TNF-RI- und TNF- α -Expression in Ovarstrukturen

5.2.3.1 TNF-RI-Expression in Ovarstrukturen

Wie in 4.2.4 beschrieben, konnte TNF-RI in Primordial-, Primär-, Sekundär-, Tertiär-, Graaf-Follikeln, Restgelbkörpern, Fibroblasten, Gefäßwänden und im Blutserum nachgewiesen werden.

In Primordial-, Primär- und Sekundärfollikeln lagen immunhistochemisch positive Reaktionen in den Follikelepithelzellen vor (4.2.4.1). Daneben reagierten auch die Theca follicularis und die Granulosa von Tertiärfollikeln und Graaf-Follikeln positiv (4.2.4.2).

Oozyten waren nur geringfügig gefärbt (4.2.4.1). Schon in früheren Studien wurde der Nachweis von TNF-Rezeptoren in Ovarien von Rindern, Ratten, Schweinen (2.2.2) und Menschen (NAZ et al. 1997) erbracht. So untersuchten SAKUMOTO et al. (2003) bei Kühen unterschiedliche Follikelentwicklungsstadien (3-5 mm große Follikel, präovulatorische Follikel, atretische Follikel). Mittels Radioreceptor-assay wiesen sie sowohl in Granulosa- als auch in Thecazellen aller Follikelentwicklungsstadien hochaffine Bindungsstellen für TNF-α nach. Ebenso konnte auch SPICER (1998) die Bindung von TNF-α an Granulosa- und Thecazellen von Kühen beobachten und damit den indirekten Nachweis von TNF-Rezeptoren erbringen. Eine neuere Untersuchung stellte TNF-RI-mRNA in Granulosazellen von Büffeln fest (MADHUSUDAN et al. 2007). Die TNF-RI-mRNA-Expression nahm hier mit Zunahme der Follikelgröße zu. Ein Nachweis von TNF-RI auf Proteinebene wurde hierbei nicht erbracht. In Ovarien von Ratten wurden ebenfalls mittels Radioreceptor-assay TNF-α-Bindungsstellen festgestellt (BALCHAK u. MARCINKIEWICZ 1999). Zusätzlich wurde in dieser Studie TNF-RI-mRNA und TNF-RII-mRNA gemessen. Eine Zuordnung zu bestimmten Ovarstrukturen und Zelltypen wurde in dieser Studie nicht durchgeführt. Im Rahmen von in vitro Studien wurde beim Schwein die Wirkung von TNF-α auf Granulosa- und Thecazellen geprüft und damit der indirekte Nachweis von TNF-Rezeptoren erbracht.

(TEKPETEY et al. 1993). PRANGE-KIEL et al. (2001) untersuchten den Einfluss von TNF-α auf kultivierte porcine Granulosazellen, die aus präovulatorischen Follikeln gewonnen wurden. Hierbei exprimierten 90% der Granulosazellen TNF-RI (Immunzytochemie). Mit der vorliegenden Arbeit wurde im Gegensatz zu den eben genannten Studien erstmalig in situ der phänotypische Nachweis von TNF-RI sowohl in Follikelepithelzellen von Primordial-,

Primär-, Sekundärfollikeln sowie Thecazellen und Granulosazellen von Tertiär-/Graaf-Follikeln beim Schwein erbracht. Nur PRANGE-KIEL et al. (2001) wiesen wie beschrieben ebenfalls TNF-RI phänotypisch nach. Allerdings erfolgte dieser Nachweis nur in vitro und nur in Granulosazellen präovulatorischer Follikel des Schweines. Der in der vorliegenden Studie immunhistochemisch nur geringfügig positive Nachweis von TNF-RI in Oozyten ist ähnlich zu Ergebnissen von NAZ et al. (1997) beim Menschen. In dieser Studie wurde TNF-RII-mRNA und das entsprechende Protein in Oozyten und Cumuluszellen entdeckt. TNF-RI dagegen wurde nicht nachgewiesen.

In der vorliegenden Studie zeigten sich neben Follikelepithel-, Theca- und Granulosazellen auch Restgelbkörper vor allem im Randbereich TNF-RI-positiv (4.2.4.3). Dieses Ergebnis bestätigt verschiedene Untersuchungen an Rindern (OKUDA et al. 1999; FRIEDMAN et al.

2000; SAKUMOTO et al. 2000) und Schweinen (RICHARDS u. ALMOND 1994;

MIYAMOTO et al. 2002). Im Rahmen dieser Studien wurden TNF-Rezeptoren in Endothelzellen sowie in kleinen und großen Lutealzellen nachgewiesen. Der Nachweis der TNF-Rezeptoren erfolgte über funktionelle Bindungstests (Radioreceptor-assay). Eine Ausnahme bildet die Studie von FRIEDMANN et al. (2000), die ausschließlich die Genexpression von TNF-RI mittels RT-PCR untersucht. Mit der vorliegenden Arbeit konnte der in den genannten Studien erbrachte funktionelle Nachweis von TNF-RI in situ immunhistochemisch bestätigt werden.

Zusätzlich zu den Funktionskörpern waren auch Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten TNF-RI positiv (4.2.4.3). SLOWIK et al. (1993) wiesen im Rahmen von in vitro Studien sowohl TNF-RI als auch TNF-RII in humanen Endothelzellen nach. In bronchialen Endothelzellen von Ratten und Menschen entdeckten ERMERT et al. (2003) TNF-RI und TNF-RII. Beim Schwein wurde bisher nur der funktionelle Nachweis von TNF-Rezeptoren (Radioreceptor-assay) in Endothelzellen der Corpora lutea in in vitro Studien erbracht (RICHARDS u. ALMOND 1994). Mit dieser Arbeit war es möglich, TNF-RI in situ in ovariellen Endothelzellen des Schweines direkt nachzuweisen. Dabei wurde im Gegensatz zu Untersuchungen durch RICHARDS und ALMOND (1994) die TNF-RI-Expression nicht nur in den Corpora lutea, sondern im gesamten Ovar des Schweines erfasst. Über TNF-Rezeptoren verursacht TNF-α nach Aussagen von SLOWIK et al. (1993) die Expression von

Rekrutierung zirkulierender Leukozyten beteiligt. Im Rahmen der Migration von Monozyten und Vorläufermastzellen in das Ovargewebe wäre dieser Aspekt von Bedeutung.

Der in der vorliegenden Arbeit erbrachte Nachweis von TNF-RI in vaskulären glatten Muskelzellen bestätigt Untersuchungen durch AMRANI et al. (2000), die TNF-RI in vaskulären glatten Muskelzellen humaner Atemwege nachwiesen. Vergleichbare Studien in Ovarien des Schweines lagen in der zugänglichen Literatur nicht vor.

Auch Fibroblasten sind in vivo als TNF-RI-exprimierende Zellen bei Mäusen (ALIKHANI et al. 2004) und in vitro bei Menschen bekannt (OHE et al. 2000).

Mit der vorliegenden Studie wurden Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten als potentielle direkte Wirkorte von injiziertem und/oder endogen synthetisiertem TNF-α identifiziert. Eine Beteiligung dieser Zellen durch Aktivierung von TNF-RI am Ovulationsgeschehen ist somit nicht auszuschließen.

Von Relevanz in dieser Studie ist die immunhistochemisch starke Reaktion des Blutserums im Ovar bezüglich TNF-RI (4.2.4.3). Im Serum existieren lösliche TNF-Rezeptoren (SPOETTL et al. 2007). Sie wären in der Lage injiziertes TNF-α zu binden und somit eine Wirkung von TNF-α auf das Ovar zu verhindern. Andererseits konnte im Blutserum des Ovars nur geringfügig und selten sowohl auf der Kontroll- als auch auf der Versuchsseite TNF-α nachgewiesen werden (4.2.5). Da in der vorliegenden Studie nur geringe Konzentrationen an TNF-α verabreicht wurden, die sich sofort nach Injektion verteilen, wäre eine stärkere immunhistochemische Reaktion auch nicht zu erwarten gewesen.

5.2.3.2 TNF-α-Expression in Ovarstrukturen

TNF-α-positive Reaktionen wurden in der Theca follicularis der Tertiär- bzw. Graaf-Follikel sowie schwach positive Reaktionen in den vaskulären glatten Muskelzellen und im Blutserum beobachtet (4.2.5). Studien bei Rindern (SAKUMOTO et al. 2000), Schweinen (NAKAYAMA et al. 2003), Menschen (KONDO et al. 1995), Schafen (MURDOCH et al.

1997) und Mäusen (CHEN et al. 1993) konnten TNF-α im Ovar nachweisen, jedoch z.T. in unterschiedlichen Zellpopulationen. Während KONDO et al. (1995) immunhistochemisch-positive Reaktionen für TNF-α in humanen Oozyten feststellten, deren Intensität mit Erreichen der präovulatorischen Phase zunahm, waren die Oozyten in der vorliegenden Studie beim Schwein TNF-α-negativ. Vergleichbare Studien beim Schwein waren in der

zugänglichen Literatur nicht zu finden. Eventuell lag die Produktion von TNF-α in den Oozyten dieser Studie unter der immunhistochemisch nachweisbaren Grenze. KONDO et al.

(1995) beobachteten zusätzlich TNF-α-positive Reaktionen in den Thecazellen von Tertiärfollikeln. Die Intensität der Färbung nahm hierbei mit der Größe und Ausreifung des Follikels zu. Auch in dieser Arbeit war die Theca follicularis von Tertiär-/Graaf-Follikeln TNF-α-positiv, frühere Follikelentwicklungsstadien waren nicht gefärbt, was auf eine Rolle von lokal synthetisiertem TNF-α im Ovulationsgeschehen hinweisen könnte. Dagegen konnten CHEN et al. (1993) bei Mäusen nur TNF-α-mRNA in Follikel- Theca- und Granulosazellen feststellten, immunhistochemisch aber keinen Proteinnachweis erbringen.

Mit der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig der phänotypische Nachweis von TNF-α in der Theca follicularis in Ovarien von Schweinen erbracht.

Im Gegensatz zu den in vitro Studien von ZOLTI et al. (1990) und CARLBERG et al. (2000) beim Menschen und NAKAYAMA et al. (2003) beim Schwein, wurde in dieser Studie keine TNF-α-Expression in Granulosazellen festgestellt. KONDO et al. (1995) konnten den immunhistochemischen Nachweis von TNF-α in humanen Granulosazellen von Sekundärfollikeln erbringen. Die Intensität der Färbung nahm auch hier mit Zunahme der Größe und Ausreifung des Follikels zu, was auf eine Beteiligung von TNF-α im Ovualtionsgeschehen hinweist. Dieses Ergebnis wurde durch die vorliegende Studie beim Schwein nicht bestätigt. Eventuell sind methodische Unterschiede in der Immunhistochemie für die unterschiedlichen Ergebnisse verantwortlich. Auch ROBY et al. (1990) stellten immunzytochemisch keine TNF-α-Expression in humanen Granulosazellen von Sekundär-, Tertiär- und Graaf-Follikeln fest. Allerdings wiesen sie TNF-α in Granulosazellen früher Follikelentwicklungsstadien und atretischer Follikel nach. Hier wäre mehr die Beteiligung von TNF-α an der Follikulogenese und Follikelatresie und weniger am Ovulationsgeschehen zu vermuten. Möglicherweise lag die TNF-α-Produktion in der vorliegenden Arbeit unter der immunhistochemisch nachweisbaren Grenze, da NAKAYAMA et al. (2003) TNF-α in Granulosazellen des Schweines nachweisen konnten. Zusätzlich zum Proteinnachweis hätte eine In-situ-Hybridisierung, wie CHEN et al. (1993) sie durchführten, weitere Informationen über die Bildung von TNF-α-mRNA in Follikel-, Granulosa- und Thecazellen beim Schwein

Theca follicularis reagierten auch die glatten Muskelzellen der Gefäßwände schwach TNF-α-positiv. Dieses Ergebnis entspricht Untersuchungen durch ERMERT et al. (2003), die TNF-α in bronchialen vaskulären glatten Muskelzellen des Menschen nachwiesen. Die schwach positive Reaktion von α im Blutserum lässt sich eventuell auf an lösliche TNF-Rezeptoren gebundenes TNF-α zurückführen.

5.2.4 Zusammenhang der TNF-RI- und TNF-α-Expression in