Die regulatorische Domäne von MalK

Einer der Hauptunterschiede von HisP und MalK ist darin zu sehen, daß der im T. litoralis MalK vorhandene C-terminale Bereich im HisP nicht vorhanden ist. Ein Strukturalignment zusammen mit der bislang nicht gelösten Struktur des MalK-Proteins aus E. coli ist in Abbildung 41 dargestellt. Festzustellen ist, daß alle Sekundärstrukturelemente der ATPase-Domäne in den drei Proteine wiedergefunden werden konnte.

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Die Kristallstruktur bietet außerdem eine Erklärung der durch Insertionsmutanten im E.

coli MalK ermittelten Phänotypen (Lippincott et al., 1997). Alle Insertionen die im C-terminalen Bereich des Proteins ermittelt wurden (ab Aminosäureposition 275 in Abb. 41) führten dabei zum Verlust der Regulation durch MalK, während der Transport davon unbeeinflußt blieb. Insertionen im N-terminalen Bereich (ATPase-Domäne) zeigten im Gegensatz dazu einen Transport negativen Phänotyp.

Die Aminosäuresequenz des C-terminalen Bereich der beiden MalK-Proteine ist, wie bereits beschrieben, wenig konserviert (Abb. 17). Bei Betrachtung des Strukturalignments kann dies größtenteils bestätigt werden (Abb. 41). Eine Ausnahme bildet dabei der Bereich der die Verknüpfung der beiden Domänen darstellt, sowie für ein weitere zwischen den Faltblattstrukuren 15 und 16. Die C-terminale Domäne des T. litoralis MalK-Proteins, könnte wie seinem Homolog aus E. coli, eine regulatorische Funktion zugeordnet werden. Solche regulatorischen Einflüsse von MalK konnten jedoch bislang für T. litoralis nicht nachgewiesen werden. Die Existenz dieser C-terminalen Verlängerung im archaeellen Protein, welche evolutionär konserviert ist (Cluster 26 in Saurin et al., 1999), weist auf eine offenbar wichtige, vom Transport unabhängige Funktion hin.

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Abbildung 41: Strukturalignment von HisP aus S. typhimurium, dem E. coli MalK und dem T.

litoralis MalK. (Entnommen aus Diederichs et al., 2000)

Die Sekundärstrukturelemente des T. litoralis MalK-Proteins sind eingezeichnet und nummeriert.

Bereiche, die in allen drei Sequenzen konserviert sind wurden gelb, jenen die nur in den beiden MalK-Proteinen vorhanden sind blau dargestellt.

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4 Charakterisierung des Maltose/Trehalose-Transportkomplex

Im Rahmen dieser Arbeit sollte als nächster Schritt der gesamte Transportkomplex von T.

litoralis, der aus den beiden Membranproteinen MalF und MalG sowie der Transport-ATPase MalK aufgebaut ist, heterolog in E. coli überexprimiert, gereinigt und charakterisiert werden.

Die Expression von Membranproteinen ist im allgemeinen nur bedingt möglich (Grisshammer et al., 1995). Viele Membranproteine sind Bestandteil eines Proteinkomplexes mit weiteren Komponenten, deren Fehlen die Expression der Membrankomponenten erschwert. Dies ist auch für das Maltose-System von E. coli bekannt. Die Autoren fanden wenig MalF, wenn MalF alleine oder zusammen mit MalG exprimiert wurden (Panagiotidis et al., 1993). Expression von MalF zusammen mit MalK oder MalK und MalG zeigten ein starkes MalF-Signal. Viel MalG war dagegen nur sichtbar, wenn es zusammen mit den anderen Komponenten des Transporters exprimiert wurde. Alle anderen Kombinationen zeigten kein oder nur ein sehr schwaches Signal.

Frühere Versuche die Membranproteine des Transporters aus T. litoralis, MalF und MalG, einzeln oder zusammen zu überexprimieren scheiterten (Gotterman, 1997). Ein möglicher Grund könnte die nicht durchführbare Koexpression der Transport-ATPase MalK sein.

Die Sequenz von malK war zu diesem Zeitpunkt noch nicht bekannt.

4.1 Expression und Reinigung des Transportkomplexes

Zur Überexpression des Transportkomplexes wurden zwei Plasmide konstruiert, die zur Koexpression dieser drei Proteine benutzt wurden. Zur Reinigung dieses Komplexes diente ein His-Tag an einem der Membranproteine. Dazu wurden Plasmide konstruiert, welche die Expression von N-His-MalF, MalG sowie MalK ermöglichte. Es wurden verschiedenste Expressions- und Reinigungsbedingungen getestet. Wie in Abbildung 32 ersichtlich, wird unter den verwendeten Expressionbedingungen zumindest das N-His-MalF-Protein nahezu vollständig in die E. coli-Membran eingebaut. Die Reinigung e r f o l g t e n a c h Solubilisierung der Membranproteine mittels eines Hitzedenaturierungsschrittes sowie zweier chromatographischer Reinigungsstufen.

Letztlich konnte ein Reinigungsprotokoll etabliert werden, durch das der Transportkomplex nahezu sauber erhalten wurde (Abb. 32). Alle drei Banden konnten als die entsprechenden Proteine bestätigt werden.

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4.2 Biochemische Charakterisierung des Transportkomplexes

Zur biochemischen Charakterisierung des Trehalose/Maltose Transporters von T. litoralis wurde der heterolog in E. coli exprimierte und gereinigte Komplex (MalFGK) verwendet.

Ziel dieser Untersuchungen war zum einen der Vergleich mit dem mesophilen Gegenstück aus E. coli und zum anderen sollten aus diesen in vitro Daten auf die in vivo Funktion Rückschlüsse gezogen werden.

Als Maß für die Funktionalität des Transportsystems wurde die ATPase-Aktivität der ABC Domäne verwendet. Dabei konnte ein Temperaturoptimum bei 70°C ermittelt werden. Bei Raumtemperatur konnte, wie bereits bei der Charakterisierung der ABC-Untereinheit MalK, nahezu keine Aktivität gemessen werden. Bei höheren Temperaturen kam es zu einem rapiden Abfall der enzymatische Aktivität (Abb. 34). Bei 80°C konnten nur etwa 40% der bei 70°C ermittelten Aktivität bestimmt werden. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der löslichen Untereinheit MalK, die bei dieser Temperatur ihr Optimum aufzeigte. Als optimaler pH-Wert konnte ein Wert von 7,0 gemessen werden (Abb. 35).

Bei der Bestimmung der kinetischen Daten von MalFGK wurde für die ATPase-Aktivität eine Km von 0,162 mM und eine Vm a x 0,220 µmol/min/mg Protein ermittelt. Eine Beeinflussung der ATPase-Aktivität von MalFGK wurde im Hinblick auf Sensitivität gegenüber Vanadat, einem Inhibitoren von F-, P-, und V-Typ ATPasen untersucht. Dabei konnte eine solcher Einfluß jedoch nicht ermittelt werden.

Für den Transportkomplex MalFGK2 von E. coli wurde ATPase-Aktivität sowohl in Membranvesikel als auch in rekonstituierten Liposomen nachgewiesen (Davidson et al., 1990; Davidson et al., 1991). In Anwesenheit von substratbeladenem Bindeprotein konnte eine wesentliche Steigerung der Aktivität gezeigt werden (Davidson et al., 1992). Dieses Verhalten konnte auch für den in Detergenz vorliegenden Transportkomplex nachgewiesen werden (Reich-Slotky et al., 2000). Deshalb stellte sich die Frage, ob in dem hier beschriebenen hyperthermophilen ABC-Transporter ebenfalls durch Zugabe des substratbeladenen Bindeproteins eine Stimulierung der ATPase-Aktivität zu ermitteln war. Wie jedoch festgestellt werden konnte, führten weder das rekombinante TMBP (N-His-TMBP) noch das aus T. litoralis Membranen gereinigte native TMBP zu einer signifikanten Erhöhung der ATPase-Aktivität.

Als einfachste Erklärung dieses Sachverhaltes könnte eine prinzipielle

„Unverträglichkeit“ der verwendeten Detergenzien, mit den für die Aktivität des hyperthermophilen ABC-Transporter nötigen Temperaturen sein. Wichtig ist jedoch auch, daß im Gegensatz zum periplasmatischen MBP von E. coli, TMBP von T. litoralis in der Membran verankert vorliegt. Möglicherweise führt erst diese Verankerung des

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Bindeproteins in Kontakt zu den Membrankomponenten zu einem stimulierenden Effekt.

Der Membranaufbau der Archaea unterscheidet sich von dem der Bakterien erheblich. In den thermophilen Archaea ersetzen die temperaturstabileren Glycerinether-Lipide (Di-und Tetraether) die in Bakterien gef(Di-undenen Glycerinester-Lipide (Di-und bilden dabei einen Monolayer aus (Kates et al., 1993). Denkbar wäre deshalb auch, daß die Membranproteine MalF und MalG eine in Detergenz „erzwungene“ Konformation einnehmen, welche die Weitergabe der durch das beladenen Bindeprotein vermittelte Information an die ABC-Domäne verhindert.

Um das in dieser Arbeit untersuchte Transportsystem weitergehend zu charakterisieren, könnte eine Rekonstitution des gereinigten MalFGK-Komplexes in Liposomen wichtige Erkenntnisse im Hinblick auf die Funktionsweise dieses Transportsysteme liefern. Ein funktionsfähiger Einbau bakterieller ABC-Transporter in Liposomen wurde bereits mehrfach beschrieben (Bishop et al., 1989; Davidson und Nikaido, 1990; Davidson und Nikaido, 1991; Liu und Ames, 1997; Liu und Ames, 1998; Reich-Slotky et al., 2000), allerdings bisher nur aus solchen von Gram-negativen Bakterien.

Obwohl die Funktion von ABC-Transportern, speziell derer in Gram negativen Bakterien, bereits gut untersucht ist, bleibt der Mechanismus des Transports bisher unverstanden.

Deshalb ist die Aufklärung der Raumstruktur solcher Systeme unerläßlich. Dies ist bisher weder für den Maltosetransportkomplex von E. coli noch für einen anderen ABC-Transporter gelungen. Man geht davon aus, daß der bisherige Mißerfolg der Strukturaufklärung dieser wichtigen Klasse von Transportsystemen durch die inhärente Eigenschaft von membrangebundenen Transportproteinen bedingt ist, eine bei der physiologischen Arbeitstemperatur notwendige Flexibilität ihrer Proteinstruktur aufzuweisen. Der in dieser Arbeit untersuchte Trehalose/Maltose-ABC-Transporter funktioniert erst bei einer Temperatur von 80°C optimal. Die Struktur des Transporters sollte deshalb bei Raumtemperatur gewissermaßen „eingefroren“ und daher einer Kristallisation zugänglich sein. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Überexpressions-und Reinigungsmethoden bieten einen guten Ausgangspunkt um damit die dreidimensionale Struktur dieser wichtigen Klasse von Transportsystemen zu erhalten.

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5 Regulation der am Trehalose/Maltose Stoffwechsel beteiligten Gene