Molekulare und biochemische Charakterisierung des Trehalose/Maltose-Transportsystems des hyperthermophilen Archaeons Thermococcus litoralis

Molekulare und biochemische Charakterisierung des Trehalose/Maltose-Transportsystems

des hyperthermophilen Archaeons Thermococcus litoralis

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der Fakultät für Biologie

der Universität Konstanz

vorgelegt von Gerhard Greller

Konstanz

Mai 2001

Dissertation der Universität Konstanz Tag der mündlichen Prüfung: 20.07.2001 Referent: Prof. Dr. W. Boos

Referent: Prof. Dr. M. Ehrmann

I Zusammenfassung 1

I Zusammenfassung

Das hyperthermophile Archaeon Thermococcus litoralis transportiert die beiden Disaccharide Trehalose und Maltose durch den selben Transportkomplex aus dem Medium in das Zellinnere. Dieser erste in der Gruppe der Archaea entdeckte ABC- Transporter konnte in dieser Arbeit näher charakterisiert werden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse wurden mit den Informationen bereits bekannter bakterieller Bindeprotein abhängiger ABC-Transportern verglichen.

Eine der Aufgabenstellungen dieser Arbeit war es zusätzlich zu den bereits bekannten Informationen Gemeinsamkeiten und Unterschiede des archaeellen Trehalose/Maltose- Bindeproteins TMBP mit dem seines bakteriellen Homologs, dem Maltose/Maltodextrin- Bindeprotein MBP aufzudecken.

Aus diesem Grund wurde zum einen, daß in der Membran verankerte Bindeprotein gereinigt. Durch eine für Glykoproteine spezifischen Färbemethode stellte sich heraus, daß das TMBP als Glykoprotein vorliegt. Um eine dreidimensionale Struktur des TMBP zu ermitteln wurde für die Röntgenstrukturanalyse eine, nach Klonierung und heterologer Expression in E. coli, Proteinreinigungsmethode etabliert. Die Struktur von TMBP weist ein, den bereits beschriebenen Bindeproteinen, homologes Faltungsmuster auf.

In dem zu Beginn dieser Arbeit bekanntem malEFG-Sequenzabschnitt konnte keine zur Energetisierung des Transports benötigten ABC-Domäne identifiziert werden. Das zentrale Projekt war deshalb die „Suche“ nach der ABC-Domäne. Das entsprechende Gen konnte kloniert und eine erste Charakterisierung ausgehend von der DNA-Sequenz erfolgen. Aus den 1119 bp die für malK ermittelt wurden ergibt sich ein 372 Aminosäuren großes Protein. Der Vergleich des T. litoralis MalK-Proteins mit ABC-Domänen aus anderen Organismen zeigte, daß alle die für diese Proteine typischen Sequenzen vorhanden sind. Nach erfolgreicher heterologer Expression in E. coli wurde das Protein gereinigt und eine eingehende biochemische Charakterisierung durchgeführt.

MalK weist ein Temperaturoptimum bei 80°C und auf. Im Gegensatz dazu konnte bei Raumtemperatur nahezu keine ATPase-Aktivität festgestellt werden. ATP stellt mit einer ermittelten km von 155 µM und einer Vm a x von 0,551 µmol Pi/min/mg Protein das bevorzugte Substrat dar.

Um ein besseres Verständnis des Wirkmechanismus von ABC-Domänen und speziell von MalK zu erhalten, sollte das MalK-Protein einer Röntgenstrukturanalyse zugänglich gemacht werden. Mit den erhaltenen Kristallen konnte die Struktur gelöst werden.

I Zusammenfassung 2

Die Struktur besteht aus zwei Domänen. Die N-terminalen 223 Aminosäurereste bilden dabei die ATPase-Domäne vom α/β-Typ, wie sie in ABC-Domänen bereits gefunden wurde. Im Gegensatz dazu bilden die C-terminalen Aminosäurereste (224-372) ein aus β- Faltblättern aufgebautes „Faß“. Den C-terminalen Domänen des T. litoralis MalK-Dimers, könnte wie seinem Homolog aus E. coli, eine regulatorische Funktion zugeordnet werden.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte als nächster Schritt der gesamte Transportkomplex von T.

litoralis, der aus den beiden Membranproteinen MalF und MalG sowie der Transport- ATPase MalK aufgebaut ist, heterolog in E. coli überexprimiert, gereinigt und charakterisiert werden. Letztlich konnte ein Reinigungsprotokoll etabliert werden, durch das der Transportkomplex nahezu sauber erhalten wurde.

Die biochemischen Charakterisierung zeigte ein Temperaturoptimum bei 70°C. Bei Raumtemperatur konnte, wie bereits bei der Charakterisierung der ABC-Untereinheit MalK, nahezu keine Aktivität gemessen werden. Bei der Bestimmung der kinetischen Daten von MalFGK wurde für die ATPase-Aktivität eine Km von 0,162 mM und eine Vmax

0,220 µmol/min/mg Protein ermittelt.

Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Überexpressions- und Reinigungsmethode des T. litoralis Transportkomplexes bieten einen guten Ausgangspunkt um damit die dreidimensionale Struktur dieser wichtigen Klasse von Transportsystemen zu erhalten.

I Inhaltsverzeichnis I

I Zusammenfassung

II Einleitung

1 Transportvorgänge über biologische Membranen

1.2 Aktive Transportsysteme 4

1.2.1 Primäre Transportsysteme 4

1.2.2 Sekundärer Transporter 4

1.2.3 Phosphotransferase-System (PTS) 5

2 ABC-Transporter

2.1 Die Bedeutung der ABC-Transporter 6

2.2 Aufbau der ABC-Transporter 7

2.2.1 Die hydrophoben Domänen von ABC-Transportern 8 2.2.2 Die hydrophilen Domänen von ABC-Transportern 9

3 Das Maltose/Maltodextrin-Transportsystem von E. coli

3.1 Das Maltoseregulon von Escherichia coli 12

3.2 Das Maltosetransportsystem 12

3.2.1 Das Aussenmembranprotein LamB und das 14 Maltosebindeprotein MBP

3.2.2 Die integralen Membranproteine MalF und MalG 14 3.2.3 Die ATP-bindende Untereinheit MalK 16

3.2.4 Modell des Maltosetransports 17

3.3 Die Enzyme des Maltosestoffwechsels 18

3.3.1 Die α-Amylase, MalS18

3.3.2 Die Amylomaltase, MalQ 18

3.3.3 Die Maltodextrinphosphorylase, MalP 19 3.3.4 Die Maltodextrin-Glucosidase, MalZ 19

3.4 Regulation des Maltoseregulons 20

4 Archaea

4.1 Die dritte Domäne des Lebens 21

4.2 Lebensräume der Archaea 23

4.3 Hyperthermophile Organismen 23

5 Das hyperthermophile Archaeon Thermococcus litoralis

5.1 Der Zuckerstoffwechsel von T. litoralis 25

5.2 Der Trehalose/Maltose Transporter von T. litoralis 25 5.2.1 Die Sequenzen von malE, malF und malG 26 5.2.2 Das Trehalose/Maltose Bindeprotein TMBP 27 5.2.3 Die Membrankomponenten MalF und MalG 29

6 Aufgabenstellung

I Inhaltsverzeichnis II

III Material und Methoden

1 Abkürzungen, Symbole und Indizes

1.1 Abkürzungen 33

1.2 Symbole 34

1.3 Indizes 34

2 Materialien und Chemikalien

3 Bakterienstämme, Plasmide und Antikörper

3.1 Bakterienstämme 36

3.2 Plasmide 36

3.3 Antikörper 38

4 Medien und Wachstumsbedingungen

4.1 Flüssige Medien 39

4.2 Fermenter-Medium 39

4.3 Feste Medien 40

4.4 Medienzusätze und Kohlenstoffquellen 40

5 Mikrobiologische Methoden

5.1 Sterilisation 40

5.2 Aufbewahrung von Stämmen 40

5.3 Wachstumsbedingungen für Feste Medien und Flüssigkulturen 41

5.4 Fermenter-Kulturen 41

5.4.1 Fermenter und Prozessleitsystem 41

5.4.2 Abblauf der Fermentation 41

5.5 Überexpressionen der rekombinanten Proteine zur späteren 42 Reinigung

5.6 Bestimmung der Zelldichte von Bakterienkulturen 43

6 Molekularbiologische und genetische Methoden

6.2.1 Liste der verwendeten Primer 44

6.2.2 Sequenzierung doppelsträngiger Plasmid-DNA 45

6.3 Plasmidkonstruktionen 45

6.3.1 Die Ausgangsplasmid pQE30, pQE31, pQE60 und deren 45 Derivate pGDR11 und pCS19

6.3.2 Konstruktion von pGG1 46

6.3.3 Konstruktion von pGG100 46

6.3.4 Konstruktion von pGG200 47

6.3.5 Konstruktion von pGG500 47

6.3.6 Das Ausgangsplasmid pGG300 47

6.3.7 Konstruktion von pGG301 48

I Inhaltsverzeichnis III

6.3.8 Konstruktion von pGG302 48

6.3.9 Konstruktion der Plasmide pGG1000, 1001 und 1002 48

7 Proteinchemische Methoden

7.1 Proteinbestimmung 49

7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 49

7.3 Nachweis von Glykoproteinen 49

7.4 Proteinreinigung 50

7.4.1 Chromatographiesystem und Säulen 50

7.4.2 Reinigung des Trehalose/Maltose-Bindeproteins 51 7.4.2..1 Reinigung des TMBP-Konstruktes mit der 51

E. coli MBP-Signal Sequenz

7.4.2..2 Reinigung von N-His-MalE 53

7.4.2.3 Reinigung des Wildtyp TMBP aus T. litoralis 53 Membranen

7.4.3 Reinigung der Transport-ATPase MalK 54

7.4.3.1 Reinigung des C-His-MalK 54

7.4.3.2 Reinigung des N-His-MalK 55

7.4.4 Reinigung des Trehalose/Maltose-Transportsystems 55 MalFGK

7.5 Isolierung des C-His-MalK Fragments zur Proteinsequenzierung 56 7.6 Isolierung und Identifizierung des MalG und des Wildtyp 56

TMBP durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

7.7 Vorbereitung von N-His-TMBP zur Fluoreszenzmessung 57

8 Immunchemische Methoden

8.1 Herstellung von MalK spezifischen Antikörpern 57

8.2 Antikörperreinigung 58

8.3 Western-Blot 58

9 Biochemische Methoden

9.1 ATPase-Aktivitäts-Tests 58

9.2 Bindetests 59

10 Computeranalysen

IV Ergebnisse

1 Das Trehalose/Maltose-Bindeprotein (TMBP)

Signalsequenz

1.2 Expression und Reinigung eines His-tag TMBP (N-His-TMBP) 63 1.3 Reinigung des Wildtyp TMBP aus T. litoralis Membranen 64

2 Die ABC-Domäne MalK des Trehalose/Maltose-

Transportsystems von T. litoralis

2.1 Klonierung des T. litoralis malK und Sequenzvergleiche 67

2.2 Expression und Reinigung von C-His-MalK 71

I Inhaltsverzeichnis IV

2.3. Biochemische Charakterisierung von MalK 73

2.3.1 Temperaturabhängigkeit der ATPase-Aktivität von MalK 73 2.3.2 Einfluß des pH-Werts auf die ATPase-Aktivität von MalK 74 2.3.3 Untersuchung der Substratspezifität von MalK 74 2.3.4 Untersuchung des Einflusses potentieller Inhibitoren 76 2.3.4.1 Einfluß von ADP und des Substratanalogons 76

ATPγS auf die ATPase-Aktivität von MalK

2.3.4.2 Einfluß von spezifischen Inhibitoren auf die 77 ATPase Aktivität von MalK

2.3.5 Einfluß der Salzkonzentration auf die Aktivität von MalK 78

2.3.6 Temperaturstabilität von MalK 79

2.4 Untersuchung des Oligomerisierungszustandes von C-His-MalK 80

2.5 Herstellung von MalK-Antikörpern 81

2.6 Induktion von TMBP und MalK in T. litoralis durch Maltose 82 und Trehalose

2.7 Expression von MalK mit N-terminalem His-Tag 83 2.7.1 Vergleich der Expression von C-His-MalK mit der 83

von N-His-MalK

2.7.2 Koexpression von tRNAs für seltenen Codons zur 85 Erhöhung der Ausbeute an N His-MalK

2.7.3 Reinigung von N-His-MalK 88

3 Der Transportkomplex MalFGK

3.1 Klonierung der Membrankomponenten des Trehalose/Maltose 89 Transporters

3.2 Expression und erste Reinigungsversuche des 89 Transportkomplexes MalFGK

3.3 Anwendung eines Hitzeschrittes zur Abtrennung der 90 hitzelabilen E. coli-Proteine

3.4 Expression und Reinigung des Transportkomplexes 91 3.5 Nachweis von MalF, MalG und MalK im gereinigtem

Transportkomplex 92

3.6 Versuche zur Erhöhung der Überexpressionsrate des 92 Transportkomplexes (MalFGK)

3.6.1 Koexpression von tRNAs für seltenen Codons zur 93 Erhöhung der Ausbeute an MalFGK

3.6.2 Verwendung verschiedener Stämme und 94 unterschiedlicher Überexpressionsbedingungen 3.7 Biochemische Charakterisierung des Transportkomplexes 95

3.7.1 Temperaturabhängigkeit der ATPase-Aktivität des 95 Transportkomplexes

3.7.2 Einfluß des pH-Werts auf die ATPase-Aktivität 96 von MalFGK

3.7.3 Bestimmung der kinetischen Parameter von MalFGK 97 3.7.4 Einfluß von Vanadat auf die Aktivität von MalFGK 98

I Inhaltsverzeichnis V

3.7.5 Stimulierung der ATPase-Aktivität durch TMBP 98

V Diskussion

1 Das Trehalose/Maltose Bindeprotein TMBP

1.1 Biochemische Untersuchungen des TMBP 100

1.1.1 Verankerung des Wildtyp TMBP in der Membran 100

1.1.2 TMBP ist ein Glykoprotein 101

1.1.3 Temperaturabhängigkeit der Substratassoziation und

–dissoziation 102

1.2 Dreidimensionale Struktur das Trehalose/Maltose-Bindeproteins 102 aus T. litoralis

1.3 Thermostabilität von TMBP 106

2 Das Trehalose/Maltose-Transportsystem von Pyrococcus furiosus

Hinweis auf einen lateralen Gentransfer zwischen Archaea

3 Die ABC-Domäne MalK des Transportsystems

3.1 Molekulare Analyse von MalK 110

3.2 Biochemische Charakterisierung von MalK 110

3.3 Die dreidimensionale Struktur von MalK 112

3.3.1 Beschreibung der Raumstruktur von MalK 113

3.3.2 Die Dimerstruktur von MalK 116

3.3.3 Beteiligung von MalK am Transportkanal 117 3.3.4 Die regulatorische Domäne von MalK 117

4 Charakterisierung des Maltose/Trehalose-Transportkomplex

5 Regulation der am Trehalose/Maltose Stoffwechsel

beteiligten Gene

5.1 Die Transkriptionsmaschinerie der Archaea 123 5.2 Induktion der am Trehalose/Maltose Stoffwechsel 124

beteiligten Gene

5.3 Hinweise auf die Existenz eines Genregulators 125

VI Literatur

VII Anhang

1 Abbildungen

2 Tabellen

II Einleitung 3

II Einleitung

1 Transportvorgänge über biologische Membranen

Lebende Zellen sind von einer Membran umgeben, die ihr Inneres, das Cytoplasma, von dem sie umgebenden Milieu abgrenzt. Dadurch wird ein unkontrollierter Austausch der Zellinhaltsstoffe mit der Außenwelt verhindert und die Konstanz der Zelle gesichert.

Allerdings erfordern die vielfältigen Stoffwechselfunktionen lebender Zellen die permanente Aufnahme von Nährstoffen zur Energieversorgung und zum Aufbau der Zellsubstanz. Dies gilt sowohl für einzellige Organismen wie Bakterien, als auch für Zellen im Verband eines Gewebes von Tieren oder Pflanzen. Darüber hinaus müssen nicht nur Stoffwechselendprodukte, darunter auch toxische Substanzen, sondern z.B.

auch Signalmoleküle für die Zell-Zell-Kommunikation ausgeschieden werden. Zu diesem Zweck sind spezielle Proteine in die Zellmembranen eingelagert, die meist als Transporter oder Transportsysteme bezeichnet werden und für eine geregelte Aufnahme oder Abgabe solcher Substanzen sorgen. Die Bedeutung dieser Proteine spiegelt sich unter anderem darin wieder, daß bei dem Darmbakterium Escherichia coli (E. coli), dessen genetische Information vollständige entschlüsselt wurde, Transportproteine mit einem Anteil von 10 % die umfangreichste funktionelle Gruppe bilden (Paulsen et al., 1998).

1.1 Mechanismen der Protein vermittelten Transportvorgänge

Durch Proteine vermittelte Transportvorgänge können nach zwei prinzipiellen Mechanismen verlaufen: Die kanal- oder porenvermittelte Diffusion ermöglicht den thermodynamisch begünstigten Transport von Substanzen in Richtung eines vorhandenen Konzentrationsgefälles (von hoher zu niedriger Konzentration).

Transportproteine dieser Art sind z.B. die Porine, die in der äußeren Membran Gram- negativer Bakterien vorhanden sind. Diese können als wassergefüllte Poren betrachtet werden, die entweder unspezifisch den Durchtritt von Stoffen ermöglichen oder über spezifische Substratbindestellen verfügen. Auch in der Cytoplasmamembran befinden sich Proteine, welche Diffusionsvorgänge erlauben. Wird dagegen mit der Aufnahme eine Akkumulation der Substanz im Cytoplasma erreicht, also die Substanz gegen das Konzentrationsgefälle in die Zelle „hineingepumpt“, so muß zur Vermeidung des (thermodynamisch begünstigten) Konzentrationsausgleiches, also des Rückflusses der Substanz, Energie aufgewendet werden. Hierbei spricht man von „aktivem Transport“.

Bildlich und vereinfacht gesprochen bedeutet dies, daß sich die Durchtrittsspore hinter jedem transportierten Molekül wieder schließt, während Diffusionsproteine in der Regel ständig nach beiden Seiten geöffnet bleiben. Aktive Transporter sind somit zelluläre Systeme zur Energiekopplung. Grundsätzlich können nach den genannten Mechanismen

II Einleitung 4

Substanzen nicht nur in die Zelle aufgenommen, sondern auch aus der Zelle ausgeschleust werden.

1.2 Aktive Transportsysteme

Aktive Transportsysteme lassen sich nach der Energiequelle, die für ihre Aktivität genutzt wird, im wesentlichen in folgende Klassen einteilen (siehe Abb. 1).

1.2.1 Primäre Transportsysteme

„Primäre Transportsysteme“ verwenden Adenosintriphosphat (ATP), welches durch chemische oder photochemische Reaktionen entsteht (z.B. bei der Atmung oder Photosynthese), als Energiequelle und bestehen in der Regel aus mehreren Proteinkomponenten. Man unterscheidet Ionen-ATPasen und ABC-Transporter. Beispiele für Ionen-ATPasen sind Entgiftungssysteme für Schwermetalle bei Bakterien, sowie die Na⁺-, K⁺-ATPase tierischer Zellen, die für die Aufrechterhaltung konstanter Konzentrationen beider Ionen sorgt. Vertreter der ABC-Transporter werden unter Punkt 2 dieses Kapitels ausführlich vorgestellt.

1.2.2 Sekundärer Transporter

Die Aktivität „sekundärer Transporter” ist an vorhandene Stoffgradienten (meist Ionen wie H⁺, Na⁺ aber auch organische Säureanionen) über der Membran gekoppelt. Solche Gradienten stellen ebenfalls eine Energieform dar, da sie aufgrund der Aktivität primärer Transporter entstanden sind. Im Unterschied zu diesen bestehen sekundäre Transporter nur aus einer Proteinkomponente. Prinzipiell können drei sekundäre Transportmechanis- men unterschieden werden.

Bei einem Uniport-Mechanismus, den man auch als erleichterte Diffusion bezeichnet, wird der Transport lediglich durch die Konzentrationsdifferenz der zu transportierenden Substanz unidirektionell, d.h. in eine Richtung getrieben. Beim Symport erfolgt der Transport gemeinsam mit der Verbindung, deren Gradient über der Membran die Energie liefert. Im Gegensatz dazu werden beim Antiport, wegen der unterschiedlichen Orientierung der Konzentrationsgefälle, beide Substanzen gegeneinander bewegt.

II Einleitung 5

1.2.3 Phosphotransferase-System (PTS)

Während Vertreter primärer und sekundärer Transporter in Zellmembranen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen anzutreffen sind, ist das Phospho- transferase-System (PTS) bislang nur bei Bakterien gefunden worden. Es dient der Aufnahme einfacher Zucker wie Glucose sowie Zuckeralkohole und bezieht die notwendige Energie ebenfalls aus einer chemischen Verbindung der Zelle mit hohem Phosphorylierungspotential, dem Phosphoenolpyruvat. Im Gegensatz zu den ATP-ge- koppelten Systemen wird der Phosphatrest hier über mehrere Proteinkomponenten schließlich auf das Substrat übertragen, weshalb man auch von „Gruppentranslokation“

spricht.

Abbildung 1: Wichtige Klassen von Transportsystemen, wie sie bei Bakterien verwirklicht sind.

S, Substrat; X, Ion (z.B. H⁺, Na⁺), dessen Gradient Energie für den Transport eines anderen Substrates liefert; ATP, Adenosintriphosphat; PEP, Phosphoenolpyruvat. (Entnommen aus Schneider, 2000)

II Einleitung 6

2 ABC-Transporter

2.1 Die Bedeutung der ABC-Transporter

Eine der in den letzten Jahren zunehmend untersuchte Transportfamilie ist die Klasse der sogenannten ABC (ATP binding cassette)-Transporter (Higgins et al., 1992). Diese zeichnet sich dadurch aus, daß sie ATP als Energiequelle für ihre Transportprozesse verwenden.

Bei der Proteinfamilie der ABC-Transporter handelt es sich um eine weit verbreitete paraloge Proteingruppe. Innerhalb zahlreicher Lebensformen, vom Bakterium über Pilze bis zum Menschen, übernimmt diese Familie den Transport einer Vielzahl unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen (Higgins, 1992). So kodieren etwa 5 % der Gene von E. coli für ABC-Transporter, 28 ABC-Proteine wurden im Hefegenom gefunden und beim Menschen werden 70 bis 100 Mitglieder dieser Proteinfamilie vermutet (Linton et al., 1998; Holland et al., 1999).

Die stetig wachsende Klasse der ABC-Transporter hat besonders aufgrund der Tatsache, daß einige Vertreter beim Menschen von medizinischer Bedeutung sind, wissenschaftliche Aufmerksamkeit erlangt.So erzeugt z.B. die Überexpression von MDR1 (multidrug resistance protein 1) in Tumorzellen eine Resistenz gegen Chemopharmaka, indem es die intrazelluläre Konzentration der Medikamente durch Export herabsetzt (Endicott et al., 1989; Gottesman et al., 1995). Defekte im Chloridkanal (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR), führen zur Mukoviszidose, der häufigsten tödlichen Erbkrankheit in Europa und den USA. Hierzu kommt es aufgrund eines gestörten Wasserhaushalts der Epithelzellschicht in den Lungen der Patienten zu einer erhöhten Mukussekretion (Drumm et al., 1993). Für Störungen des zellulären Lipidstoffwechsels, wie die verschiedenen HDL-Defizienz-Syndrome, konnten als deren Ursache Mutationen im ABC1-Gen identifiziert werden (Schmitz et al., 2000). Der in der Membran des endoplasmatischen Retikulumslokalisierte Antigenpeptid-Transporter TAP ist schließlich entscheidend an der Immunabwehr von Tumorzellen und intrazellulären Pathogenen, wie z.B. Viren, beteiligt (Abele et al., 1999).

In Bakterien sind ABC-Transporter nicht nur am Substrattransport, sondern auch an der Signaltransduktion, der Sporulation und der Sekretion von z.B. Pathogenitätsfaktoren beteiligt. Sie bewirken also eine Anpassung an veränderte Umweltbedingungen. So existieren bakterielle Transporter für die verschiedensten Moleküle wie z. B. Maltose (Zucker), Histidin (Aminosäure), Hämolysin (Protein), ColicinV (Peptid) und Eisenchelate (Kofaktor) (Boos und Lucht, 1996).

II Einleitung 7

2.2 Aufbau der ABC-Transporter

ABC-Transporter zeichnen sich alle durch einen typischen Aufbau, bestehend aus vier Domänen, aus (Abb. 2 A). Zwei dieser Domänen sind integrale Membranproteine, die den Transportkanal bilden. Die beiden anderen Domänen sind hydrophil und liegen an der cytoplasmatischen Seite der Membran. Sie besitzen je eine Nukleotidbindestelle welche zur Energetisierung des Transportprozesses benötigt wird (Higgins et al., 1992).

Trotz ihres ähnlichen Aufbaus sind die Transporter in ihrer molekularen Struktur sehr vielgestaltig (Holland et al., 1999). Die Verknüpfung der vier Domänen kann auf verschiedene Weisen realisiert sein (Abb. 2 B). Prokaryonten synthetisieren vorwiegend alle Untereinheiten als getrennte Polypeptidketten, die miteinander zum funktionalen Transportkomplex assemblieren (Doige et al., 1993). Höhere Eukaryonten dagegen exprimieren häufig die einzelnen Domänen auf ein oder zwei Polypeptidsträngen. Der Antigenpeptid-Transportkomplex TAP baut sich z.B. aus den Untereinheiten TAP1 und TAP2 auf, die jeweils aus einer Transmembrandomäne und einer Nukleotidbindedomäne bestehen (Spies et al., 1992; Kelly et al., 1992), während bei MDR1 alle Domänen auf einer einzigen Polypeptidkette liegen. Aber auch in Bakterien findet man schon verschiedene Verschmelzungszustände dieser Domänen. In Fällen in denen eine der Domänen fehlt, kann eine oder mehrere der verbleibenden Domänen als Homodimer die Funktion komplementieren (Davidson et al., 1991; Kerppola et al., 1991). Zusätzlich zu den vier Domänen können weitere vorhanden sein. So findet man beispielsweise beim humanen CFTR-Protein eine regulatorische Domäne R (Cheng et al., 1991) und bei dem Maltosetransporter von E. coli MalFGK ein periplasmatisches Bindeprotein MalE (Shuman et al., 1982). Bindeproteine sind hochaffin für ihr Substrat und dienen als

„Fänger“ für die in der Umgebung von Bakterien normalerweise nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhandenen Substratmoleküle. Diese Bindeprotein abhängigen ABC- Transportsysteme wurden ursprünglich in Gram-negativen Bakterien, später auch in Gram-positiven (Gilson et al., 1988) entdeckt. Auch in thermophilen Bakterien (Sahm et al., 1996 Herrman et al., 1996; Jones et al., 2000; Wassenberg et al., 2000) und Archaea (Xavier et al., 1996; Albers et al., 1999; Wanner et al., 1999) wurden sie kürzlich gefunden.

II Einleitung 8

Abbildung 2: Prinzipieller Aufbau von ABC-Transporter. (Entnommen aus Neumann, 2000) (A) ABC-Transporter bestehen aus zwei Transmembrandomänen (schwarz), welche die Membran mit je fünf bis zehn α-Helices durchspannen und zwei hydrophilen, cytosolischen Domänen (grau) in denen die hochkonservierten ATP-Bindestellen liegen.

(B) Die ABC-Proteine transportieren verschiedene Substrate u.a. über die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER), die Plasmamembran (PM) sowie die innere Bakterienmembran (IM). Zusätzlich zu diesen vier Domänen können weitere vorhanden sein (weiß). In Gram-negativen Bakterien erfolgt dieser Transport erst nach Diffusion des Substrats über die äußere (OM) in das Periplasma.

2.2.1 Die hydrophoben Domänen von ABC-Transportern

Die Transmembrandomänen bilden den eigentlichen Transportkanal von ABC- Transportern. Analysen der Primärstruktur dieser Domänen zeigen das Vorhandensein einiger ungeladener, hoch hydrophober Bereiche. Für diese wird die Bildung α-helicaler Konformationen vorausgesagt, welche die Membran durchspannen. Die hydrophoben Domänen der meisten ABC-Transporter besitzen typischerweise je sechs membranspannende Segmente (MSS) bzw. α-Helices, wobei dann die Amino- und Carboxyenden dieser Proteine zur cytoplasmatischen Seite der Membran orientiert sind.

Dazwischen liegen in der Regel drei extrazelluläre und zwei intrazelluläre hydrophile Peptidbereiche (Higgins et al., 1992). Die Anzahl der membranspannenden Segmente ist aber nicht bei allen ABC Transportern gleich. Für CFTR und MDR1 wurde experimentell nachgewiesen, daß jede Transmembrandomäne aus sechs Transmembranhelices besteht (Wang et al., 1991; Ames et al., 1992; Gottesman et al., 1993; Loo et al., 1993; Loo et al., 1993),

II Einleitung 9

während die Transmembrandomänen des Antigenpeptid-Transporters TAP die Membran jeweils acht- bis zehnmal durchqueren (Gileadi et al., 1997; Vos et al., 1999).

Das Membranprotein MalF des Maltosetransporters von E. coli weist acht membranspannende Segmente auf, die auch experimentell nachgewiesen werden konnten (Froshauer et al., 1988). Dagegen besitzen die Membranproteine HisQ und HisM des Histidintransporters aus S. typhimurium nur je fünf MSS (Higgins et al., 1992;

Kerppola et al., 1992). Dies führte zu der Annahme, daß die ABC-Transporter mindestens fünf α-Helices pro Membrandomäne benötigen, um den Transport zu ermöglichen (Ames et al., 1992).

Die Membrankomponenten der verschiedenen ABC-Transporter weisen nur geringe Homologie zueinander auf. Dies rührt wahrscheinlich daher, daß die Aminosäuren der α- helikalen Abschnitte durch unterschiedliche Aminosäuren substituiert werden können und trotzdem die für die Transportfunktion wichtige, hydrophobe α-helikale Struktur erhalten bleibt (Gerlach et al., 1986; Higgins et al., 1992). Eine Ausnahme bildet ein ca. 20 Aminosäuren langes, hydrophiles Motiv, das in bakteriellen ABC-Transportern gefunden wurde. Dieses ist ca. 100 Aminosäuren vom C-Terminus entfernt und liegt in einer cytosolischen Schleife der Proteine. Die Konsensussequenz lautet: EAA-X3-G-X9-I-X-LP (Saurin und Dassa, 1994; Saurin et al., 1994). Man vermutet, daß dieses sogenannte EAA- Motiv wichtig für die Transportfunktion oder für die Interaktion mit der ATP-bindenden Komponente des Transportsystems ist (Mourez et al., 1997).

2.2.2 Die hydrophilen Domänen von ABC-Transportern

Diese ATP-binding cassette (ABC)-Domänen, die dem Transportsystem auch den Namen gegeben haben, umfassen eine Gruppe von hochkonservierten Proteinen. Der Vergleich einer größeren Anzahl ATP-bindender Untereinheiten von ABC-Transportern machte deutlich, daß diese Proteine innerhalb von ca. 200 Aminosäuren im N-Terminus starke Homologien aufweisen (Boos und Lucht, 1996). Die Homologien sind nicht nur auf die ATP-Bindestellen begrenzt und finden sich auch in eukaryontischen Proteinen (MDR, CFTR) wieder (Mourez et al., 1997). Durch eine Analyse der Aminosäuresequenz konnten vier Konsensusmotive identifiziert werden (Abb. 3).

Dies sind zum einen die als Walker A und Walker B bezeichneten Motive zur Nukleotidbindung (Walker et al., 1982). Das Walker A-Motiv oder „phosphat-binding loop“ (P-loop) (GX2GXGKT/S) ist eine Glycin reiche Schleife welche mit den Phosphatgruppen und dem Magnesiumion des gebundenen Mg²⁺-Nukleotidkomplexes interagiert (Smith et al., 1996; Saraste et al., 1990).

II Einleitung 10

Basierend auf Röntgenstrukturanalysen von ATPasen, die ebenfalls Walker A- und B- Motive enthalten wie Ras p21 (Egner et al., 1987), die F1F0–ATPase (Abrahams, 1994) oder dem Elongationsfaktor Tu (EF-Tu) (Berchtold et al., 1993) sowie aufgrund der gelösten Struktur der ABC-Domäne HisP des Histidin-Transporters von Salmonella typhimurium (Hung et al., 1998) wird angenommen, daß das Lysin in der Walker A-Region eine Salzbrücke zu der γ-Phosphatgruppe des gebundenen ATPs bildet. Als Walker B-Motiv wird die Sequenz hhhhD bezeichnet, wobei h für eine hydrophobe Aminosäure steht. Der hochkonservierte Aspartat-Rest ist in der Koordination des Mg²⁺-Ions involviert (Senior et al., 1992; Senior et al., 1993). Für das konservierte Lysin im Walker A- sowie das Aspartat im Walker B-Motiv konnte nachgewiesen werden, daß sie für die ATP-Hydrolyse essentiell sind (Schneider et al., 1998).

Das als helikale Domäne bezeichnete Motiv zwischen Walker A- und Walker B-Motiv soll zusammen mit dem EAA-Motive der Membrankomponenten für die Bildung des funktionellen Komplexes notwendig sein (Hyde et al., 1990). Die Bedeutung des helikalen Motivs für die Bildung des Transportkomplexes wurde auch in anderen Arbeiten gezeigt (Schneider et al., 1991; Wilken et al., 1996; Lippincott et al., 1997; Hunke et al., 2000).

Der helikalen Domäne anschließend, folgt ein als „linker peptide“ bezeichnetes Motiv (LSGGQ(Q/R/K)QR) (Ames et al., 1992). Dieses ist charakteristisch für ABC-Proteine und wird deshalb auch als Signatursequenz beschrieben (Hyde et al., 1990; Ames et al., 1990) und dient zur Identifizierung von neuen Mitgliedern dieser Familie (Holland und Blight, 1999). In Anlehnung an die Bezeichnungen Walker A- und Walker B-Motiv wird es auch C-Motiv genannt (Bianchet et al., 1997). Es wird vermutet, daß diese Region an der Weiterleitung der durch ATP-Hydrolyse entstandenen Energie beteiligt ist. Dadurch soll eine Konformationsänderung der Membrandomänen erfolgen, die zum Transport des Substrats führt (Hyde et al., 1990; Ames et al., 1992; Schmees et al., 1999). Mutationen in diesem Bereich bewirken jedoch den Verlust der ATPase-Aktivität und deshalb wird auch vermutet, daß diese Region als Teil der Nukleotid-Bindetasche fungiert (Manavalan et al., 1995). Im CFTR-Protein führen Mutationen in diesem Bereich zu schweren Fällen der Mukoviszidose (Welsh et al., 1993).

Das vierte Motiv, die sogenannte „switch region“, enthält ein konserviertes Histidin, welches ca. 30 Aminosäuren nach der Asparaginsäure des Walker B-Motivs zu finden ist.

Üblicherweise liegen vor diesem Histidin vier hydrophobe und dahinter eine geladene Aminosäure. Mutationen des Histidins in verschiedenen bakteriellen ABC-Untereinheiten führten zum Ausfall des Transports der entsprechenden Substrate (Shyamala et al., 1991;

Walter et al., 1992; Bliss et al., 1996), während die Nukleotidbindung und Hydrolyse unbeeinflußt blieben (Shyamala et al., 1991; Walter et al., 1992). Diese Daten lassen vermuten, daß diese Region in der Konformationsänderung der Membrandomänen, die

II Einleitung 11

zum Transport des Substrats führt, beteiligt sein könnte (Schneider et al., 1998). Bei Fusionen zweier ABC-Domänen konnte das Histidin in jeweils einer der beiden Untereinheiten gefunden werden, wobei es offenbar keinen Unterschied zu machen scheint, ob es in der C- oder N-terminalen Domäne vorhanden ist. Entsprechend wurde es ebenfalls in heterodimeren Fusionen von ABC-Domänen in der ensprechenden Partner ABC-Domäne gefunden (Linton et al., 1998). Daraus kann geschlossen werden, daß den seperaten Domänen heterodimerer ABC-Transporter unterschiedliche Funktion zuzuordnen sind, wie dies im Falle des CFTR bereits unterstellt wird (Hwang et al., 1994).

Abbildung 3: Schematischer Aufbau von ABC-Domänen mit Darstellung der konservierten Regionen. (Entnommen aus Schneider et al., 1998) (Erläuterungen im Text).

II Einleitung 12

3 Das Maltose/Maltodextrin-Transportsystem von E. coli

Zum besseren Verständnis, des in dieser Arbeit beschriebenen Trehalose/Maltose-ABC- Transporters aus Thermococcus litoralis, soll der Stoffwechselweg für Maltose in E. coli kurz erläutert werden.

3.1 Das Maltoseregulon von Escherichia coli

Maltose und Maltodextrine können vom Bakterium E. coli als Kohlenstoffquellen genutzt werden. Maltose ist ein Disaccharid, bestehend aus zwei α-1,4-glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen. Bei Maltodextrinen ist die Anzahl der miteinander verknüpften Glucosereste je nach Dextrin entsprechend größer, die Zuckerketten sind jedoch immer unverzweigt. Die Aufnahme dieser Zucker erfolgt durch ein spezifisches Transportsystem, das zur Familie der Bindeprotein abhängigen ABC-Transporter gehört (Higgins et al., 1992; Boos und Lucht, 1996). Die Komponenten des Maltosetransport- systems werden durch fünf der insgesamt 10 Gene des Maltoseregulons kodiert. Vier der weiteren fünf Gene kodieren für Enzyme, die für den Metabolismus von Maltose und Maltodextrinen in der Zelle notwendig sind.

Die Expression des gesamten Regulons unterliegt der Kontrolle des Transkriptionsaktivators MalT. Die einzelnen Gene des Maltoseregulons sind auf vier Loci im E. coli -Chromosom verteilt (Boos und Shuman, 1998).

3.2 Das Maltosetransportsystem

Die meisten bakteriellen ABC-Transporter, die zur Nährstoffaufnahme benötigt werden, haben zusätzlich zu dem typischem membranassoziiertem Komplex aus vier Domänen weitere Untereinheiten (siehe Kapitel 1.2), wie Bindeproteine und bei Gram-negativen Bakterien auch Außenmembranproteine (Boos und Lucht, 1996). Für die Aufnahme von Maltose und Maltodextrinen in E. coli sind dies das Außenmembranprotein LamB und das periplasmatische Maltosebindeprotein MBP. In Abbildung 4 ist das Maltose/Maltodextrintransport- sowie das Stoffwechselsystem schematisch dargestellt.

II Einleitung 13

MalQ MalZ

MalP

MalG

LamB

Maltose Maltodextrine

MalS MalE

MalF

MalK MalK

+ P_i

P_i + +

Medium Außenmembran Periplasma

Innenmembran Cytoplasma

LamB

= α-1,4 Glukoseeinheiten

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Maltose/Maltodextrintransport- und Stoffwechselsystems aus E. coli. Die Komponenten des Maltosesystems sind schematisch dargestellt. Maltose und Maltodextrine, deren reduzierende Enden grau markiert sind, gelangen über LamB ins Periplasma. Dort können längere Dextrine durch MalS gespalten werden. MBP bindet das Substrat und gibt es an den Transportkomplex in der Innenmembran weiter. Dieser besteht aus den Membrankomponenten MalF und MalG und zwei Molekülen MalK. MalK ist nur membranassoziiert und energetisiert den Transport durch ATP-Hydrolyse. Im Cytoplasma werden die transportierten Zucker durch MalQ, MalP und MalZ verstoffwechselt. (Abbildung nach Schwartz et al., 1987)

II Einleitung 14

3.2.1 Das Aussenmembranprotein LamB und das Maltosebindeprotein MBP

LamB wurde ursprünglich als Rezeptor für den Bakteriophagen λ entdeckt (Randall- Hazelbauer et al., 1973). Das Protein bildet als Homotrimer einen wassergefüllten Kanal durch die äußere Membran von E. coli (Palva et al., 1979; Ishii et al., 1981). Diese Pore wird für die erleichterte Diffusion von Maltose und längerkettigen Maltodextrinen (Szmelcman et al., 1975) aber auch anderer Zucker (Freundlieb et al., 1988; Klein et al., 1993; Death et al., 1993; Death et al., 1994) über die äußere Membran benötigt. Eine Bindestelle im Inneren des Kanals ist für die Zuckerspezifität verantwortlich (Benz et al., 1987; Ferenci et al., 1980;

Szmelcman et al., 1975).

Das Maltosebindeprotein (MBP oder MalE) wird durch das Gen malE kodiert und ist ein periplasmatisches Protein (Duplay et al., 1984). Durch MBP wird dem Transportsystem ohne Verlust der Transporteffizienz eine hohe Affinität zum Substrat verliehen. Die Bindung von Maltose und erfolgt mit einer Kd von 1 µM (Kellerman et al., 1974, Szmelcman et al., 1976). Die Menge an Maltosebindeprotein im Periplasma übersteigt die der Membrankomponenten um das 30-50 fache und kann eine Konzentration bis zu 1 mM erreichen (Dietzel et al., 1978).

Für den Transport ist eine Interaktion des substratbeladenen MBP mit den integralen Innenmembranproteinen MalF und MalG notwendig (Treptow et al., 1988).

Darüberhinaus interagiert substratbeladenes MBP nicht nur mit MalF und MalG sondern auch mit dem Chemotaxis-Sensor-Protein Tar und ermöglicht dem Bakterium so eine chemotaktische Antwort auf Maltose- und Maltodextrinkonzentrationsgradienten im Medium (Koiwai et al., 1979; Zhang et al., 1992)

3.2.2 Die integralen Membranproteine MalF und MalG

Die integralen Membrankomponenten des Maltosetransportsystems sind MalF und MalG.

MalF weist dabei acht, MalG sechs membranspannende α-Helices auf. Dabei bildet MalF im Vergleich zu den Membrandomänen anderer ABC-Transporter einen Ausnahme.

Sowohl N-Terminus als auch C-Terminus liegen bei beiden Proteinen im Cytoplasma (Ehrmann et al., 1990; Dassa et al., 1993; Boyd et al., 1993).

Mit diesen beiden Proteinen wurden detaillierte Untersuchungen der Funktion des EAA- loops durchgeführt (Mourez, 1997). Es konnte gezeigt werden, daß Substitutionen an identischen Positionen in MalF und MalG zu unterschiedlichen Phänotypen führen, d.h.

das die EAA-loops der beiden Proteine keine „Funktionssymmetrie“ zeigen. Mutationen im EAA-loop von MalF oder MalG die einzeln betrachtet nur geringen Einfluß auf den Transport zeigten, führten zusammen zu einem kompletten Ausfall des Transports. Dies läßt vermuten, daß die EAA-loops im Transport zusammenarbeiten.

II Einleitung 15

Es konnten Mutationen in malF und m a l G isoliert werden, die zu einem MBP- unabhängigen Transport von Maltose führen (Treptow et al., 1985). Andere Zucker werden durch diesen mutierten Transportkomplex nicht transportiert. Dies spricht dafür, daß auch der Membrankomplex aus MalFGK₂ eine, wenn auch im Wildtyp nicht zugängliche, Substratbindestelle besitzt. Maltodextrine werden in diesen Mutanten nicht transportiert. Sie müssen wahrscheinlich im Wildtyp durch das MBP in der richtigen Orientierung präsentiert werden, um zur Substratbindestelle im durch MalF und MalG gebildeten Transportkanal zu gelangen (Nikaido et al., 1994).

Bisher liegt keine Kristallstruktur eines kompletten ABC-Transporters oder einer seiner Membrankomponenten vor. Ein Modell der Anordnung der Transmembrandomänen von MalF und MalG wurde unter Berücksichtigung der verfügbaren experimentellen Daten und theoretischer Betrachtungen erstellt (Ehrmann, 1998). Die Grundlage dieses Modells war dabei die Herleitung der Abfolge der Helices, welche durch die Kriterien der Looplängen und aus Suppressoruntersuchungen von MalF erfolgten (Ehrle, 1996).

Danach ist der Caboxyterminus von MalF in der Nähe des Aminoterminus von MalG positioniert. Dies beruht auf der Feststellung, daß ein Fusionsprotein aus MalF-MalG teilweise funktionsfähig ist (Shuman, 1993). Die Transmembrandomänen sind rotationssymmetrisch angeordnet und die ersten beiden Transmembrandomänen von MalF sind am Rand des MalFG-Komplexes lokalisiert. Grundlage für die nicht mit Einbeziehung dieser beiden Domänen sind zum einen der experimentelle Beweis, daß die erste cytoplasmatische Domäne deletiert werden kann ohne Struktur und Funktion wesentlich zu beeinflussen (Ehrmann, 1991). Auch wurde durch den Vergleich von MalF mit anderen Transmembrandomänen verschiedener ABC-Transporter festgestellt, daß die Homologie der Sekundärstrukuren überwiegend in den C-Termini (MSS 3-6 von MalF, siehe auch Abb. 9) dieser Proteine gefunden werden kann (Kerppola, 1992).

Letztlich konnte so ein Model aufgestellt werden, in dem ein symmetrisches Dimer aus MalF und MalG gebildet wird. Die Substratbindestelle im Transportkanal wird durch hydrophile Bereiche gebildet, welche von hydrophoben Regionen separiert werden. Dies würde den Transport des Substrates jedoch verhindern. Durch die ABC-Untereinheit MalK könnte mittels ATP-Hydrolyse allerdings eine Konformationsänderung im Transportkanal induziert werden, welche zur Überwindung dieses „Hindernisses“ führen würde.

II Einleitung 16

3.2.3 Die ATP-bindende Untereinheit MalK

Das E. coli MalK Protein wurde seit seiner Entdeckung (Bavoil et al., 1980; Shuman et al., 1981) intensiv analysiert. MalK ist ein lösliches Protein von 371 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 40,7 kDa (Gilson et al., 1982; Dahl et al., 1989). Zur Bildung des funktionellen Membrankomplexes ist die Bindung von jeweils einem MalK an MalF und MalG notwendig (Davidson und Nikaido, 1991). Durch Reinigung und Rekonstitution des Transportkomplexes in Proteoliposomen konnte gezeigt werden, daß der Maltosetransport unter Verbrauch von ATP stattfindet, jedoch nur in Gegenwart von substratbeladenem MBP (Davidson und Nikaido, 1991). Gereinigtes MalK ist ebenfalls in der Lage, ATP zu binden und zu hydrolysieren, jedoch mit einer weit geringeren Rate (Walter et al., 1992; Morbach et al., 1993).

Bisher wurden sehr kontroverse Daten zur Beteiligung von MalF und MalG an der Membranassoziation von MalK veröffentlicht. Bei früheren Beobachtungen wurde MalK in einer malG-Mutante in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert (Shuman et al., 1980).

Später konnte gezeigt werden, daß sogar ein 20 kDa großes Fragment von MalF ausreicht, um MalK an die Cytoplasmamembran zu binden (Panagiotidis et al., 1993). Neuere Daten machen jedoch glaubhaft, daß sowohl MalF als auch MalG für die Membranassoziation von MalK notwendig ist (Mourez et al., 1997). Hier wurde gezeigt, daß die Abwesenheit von MalF oder MalG zu einer cytoplasmatischen Lokalisation von MalK führt. Die in dieser Arbeit isolierten Mutationen in den EAA-Motiven von MalF und MalG haben un- terschiedliche Auswirkungen auf die Lokalisation von MalK. So haben Mutationen, die zur Beeinträchtigung der Transportfunktion führen, nur zum Teil und auch in unterschiedlichem Ausmaß eine cytoplasmatische Lokalisation von MalK zur Folge. Es wurden Supressormutationen zu den ursprünglich isolierten Mutationen in den EAA- Motiven gefunden. Alle wurden in einer bestimmten Region von MalK lokalisiert. Diese wird als helikale Domäne bezeichnet und liegt zwischen WalkerA- und Walker B-Motiv (siehe Abb. 2) (Mourez et al., 1997).

Für Bindeprotein abhängige ABC-Transporter in E. coli konnte nachgewiesen werden, daß in Abwesenheit der entsprechenden ABC-Untereinheit, ein Homolog eines anderen ABC- Transportsystems die Funktion übernehmen kann. Beispiele dafür sind das Ugp-System über das die Aufnahme von Glycerin-3-Phosphat erfolgt und dessen ABC-Domäne UgpC hohe Homologie zum MalK aufweist. Dabei kann UgpC, trotz der Verschiedenartigkeit der Substratspezifität der beiden Transportsysteme MalK ersetzen sowie auch umgekehrt (Hekstra und Tommassen, 1993). MalK kann ebenfalls durch CymD, der ABC-Domäne des Cyclodextrin-Transportsystems von Klebsiella oxytoca (Pajatsch et al., 1998) komplementiert werden. LacK, die Untereinheit des Lactose-Transporters von Agrobacterium radiobacter kann, nach Mutagenisierung, sowohl das MalK von E. coli als

II Einleitung 17

jenes von Sallmonella typhimurium ersetzen (Wilken et al., 1996). Im Gegensatz dazu konnte bisher eine Komplementation von Transmembrandomänen solcher Transportsystems nicht nachgewiesen werden.

MalK hat außer zur Energetisierung des Maltose/Maltodextrintransportes noch eine weitere Funktion. Diese beruht auf der Interaktionen mit anderen Proteinen. Dabei verhält sich MalK phänotypisch als Repressor der zum Maltoseregulon gehörenden Gene (Boos und Shuman, 1998) (siehe Abschnitt 3.4). Diese Funktion wurde dem, unter den ABC-Proteinen nicht stark konservierten, C-Terminus von MalK zugeordnet (Kühnau et al., 1991). Die Wechselwirkung von MalK mit der unphospholylierten Untereinheit EIIA^Glc des Glucose-Transportsystems führt zur Inhibierung des Maltosetransportes (Dean et al., 1990; Van der Vlag und Postma, 1995). Dies zeigt, daß eine direkte Verknüpfung zwischen Substrattransport und Genregulation existiert.

3.2.4 Modell des Maltosetransports

Die Translokation des Substrates über die Cytoplasmamembran wird bei ABC- Transportern durch ATP-Hydrolyse der membranassoziierten, ATP-bindenden Untereinheit energetisiert. Um zu vermeiden, daß auch in Abwesenheit von Substrat eine ATP-Hydrolyse stattfindet, muß eine Signaltransduktion über die Innenmembran erfolgen.

Aufgrund neuster Untersuchungen (Chen et al., 2001) wurde ein bereits aufgestelltes Modell (Davidson et al., 1992; Boos und Lucht, 1996) modifiziert. Dieses neue Modell besagt, daß das Signal der Interaktion von substratbeladenem MBP mit MalFGK2 den Tranport initiiert. In der Übergansphase zur ATP-Hydrolyse, bei der MBP mit geringer Affinität für Maltose fest gebunden an den Transportkomplex vorliegt, ist die Substratbindestelle in MalFGK2 zum Periplasma orientiert um die vom MBP freigegebene Maltose „einzufangen“. Nach der Bindung des Zuckers findet eine Umorientierung der Bindestelle hin zum Cytoplasma statt, so daß die Maltose in das Zellinnere freigegeben werden kann. Alternativ könnte die periplasmatische Seite des offene Kanals in der Übergangsphase „Transition state“ auch durch das gebunden MBP blockiert sein.

Notwendigerweise müssen alle Reaktionen, durch Konformationsänderungen des MBP- MalFGK₂-Komplexes gleichzeitig ablaufen, welche direkt mit der ATP-Hydrolyse in der Übergangsphase verbunden sind.

II Einleitung 18

Abbildung 5: Modell des Maltosetransports (Entnommen aus Chen et al., 2001)

A)MBP bindet Maltose wodurch es zu einer Konformationsänderung der offenen zur geschlossenen Form kommt, welches zur Bildung eine hoch affinen Substratbindestelle führt.

Dieses MBP bindet an MalFGK2 und initiiert den Transport und die ATP-Hydrolyse.

B) In der Übergangsphase kommt es zur starken Bindung von MBP und MalFGK2, wobei es zur Öffnung und dadurch zur gegenseitigen Exponierung der Substratbindestellen durch beide

„Proteine“ kommt. Die Öffnung des MBP in der Übergangsphase führt zur Schwächung der Interaktion von MBP mit der Maltose, wodurch der Transfer der Maltose an die schwächere Substratbindestelle im MalFGK2-Komplex ermöglicht wird.

C ) Die Maltose wurde transportiert und das MBP, nach der Reorientierung der MalFGK2- Substratbindestelle in Richtung Cytoplasma, wieder freigegeben.

3.3 Die Enzyme des Maltosestoffwechsels 3.3.1 Die αααα-Amylase, MalS

Die periplasmatische α-Amylase wird durch das Gen malS kodiert. Substrate von MalS sind Maltodextrine mit einer minimalen Größe von drei Glucoseeinheiten. Bei der Spaltung von längeren Dextrinen wird bevorzugt Maltohexaose freigesetzt (Abb. 4).

Längere Dextrine können zwar ins Periplasma gelangen und auch durch MBP gebunden werden, über die Innenmembran können jedoch nur Dextrine bis zur Größe von Maltohexaose transportiert werden (Freundlieb et al., 1986).

3.3.2 Die Amylomaltase, MalQ

Das Strukturgen für die Amylomaltase ist malQ. Es kodiert für ein cytoplasmatisches Protein, das als Monomer aktiv ist (Pugsley et al., 1988). Das Enzym katalysiert eine Dextrinyl-Transferreaktion, bei der vom reduzierenden Ende des Donordextrins eine

II Einleitung 19

Glucoseeinheit abgespalten und das restliche Dextrin auf das nichtreduzierende Ende eines Akzeptormoleküls übertragen wird (Palmer et al., 1976; siehe auch Abb. 4). Statt Glucose kann aber auch ein längeres Dextrin freigesetzt werden. Das kleinstmögliche Donordextrin ist Maltotriose. Als Akzeptor kann bereits Glucose dienen (Schwartz et al., 1987). Die Anzahl der glycosidischen Bindungen bleibt bei der durch die Amylomaltase katalysierten Reaktion konstant. Die Disproportionierung führt zur Bildung von immer längeren Dextrinen, die wiederum ein Substrat für die Maltodextrinphosphorylase- reaktion sind (s. u.).

3.3.3 Die Maltodextrinphosphorylase, MalP

Ein weiteres Enzym des Maltodextrinstoffwechsels ist die Maltodextrin-Phosphorylase, kodiert durch das malP-Gen. Dieses Enzym ist als Homodimer aktiv. Pro Untereinheit ist ein Molekül Pyridoxalphosphat über einen Lysinrest gebunden (Schächtele et al., 1978;

Schinzel et al., 1991). Die Maltodextrinphosporylase katalysiert die Abspaltung eines Glucoserestes vom nichtreduzierenden Ende eines Dextrins, das mindestens aus fünf Glucoseeinheiten besteht, unter Verwendung von Phosphat (Schwartz et al., 1967). Somit entsteht ein Molekül Glucose-1-Phosphat und ein um einen Glucoserest verkürztes Dextrin (Abb. 4). Die Reaktion ist reversibel und daher in Abwesenheit hoher Phosphatkonzentrationen umkehrbar.

Es wird deutlich, daß der Abbau von Maltose nur durch eine konzertierte Aktion von MalQ und MalP erfolgen kann, indem während der MalQ-Reaktion Maltose als Akzeptor dient und zu längeren Dextrinen aufpolymerisiert wird, die dann durch die MalP- Reaktion wieder abgebaut werden können. Die entstehenden Produkte Glucose und Glucose-1-Phosphat können dann in die Glykolyse einfließen.

3.3.4 Die Maltodextrin-Glucosidase, MalZ

Die cytoplasmatische Maltodextrin-Glucosidase wird durch das Gen malZ kodiert. Im Gegensatz zu MalP und MalQ ist MalZ entbehrlich für den Maltose- und Maltodextrinstoffwechsel. Natürliche Substrate der Glucosidase sind kleine Maltodextrine, von Maltotriose bis Maltoheptaose; Maltose ist auch durch MalZ nicht spaltbar (Tapio et al., 1991). Die durch MalZ katalysierte enzymatische Reaktion ist für Glucosidasen untypisch, da die Maltodextrin-Glucosidase Glucose und zum Teil auch Maltose vom reduzierenden Ende des Dextrins abspaltet. Durch Untersuchungen mit gereinigtem MalZ-Protein konnte gezeigt werden, daß das Protein auch eine Cyclodextrinaseaktivität aufweist (Peist et al., 1996).

II Einleitung 20

3.4 Regulation des Maltoseregulons

Die Expression aller hier beschriebenen Maltosegene ist abhängig vom Transkriptionsaktivator MalT. Das MalT-Protein wurde als ausschließlich aktivierendes Regulatorprotein identifiziert (Hatfield et al., 1969; Hofnung et al., 1971). Es kann in zwei unterschiedlichen Konformationen vorliegen, einer aktiven oligomeren und einer in- aktiven monomeren Form (Schreiber et al., 1999). Das Gleichgewicht wird bei Bindung von ATP (Richet et al., 1989) und dem Induktor Matotriose (Dardonville et al., 1990) in Richtung der aktiven Konformation verschoben. Aber auch die Bindung von ADP oder nicht-hydrolysierbarer ATP-Analoga führt zur Transkriptionsaktivierung (Richet et al., 1989). Dabei scheint die Hydrolyse von ATP für die Bildung des offenen Komplexes bei der Transkriptionsinitiation keine Rolle zu spielen. Im C-Terminus von MalT wurde ein DNA-Bindemotiv lokalisiert (Vidal-Ingigliardi et al., 1993).

Die Expression aller Maltosegene ist indirekt cAMP/CRP-abhängig, da die Transkription von malT durch Bindung dieses Komplexes reguliert wird (Debarbouille et al., 1978;

Chapon et al., 1983). Dadurch unterliegt das gesamte Regulon der Katabolitrepression. Die Expression der Gene, die für die Maltosetransportproteine kodieren, sind nachgewiesenermaßen zusätzlich direkt durch die Bindung von cAMP/CRP kontrolliert (Vidal-Ingigliardi et al., 1991).

Wie bereits erwähnt (siehe 3.2.2) hat die ABC-Domäne MalK auch eine regulatorische Funktion. Es konnte gezeigt werden, daß MalK mit MalT interagiert und dabei MalT in die inaktive Form überführt (Panagiotidis et al., 1998). So konnte in einem MalK- Deletionsstamm eine konstitutive Synthese der mal-Gene, jedoch kein Transport mehr, nachgewiesen werden (Bukau et al., 1986). Im Gegensatz dazu zeigt eine plasmidkodierte Überexpression von MalK eine starke Repression der von MalT kontrollierten Gene (Reyes et al., 1988; Kühnauet al., 1991).

II Einleitung 21

4 Archaea

4.1 Die dritte Domäne des Lebens

Bis in die späten siebziger Jahre herrschte die Lehrmeinung vor, alle heutigen Lebewesen ließen sich zu zwei großen Entwicklungslinien oder Urreichen zuordnen: entweder den einfach gebauten einzelligen Bakterien ohne echten Zellkern oder den ein- bis vielzelligen Eukaryoten mit komplex gegliederten Zellen (Woese et al., 1990).

Als einer der ersten Wissenschaftler richtete Carl R. Woese und seine Kollegen sein Augenmerk auf die DNA, welche für die kleine Untereinheit der Ribosomen (16S rRNA) kodiert, um Verwandschaftbeziehungen unter allen Organismen zuverlässig zu bestimmen. Seine Ergebnisse untermauerten die Trennung der Lebewesen in Prokaryoten und Eukaryoten, denn die von ihm untersuchten rRNAs typischer Bakterien ähnelten in ihren Sequenzen einander mehr als den entsprechender Eukaryoten. Bei seinen Untersuchungen stellten sich jedoch Unstimmigkeiten heraus, denn einige Prokaryoten sahen zwar wie Bakterein aus, ihre DNA-Sequenzen ließen sich jedoch eindeutig von ihnen abgrenzen (Woese et al., 1978). Diese anfangs noch als Archaebakterien bezeichneten Mikroorganismen stellten also ein drittes Urreich dar (Abb. 6). Um diese Trennung auch begrifflich schärfer herauszustellen, wurden sie später in Archaea umbenannt (Woese et al., 1990). Aufgrund der 16S rRNA Analysen lassen sich die Archaea desweiteren in zwei Untergruppen klassifizieren. Die Euryarchaeota stellen dabei eine Gruppe dar, die in den unterschiedlichsten Lebensräumen gefunden werden können. Zu dieser zählen halophile, methanogene und thermophile Organsimen. Von der Gruppe der Crenarchaota waren lange Zeit nur thermophile Vertreter bekannt (Woese et al., 1990), kürzlich wurden jedoch auch nicht thermophile Mitglieder dieser Familie gefunden (DeLong et al., 1998; Schouten et al., 2000).

Als das Erbgut von Methanococcus jannaschii, des ersten Vertreters dieser dritten Domäne, 1996 komplett sequenziert war (Bult et al., 1996) und dessen Gene mit denen bereits entschlüsselter anderer Organismen verglichen wurden, stellte sich diese Abgrenzung noch deutlicher heraus. Für 44 Prozent von ihnen fanden sich ähnliche Gene in Bakterien oder Eukaryoten, ein Teil auch in beiden zugleich; die übrigen 56 Prozent sind bislang von allen bekannten Genen grundverschieden. Die gefunden Gemeinsamkeiten der drei Linien sprechen dafür, daß sie letztlich von einem einzigen Urorganismus abstammen (Olsen et al., 1996).

II Einleitung 22

Abbildung 6: Universeller auf rRNA-Sequenzen basierender pylogenetischer Stammbaum.

(Entnommen aus Pace et al., 1997).

II Einleitung 23

4.2 Lebensräume der Archaea

In der Tiefsee bei Drücken von mehreren 100 bar, in heißen vulkanischen Quellen bei über 100°C, in kalten Regionen bei Temperaturen um den Gefrierpunkt, in Salzseen ebenso wie in Umgebungen mit sehr niedrigem oder auch sehr hohem Säuregehalt (pH- Wert), also auch an den unwirtlichsten Milieus der Erde existiert Leben. Die hier zu findenden Organismen werden deshalb auch als Extremophile bezeichnet (Kristjansson et al., 1995). Neben wenigen höheren Organismen (Pilzen und Algen) und einigen Klassen der Bakterien gehören diese Organismen überwiegend zu der Domäne Archaea.

Anfangs wurde vermutet, daß die Archaea auf diese ökologischen Nischen mit extremen Umweltbedingungen besonders spezialisiert sind. Doch es stellte sich heraus, daß sie auch unter „normalen“ Umweltbedingungen wie in den Meeren, den Binnenseen, dem Erdboden und als Endosymbioten existieren. An diesen Orten stellen sie bis zu 30% der mikrobiellen Population dar (DeLong et al., 1994). Diese Ergebnisse verdeutlichen, daß die Archaea weit verbreitet und nur eine geringe Anzahl bekannt sind.

Intensive Untersuchungen seit Mitte der 80er Jahre haben gezeigt, daß die Archaea nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für moderne biotechnologische Anwendungen von Interesse sind. Die Anpassung an die extremen Umweltbedingungen schuf einen Zellaufbau und einen Stoffwechsel, der sich stark von den bisher bekannten,

„mesophilen” Organismen unterscheidet. Die den Stoffwechsel steuernden Proteine, insbesondere die Enzyme weisen Eigenschaften auf, die für industrielle Anwendungen vielversprechende neue Potentiale aufzeigen (Übersicht in Niehaus et al., 1999).

4.3 Hyperthermophile Organismen

Die von Karl Stetter (Stetter et al., 1996) definierten Hyperthermophilen weisen eine optimale Wachstumstemperatur von über 80°C auf und sind unter 60°C zu keinem Wachstum fähig. Während der letzten zehn Jahre wurden zahlreiche dieser Organismen aus den unterschiedlichsten Umgebungen isoliert (Stetter et al., 1999). Dabei handelt es sich bei der Mehrzahl um Prokaryoten, wozu neben einigen Bakterien hauptsächlich Vertreter der Archaea zählen. Einige davon weisen bei Temperaturen von bis zu 113°C noch Wachstum auf (Blochl et al., 1997), wobei diese Temperatur momentan auch die oberste Grenze für das uns bekannte Leben darstellt. Das natürliche Umfeld, in dem sich hyperthermophile Mikroorganismen am besten entwickeln, ist meistens geothermischen Ursprungs und steht damit in Verbindung zu tektonisch aktiven Zonen. Entsprechende Biotope an der Erdoberfläche sind überwiegend schwefelhaltige Regionen vulkanischen Ursprungs, bestehend aus heißen Schlammfeldern und Quellen, die von dem darunter liegenden Magma aufgeheizt werden. Die marinen Biotope seichter Gefilde und der

II Einleitung 24

Tiefsee weisen Lavaspalten, heiße Quellen oder sogenannte “black smoker” auf, die in der unmittelbarer Umgebung Temperaturen von bis zu 400°C erzeugen. Durch die Anwesenheit reduzierender Gase und Verbindungen fehlt thermophilen Biotopen meistens der Sauerstoff, sie beherbergen daher in der Regel Anaerobier (Stetter et al., 1996).

5 Das hyperthermophile Archaeon Thermococcus litoralis

Zu den hyperthermophilen Archaea gehören unter anderen die zu den Euryarchaeota zählende Familie der Thermoccoales. Diese läßt sich in die Gattung Thermococcus und Pyrococcus unterteilen. Die Genome der Organsimen Pyrococcus abyssii (Forterre, unveröffentlicht), Pyrococcus horikossii (Kawarabayasi et al., 1998) und Pyrococcus furiosus (Weiss et al., unveröffentlicht) wurden bereits komplett sequenziert. Der best untersuchte Vertreter P. furiosus weist in Bezug auf Wachstum und Metabolismus mit Thermococcus litoralis viele Gemeinsamkeiten auf (Brown et al., 1993).

T. litoralis ist ein hyperthermophiles marines Achaeon mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 85°C (Neuner et al., 1990). Bei diesem Organismus handelt es sich um unregelmässig bis regelmässig geformte Kokken mit Durchmessern von 0,5 bis 3 µm. Unter dem Elektronenmikroskop ist eine Proteinschicht, der sogenannte S-layer, um die Cytoplasmamembran zu erkennen. Im Gegensatz zu anderen Vertretern der Thermococcales besitzt T. litoralis keine Geiseln. Von T. litoralis sind zwei Stämme bekannt, die beide aus unterirdischen Thermalquellen in Italien isoliert wurden. Stamm NS-C (DSM 5473) wurde in der Nähe von Neapel isoliert und zeigt Wachstum zwischen 55 und 98°C mit einem Optimum bei 88°C; Stamm A3 (DSM 5474) wurde auf einer Vulkaninsel isoliert (Neuner et al., 1990) und zeigt Wachstum zwischen 50°C und 96°C mit einem Optimum bei 85°C. Beide können bei pH-Werten zwischen 4 und 8,5 wachsen und weisen Optimum bei pH 6,0 auf. Zum Wachstum werden NaCl-Konzentrationen zwischen 1,8 bis 6,5% (ca. 200 bis 600 mM) benötigt.

II Einleitung 25

5.1 Der Zuckerstoffwechsel von T. litoralis

T. litoralis ist ein heterotropher Organismus, der anfangs zum Wachstum auf Peptiden und Pyruvat, nicht aber auf Kohlenhydrate beschrieben wurde (Neuner et al., 1990).

Mehrere Enzyme, die vermutlich im Peptid Metabolismus dieses Archaeons involviert sind wurden charakterisiert (Mukund et al., 1993; Ohshima et al., 1994; Andreotti et al., 1994; Kletzin et al., 1995; Ma et al., 1994). Spätere Untersuchungen zeigten jedoch, daß das Wachstum auf Peptiden durch Maltose stimuliert werden kann (Mukund et al., 1993). T.

litoralis produziert, ebenso wie P. furiosus, extrazelluläre amylolytische Enzyme als Antwort auf die Anwesenheit von α-1,4- und α-1,6-verknüpften Sacchariden (Brown et al., 1993). Auch wurde eine intrazelluläre α-Glucosidase gefunden (Kelly et al., 1994). Die Entdeckung dieser Enzyme lies vermuten, daß ein Polysaccharid-Stoffwechsel in T.

litoralis existiert, der durch die hydrolytische Aktivität extrazellulärer Enzyme initiiert wird. Diese Enzyme bauen komplexe Kohlehydrate zu Oligo- und Dissacharide, wie z.B.

Cellobiose und Maltose, ab. Diese werden dann in die Zelle transportiert und durch die intrazelluläre α-Glucosidase zu Glucose abgebaut. Letztendlich erfolgt durch einen Emden-Mayerhof ähnlichen glycolytischen Stoffwechselweg die Katabolisierung (Selig, 1997).

5.2 Der Trehalose/Maltose Transporter von T. litoralis

In früheren Untersuchungen wurde festgestellt, das T. litoralis, bei Wachstum in Pepton- Medium mit Hefeextrakt als Kohlenstoffquelle, Maltose mit hoher Transportrate aufnimmt (Xavier et al., 1996). Dieser Transport zeigte eine starke Temperaturabhängigkeit. Bei Raumtemperatur wurden im Vergleich zu 85°C weniger als 2% an Maltose aufgenommen. Zellen, die nur in Pepton-Medium ohne Hefeextrakt- Zusatz gewachsen waren, zeigten keine Maltose-Aufnahme. Das Fehlen eines Maltose- Transports in Zellen unter diesen Bedingungen lies vermuten, daß Komponenten des Hefeextrakts, aller Wahrscheinlichkeit nach Kohlehydrate, für die Induktion des Transports verantwortlich sind. Eine genauere Untersuchung des Hefeextrakts zeigte das Vorhandensein hoher Konzentrationen an Trehalose. Zellen die in Pepton-Medium mit Zusatz einer entsprechenden Menge an Trehalose gewachsen waren, wiesen dieselbe Maltose-Aufnahme auf, wie in Pepton-Hefeextrakt gewachsene.

Daraus konnte gefolgert werden, daß Trehalose ein Induktor des Maltose-Transportes ist.

Die Inhibierung des Maltose-Transportes durch verschiedene Kohlehydrate (Maltotriose, Glucose, Sucrose und Trehalose) wurde ebenfalls durchgeführt. Glucose und Sucrose zeigten keine Inhibierung. Im Vergleich zu Maltose zeigte Maltotriose auch eine teilweise Inhibierung, aber nur bei 1000-fachen Überschuss. Unter den gleichen Bedingungen inhibierte Trehalose die Aufnahme von Maltose komplett. Die Ki von Trehalose bezogen auf den Maltosetransport betrug 21 nM. Im Gegensatz dazu wurde ein 10-facher

II Einleitung 26

Überschuss an Maltose für eine 50%ige Inhibierung des Trehalosetransports benötigt.

Eine vollständige Inhibierung fand erst ab einer Maltosekonzentration von 2 mM statt (Xavier et al., 1996). Trehalose ist also nicht nur ein Induktor des Maltose- Transportsystems, sondern wird offensichtlich auch durch das selbe System transportiert.

Für den Maltose-Transport wurde eine Km von 22 nM, für Trehalose eine von 17 nM, bei einer Vmax von 3 bis 7 nmol/min/mg Protein bestimmt (Xavier et al., 1996). Das entsprechende Maltose Transportsystem in E. coli zeigt eine Km von 1 µM und eine Vmax von 3 nmol/min/mg Protein (Szmelcman et al., 1976). Daraus ergeben sich daher für beide Systeme vergleichbare Transportraten, jedoch weist das T. litoralis System eine 50- fach höhere Substrataffinität auf. Dieses Transportsystem erkennt mit gleicher Affinität Maltose und Trehalose, ein nicht reduzierendes Disaccharid mit einer vollkommen anderen Struktur als Maltose. Aus den bestimmten Km-Werten wurde gefolgert, daß es sich dabei um ein Bindprotein abhängiges Transportsystem handeln könnte. Zur weiteren Charakterisierung wurde aus induzierten Zellen ein Membran assoziiertes Protein gereinigt, welches die selben Substratspezifitäten wie das in ganzen Zellen gefundene Transportsystem aufwies (Xavier et al., 1996 ).

5.2.1 Die Sequenzen von malE, malF und malG

Nach der Sequenzierung eines zum E. coli malG-Genhomologen Bereichs aus P. furiosus (Borges et al., 1996) wurde eine Genbank von T. litoralis durchsucht. Dabei konnten die vollständigen DNA-Sequenzen des Trehalose/Maltose Bindeproteins (malE) sowie zweie hypothetische Membranproteine (malF und malG) ermittelt werden (Abb. 7) (Horlacher et al., 1998).

Stromaufwärts von malE wurde eine mögliche prokaryotische Ribosomenbindestelle sowie eine als TATA-Box bezeichnete Sequenz gefunden, welche in Archaea als Promotorelement fungiert (Hain et al., 1992; Hausner et al., 1991). Dem Translationsstop folgend konnte eine oligo-dT-Sequenz, die in Archaea als Transkriptionsstop dient (Thomm et al., 1994), identifiziert werden.

II Einleitung 27

Abbildung 7: Sequenzbereich der T. litoralis malE, malF und malG Gene und ihrer flankierenden Regionen. Die Nukleotidsequenz ist in 5`-3` Orientierung bezogen auf malE dargestellt. Die durch Translation des offenen Leserasters gewonnene Proteinsequenz ist unterhalb der DNA-Sequenz vermerkt, die Nummerierung der Aminosäuren erfolgt ebenso wie die der Basen jeweils am Zeilenrand. In der Nukleotidsequenz wurde ein möglicher Promotor umrahmt, eine mögliche Ribosomenbindestelle wurde in Fettschrift und ein Tanskriptionsterminator unterstrichen dargestellt. In der MalE Aminosäuresequenz ist die konservierte Erkennungssequenz der Lipoprotein Signalpeptidase Schnittstelle unterstrichen dargestellt. Das sich daraus vermutete N-terminale Cystein des reifen Proteins ist in Fettschrift dargestellt und mit einem Pfeil markiert.

Sequenzen innerhalb der Strukturgene sind nicht dargestellt, dies ist durch die Punkte und Deletionszeichen vermerkt. (Entnommen aus Horlacher et al., 1998).

5.2.2 Das Trehalose/Maltose Bindeprotein TMBP

Die Sequenz von malE besteht aus 1353 Nukleotiden, welche für ein 450 Aminosäuren großes Protein kodieren. Damit ist es etwas grösser als sein Homolog aus E. coli, das aus 396 Aminosäuren besteht. Die TMBP Sequenz zeigt Homologie zur einer Familie der periplasmatischen Bindeproteine. Diese Gruppe, die sogenannten „Cluster 1“- Bindeproteine (siehe Abb. 8) beinhaltet Bindeproteine von Maltooligosaccharide-, verschiedene andere Zucker-, sn-Glycerin-3-Phosphat- und Eisen-Transportsysteme (Tam et al., 1993).