Temperaturabhängigkeit der Substratassoziation und –dissoziation

Der Transport von Trehalose und Maltose durch T. litoralis weist eine starke Temperaturabhängigkeit auf, wobei das Optimum bei 80°C liegt (Xavier et al., 1996).

Entsprechende Resultate wurden für das isolierte TMBP erhalten, wobei eine Kd von 0,16 µM ermittelt wurde (Horlacher et al., 1998).

Um die Assoziation und Dissoziation des Substrates näher zu untersuchen, fand im Rahmen dieser Arbeit, nach erfolgter Reinigung eine Denaturierung und anschließende Rückfaltung des N-His-TMBP statt. Ziel war die Entfernung von möglicherweise gebundenen Substraten (Trehalose, Maltose). Die kinetischen Untersuchungen mittels Fluoreszenzspektroskopie wurden von Renate Riek (AG Boos, Universität Konstanz) durchgeführt. Der Hintergrund dieser Versuchsdurchführung liegt in der Erkenntnis, daß die Bindung von Maltose durch TMBP eine Erhöhung der Fluoreszenz bewirkt, während die Bindung von Trehalose zu einer Erniedrigung der Fluoreszenz führt (Horlacher et al., 1998). Die hierbei gewonnen Daten zeigen, daß TMBP im Temperaturbereich von 15 bis 80°C eine gleichbleibend schnelle Bindungsgeschwindigkeit aufweist. Im Gegensatz dazu erfolgt die Dissoziation des Substrates bei niedrigen Temperaturen stark verlangsamt.

Diese verlangsamte Freigabe des Substrates kann durch eine geringere Öffnungsgeschwindigkeit unter diesen Bedingungen erklärt werden (Diez et al., 2001).

1.2 Dreidimensionale Struktur das Trehalose/Maltose-Bindeproteins aus T. litoralis Aus den Raumstrukturen der bereits bekannten Bindeproteine konnten mehrere Gemeinsamkeiten ermittelt werden (Argos et al., 1981; Quiocho et al., 1990; Mowbary et al., 1992; Quiocho et al., 1986; Spurlino et al., 1991; Vyas et al., 1991; Yao et al., 1994).

Allgemein handelt es sich um monomere Proteine mit zwei getrennten globulären Domänen, dem „N-lobe“ und dem „C-lobe“. Diese Bezeichnung wurde aufgrund ihrer Lokalisierung in der Polypeptidkette gewählt. Trotz der sehr unterschiedlichen Aminosäuresequenzen welche diese Domänen bilden, weisen beide ähnliche Sekundärstrukturen auf. Diese Domänen sind üblicherweise über einen Bereich von zwei bis drei Polypeptidketten verbunden, welcher als Scharnier fungiert.

V Diskussion 103

Die beiden „lobes“ weisen jeweils eine zentrale, meist sechs- bis siebensträngige β−Faltblattstruktur auf, welche von zwei bis drei α-Helices umgeben wird. Zwischen diesen beiden Domänen wird eine „Furche“ gebildet, welche die Substratbindestelle darstellt.

Das Maltose-Bindeprotein (MBP) von E. coli wurde besonders intensiv untersucht. Dabei wiesen sowohl Struktuanalysen (Spurlino et al., 1991; Spurlino et al., 1992; Sharff et al., 1992; Rodseth et al., 1993; Sharff et al., 1993; Shilton et al., 1996; Shilton et al., 1996; Hall et al., 1997; Quiocho et al., 1997) als auch kinetische Analysen (Thomson et al., 1998; Döring et al., 1999) auf eine substratinduzierte Konformationsänderungen hin. Die „lobes“ bewegen sich dabei um einen Winkel von 35° mit einer seitlichen Drehung von 8° an der

„Scharnier“-Region aufeinander zu (Sharff et al., 1992). Hierdurch kommt es zum Umschließen des Substrates und zu dessen räumlicher Abtrennung vom Lösungsmittel.

Aufgrund dieser kinetischen Untersuchungen sowie der Kristallstruktur einer substratfreien geschlossenen Form des Glucose/Galaktose-Bindeproteins (Flocco und Mowbray, 1994), wurde ein Modell aufgestellt. Dieses besagt, daß ein dynamisches Gleichgewicht zwischen der substratfreien offenen und der geschlossenen Form der Bindeproteine existiert. Die Substratbindung führt zur Stabilisierung dieser geschlossene Form, wodurch die Bewegung der beiden „lobes“ stark reduziert wird. Diese Form des MBP wird vermutlich von den integralen Cytoplasmamembranproteinen MalF und MalG erkannt, an welche MBP das Substrat für den Transportvorgang ins Cytoplasma überträgt (Davidson et al., 1992). Dabei bindet wahrscheinlich der N-terminale „lobe“ an MalG und der C-terminale „lobe“ an MalF (Hor und Shuman, 1993).

Um eine dreidimensionale Struktur des Trehalose/Maltose-Bindeproteins (TMBP) zu ermitteln, sollte für eine Röntgenstrukturanalyse ausreichend Protein zur Verfügung gestellt werden. Diese Tertiärstrukturbestimmung wurde von der AG Welte (Universität Konstanz) durchgeführt. Für die Strukturanalyse wurde ein TMBP-Derivat verwendet, bei dem die TMBP-Signalsequenz durch die des MBP von E. coli ersetzt war. Dieses Protein wurde in E. coli überexprimiert und gereinigt. Damit konnten erste Proteinkristalle erhalten werden, die jedoch nicht zu reproduzieren waren (persönliche Mitteilung von Joachim Diez, AG Welte, Universität Konstanz). Mittels der Modifizierung des letzten chromatographischen Reinigungschrittes durch Joachim Diez, lies sich dieses Problem beseitigen und die Struktur konnte damit gelöst werden (Diez et al., 2001).

Die Struktur von TMBP weist dabei die oben beschriebenen Faltungsmuster auf (Abb. 37).

Das Scharnier wird dabei durch die „loops“ zwischen β4 und β5, β11 und β12 sowie zwischen α14 und α15 gebildet. Die „Furche“, also die Substratbindestelle, ist wie auch bei den anderen Vertretern dieser Klasse von Proteinen zwischen den beiden „lobes“ zu finden. Wie in Abbildung 37 dargestellt, konnte aufgrund der Elektronendichte als

V Diskussion 104

gebundenes Substrat α,α-Trehalose identifiziert werden. Bei einem Vergleich mit bereits bekannten Strukturen von Zucker-Bindeproteinen (Quiocho et al., 1977; Newcomer et al., 1981; Mowbray et al., 1983; Spurlino et al., 1991; Spurlino et al., 1992; Mowbray et al., 1992;

Dutzler et al., 1996; Chaudhuri et al., 1999) zeigte TMBP die höchste Homologie zum MBP von E. coli. Ein Strukturalignment der beiden Proteine (Abb. 39) zeigt, daß die Abfolge der Sekundärstrukturmotive trotz der niedrige Aminosäureidentität (28%) nahezu übereinstimmend sind. Deshalb wurden die Strukturen des mit Trehalose „beladenen“

TMBP mit dem des Maltose „beladenen“ MBP verglichen.

Abbildung 37: Dreidimensionale Struktur von TMBP

Schematische Darstellung der dreidimensionalen Struktur von TMBP mit gebundener α,α-Trehalose. Die beiden Domänen („lobes“), N- und C-terminal, sind gelb bzw. blau dargestellt. Die gebundene Trehalose ist schwarz eingezeichnet. Die Nummerierung der α-Helices und der β-Faltblätter erfolgte gemäß Abbildung 38. (Entnommen aus Diez et al., 2001)

V Diskussion 105

Abbildung 38: Strukturalignment von TMBP und MBP.

α-Helices sind als Rechtecke und β-Faltblätter als Pfeile dargestellt. Konservierte Regionen sind gelb unterlegt gekennzeichnet. (Entnommen aus Diez et al., 2001).

V Diskussion 106

Die Substratbindung erfolgt bei TMBP entsprechend den bereits beschriebenen Zucker-Bindeproteinen (Q u i o c h o et al., 1996). Diese Bindung wird dabei durch Wasserstoffbrücken-Bindungen und van-der-Waals-Kräfte zwischen dem Zucker und dem Protein ermöglicht. Festgestellt werden kann, daß die Bindung der beiden Glykosyl-Reste der Trehalose durch unterschiedlich viele Wasserstoff-Brücken erfolgt, 14 für Glykosylrest 1 (Glc 1) und 10 für Glc 2. Im Vergleich zum MBP-Maltose-Komplex (5 für Glc 1 und 9 für Glc 2) (Quiocho et al., 1996) wird der TMBP-Trehalose-Komplex also durch eine höhere Anzahl an Bindungen (24 Wasserstoffbrücken-Bindungen) gebildet. Deshalb scheint die Substratbindestelle eine höhere Polarität aufzuweisen.

Der Glykosyl-Rest 1 (Glc 1) der im TMBP gebundenen Trehalose konnte exakt dem Glc 1 der im MBP gebunden Maltose zugeordnet werden. Im Gegensatz dazu erfolgt die Bindung von Glc 2 der im TMBP gebundenen Trehalose im Vergleich zu dem im MBP gebundenen Glc 2 (der nicht reduzierende Glykosyl-Rest) unterschiedlich. Während Glc 2 der Maltose direkt im Zentrum des MBP gebunden ist, kann dieser Rest in der Trehalose näher an der Oberfläche des Proteins gefunden werden und bildet dabei einen van-der-Waals-Kontakt zum Tryptophanrest an der Aminosäureposition 295 aus. Dies könnte auch eine Erklärung der unterschiedlichen Änderungen der Fluoreszenz mit Maltose (zunehmend) und Trehalose (abnehmend) im TMBP darstellen.