzierte Infektiösität gegenüber epithelialen Zellen (FRIRDICH et al. 2019). Des Weiteren können Campylobacter spp. in den „viable but non-culturable“ (VBNC)-Zustand übergehen (IKEDA u. KARLYSHEV 2012). VBNC bezeichnet den Zustand, in dem Bakterien zwar lebensfähig, aber nicht kultivierbar sind. Verschiedene Studien konnten zeigen, dass der VBNC-Zustand reversibel ist (LV et al. 2020). So beobachtete CHAVEERACH et al. (2003), dass C. jejuni und C. coli unter Säurestress (pH 4) in den VBNC-Zustand übergehen, sich durch eine Kultivierung in embryonierten Hühnereiern teilweise aber erholten. Auch nach einer Kolonisierung von Mäusen in vivo konnte

(16)

gezeigt werden, dass C. jejuni den VBNC-Zustand wieder verlassen können (CHAVEERACH et al. 2003; BAFFONE et al. 2006).

2.1.3. Wachstumseigenschaften

Campylobacter spp. gelten als anspruchsvolle Bakterien mit hohen Anforderungen an die Wachstumsbedingungen (PARK 2002). Die beiden für den Menschen relevantesten Spezies C. jejuni und C. coli sind thermophil mit einem Wachstumsoptimum bei 41,5°C (SILVA et al. 2011). Darüber hinaus wachsen die meisten Campylobacter spp. am besten in einer mikroaeroben Atmosphäre mit 5 – 10

% Sauerstoff (O2), 10 % Kohlenstoffdioxid (CO2) und 80 – 85 % Stickstoff (N2) (THOMPSON et al. 1990; STANLEY u. JONES 2003; KAAKOUSH et al. 2015). Der optimale pH-Wert für das Wachstum von Campylobacter spp. liegt zwischen 6,5 und 7,5 (DOYLE u. ROMAN 1981).

Für die selektive Anzucht von Campylobacter spp. sind spezielle Nährmedien notwendig, um ein Überwachsen durch die Begleitflora zu verhindern. Zu dem Zweck wurden verschiedene Selektivnährmedien entwickelt. Dazu gehören beispielsweise der modifizierte Aktivkohle Cefoperazon Desoxycholat (modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate, mCCD)-Agar mit Cefoperazon als Antibiotikum, die Bolton-Bouillon mit Cefoperazon, Vancomycin und Trimethoprim und die Preston- Selektiv-Anreicherungsbouillon mit Polymyxin B, Rifampicin und Trimethoprim (KIM et al. 2019).

2.1.4. Campylobacter spp. beim Menschen

Die Campylobacteriose war 2019 mit 61.321 Fällen die häufigste meldepflichtige bakterielle Krankheit in Deutschland (RKI 2020). Dabei kann typischerweise ein saisonaler Verlauf mit einer Häufung der Fallzahlen in den Sommermonaten und im frühen Herbst beobachtet werden (LAKE et al. 2019). Am häufigsten wurden die beiden thermophilen Spezies C. jejuni (83,9 %) und C. coli (10,3 %) nachgewiesen.

Daneben spielten mit einem geringen Anteil von jeweils 0,1 % auch Infektionen mit den Spezies C. lari, C. fetus und C. upsaliensis eine Rolle (EFSA 2019).

(17)

Kontaminiertes Hähnchenfleisch wird als die wichtigste Ansteckungsquelle für den Menschen angesehen. Schätzungen zufolge ist Hähnchenfleisch für circa 20 bis 30 % der Infektionen verantwortlich, während dem Reservoir Geflügel als Ganzes circa 50 bis 80 % der Fälle zugeschrieben werden (EFSA 2011). Weitere Infektionsquellen sind beispielsweise kontaminiertes Rind- und Schweinefleisch oder der Konsum von kontaminierter Milch und kreuzkontaminierten Lebensmitteln, aber auch der Kontakt zu Haustieren (KAAKOUSH et al. 2015; ANDRZEJEWSKA et al. 2019; EFSA 2019).

Campylobacter spp. weisen eine vergleichsweise niedrige krankheitsauslösende Infektionsdosis von 500 Keimen auf (IKEDA u. KARLYSHEV 2012).

Infektionen mit Campylobacter spp. verlaufen teilweise asymptomatisch, können sich aber auch in einer akuten Magen-Darm-Entzündung mit wässrigem oder blutigem Durchfall, Fieber und Krämpfen äußern (KAAKOUSH et al. 2015). Die Erkrankung ist in der Regel selbstlimitierend und die Symptome halten durchschnittlich für 6 Tage an (MAN 2011). Immungeschwächte, sehr junge und ältere Menschen sind am stärksten gefährdet, schwere oder chronische Verläufe zu erleiden. In seltenen Fällen können Folgeerkrankungen wie die reaktive Arthritis oder das Guillain-Barré Syndrom auftreten (IKEDA u. KARLYSHEV 2012). Je nach Verlauf der Erkrankung kann eine Antibiotikatherapie indiziert sein. Azithromycin aus der Wirkstoffgruppe der Makrolide ist Mittel der ersten Wahl zur antibiotischen Behandlung einer Campylobacteriose (DAI et al. 2020).

2.1.5. Campylobacter spp. in der Hähnchenmast

Mit einem Temperaturoptimum von 42 °C, einem pH-Wert Optimum zwischen 6,5 und 7,5 sowie den mikroaerophilen Eigenschaften finden Campylobacter spp. optimale Wachstumsbedingungen im Darmtrakt von Vögeln vor (PRINZINGER et al. 1991;

THOMPSON u. HINTON 1997; VAN DER WIELEN et al. 2000; PARK 2002). Dies könnte ein möglicher Grund dafür sein, dass Masthähnchen weltweit ein bedeutendes Reservoir für diesen Erreger darstellen (KAAKOUSH et al. 2015). Der Anteil Campylobacter spp.-positiver Herden variierte 2008 stark zwischen den Ländern der Europäischen Union und schwankte zwischen 2 und 100 %. Die durchschnittliche Prävalenz lag in den untersuchten Geflügelpopulationen bei 71 % (EFSA 2020). Die

(18)

Prävalenz von Campylobacter spp. in den Masthähnchenherden schwankt dabei im Jahresverlauf mit erhöhten Nachweisraten in den warmen Monaten. Als mögliche Gründe für die erhöhte Nachweisrate im Sommer werden beispielsweise ein vermehrtes Auftreten von Fliegen oder auch eine verstärkte Lüftung der Masthähnchenställe diskutiert (EFSA 2011). Im Rahmen des deutschlandweiten Zoonosen-Monitorings 2018 konnten in 41,6 % der am Schlachthof gewonnenen Zäkumproben von Masthähnchen Campylobacter spp. nachgewiesen werden (BVL 2020). Im Vergleich zu den vergangenen Jahren ist die Prävalenz konstant hoch. So lag die Prävalenz 2013 bei 25,3 %, 2014 bei 50,4 % und 2016 bei 43,5 % (BVL 2015, 2016, 2018). Dementsprechend hoch waren 2018 auch die Prävalenzen von Campylobacter spp. auf den Hähnchenschlachtkörpern (46,3 %) und in Hähnchenfleischproben (47,8 %) aus dem Einzelhandel (BVL 2020).

Campylobacter spp. können zumeist nach frühestens 21 Tagen in den Masthähnchenherden nachgewiesen werden. Unterschiedliche Faktoren werden als mögliche Gründe für die verzögerte Kolonisation diskutiert. So könnten ein Schutz der Tiere durch maternale Antikörper oder die Schwierigkeit, eine beginnende Kolonisierung einer Masthähnchenherde mit wenigen positiven Tieren und niedrigen Campylobacter spp.-Konzentrationen zu erfassen, eine Rolle spielen (EFSA 2020).

Eine vertikale Übertragung des Erregers in die Masthähnchenbestände gilt als unwahrscheinlich (EFSA 2020). Stattdessen geht man davon aus, dass der Erregereintrag hauptsächlich horizontal, beispielsweise durch Vektoren wie Tränkewasser, landwirtschaftliche Gerätschaften, Insekten, Nagetiere und Wildtiere geschieht (SORO et al. 2020). Auch Besucher, das landwirtschaftliche Personal oder insbesondere die Arbeiterkolonnen für den Vorfang von Masthähnchen können den Erreger in die Masthähnchenbestände eintragen (NEWELL u. FEARNLEY 2003).

Nach der Kolonisation einzelner Tiere kommt es durch die fäkale Kontamination von Futter, Einstreu und Tränkewasser zu einer raschen Verbreitung des Erregers innerhalb der gesamten Masthähnchenherde. Die Übertragung erfolgt dabei auf fäkal- oralem Wege und führt innerhalb weniger Tage dazu, dass alle Tiere einer Herde kolonisiert werden (AWAD et al. 2018). Im Tier besiedeln Campylobacter spp.

insbesondere Kolon, Zäkum und Kloake und können hier in Konzentrationen von bis

(19)

zu 10⁹ koloniebildenden Einheiten (KbE)/g Kot nachgewiesen werden (SILVA et al.

2011; SAHIN et al. 2015). Eine Kontamination des Geflügelfleisches mit dem Erreger geschieht dann ggf. während des Schlachtprozesses. Als mögliche Kontaminationsquellen gelten vor allem die externe Kontamination der Federn und der Haut sowie die intestinale Kolonisation der Tiere mit Campylobacter spp.

(SELIWIORSTOW et al. 2016). Eine externe Kontamination der Tiere findet dabei nicht nur in den Masthähnchenställen, sondern auch während des Transports zum Schlachthof statt. So konnte gezeigt werden, dass nach einer achtstündigen Lagerung von Transportboxen, in die Campylobacter spp.-positive Masthähnchen gesetzt wurden, keine Abnahme der Campylobacter spp.-Konzentrationen beobachtet werden konnte (BERRANG et al. 2004). Selbst nach einer 48-stündigen Lagerung konnten in einem Teil der Transportboxen noch lebensfähige Campylobacter spp. nachgewiesen werden (BERRANG et al. 2004). Die fäkale Ausscheidung von Campylobacter spp.

während des Transports stellt damit ein großes Risiko für die Kreuzkontamination von negativen Masthähnchenherden dar (BERRANG et al. 2003; BERRANG et al. 2004).

Schätzungen der EFSA zufolge könnte das Risiko für die öffentliche Gesundheit durch den Verzehr von Masthähnchenfleisch um mindestens 50 % reduziert werden, wenn die Schlachtkörper einen Grenzwert von 1000 KbE/g für Campylobacter spp. nicht überschreiten (EFSA 2011). Dementsprechend wurde am 01.01.2018 gemäß der Verordnung (EU) 2017/1495 zur Änderung der Verordnung (EU) 2073/2005 ein Prozesshygienekriterium für Campylobacter spp. auf Hähnchenschlachtkörpern eingeführt. Gemäß dieser Verordnung darf nur ein bestimmter Anteil der Hähnchenhautproben Campylobacter spp.-Keimzahlen von 1000 KbE/g oder mehr aufweisen. Überschreiten mehr als 30 % (20 % ab 01.01.2025) der untersuchten 50 Proben diesen Grenzwert, müssen entsprechende Hygienemaßnahmen auf dem Schlachthof und im Herkunftsbetrieb eingeleitet werden. Im Rahmen des Zoonosen- Monitorings in Deutschland wurden 2018 in 22,6 % der Proben Keimkonzentrationen von über 1000 KbE/g nachgewiesen (BVL 2020). Der Anteil der Proben, der über 1000 KbE/g lag, stieg im Vergleich zu 2013 (19,4 %) leicht an (BVL 2015).

(20)

2.1.6. Minimierungsstrategien in der Primärproduktion

Auf Grund der anhaltend hohen Infektionszahlen mit Campylobacter spp. beim Menschen sind dringend wirksame Minimierungsstrategien erforderlich. In der Vergangenheit wurde die Effektivität unterschiedlicher Biosicherheitsmaßnahmen zur Senkung des Erregereintrags in die Masthähnchenbestände untersucht. Dazu gehörten Zugangsbeschränkungen, Intensivierungen der Reinigung und Desinfektion von Masthähnchenstallungen, optimierte Konzepte zur Personalhygiene sowie Maßnahmen zur Insektenbekämpfung (GIBBENS et al. 2001; HALD et al. 2007).

Beispielsweise konnte nach der Installation von Fliegengittern in verschiedenen Studien beobachtet werden, dass die Prävalenz von Campylobacter spp. in den untersuchten Masthähnchenherden reduziert war (HALD et al. 2007). Dagegen stellten DE CASTRO BURBARELLI et al. (2017) fest, dass optimierte Reinigungs- und Desinfektionsprogramme zwar die Campylobacter spp.-Belastung in der Umwelt senken, aber nicht zu einer Reduktion der Kolonisation der Masthähnchen führen.

Insgesamt zeigte sich, dass die Einführung verschiedener Biosicherheitsmaßnahmen zu einer Reduktion von Campylobacter spp. in Masthähnchenbeständen beitragen kann, als einzelne Maßnahme aber keinen ausreichenden Effekt erzielt und daher mit weiteren Nicht-Biosicherheitsmaßnahmen kombiniert werden sollte (NEWELL et al.

2011).

Eine mögliche Minimierungsstrategie stellt dabei die Immunisierung von Masthähnchen gegen Campylobacter spp. dar. Unterschiedliche Studien haben in der Vergangenheit die Effektivität einer aktiven oder passiven Immunisierung durch unterschiedliche Antigene wie Flagellin oder Transportproteine untersucht (ROBYN et al. 2015). Trotz teilweise erfolgversprechender Studienergebnisse steht bis heute allerdings kein zugelassener Impfstoff zur Verfügung (EFSA 2020).

Eine andere Interventionsmaßnahme in der Primärproduktion ist die Anwendung von Bakteriozinen. Bakteriozine sind Peptide, die von Bakterien produziert werden und das Wachstum anderer Bakterien hemmen können (SVETOCH u. STERN 2010). In einer Studie von STERN et al. (2005) wurde ein von Paenibacillus polymyxa gebildetes Bakteriozin aufgereinigt und in mikroenkapsulierter Form über das Futter verabreicht.

Die Gabe führte zu einer signifikanten Reduktion der Campylobacter spp.-Kolonisation

(21)

im Zäkum der Masthähnchen (STERN et al. 2005). Auch in einer anderen Studie konnte die orale Gabe eines Bakteriozins die intestinale Kolonisation mit Campylobacter spp. in Geflügel signifikant reduzieren (SVETOCH et al. 2008).

Allerdings gibt es bis heute kein kommerziell erhältliches Bakteriozin-Präparat für den Einsatz gegen Campylobacter spp. (EFSA 2020).

Auch die Anwendung von Bakteriophagen wird vielfach als eine Bekämpfungsstrategie diskutiert (MEUNIER et al. 2016). Bakteriophagen sind Viren, die sehr spezifisch einzelne Bakterienspezies bzw. Bakterienstämme infizieren und zerstören (ROHWER 2003). Verschiedene Studien konnten zeigen, dass die Anwendung von Phagen zu signifikant niedrigeren Campylobacter spp.-Konzentrationen in Masthähnchen führt (WAGENAAR et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009; CARVALHO et al. 2010; KITTLER et al. 2013). Ein Problem der Phagentherapie ist das teilweise enge Wirtsspektrum der Phagen. Um eine Wirksamkeit gegenüber dem jeweiligen Campylobacter spp.-Isolat in der Masthähnchenherde zu gewährleisten, ist eine sorgfältige Auswahl passender Phagen bzw. eine Kombination von Phagen mit sich ergänzenden Wirtsspektren erforderlich (KITTLER et al. 2013). Da es in der Europäischen Union bisher keinen regulatorischen Rahmen zur Anwendung von Phagen gibt, sind Phagen zurzeit nicht zur Anwendung zugelassen (PELFRENE et al. 2020).

Die Anwendung von organischen Säuren stellt eine weitere interessante Strategie zur Minimierung von Campylobacter spp. in der Primärproduktion dar. Ein großer Vorteil gegenüber anderen Interventionsstrategien ist, dass viele organische Säuren wie Propionsäure, Sorbinsäure und Essigsäure gemäß der Verordnung (EG) Nr.

1831/2003 (Futtermittelzusatzstoff-Verordnung) als Futteradditiv zugelassen sind und damit für die Anwendung in der Primärproduktion unmittelbar zur Verfügung stehen (EUROPEAN COMMISSION 2020).

2.2. Organische Säuren

2.2.1. Chemische Eigenschaften

Organische Säuren sind chemische Verbindungen, die über eine oder mehrere funktionelle Gruppen verfügen, die für ihr Verhalten als Säure verantwortlich sind. Eine

(22)

große Gruppe organischer Säuren sind die Carbonsäuren, deren Moleküle eine oder mehrere Carboxylgruppen (-COOH) enthalten (Abb. 1). Organische Säuren gehen in wässriger Lösung eine Gleichgewichtsreaktion mit Wasser ein. Hierbei dissoziieren sie in H+-Ionen und die entsprechenden Säure-Anionen. Die Säurestärke der organischen Säuren wird durch die Säurekonstante bzw. den pKs-Wert gekennzeichnet.

(23)

Caprylsäure Propionsäure

Sorbinsäure Essigsäure

Capronsäure Ameisensäure

Ascorbinsäure Benzoesäure

Weinsäure Fumarsäure

Abbildung 1: Strukturformeln der zehn für die vorliegende Studie ausgewählten organischen Säuren.

(24)

In Tabelle 1 sind die chemischen Eigenschaften der zehn für die vorliegende Studie ausgewählten organischen Säuren aufgeführt. Je kleiner der pKs-Wert, desto größer ist die Säurestärke der organischen Säure. Abhängig von der Länge der Kohlenstoffkette können organische Säuren in kurzkettige (short chain fatty acids, SCFA) oder mittelkettige (medium chain fatty acids, MCFA) Fettsäuren eingeteilt werden (Tabelle 1). Benzoesäure besteht aus einem Phenylrest und einer Carboxylgruppe und wird folglich als aromatische Carbonsäure bezeichnet. Weinsäure und Fumarsäure werden auf Grund ihrer zwei Carboxylgruppen zu den Dicarbonsäuren gezählt. Im Gegensatz zu den restlichen neun organischen Säuren besitzt Ascorbinsäure keine Carboxylgruppe. Das saure Verhalten von Ascorbinsäure in wässriger Lösung ist bedingt durch ihre Endiol-Struktur (PEREZ u. PEREZ 2000).

Organische Säuren weisen abhängig von ihrer chemischen Struktur unterschiedliche Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten auf. Diese dienen als Maß für das Verhältnis zwischen der Fettlöslichkeit und der Wasserlöslichkeit einer Substanz. Werte, die kleiner als eins sind, deuten auf eine höhere Wasserlöslichkeit hin, während Werte, die größer als 1 sind, eine höhere Fettlöslichkeit anzeigen.

(25)

Tabelle 1: Übersicht über die chemischen Eigenschaften der organischen Säuren Organische

Säure

Anzahl Kohlen- stoff- atome

Anzahl Kohlen- stoff- Doppel- bindungen

Anzahl der Carboxyl- gruppen

Säure- konstante (pKs1)^d,e

Oktanol- Wasser- Verteilungs- koeffizient

Caprylsäure^a 8 0 1 4,89 3,05

Sorbinsäure 6 2 1 4,76 1,33

Capronsäure^b 6 0 1 4,88 1,92

Ascorbinsäure 6 1 0 4,70 -1,85

Benzoesäure^c 7 3 1 4,19 1,87

Propionsäure^b 3 0 1 4,88 0,33

Essigsäure^b 2 0 1 4,76 -0,17

Ameisensäure^b 1 0 1 3,75 -0,54

Weinsäure 4 0 2 3,40 -1,35

Fumarsäure 4 1 2 3,03 0,46

aMittelkettige Fettsäure (medium chain fatty acid, MCFA)

bKurzkettige Fettsäure (short chain fatty acid, SCFA)

caromatische Carbonsäure

dpKs1: pKs-Wert der ersten Protolysestufe

eDie pK^s2-Werte (pK^s-Werte der zweiten Protolysestufe) der zweiprotonigen organischen Säuren sind 4,45 für Weinsäure und 4,54 für Fumarsäure.

2.2.2. Einsatz von organischen Säuren in der Hähnchenmast

In der Vergangenheit war es üblich, Antibiotika in sub-inhibitorischen Konzentrationen in der Primärproduktion einzusetzen, um das Wachstum der Masttiere zu fördern und prophylaktisch eine Kolonisation mit Pathogenen zu verhindern (DIBNER u.

RICHARDS 2005). Angesichts steigender Antibiotikaresistenzen wurde diese Praxis Anfang 2006 EU-weit verboten (KHAN u. IQBAL 2016). Auch in den USA ist der Einsatz von Antibiotika zur Leistungsförderung verboten, wohingegen es beispielsweise in mehreren Ländern Afrikas keine entsprechende Regulierung gibt (VAN et al. 2020). Infolgedessen gab es große Bemühungen, Alternativen zur antibiotischen Leistungsförderung zu suchen. In einer Studie von HASSAN et al.

(2010) wurde der Effekt des antibiotischen Wachstumsförderers Enramycin mit dem Effekt zweier kommerziell erhältlicher Kombinationen aus organischen Säuren auf die Leistungsdaten und die Darmflora von Masthähnchen verglichen. Es zeigte sich, dass

(26)

organische Säuren die Leistung sogar in höherem Maße steigerte als der Einsatz des Antibiotikums (HASSAN et al. 2010). Andere Studien dagegen konnten keinen positiven oder gar einen negativen Effekt von organischen Säuren auf die Leistungsdaten beobachten (KIM et al. 2015). Als mögliche Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse wurde genannt, dass organische Säuren dosisabhängig zu einer Reduktion der Futteraufnahme von Masthähnchen führen könnten und der Effekt organischer Säuren abhängig vom hygienischen Zustand der Masthähnchenställe unterschiedlich ausfallen kann (KIM et al. 2015). Neben der leistungsfördernden Wirkung von organischen Säuren wurde für Ascorbinsäure ein positiver Einfluss auf die Broilergesundheit bei Hitzestress beschrieben (KHAN et al.

2012).

Neben dem Aspekt der Leistungsförderung wurde der Fokus in den letzten Jahren vermehrt auf die antimikrobielle Wirksamkeit organischer Säuren gelenkt. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass durch die Anwendung von organischen Säuren in der Hähnchenmast die intestinale Kolonisation mit Salmonella spp. reduziert werden kann (VAN IMMERSEEL et al. 2006). Auch die antimikrobielle Wirksamkeit organischer Säuren gegenüber Campylobacter spp. wurde in verschiedenen Studien untersucht. Die Ergebnisse bisheriger Studien zur Effektivität von organischen Säuren sind allerdings widersprüchlich. So konnten verschiedene Studien zeigen, dass die Anwendung organischer Säuren die Campylobacter spp.-Konzentrationen im Darm reduzierte (SOLIS DE LOS SANTOS et al. 2008; SOLIS DE LOS SANTOS et al. 2009;

JANSEN et al. 2014), während in anderen Studien kein reduzierender Effekt beobachtet wurde (VAN DEUN et al. 2008; HERMANS et al. 2010). Weitere Studien konnten zwar keinen reduzierenden Effekt auf die Campylobacter spp.-Zahlen im Darm nachweisen, allerdings zeigte sich eine verminderte Empfänglichkeit der Masthähnchen gegenüber einer Kolonisation mit dem Erreger (HERES et al. 2004;

HERMANS et al. 2012a). Dabei deuten Ergebnisse sowohl aus In-vitro- als auch aus In-vivo-Studien darauf hin, dass eine kombinierte Anwendung verschiedener organischer Säuren vorteilhaft gegenüber der Einzelanwendung ist (CHAVEERACH et al. 2002; SKÅNSENG et al. 2010; KIM u. RHEE 2013). Die aktuelle Studienlage zeigt, dass die Anwendung organischer Säuren das Potential hat, einen Beitrag zur

(27)

Reduktion der Campylobacteriose zu leisten. Gleichzeitig besteht dringend weiterer Forschungsbedarf, um die teils widersprüchlichen Ergebnisse früherer Studien zu untersuchen und damit die praktische Anwendung organischer Säuren weiter optimieren zu können.

2.2.3. Antimikrobielle Wirkung

Organische Säuren entfalten ihre antimikrobielle Wirkung über verschiedene Mechanismen. Ein Wirkmechanismus stellt die pH-Wert Absenkung des Mediums dar.

Abhängig von ihrem pKs-Wert reagieren organische Säuren im wässrigen Milieu unterschiedlich sauer und führen so zu einer unterschiedlich starken Wachstumshemmung der Bakterien. So konnte in einer Studie von DOYLE u. ROMAN (1981) gezeigt werden, dass pH-Werte unter 4,7 das Wachstum von Campylobacter spp. verhindern, während je nach Isolat auch bei höheren pH-Werten von 4,9 kein Wachstum der Erreger mehr beobachtet werden konnte. Erst ab pH 5,5 zeigten alle untersuchten Campylobacter spp.-Isolate Wachstum, wobei pH-Werte zwischen 6,5 und 7,5 für das Wachstum optimal waren (DOYLE u. ROMAN 1981).

Darüber hinaus sind organische Säuren in der Lage, durch die bakterielle Zellmembran zu diffundieren und im Zytoplasma eine Störung verschiedener Zellfunktionen zu bewirken (MASTROMATTEO et al. 2010). Der Grad und die Geschwindigkeit der Diffusion durch die Zellmembran unterscheiden sich dabei zwischen den verschiedenen organischen Säuren und sind abhängig von ihrer jeweiligen Fettlöslichkeit (GREENACRE et al. 2003). Die Fettlöslichkeit der organischen Säuren wird von der chemischen Struktur wie beispielsweise der Länge der Kohlenstoffkette bestimmt. Ein Maß für die Lipophilie ist der in Tabelle 1 aufgeführte Oktanol-Wasser- Verteilungskoeffizient. Daneben ist der Grad der Dissoziation ein weiterer Faktor, der die Fettlöslichkeit organischer Säure beeinflusst. Je niedriger der pH-Wert des extrazellulären Milieus und der pKs-Wert der organischen Säuren sind, desto mehr gehen organische Säuren in die undissoziierte bzw. protonierte und damit vermehrt fettlösliche Form über (GRILLI et al. 2013). Der intrazelluläre pH-Wert von Bakterien der Gattung Campylobacter spp. liegt physiologischerweise im neutralen Bereich (SMIGIC et al. 2009). Dies bedingt, dass organische Säuren nach der Diffusion durch

(28)

die bakterielle Zellmembran angesichts des vergleichsweise hohen intrazellulären pH- Wertes sauer reagieren und in Protonen und ihre Anionen dissoziieren (MASTROMATTEO et al. 2010). Sowohl die intrazelluläre pH-Wert-Absenkung als auch die Akkumulation der Anionen bewirken eine Störung verschiedener Zellfunktionen und können letztendlich zum Tod des Bakteriums führen (RUSSELL 1992; RICKE 2003).

Darüber hinaus wurde beispielsweise mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht, welchen Einfluss organische Säuren auf die bakterielle Zellmembran ausüben. Die Ergebnisse verschiedener Studien wiesen darauf hin, dass organische Säuren wie Benzoesäure, Sorbinsäure und MCFA eine Schädigung der bakteriellen Zellmembran bewirken (BERGSSON et al. 1998; STATHAM u. MCMEEKIN 2008;

CAMPOS et al. 2009; TER BEEK et al. 2015). Dies könnte in einer vermehrten Durchlässigkeit der Zellmembran für andere Substanzen resultieren (KIM u. RHEE 2013). Dagegen zeigten Untersuchungen über den Effekt kurzkettiger organischer Säuren wie Ameisensäure und Essigsäure keinen oder nur einen geringen Effekt auf die Zellmembran (CHAVEERACH et al. 2002; TER BEEK et al. 2015).

2.2.4. Mechanismen der Adaptation von Campylobacter spp.

Verschiedene Studien konnten für Campylobacter spp. und andere Bakterien zeigen, dass sie die Fähigkeit besitzen, sich an organische Säuren zu adaptieren und damit gegenüber der antimikrobiellen Wirksamkeit der Substanzen widerstandsfähiger zu werden.

In der Literatur beschriebene Mechanismen der Adaptation zeigen, dass sich die Bakterien an die durch organische Säuren verursachte intrazelluläre oder extrazelluläre pH-Wert-Senkung anpassen (RICKE 2003; BIRK et al. 2012). So konnte bei Campylobacter spp. nach Anwendung von Säuren eine erhöhte Expression von bestimmten Genen nachgewiesen werden, die Teil der bakteriellen Stressantwort sind.

REID et al. (2008) untersuchten die Genexpression von C. jejuni nach einer Säurebehandlung bei pH 4,5. Es zeigte sich, dass die Erreger infolge des Säurestresses mit einer verminderten Expression von Genen reagierten, die ribosomale Proteine kodieren. Das diente vermutlich der Energieeinsparung. Zudem

(29)

konnte eine vermehrte Genexpression beispielsweise von Hitzeschock-Proteinen nachgewiesen werden (REID et al. 2008). BIRK et al. (2012) untersuchte mittels einer 2 D-Gelelektrophorese die Proteinexpression bei C. jejuni nach einer Behandlung mit Essigsäure oder Salzsäure. In der Proteomanalyse zeigte sich, dass C. jejuni mit der Expression verschiedener Proteine reagierte, die der Kontrolle der Eisenkonzentration und der Abwehr von oxidativem Stress dienen. Infolge einer Säureadaptation zeigten Bakterien dabei eine erhöhte Widerstandsfähigkeit sowohl gegenüber niedrigen extrazellulären pH-Werten als auch gegenüber organischen Säuren (LEYER et al.

1995; SHAHEEN et al. 2007; THERON u. LUES 2011).

Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Bakterien und Hefen unter dem Einfluss organischer Säuren mit Veränderungen in der Zellmembran reagieren. So wurden in der Literatur beispielsweise Veränderungen in der Lipidzusammensetzung der bakteriellen Zellmembran, eine Porenbildung oder eine reduzierte Hydrophobie der Zelloberfläche beobachtet (DESBOIS u. SMITH 2010; LIU et al. 2013; ROYCE et al.

2013). ABBOTT et al. (2007) untersuchten die Genexpressionsmuster von Saccharomyces cerevisiae nach einer Behandlung mit Benzoesäure, Sorbinsäure, Essigsäure und Propionsäure. In Übereinstimmung mit den in Kap. 2.2.3. aufgeführten Wirkmechanismen zeigte sich, dass die Reaktion je nach Art der organischen Säure unterschiedlich ausfiel. So wurden als Reaktion auf die vergleichsweise lipophilen organischen Säuren Benzoesäure und Sorbinsäure hauptsächlich Gene induziert, die in die Zellwandsynthese involviert sind. Dagegen führte eine Behandlung mit Essigsäure und Propionsäure zu einer vermehrten Expression von Genen, die Transportmechanismen in der Zellmembran regulieren (ABBOTT et al. 2007).

(30)

(31)

3. Material und Methoden 19

3. Material und Methoden

3.1. Antimikrobielle Wirksamkeit organischer Säuren 3.1.1. Untersuchungen in vitro

3.1.1.1. Auswahl der organischen Säuren und Campylobacter spp.-Isolate Für die In-vitro-Untersuchungen zur antibakteriellen Wirksamkeit organischer Säuren gegenüber Campylobacter spp. wurden folgende zehn organische Säuren ausgewählt: Propionsäure, Ascorbinsäure, Weinsäure, Sorbinsäure, Benzoesäure, Fumarsäure, Caprylsäure, Ameisensäure (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) und Essigsäure (E. Merck KG, Darmstadt, Deutschland). Die Auswahl der organischen Säuren erfolgte nach verschiedenen Kriterien wie der bisherigen Anwendungshäufigkeit in der Hähnchenmast, der antimikrobiellen Wirksamkeit oder ihren jeweiligen chemischen Eigenschaften. So sollte eine möglichst große Bandbreite unterschiedlicher organischer Säuren in die Studie mit einbezogen werden.

Propionsäure, Ameisensäure und Essigsäure wurden ausgewählt, da sie bereits in der Vergangenheit vielfach in der Hähnchenmast eingesetzt wurden und im Vergleich beispielsweise zur Caprylsäure niedrige pKs-Werte, kurze Kohlenstoffketten und eine sehr gute Wasserlöslichkeit aufweisen. Fumarsäure und Weinsäure als Dicarbonsäuren sowie Benzoesäure als aromatische Carbonsäure unterscheiden sich in ihrer chemischen Struktur von anderen organischen Säuren (Tabelle 1, Kap. 2.2.1.).

Auch Ascorbinsäure als vinyloge organische Säure besitzt eine besondere chemische Struktur. Darüber hinaus zeigte sie in früheren Studien zwar eine sehr gute antimikrobielle Wirksamkeit (FLETCHER et al. 1983; JUVEN u. KANNER 1986), wurde aber in den darauffolgenden Jahren nicht weiter auf ihren reduzierenden Effekt gegenüber Campylobacter spp. in der Hähnchenmast untersucht. Caprylsäure, Capronsäure und Sorbinsäure zeigten bereits in früheren Studien eine sehr gute antimikrobielle Wirksamkeit und wurden aus diesem Grund in die Studie mit einbezogen (SOLIS DE LOS SANTOS et al. 2008; HERMANS et al. 2012a; GRILLI et al. 2013). Mit Ausnahme von Caprylsäure und Capronsäure sind die ausgewählten organischen Säuren gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1831/2003 als

(32)

Futtermittelzusatzstoff in der Europäischen Union zugelassen (EUROPEAN COMMISSION 2019).

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) der organischen Säuren wurde bei zwei unterschiedlichen pH-Werten (pH 6,0 und pH 7,3) ermittelt. Dazu wurden für jede organische Säure zwei Stammlösungen mit jeweils der doppelten Konzentration der ersten Verdünnungsstufe angefertigt (Tabelle 2). Die entsprechende Masse an organischer Säure wurde mit Hilfe einer Feinwaage (Präzisions-Waage Pioneer, PX523, Nänikon, Schweiz) eingewogen und in 20 mL Kationen-adjustierte Mueller- Hinton Bouillon (CAMHB, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) in Lösung gebracht. Das Einstellen der pH-Werte auf 6,0 bzw. 7,3 erfolgte durch Zugabe von 2 mol/L und 8 mol/L Natriumhydroxid. Anschließend wurde die Lösung mit dem entsprechenden Volumen an CAHMHB auf ein Endvolumen von 50 mL aufgefüllt. Es wurden 11 zweifache Verdünnungsreihen in CAMHB angefertigt, die zuvor auf einen pH-Wert von 7,3 bzw. 6,0 eingestellt worden war.

Tabelle 2: Übersicht über die getesteten Konzentrationsstufen und die eingewogene Masse der organischen Säuren bezogen auf die erste Verdünnungsstufe.

Säurename mEinwaagea

(g)

Verd.- stufen^b (mmol/L)

Säurename mEinwaage

(g)

Verd.- stufen (mmol/L) Caprylsäure 0,508 0,031-32 Propionsäure 3,833 0,5-512 Sorbinsäure 0,598 0,063-64 Essigsäure 2,928 0,5-512 Capronsäure 0,800 0,063-64 Ameisensäure 1,933 0,5-512 Ascorbinsäure 0,342 0,031-32 Weinsäure 4,298 0,5-512 Benzoesäure 0,592 0,063-64 Fumarsäure 3,624 0,5-512

am^Einwaage = eingewogene Masse der jeweiligen organischen Säure bezogen auf die erste Verdünnungsstufe (doppelte Konzentration der Endkonzentration).

Es wurden 20 C. jejuni- und 10 C. coli-Isolate in die Untersuchungen einbezogen (Tabelle 3). Das Testpanel bestand sowohl aus Typ- und Referenzstämmen als auch aus aktuellen Feldisolaten aus Hähnchenmastanlagen, um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit bisherigen Studien zu erhöhen und ein möglichst aktuelles Bild der

(33)

Empfindlichkeitssituation in der Campylobacter spp.-Population zu erhalten. Die Isolate wurden in Kryoröhrchen (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) bei -80°C aufbewahrt. Zur Anzucht wurden die Isolate zunächst auf Columbia Agar supplementiert mit Schafsblut (Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland) ausgestrichen und für 48 Stunden im Brutschrank (CO2 Brutschrank CB 160, Fa.

BINDER GmbH, Tuttlingen, Deutschland) bei 42 ± 1 °C mikroaerob (10 % CO2, 5 % O2, 85 % N2) bebrütet.

Tabelle 3:Übersicht der verwendeten Campylobacter spp.-Isolate

C. jejuni C. coli

Isolat Herkunft Isolat Herkunft

Campy_If37^a Hähnchen Campy_If49^a Hähnchen

Campy_If83^a Hähnchen Cc1^a Hähnchen

Campy_IfM3^a Hähnchen Cc7^a Hähnchen

Cj3^a Hähnchen Cc21^a Hähnchen

Cj5^a Hähnchen BfR-CA-09557 Hähnchen

Cj8^a Hähnchen DSM 4689 Schweinekot

Cj9^a Hähnchen

Cj10^a Hähnchen

Cj13^a Hähnchen

Cj15^a Hähnchen

Cj16^a Hähnchen

Cj18^a Hähnchen

Cj24^a Hähnchen

ATCC 81-176 Mensch

BfR-CA-14430 Hähnchenfleisch

DSM 4688 Rinderkot

a Die Feldisolate sind Teil der Stammsammlung des LMQS und wurden zwischen Juli 2005 und Januar 2018 aus Proben aus Masthähnchenställen isoliert.

(34)

3.1.1.2. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) der organischen Säuren gegenüber den 20 C. jejuni- und 10 C. coli-Isolaten wurde mittels der Bouillon-Mikrodilutionsmethode ermittelt. Der MHK-Wert ist definiert als die niedrigste Konzentration einer organischen Säure, die makroskopisch sichtbares bakterielles Wachstum verhindert. Die Testung erfolgte in Anlehnung an die im Dokument VET-01-A4 aufgeführten Empfehlungen der Richtlinien des Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI 2013). Zur Herstellung der Bakteriensuspensionen wurden die Campylobacter spp.-Isolate auf Columbia Agar (supplementiert mit Schafsblut) ausgestrichen und für 24 Stunden mikroaerob bei 41,5°C ± 1°C bebrütet. Es wurden 50 µL der organischen Säuren in der jeweils doppelten Konzentration der Endkonzentration in die Vertiefungen einer 96-Well Platte mit einem U-Boden (Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Deutschland) gegeben. Die gewachsenen Kolonien der Übernachtkulturen wurden in einer sterilen 0,8 % Natriumchlorid (NaCl) Lösung suspendiert und mit Hilfe eines Densimaten auf einen McFarland Standard von 0,5 eingestellt (ca. 1-2 x 10⁸ KbE/mL). Das Prinzip des McFarland Standards beruht darauf, dass anhand der Trübung einer Bakteriensuspension die Keimkonzentration eingeschätzt werden kann und auf diese Weise Inokula mit einer definierten Bakterienkonzentration hergestellt werden können.

Die Bakteriensuspension wurde anschließend 1:100 in CAMHB verdünnt. Die CAMHB war zuvor für die Testung bei zwei unterschiedlichen pH-Werten auf einen pH von 6,0 oder pH 7,3 eingestellt und mit 5 % fetalem Kälberserum supplementiert worden (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland). Von den verdünnten Bakteriensuspensionen wurden 50 µL in die jeweiligen Vertiefungen der Mikrotiterplatte überimpft. Für jedes Isolat wurde eine Positivkontrolle bestehend aus 50 µL CAMHB und 50 µL der Bakteriensuspension angefertigt. Der C. jejuni-Stamm DSM 4688 und der C. coli Stamm DSM 4689 dienten als Qualitätskontrollstämme und wurden in jedem Versuchsdurchgang mitgeführt. Die MHK-Werte der beiden Qualitätskontrollstämme wurden zuvor dreimalig sowohl mittels der Bouillon- Mikrodilutionsmethode als auch der Bouillon-Makrodilutionsmethode getestet. Nach einer Bebrütungszeit von 48 Stunden bei 42°C ± 1 °C in mikroaerober Atmosphäre wurden die MHK-Werte abgelesen.

(35)

3.1.1.3.

Zusammenstellung von Säurekombinationen

Zur Untersuchung der Wirksamkeit von Säurekombinationen wurden zehn unterschiedliche Kombinationen aus drei bis fünf organischen Säuren zusammengestellt. Die Auswahl der organischen Säuren und ihrer Anteile am Gemisch erfolgte anhand der MHK90-Werte, die für die organischen Säuren zuvor mittels der Bouillon-Mikrodilutionsmethode bestimmt worden waren. Die Anteile der organischen Säuren am Gemisch wurden so gewählt, dass die organische Säure mit der größten antibakteriellen Wirksamkeit den größten Anteil und die organische Säure mit der geringsten antibakteriellen Wirksamkeit den geringsten Anteil an der Kombination ausmacht. Die Konzentrationen der organischen Säuren wurden abhängig von der Anzahl der Komponenten gemäß den folgenden Verhältnissen gewählt: 3:2:1 (drei organische Säuren), 4:3:2:1 (vier organische Säuren) oder 5:4:3:2:1 (fünf organische Säuren) (Abb. 2).

(36)

Abbildung 2: Darstellung der Anteile der einzelnen organischen Säuren an der Gesamtkonzentration der Säurekombinationen. Die Verhältnisse der organischen Säuren zueinander wurden abhängig von der Anzahl der Komponenten folgendermaßen gewählt: 3:2:1 (drei Komponenten), 4:3:2:1 (vier Komponenten) oder 5:4:3:2:1 (fünf Komponenten). Zur Veranschaulichung der Verhältnisse in den einzelnen Säurekombinationen beziehen sich die dargestellten Konzentrationen auf die Endkonzentration der ersten Verdünnungsstufe von 64 mmol/L.

Die Säurekombinationen sind in Tabelle 4 dargestellt. Fumarsäure und Weinsäure wurden auf Grund der hohen MHK-Werte nicht in die Säurekombinationen einbezogen.

32

26 21

21

19

17 11

13

13 6

9 4

00 10 20 30 40 50 60 70

drei Komponenten vier Komponenten fünf Komponenten

Konzentration (mmol/L)

A B C D E

(37)

3. Material und Methoden25

Tabelle 4: Zusammensetzung der zehn untersuchten Säurekombinationen basierend auf der ersten Verdünnungsstufe mit derEndkonzentration von 64 mmol/L.

Zusammensetzung der Kombinationen (mmol/L)Kombi-nation Capryl-säure Sorbin-säure Capron-säure Ascorbin-säure Benzoe-säure Propion-säure Essig-säure Ameisen-säure

CA32,021,310,7CB25,619,212,86,4

CC25,619,212,86,4CD21,317,112,88,54,3

CE21,317,112,88,54,3CF32,021,310,7

CG25,619,212,86,4CH32,021,310,7

CI 25,619,212,86,4CJ21,317,112,88,54,3

(38)

Im Hinblick auf die derzeitige praktische Anwendbarkeit bestanden die Kombinationen entweder ausschließlich aus organischen Säuren, die in der Europäischen Union bereits als Futtermittelzusatzstoff zugelassen waren oder enthielten Caprylsäure und Capronsäure, die in früheren Studien eine sehr gute antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber Campylobacter spp. gezeigt hatten, aber bisher nicht in der Liste der zugelassenen Futtermittelzusatzstoffe aufgenommen wurden (SOLIS DE LOS SANTOS et al. 2008; SOLIS DE LOS SANTOS et al. 2009; EUROPEAN COMMISSION 2019). Darüber hinaus wurden die chemische Struktur und der Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient berücksichtigt, um Kombinationen aus möglichst unterschiedlichen organischen Säuren zu erhalten. Daher wurde Ascorbinsäure als einzige vinyloge Carbonsäure mit dem niedrigsten Oktanol-Wasser- Verteilungskoeffizienten in vier Kombinationen aufgenommen (Tabelle 1, Kap. 2.2.1.).

Anhand der Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung einzelner organischer Säuren wurde geschätzt, in welchen Konzentrationsbereichen die MHK-Werte der Säurekombinationen liegen. Für jede Säurekombination wurde eine Stammlösung in einer Konzentration von 128 mmol/L (Endkonzentration in der Mikrotiterplatte: 64 mmol/L) hergestellt. Anschließend wurden die Stammlösungen mit Hilfe von 2 mol/L und 8 mol/L Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7.3 eingestellt und 11 zweifache Verdünnungsstufen in CAMH Bouillon (pH 7.3) angefertigt.

3.1.1.4. Untersuchungen zu synergistischen Interaktionen

Um die Wechselwirkungen der organischen Säuren in Kombination näher zu untersuchen, wurde für jede Säurekombination der fractional inhibitory concentration (FIC) Index berechnet. Der FIC Index ist eine dimensionslose Zahl und erlaubt eine Aussage darüber, ob die kombinierten Substanzen synergistische, indifferente oder antagonistische Interaktionen bedingen (ORHAN et al. 2005). Für die Berechnung des FIC Index der Säurekombinationen werden zwei Werte jeder einzelnen organischen Säure benötigt: der MHK-Wert der organischen Säure aus der Einzeltestung und der MHK-Wert der organischen Säure in Kombination. Der MHK-Wert der jeweiligen organischen Säure in Kombination errechnete sich dabei aus dem Gesamt-MHK-Wert

(39)

der Säurekombination und dem Anteil, den die organische Säure am Gemisch ausmachte.

Zur Berechnung des FIC Index wurden für jede Säurekombination zunächst die FICs der einzelnen organischen Säuren gemäß folgender Formel berechnet (ORHAN et al.

2005):

FIC= MHK-Wert in Kombination MHK-Wert alleine

Der FIC Index (∑FIC) errechnet sich aus der Summe der einzelnen FICs gemäß folgender Formel (BERENBAUM 1978; ORHAN et al. 2005):

FIC

Dabei wurden ∑FIC ≤ 0.5 als synergistische Aktivitäten, ∑FIC > 0.5 bis < 2 als indifferente Aktivitäten und ∑FIC ≥ 2 als antagonistische Aktivitäten definiert (ORHAN et al. 2005).

3.1.2. Untersuchungen in vivo 3.1.2.1. Ethik

Die tierexperimentelle Studie wurde in Kooperation mit dem Institut für Tier- und Umwelthygiene der Freien Universität (FU) Berlin durchgeführt und fand in der Versuchsanlage des Zentrums für Infektionsmedizin der FU Berlin statt. Der Tierversuch wurde vom Landesamt für Gesundheit und Soziales (LAGeSo) unter dem Aktenzeichen G0098/18 genehmigt und gemäß den Tierschutzbestimmungen der Freien Universität Berlin durchgeführt.

3.1.2.2. Auswahl und Herstellung des Säurecocktails

Die Kombination CI bestehend aus Sorbinsäure, Benzoesäure, Propionsäure und Essigsäure wurde für den Einsatz im Tierversuch ausgewählt. Alle vier Komponenten sind als Futtermittelzusatzstoffe in der Europäischen Union zugelassen (EUROPEAN

(40)

COMMISSION 2019) und stehen damit unmittelbar für den Einsatz in der Praxis bereit.

Zudem wies die Kombination CI einen niedrigen Gesamt-MHK90-Wert von 4 mmol/L auf und zeigte synergistische Aktivitäten gegenüber der zweithöchsten Anzahl an Campylobacter spp.-Isolaten (fünf C. jejuni- und vier C. coli-Isolate).

Die Stammlösung der Säurekombination wurde in einer Gesamtkonzentration von 480 mmol/L angefertigt. Dazu wurden die vier organischen Säuren entsprechend folgenden Stoffmengenkonzentrationen steril eingewogen: 192 mmol/L Sorbinsäure, 144 mmol/L Benzoesäure, 96 mmol/L Propionsäure, 48 mmol/L Essigsäure. Die organischen Säuren wurden anschließend in autoklaviertem Leitungswasser gelöst und mit 30 mol/L Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt. Um einen Verdünnungseffekt zu vermeiden, wurde das Volumen an Natriumhydroxid vom Volumen des zuzugebenden autoklavierten Leitungswassers subtrahiert.

3.1.2.3. Aufbau des Tierversuchs

Der Tierversuch wurde gemäß dem von SZOTT et al. (2020) beschriebenen Studiendesign durchgeführt. Die Belüftung der klimatisierten Tierställe in der Versuchsanlage des Zentrums für Infektionsmedizin erfolgte mit gefilterter Luft und ein automatisiertes Hell-Dunkel-Lichtregime wurde geschaltet. Vor Beginn des Versuchs wurde die Versuchsanlage gereinigt und mit Wasserstoffperoxiddampf desinfiziert. Es wurden 180 Bruteier von Hühnern der Rasse Ross 308 von einer kommerziellen Brüterei bezogen und für 21 Tage bebrütet. Nach dem Schlupf wurden die Küken nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen á 90 Tiere aufgeteilt. Eine Gruppe fungierte als Kontrollgruppe, die mit dem C. jejuni-Stamm inokuliert wurde und Tränkewasser ohne Zusatz organischer Säuren erhielt. Die zweite Gruppe wurde als Versuchsgruppe definiert, die ebenfalls mit dem C. jejuni-Stamm inokuliert wurde, dabei aber Tränkewasser supplementiert mit der Säurekombination erhielt. Um das natürliche Infektionsgeschehen in Masthähnchenbeständen nachzustellen, erfolgte die Inokulation des C. jejuni-Stamms nach dem sogenannten Seeder-Bird-Modell. Dabei wurde nur ein Teil der Masthähnchen experimentell inokuliert (Seeder, n = 18). Die Kolonisierung der nativen Tiere (Sentinel, n = 36) erfolgte nachfolgend durch Kontakt der Sentinel zu den Seeder. Zur Identifizierung der einzelnen Masthähnchen wurden

(41)

alle Tiere mit einer fortlaufenden Nummer gekennzeichnet. Die Einstallung erfolgte in Bodenhaltung in einer unter konventionellen Bedingungen üblichen Besatzdichte von 39 kg/m². Die Masthähnchen erhielten kommerzielles Masthähnchenfutter (Tabelle 5) und Tränkewasser ad libitum. Das Tränkewasser wurde über Nippeltränken verabreicht.

Tabelle 5: Zusammensetzung des Broilerfutters.

Komponenten (pro kg) Starterfutter (0 – 8 Tage)

Mastfutter (9 – 26 Tage)

Endmastfutter (27 – 33 Tage)

Rohprotein (%) 21,5 21,0 20,0

Rohfett (%) 4,9 6,4 5,5

Rohfaser (%) 2,9 3,4 3,3

Rohasche (%) 5,3 5,1 4,9

MJ ME¹ 12,4 12,4 12,4

Calcium (%) 0,9 0,8 0,8

Phosphor (%) 0,6 0,55 0,5

Natrium (%) 0,14 0,14 0,14

Methionin (%) 0,55 0,50 0,50

Lysin (%) 1,25 1,15 1,05

1Megajoules umsetzbare Energie

Die Inokulation der Seeder mit dem C. jejuni-Kolonisierungsstamm BfR-CA-14430 erfolgte zehn Tage nach der Einstallung. Der Stamm wurde mit einer Dosis von circa 10⁴ KbE direkt in den Kropf gegeben.

Während des Versuchs erfolgte an mehreren Tagen eine Gewichtskontrolle von zehn zufällig ausgewählten Masthähnchen. Die Sektion der Tiere erfolgte 23 Tage nach der Inokulation (days post inoculation, dpi) (Abb. 3). Die Tiere wurden mit einer intramuskulären Injektion eines Gemisches aus Ketamin 10 % (0,375 mL), Xylazin 20 mg/mL (0,075 mL) und Dormicum (5 mg/mL) sediert und mit Hilfe einer Zange zur zervikalen Dislokation (Corstechnology, Neerstedt, Niederlande) getötet.

(42)

Abbildung 3: Versuchsaufbau des In-vivo-Versuchs. Zur Darstellung der zeitlichen Abfolge sind die Tage nach der Einstallung (days post hatch, dph) und Tage nach Inokulation der Seeder mit dem C. jejuni-Stamm (days post inoculation, dpi) aufgeführt.

3.1.2.4. Applikation der Säurekombination

Die Säurekombination wurde 1:30 in Leitungswasser verdünnt und kontinuierlich über den gesamten Tierversuch hinweg über die Nippeltränken verabreicht. Die Endkonzentration der Säurekombination lag bei 16 mmol/L mit folgenden Konzentrationen der einzelnen Komponenten: 6,4 mmol/L Sorbinsäure, 4,8 mmol/L Benzoesäure, 3,2 mmol/L Propionsäure und 1,6 mmol/L Essigsäure. Das supplementierte Tränkewasser wurde auf einen pH-Wert von 6,0 angesäuert. Für diesen pH-Wert war gemäß den Ergebnissen früherer Untersuchungen keine Beeinträchtigung der Leistungsparameter zu erwarten.

3.1.2.5. Probennahme und Untersuchung

Die Bestimmung der Campylobacter-Konzentration erfolgte zu festgelegten Zeitpunkten (Abb. 3). Vier Tage nach der Einstallung wurden Kloakentupfer (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) von allen Küken genommen und untersucht, um die Campylobacter-Freiheit zu bestätigen. Zwei Tage nach der Inokulation wurden

(43)

Kloakentupfer der 18 Seeder entnommen, um zu kontrollieren, dass die Tiere kolonisiert wurden und Campylobacter über den Kot ausscheiden. Anschließend wurden von Tag 3 bis Tag 18 nach der Inokulation Kloakentupfer der Sentinel entnommen und die Campylobacter-Konzentration bestimmt. In der Sektion der Tiere (23 Tage nach der Inokulation) wurden unter sterilen Bedingungen Proben aus dem Zäkum und dem Kolon der Sentinels entnommen, um ebenfalls die Campylobacter- KonzentrationOzuObestimmen.

Die Bestimmung der Campylobacter-Konzentration erfolgte semiquantitativ in Anlehnung an die DIN EN ISO 10272-3:2011. Abweichungen ergaben sich hinsichtlich der Wahl des Mediums für die Voranreicherung und der Inkubationstemperatur. Die Kloakentupfer wurden in 9 mL Preston-Bouillon überführt und 1 Minute lang gevortext.

Nach dem Anfertigen einer zehnfachen Verdünnungsreihe in Preston-Bouillon wurden die Röhrchen mikroaerob bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden mit Hilfe einer Impföse jeweils 10 µL der Kultur auf mCCD-Agar (Modifizierter Aktivkohle Cefoperazon Desoxycholat Agar) ausgestrichen. Die Platten wurden für 48 Stunden mikroaerob bei 37°C inkubiert. Zur Auswertung der semiquantitativen Bestimmung wurde nach der Inkubation abgelesen, bis zu welcher Verdünnungsstufe Campylobacter Kolonien vorhanden waren. Um zu bestätigen, dass es sich um Campylobacter Kolonien handelte, wurden stichprobenartig charakteristische Kolonien entnommen und die Spezies mittels MALDI-TOF überprüft.

3.1.2.6. Statistik

Die statistische Auswertung wurde von der FU Berlin durchgeführt und erfolgte mittels der SPSS Software (Version 25.0) für Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL, United States). Die Mittelwerte der jeweiligen Campylobacter-Konzentrationen wurden logarithmiert und sowohl mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test als auch mit dem Shapiro-Wilks-Test auf Normalverteilung geprüft. Die Unterschiede zwischen den gebildeten Mittelwerten der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe wurden mittels des nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Tests auf statistische Signifikanz überprüft (p < 0,05).

(44)

3.2. Nachweis möglicher Adaptationen nach Säurebehandlungen von Campylobacter spp.

3.2.1. Untersuchungen in vitro

3.2.1.1. Auswahl der organischen Säuren und Campylobacter spp.-Isolate Die beiden organischen Säuren Propionsäure und Sorbinsäure wurden für die Adaptationsversuche ausgewählt. Beide organische Säuren sind in der Europäischen Union als Futtermittelzusatzstoff zugelassen und können damit unmittelbar in der Praxis eingesetzt werden (EUROPEAN COMMISSION 2019). Zudem wurde die antibakterielle Wirksamkeit beider organischen Säuren sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Versuchen nachgewiesen (CHAVEERACH et al. 2002; VAN DEUN et al. 2008;

SKÅNSENG et al. 2010; GRILLI et al. 2013; JANSEN et al. 2014). Darüber hinaus spielen beide organische Säure als Konservierungsmittel eine wichtige Rolle in der Lebensmittelproduktion (THERON u. LUES 2011). In der vorliegenden Studie zeigte Sorbinsäure unter allen als Futtermittelzusatzstoff zugelassenen organischen Säuren die niedrigsten und Propionsäure nach Benzoesäure die drittniedrigsten MHK90-Werte.

Die beiden organischen Säuren unterscheiden sich dabei in ihren chemischen Eigenschaften. Sorbinsäure weist mit einem Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten von 1,33 eine vergleichsweise niedrige Wasserlöslichkeit auf, während Propionsäure mit einem Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten von 0,33 eine relativ gute Wasserlöslichkeit aufzeigt.

Aus dem Panel an Campylobacter spp.-Isolaten (s. Kap. 3.1.1.1.) wurden die beiden C. jejuni-Isolate Cj5 und Cj18 sowie das C. coli Isolat Cc7 für die Adaptationsversuche ausgewählt. Ein Kriterium war, dass aktuelle Feldisolate aus Hähnchenmastbetrieben mit Vertretern aus beiden Campylobacter spp.-Spezies in die Untersuchungen einbezogen werden sollten. Zudem wurden die ermittelten MHK-Werte für Propionsäure und Sorbinsäure bei der Auswahl berücksichtigt. Die beiden C. jejuni- Isolate zeigten mit 2 mmol/L (Sorbinsäure) und 32 mmol/L (Propionsäure) bei pH 7,3 vergleichsweise niedrige MHK-Werte, wohingegen das C. coli Isolat Cc7 bei pH 7,3 vergleichsweise hohe MHK-Werte von 4 mmol/L für Sorbinsäure und 64 mmol/L für Propionsäure aufwies.