Zytokine, Chemokine und Enzyme .1 Zytokine

Zytokine sind Proteine, die als Mediatoren von Zellen des Immunsystems und anderen Zellen

autokrine und endokrine Art und Weise ausüben zu können (BRÄNNSTRÖM u. NORMAN 1993). Inflammatorische Zytokine und Chemokine erhöhen z.B. die bakterizide Aktivität von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, fördern die Immigration von neutrophilen Granulozyten in infizierte Gewebe, induzieren die Reifung von dendritischen Zellen und kontrollieren die Antwort des erworbenen Immunsystems (SORDILLO et al. 1991).

Antiinflammatorische Zytokine hemmen die Synthese proinflammatorischer Zytokine und vermindern die Intensität der inflammatorischen Kaskade (TRACEY 2007). Im porcinen Ovar wurden in der vorliegenden Arbeit die pro-inflammatorischen Zytokine GM-CSF, IL-6 und TNF-α sowie die anti-inflammatorischen Zytokine TGF-β und IL-10 untersucht. Im Folgenden wird deren Bedeutung im Hinblick auf ihre Rolle im Ovar dargestellt.

Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)

GM-CSF wird durch immigrierende Leukozyten, Fibroblasten, wie auch Endothelzellen im Ovar gebildet (BRÄNNSTRÖM u. NORMAN 1993). GM-CSF stimuliert die Proliferation und Differenzierung von Makrophagen, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten und begünstigt bei reifen neutrophilen Granulozyten und Makrophagen die Synthese von Zytokinen wie IL-1, IL-6, G-CSF, M-CSF, PAF (HOLLÄNDER 2006).

Verschiedene Arbeitsgruppen konnten GM-CSF in Follikeln und Follikelflüssigkeit von Frauen nachweisen, wobei der größte Anteil an GM-CSF-mRNA und auch die stärkste Proteinsynthese in der Theca follicularis ermittelt wurde (ZHAO et al. 1995; JASPER et al.

1996). BRÄNNSTRÖM et al. (1994a) wiesen bei Ratten eine erhöhte GM-CSF-Syntheserate um den Ovulationszeitpunkt nach. Anhand von GM-CSF-knockout-Mäusen stellten JASPER et al. (2000) zwar eine ähnliche Ovulationsrate wie bei Wildtyp-Mäusen fest, allerdings war ihr Zyklus länger, die Steroidsynthese reduziert und die Anzahl aktivierter Makrophagen innerhalb des ovariellen Stromas und in der Theca follicularis zum Zeitpunkt der Ovulation vermindert. Die GM-CSF-Produktion von Mäusen wird nach ROBERTSON et al. (1996b) durch Gonadotropine und ovarielle Steroidhormone reguliert. Östradiol fördert die mRNA-Expression und Sekretion in uterinen Epithelzellen, wohingegen Progesteron einen hemmenden Effekt besitzt. Bei Ratten konnte GM-CSF in Gegenwart von IL-1β die Histaminfreisetzung von präovulatorischem ovariellen Gewebe induzieren (TAMURA u.

KOGO 1999).

Interleukin-6 (IL-6)

IL-6 wird von T-Lymphozyten, mononukleären Phagozyten, Fibroblasten, Mastzellen, Epithelzellen und Endothelzellen gebildet. Es handelt sich um ein endogenes Pyrogen, welches außerdem die Produktion von hepatischen Akut-Phase-Proteinen induziert (HOLLÄNDER 2006). IL-6-mRNA wurde in Ovarien von Mäusen nachgewiesen (MOTRO et al. 1990). BRÄNNSTRÖM et al. (1994a) konnten mithilfe eines Rattenovarperfusionsmodells die Bildung von IL-6 im Ovar messen, die allerdings keine zyklusbedingten Schwankungen zeigte. Eine mögliche ovulatorische Rolle von IL-6 liegt nach MARUO et al. (1992) in der Förderung der Gefäßpermeabilität. IL-6 reduziert außerdem die Proliferation von bovinen Granulosazellen in vitro und ist in die Regulation der Steroidsynthese und Sekretion involviert (ALPIZAR u. SPICER 1994).

Tumornekrosefaktor-α (TNF-α)

Lokalisationen und Funktionen von TNF-α im Ovar sind unter 2.2.2 beschrieben.

Transforming growth factor-β (TGF-β)

Das antiinflammatorische Zytokin TGF-β wird hauptsächlich von aktivierten T-Zellen, Monozyten und Makrophagen synthetisiert (HOLLÄNDER 2006). Es wird nach HUNTER (2003) sowohl in Theca - als auch in Granulosazellen des Ovars produziert und hemmt nach ROBERTS und SKINNER (1991) die Proliferation von Granulosa- und Thecazellen in bovinen Follikeln, steigert aber die Gonadotropin-vermittelte Steroidsynthese.

Interleukin-10 (IL-10)

IL-10 ist ein Zytokin, welches sowohl immunsuppressive als auch immunmodulatorische Eigenschaften besitzt und vor allem von TH2-polarisierten CD4⁺ und CD8⁺-T-Zellen gebildet wird, aber auch von Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen (HOLLÄNDER 2006).

Es konnten Konzentrationen von 0,7-10,8 pg/ml in humaner Follikelflüssigkeit gemessen werden. Es ergaben sich allerdings keine signifikanten Korrelationen zwischen Fruchtbarkeitsraten, Zellteilungsraten und follikulären IL-10-Konzentrationen (CERKIENE et al. 2008). IL-10 wurde außerdem in humanen Oozyten nachgewiesen (HUNTER 2003).

2.4.2.2 Chemokine

Bei Chemokinen handelt es sich um Moleküle mit chemotaktischer Aktivität. Sie regulieren die Migration der Leukozyten und beeinflussen die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren durch diese Zellen. Aufgrund der Anordnung von Cysteinen (C) in der Aminosäureabfolge des Moleküls werden die Chemokine in die vier Unterfamilien CXC , CC, C und CX3C eingeteilt (HOLLÄNDER 2006).

CXCL8

CXCL8 wird hauptsächlich von Monozyten und Makrophagen produziert (ZEILHOFER u.

SCHORR 2000) und ist an der Rekrutierung und Aktivierung neutrophiler Granulozyten sowie an der Zellproliferation und Angiogenese (RUNESSON et al. 2000) und auch am Ovulationsprozess beteiligt (BRÄNNSTRÖM u. ENSKOG 2002). UJIOKA et al. (1998) stellten eine Reduktion der Ovulationsrate durch blockierende CXCL8-spezifische Antikörper fest. Nach GOTO et al. (1997) scheint CXCL8 bei der Migration neutrophiler Granulozyten in Follikel zum Ovulationszeitpunkt eine Rolle zu spielen. So wurde bei Ratten ein dreifacher Anstieg an neutrophilen Granulozyten in der Medulla und ein achtfacher Anstieg in der Theca follicularis präovulatorischer Follikel zum Ovulationszeitpunkt nachgewiesen (BRÄNNSTRÖM et al. 1993). RUNESSON et al. (2000) konnten eine 5-10 fach höhere Konzentration an CXCL8 in der humanen Follikelflüssigkeit in der ovulatorischen Phase im Gegensatz zur follikulären Phase messen. In humaner Follikelflüssigkeit wurden CXCL8-Konzentrationen von 200 pg/ml festgestellt, im Serum dagegen 20 pg/ml (GOTO et al. 1997).

Vor allem Thecazellen, aber auch Granulosazellen sezernieren CXCL8 (RUNESSON et al.

2000). Die CXCL8-Produktion konnte in Granulosazellen durch FSH, in Theca- und Granulosazellen durch IL-1 verstärkt werden (RUNESSON et al. 2000). BUKULMEZ und ARICI (2000) wiesen einen Anstieg der CXCL8-mRNA-Kopien in ovariellen Stromazellen und Granulosa-Luteinzellen des Menschen nach hCG/LH-Gaben nach. GOTO et al. (1997) identifizierten im humanen Ovar CXCL8-produzierende Zellen hauptsächlich als Mastzellen.

2.4.2.3 Ausgewählte Enzyme des Arachidonsäurezyklus

Die Beteiligung von Prostaglandin-G/H-Synthasen (Cyclooxygenasen) und Lipoxygenasen am Ovulationsgeschehen wurde nachgewiesen (GAYTAN et al. 2006).

Prostaglandin-G/H-Synthase-2 (PTGS2)

Prostaglandin-G/H-Synthasen katalysieren die Bildung von Prostaglandin H2 (PGH2), aus dem über verschiedene weitere Isomerasen und Oxidoreduktasen bioaktive Prostaglandinisomere entstehen (SIMMONS et al. 2004). Die Expression der Prostaglandin-G/H-Synthase-2 (PTGS2) als eine Isoform der Prostaglandin G/H Synthase wird in präovulatorischen Follikeln durch LH induziert (SIROIS et al. 2004). Verschiedene Arbeitsgruppen konnten mithilfe von nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) als Hemmer von Prostaglandin-G/H-Synthasen die Ovulation bei vielen Säugetieren hemmen (GAYTAN et al. 2006). DAVIS et al. (1999) beobachteten, dass Prostaglandin-G/H-Synthase-2-defiziente Mäuse nicht ovulierten und eine abnormale Implantation aufwiesen. Eine Gonadotropinstimulation und gleichzeitige Gabe von PGE2 oder IL-1β konnten bei diesen Mäusen wieder Ovulationen hervorrufen. Prostaglandin-G/H-Synthase-2 ist nach DAVIS et al. (1999) für den Gonadotropin-induzierten ovariellen Prostaglandin-Spiegel erforderlich.

Ebenso sind Prostaglandin-G/H-Synthase-2-Prostanoide für die Stabilisation des Cumulus oophorus während der Ovulation notwendig (DAVIS et al. 1999).

Lipoxygenase-5 (ALOX5)

Lipoxygenase-5 nimmt eine zentrale Rolle in der Biosynthese von Leukotrienen ein (SAMUELSSON et al. 1987). Diese stellen inflammatorische Mediatoren dar, die an der Chemotaxis von Phagozyten (LTB4) und der Förderung der Gefäßpermeabilität (Cystenyl-Leukotriene) beteiligt sind (RADMARK et al. 2007). Lipoxygenase-5 wird in Granulozyten, Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert (RADMARK et al.

2007). In Homogenaten aus Rattenovarien und Graaf-Follikeln konnten REICH et al. (1985) mittels Chemilumineszenz Lipoxygenaseaktivität messen, die nach Stimulation mit hCG im Ovarhomogenat auf das zweifache und im Follikelhomogenat auf das fünffache anstieg.

TSAFRIRI (1995) beschrieb eine dosisabhängige Blockade der Ovulation durch

Follikel festgestellt werden, weswegen nach TSAFRIRI (1995) Eicosanoide für die LH-vermittelte Stimulation der follikulären Kollagenase verantwortlich zu sein scheinen.

KURUSU et al. (2009) konnten Lipoxygenase-5 sowohl in Theca- als auch in Granulosazellen präovulatorischer Follikel von Ratten immunhistochemisch nachweisen und hier einen Anstieg der Reaktivität nach hCG-Stimulation verzeichnen. Eine spezifische Hemmung der Lipoxygenase-5 führte auch in Studien dieser Arbeitsgruppe zu einer gestörten Ovulation.

3 Methoden