Biochemische Charakterisierung des Transportkomplexes

Zur biochemischen Charakterisierung des Trehalose/Maltose Transporters von T. litoralis wurde der heterolog in E. coli expremierte und gereinigte Komplex (MalFGK) verwendet.

Ziel dieser Untersuchungen war zu der Vergleich mit dem mesophilen Gegenstück aus E.

coli. Als Maß für die Funktionalität des Transporters wurde die ATPase-Aktivität der membranassoziierten ABC-Domäne verwendet.

3.7.1 Temperaturabhängigkeit der ATPase-Aktivität des Tranportkomplexes

Der Temperatureinfluß auf die enzymatische Aktivität wurde zwischen 60 und 90°C untersucht (Abbildung 34). Dabei konnte ein Temperaturoptimum bei 70°C ermittelt werden. Bei Raumtemperatur (25°C) konnte wie bereits bei der Charakterisierung der ABC-Untereinheit der nahezu keine Aktivität gemessen werden. Bei höheren Temperaturen kam es zu einem rapiden Abfall der enzymatische Aktivität. Bei 80°C konnten nur etwa 40% der Vergleichsaktivität ermittelt werden. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der löslichen Untereinheit MalK, die bei dieser Temperatur ihr Optimum aufzeigte. Dafür können verschiedene Erklärungen aufgeführt werden. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde keine systematische Untersuchung der Verhaltens von Detergenzien wie z.B. DDM bei solchen Temperaturen durchgeführt. Deshalb ist nicht auszuschließen, daß das Detergenz für dieses Ergebnis verantwortlich ist. Aus diesem Grund sollte neben DDM noch ein weiteres Detergenz getestet werden. Dazu wurde der, wie unter 3.4 beschriebene gereinigte Komplex, erneut an Ni-NTA-Material gebunden.

Durch Waschen mit Puffer welcher anstelle von DDM das Detergenz Thesit enthielt fand ein Austausch der Seife statt. Thesit weist laut Literatur einen Wolkenpunkt von 79°C auf (Helenius und Simons, 1975). Der Wolkenpunkt ist dabei diejenige Temperatur, bei der

IV Ergebnisse 96

die Seife in wäßriger Lösung ausfällt. Mit dem so erhaltenen Komplex wurde nachfolgend die oben beschriebene Bestimmung der Temperaturabhängigkeit durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß auch bei Verwendung von Thesit als Detergenz das Temperaturoptimum bei 70°C lag. Allerdings konnte dabei im Vergleich zu DDM höhere ATPase-Aktivitäten ermittelt werden.

Abbildung 34: Temperaturabhängigkeit der ATPase-Aktivität von MalFGK.

Jeweils 10 µg des Transportkomplexes wurde mit ATPase-Puffer gemischt, die Reaktion durch Zugabe von 1 mM ATP gestartet und der Testansatz für 15 min bei der jeweiligen Temperatur inkubiert.

Da gereinigtes MalK ebenfalls ATPase-Aktivität zeigt, könnte die hier für den gereinigten Komplex bestimmt Aktivität allerdings auch auf der Aktivität der von den Membrankomponenten dissoziierten ABC-Domäne beruhen. Allerdings wurde durch den erfolgreichen Austausch der Detergenz gezeigt werden, daß zumindest unter den hier verwendeten Bedingungen der Transportkomplex assoziiert vorliegt. Dies konnte ebenfalls durch eine durchgeführte Größensäulen-Chromatographie bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).

3.7.2 Einfluß des pH-Werts auf die ATPase-Aktivität von MalFGK

Zur Ermittlung der pH-Abhängigkeit der ATPase wurden die Versuche in Puffer unterschiedlicher pH-Werte durchgeführt. Als Bereich wurde eine Bereich von pH 5,0 bis pH 8,0 gewählt. Dabei konnte ein optimaler pH-Wert von 7,0 ermittelt werden (Abb. 35).

IV Ergebnisse 97

Abbildung 35: Einfluß des pH-Wertes auf die ATPase-Aktivität von MalFGK.

Die Aktivität wurde von pH 5,0 bis pH 8,0 in ATPase-Puffer mit 50 mM Tris-HCl unter den ansonsten beschriebenen Standardbedingungen bestimmt.

3.7.3 Bestimmung der kinetischen Parameter von MalFGK

Zur Bestimmung der kinetischen Daten von MalFGK wurden die ATPase-Aktivität bei unterschiedlichen Konzentrationen an ATP durchgeführt. Die Konzentrationen wurden dabei im Bereich von 0,05 bis 2 mM des Substrats gewählt (Abb. 36 A). Die Substrataffinität (Km) und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) wurde aus dem reziproken Auftrag nach Linewaver und Burk ermittelt (Abb. 36 B). Die Km des Komplexes betrug 0,162 mM und die Vmax 0,220 µmol/min/mg Protein (Komplex) oder 0,392 µmol/min/mg MalK2 (unter der Annahme, von jeweils 2 MalK-Moleküle pro Komplex) .

IV Ergebnisse 98

Abbildung 36: Bestimmung der kinetischen Parameter von MalFGK.

A) Michelis-Menten Darstellung.

Die Messungen fanden mit unterschiedlichen ATP-Konzentrationen unter Standardbedingungen bei 70°C statt.

B) Lineweaver-Burk-Blot zur Ermittlung der kinetischen Parameter.

Zur Ermittlung der kinetischen Parameter wurde die spezifische Aktivität gegen die Substratkonzentration reziprok aufgetragen. Die Substratabhängigkeit der ATPase-Aktivität ließ sich dann als Gleichung der Ausgleichsgeraden beschreiben. Aus der Geradengleichung konnten nach Lineweaver und Burk die Substrataffinität (Km) und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) berechnet werden.

3.7.4 Einfluß von Vanadat auf die Aktivität von MalFGK

Die ATPase-Aktivität von MalFGK wurde im Hinblick auf Sensitivität gegenüber Vanadat, einem Inhibitoren von F-, P-, und V-Typ ATPasen (Pedersen, 1987), untersucht.

Dabei wurde der Transportkomplex mit steigenden Konzentrationen des Inhibitors 15 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Durch Zusatz von 1 mM ATP wurde der Test jeweils gestartet. Die Aktivität wurde selbst durch 10 mM Vanadat nicht beeinflußt (Daten nicht gezeigt).

3.7.5 Stimulierung der ATPase-Aktivität durch TMBP

Im folgenden sollte der stimulierende Effekt des TMBP auf die ATPase-Aktivität des gereinigten Transportkomplexes MalFGK untersucht werden. Verwendet wurde dazu sowohl N-His-TMBP als auch Wildtyp TMBP. Die Bindeproteine wurden durch Inkubation bei 80°C für 10 min in Puffer mit 100 mM Maltose oder Trehalose mit dem jeweiligen Substrat beladen und in steigenden Konzentrationen dem Reaktionsansatz zugegeben. Als Ergebnis konnte festgestellt werden, daß selbst die Zugabe von 5 mg/mL des jeweiligen Bindproteins keinen Einfluß auf die ATPase-Aktivität hatte. Ebenso konnte keine Veränderung der Aktivität durch Maltose oder Trehalose im Reaktionsansatz beobachtet werden.

V Diskussion 99

V Diskussion

Eine der in den letzten Jahren zunehmend untersuchte Transportfamilie ist die Klasse der sogenannten ABC (ATP binding cassette)-Transporter (Higgins et al., 1992; Boos und Lucht, 1996; Boos und Eppler, 2001). Bei der Proteinfamilie der ABC-Transporter handelt es sich um eine weit verbreitete paraloge Proteingruppe. Innerhalb zahlreicher Lebensformen, vom Bakterium über Pilze bis zum Menschen, übernimmt diese Familie den Transport einer Vielzahl unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen (Higgins et al., 1992). Die stetig wachsende Klasse der ABC-Transporter hat besonders aufgrund der Tatsache, daß einige Vertreter beim Menschen von medizinischer Bedeutung sind, wissenschaftliche Aufmerksamkeit erlangt.

ABC-Transporter zeichnen sich alle durch einen typischen Aufbau, bestehend aus vier Domänen, aus. Zwei dieser Domänen sind integrale Membranproteine, die den Transportkanal bilden. Die beiden anderen Domänen sind hydrophil und liegen an der cytoplasmatischen Seite der Membran. Sie besitzen je eine Nukleotidbindestelle, welche zur Energetisierung des Transportprozesses benötigt wird (Higgins et al., 1992).

Zusätzlich zu den vier Domänen können weitere vorhanden sein, wie z.B. bei dem Maltosetransporter MalFGK2 aus E. coli mit dem periplasmatischem Bindeprotein MalE (Shuman et al., 1982). Bindeproteine sind hochaffin für ihr Substrat und dienen als

„Fänger“ für die in der Umgebung von Bakterien normalerweise nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhandenen Substratmoleküle. Diese Bindeprotein abhängigen ABC-Transportsysteme wurden ursprünglich in Gram-negativen Bakterien, später auch in Gram-positiven (Gilson et al., 1998) entdeckt. Auch in thermophilen Bakterien (Sahm et al., 1996 Herrman et al., 1996; Jones et al., 2000; Wassenberg et al., 2000) und Archaea (Xavier et al., 1996; Albers et al., 1999; Wanner et al., 1999) wurden sie kürzlich gefunden.

Das hyperthermophile Archaeon Thermococcus litoralis transportiert die beiden Disaccharide Trehalose und Maltose durch den selben Transportkomplex aus dem Medium in das Zellinnere. Dieser erste in der Gruppe der Archaea entdeckte ABC-Transporter (Xavier et al., 1996; Horlacher et al., 1998) konnte in dieser Arbeit näher charakterisiert werden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse werden im folgenden mit den Informationen bereits bekannter bakterieller Bindeprotein abhängiger ABC-Transportern verglichen.

V Diskussion 100

1 Das Trehalose/Maltose Bindeprotein TMBP

Ein Charakteristikum aller prokaryotischen ABC-Importsysteme ist das Vorhandensein von hochaffinen Bindeproteinen. Die Substraterkennung der Transporter erfolgt über diese Proteinklasse. Bindeproteine liegen dabei immer außerhalb der Cytoplasmamembran vor. Eine der Aufgabenstellungen dieser Arbeit war es, zusätzlich zu den bereits bekannten Informationen (Horlacher et al., 1998) Gemeinsamkeiten und Unterschiede des archaeellen Trehalose/Maltose-Bindeproteins TMBP mit dem seines bakteriellen Homologs, dem Maltose/Maltodextrin-Bindeprotein MBP aufzudecken.