Bei der Reinigung des oben beschriebene ssMBP-TMBP konnte festgestellt werden, daß weniger als 5% des Proteins in der periplasmatischen Fraktion wieder gefunden wurde und sich der Hauptanteil im Cytoplasma befand (Daten nicht gezeigt). Diese Reinigung war, aufgrund des verwendeten kalten osmotischen Schocks und zweier Chromatographiesäulen, zeitintensiv. Mit dem so gereinigten Protein wurden jedoch erste Kristalle erhalten (persönliche Mitteilung von Eckhard Hoffmann, Strukturgruppe AG Welte, Universität Konstanz). Trotzdem wurde, aus den oben genannten Gründen, versucht, die Reinigung zu vereinfachen und auf die E. coli-Signalsequenz zu verzichten.
Realisiert wurde dies, durch die Konstruktion des Plasmids pGG1, welches das Trehalose/Maltose-Bindeprotein (TMBP) ohne Signalsequenz und mit einem N-terminalen His-Tag enthält. Zur Überexpression wurde der E. coli-Stamm BL21 mit den Plasmiden pGG1 und pIq (lacIq; Repressor des lac-Systems) verwendet. Die Proben der einzelnen Reinigungsschritte wurden jeweils auf Anwesenheit des 48 kDa Proteins (N-His-TMBP) durch SDS-PAGE überprüft (Abb. 13). Induzierte Zellen (Spur 2) zeigen im Vergleich zu uninduzierten Zellen (Spur 1) deutlich die Synthese des Proteins. Die nach der Fermentermethode unter induzierten Bedingungen erhalten Zellen wurden aufgeschlossen und die löslichen Proteine (Spur 3) von den unlöslichen Bestandteilen abgetrennt. Hitzelabile E. coli Proteine wurden durch Anwendung eines Hitzeschrittes denaturiert und abgetrennt (Spur 6). Das im hitzestabilen Extrakt enthaltene N-His-TMBP (Spur 5) konnte durch Affinitätsreinigung an Ni-NTA-Superflow-Material hinreichend
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sauber erhalten werden (Spur 7). Bis zu weiteren Untersuchungen fand die Lagerung bei 4°C statt. Die Ausbeuten dieser Reinigungen betrugen ungefähr 100 mg N-His-MalE aus 100 g induzierten Zellen.
Durch Bindetest mit sowohl radioaktiver Trehalose als auch Maltose wurde die Bindung dieser beiden Zucker untersucht. Die durchgeführte Modifizierung des N-terminalen Bereichs zeigte dabei keine Veränderung der Substrataffinität (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 13: Reinigung von N-His-TMBP
Alle Proben der einzelnen Expressions- und Reinigungsschritte wurden durch SDS-PAGE analysiert und Commassie gefärbt.
1) uninduzierte Zellen, 2) induzierte Zellen, 3) lösliche Proteine nach Aufschluss der Zellen (French Press) und 4) unlösliche Bestandteile, 5) Überstand nach Hitzeschritt und 6) Pellet, 7) Eluat der Ni-NTA-Chromatographie, 8) Proteinstandard mit angegebenen Molekulargewichten in kDa.
1.3 Reinigung des Wildtyp TMBP aus T. litoralis Membranen
Es wird angenommen, daß das TMBP in T. litoralis als Lipoprotein in der Zellmembran verankert vorliegt (Horlacher et al., 1998). Allerdings konnte für die Existenz eines solchen Lipidankers bisher kein Beweis erbracht werden. Aus diesem Grund sollte das Membran verankerte Bindeprotein gereinigt und durch der Arbeitsgruppe Pryzibilski (Universität Konstanz) zur Analyse des Lipidankers mittels Massenspektrometrie übergeben werden.
Anfangs wurde versucht, das in der Membran verankerte TMBP, wie von Horlacher et al.
(1998) beschrieben, zu reinigen. Diese Reinigungsmethode erwies sich jedoch als nicht reproduzierbar. Durch eine für Glycoproteine spezifischen Färbemethode stellte sich heraus, daß das TMBP glykosyliert vorliegt (Abb. 14 B). Aufgrund dieser Tatsache wurde eine neu Reinigungsmethode etabliert. Die Reinigung des Wildtyp Bindeproteins erfolgte aus T. litoralis (DSM 5473) Membranen (Abb. 14 A). Diese wurden aus dem Labor von Helena Santos (Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa) bereits nach der beschriebenen Methode (Xavier et al., 1996) erhalten. Nach Solubilisierung der Membranen (Spur 1) fand als erster Reinigungsschritt eine
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Affinitätschromatographie an ConA-Sepharose statt. Gebundenes TMBP und andere glycosylierte Membranproteine konnten durch Methyl-D-Mannopyranosid von der Säule eluiert werden (Spur 2). Die Endreinigung fand durch Anionenaustausch-Chromatographie statt. Das TMBP wurde unter diesen Bedingungen vollständig im Durchlauf wiedergefunden (Spur 3). Die Ausbeute betrug bei dieser Reinigung ungefähr 20 mg TMBP aus ca. 20 g des Membranpellets.
Abbildung 14: Reinigung des Wildtyp Trehalose/Maltose-Bindeprotein aus T. litoralis Membranen. Alle Proben der einzelnen Reinigungschritte wurden durch SDS-PAGE analysiert. A) Coomassie gefärbt, B) Glycoprotein spezifische Färbung.
1) Membranextrakt, 2) Eluat der Affinitätschromatographie an ConA-Sepharose, 3) Durchlauf der Anionenaustausch-Chromatographie, 4) Proteinstandard mit folgenden Molekulargewichten von oben nach unten in kDa: 103, 76, 49, 33, 28, 20, 5) Sojabohnen Trypsininhibitor als negativ Kontrolle und 6) Meerrettich Peroxidase als positiv Kontrolle für den „Glycostain“.
Die Reinigung wurde zusätzlich durch Bindetests der jeweiligen Fraktionen der einzelnen Reinigungsstufen verfolgt (Daten nicht gezeigt). Durch Western Blot mit TMBP spezifischen Antikörpern konnte das gereinigte Protein als TMBP verifiziert werden (Daten nicht gezeigt). Darüberhinaus konnte es ebenfalls durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Dazu wurde die aus einem SDS-PAGE ausgeschnittene Protein-Bande tryptisch verdaut, die Peptide aus dem Gelstück eluiert und eines der erhaltenen Peptide sequenziert. Die Analyse fand an einem QSTAR NanoESI/Q/TOF Massenspektrometer statt und wurde von Herrn Wolfgang Rist (Universität Freiburg, AG Bukau) durchgeführt. Die dabei erhaltene Sequenz, IVFAVGGAPNEIEYWK, stimmt identisch mit der Sequenz der Aminosäurepositionen 49-64 des unprozessierten Proteins überein (Daten nicht gezeigt).
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Während der Reinigung des Wildtyp TMBP wurde, neben der Glykosylierung, ein weiters interessantes Verhalten des Proteins entdeckt. Wie in Abbildung 15 zu erkennen ist, hat die Anwendung des Erhitzens des Proteins in SDS-PAGE-Auftragspuffer Einfluß auf das Laufverhalten in der SDS-PAGE. In Spur 1 kann deutlich ein heterogenes Bandenmuster des nicht erhitzten gereinigtes Wildtyp TMBP erkannt werden. Die Anwendung des Denaturierungsschrittes zeigt (Spur 2), daß dadurch das uneinheitliche Laufverhalten, des wahrscheinlich nur partiell denaturierten TMBP, in eine einheitliche Proteinform überführt wird. Im Gegensatz dazu zeigt das heterolog in E. coli expremierte und gereinigte N-His-TMBP (Spur 3) keine Veränderung des Laufverhaltens im Hinblick auf einen durchgeführten Denaturierungsschrittes (Daten nicht gezeigt). Ein Erklärung des beim Wildtyp TMBP beobachteten Sachverhaltes könnte der vermutete Lipidanteil darstellen. Zur Klärung dieser Frage wurde sowohl das N-His-TMBP, als auch das Wildtyp TMBP an Andreas Seidl (AG Pryzibilski, Uni Konstanz) zur Analyse übergeben.
Abbildung 15: Einfluß des Erhitzens des Wildtyp TMBP in SDS-PAGE-Auftragspuffer auf das Laufverhalten in der SDS-PAGE.
1) gereinigtes Wildtyp TMBP nicht erhitzt und 2) wie Spur 1 jedoch vor der SDS-PAGE 10 min in Probenpuffer bei 95°C erhitzt, 3) gereinigtes N-His-TMBP (nicht erhitzt); Proteinstandard mit angegebenen Molekulargewichten in kDa.
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2 Die ABC-Domäne MalK des Trehalose/MaltoseTransportsystems von T. litoralis
In dem bisher bekanntem MalEFG-Sequenzabschnitt konnte keine, der zur Energetisierung des Transports benötigte, ABC-Domäne identifiziert werden (Horlacher et al., 1998). Im Zuge eines Sequenzierprojekts des zu T. litoralis nahe Verwandten Organismus P. furiosus, (DiRuggiero et al., 2000) wurden, durch Vergleich mit dem E. coli malK, zwei dazu hoch homologe Gene in dessen Genom gefunden. Überraschenderweise stellte sich bei genauerem Vergleich des T. litoralis malEFG-Sequenzabschnitts mit dem Sequenzbereich stromaufwärts des m a l K-Homologes mit der höchsten Aminosäureidentität heraus, daß diese identisch waren. Aufgrund dieser Erkenntnis wurde vermutet, daß auch in T. litoralis dieses malK-Gen existieren müßte. Es wurden deshalb versucht, mit Primern zu diesem P. furiosus malK-Gen, das entsprechende T.
litoralis Gen von chromosomaler T. litoralis DNA zu amplifizieren.