Untersuchung TNF-[alpha]-vermittelter Effekte auf präovulatorische Ovarien von Jungsauen

Untersuchung TNF-α-vermittelter Effekte auf präovulatorische Ovarien von Jungsauen

INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Maren Krüger

aus Göttingen

Hannover 2009

Prof. Dr. R.H.F. Hunter

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth AG Immunologie

PD Dr. med. vet. A. Schnapper Anatomisches Institut

1. Gutachter/in: Prof. Dr. med. vet. D. Waberski 2. Gutachter/in: Prof. Dr. med. vet. D. Rath

Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2009

Meinen Eltern

2 LITERATURÜBERSICHT 12

2.1 Uterus und Ovar beim Schwein 12

2.1.1 Gefäßversorgung der Ovarien und des Uterus beim Schwein 12 2.1.2 Counter current transfer (Gegenstromprinzip) 13

2.2 Ovulationsmechanismus 15

2.2.1 Ablauf der Ovulation 15

2.2.2 TNF-α als Ovulationsinduktor 19

2.2.3 Rolle des Seminalplasmas 21

2.3 Immunrelevante Zellen im Ovar 24

2.3.1 Überblick 24

2.3.2 Mastzellen 25

2.3.3 Makrophagen 28

2.4 Lösliche Mediatoren im Ovar 31

2.4.1 Histamin 31

2.4.2 Zytokine, Chemokine und Enzyme 32

2.4.2.1 Zytokine 32

2.4.2.2 Chemokine 35

2.4.2.3 Ausgewählte Enzyme des Arachidonsäurezyklus 36

3 METHODEN 38

3.1 Etablierung des Tiermodells 38

3.1.1 In-situ-Adspektion des ovariellen Gefäßkonvoluts im anatomischen Präparat 38

3.1.2 Versuchstiere 38

3.1.3 Brunstkontrolle 38

3.1.4 Chirurgische Maßnahmen zur Etablierung des Tiermodells 39

3.2 Versuchsdesign 44

3.3 Chirurgische Maßnahmen 44

3.4 Probenaufbereitung 45

3.5 Histologische und immunhistochemische Untersuchungen 46

3.5.1 Fixierung der Proben 46

3.5.2 Einbettung und Anfertigung der Schnitte 46

3.5.3 Histologische Färbungen 47

3.5.4 Immunhistochemische Nachweise 51

3.5.8 Auswertung der immunhistochemischen Befunde 58 3.6 Aufarbeitung der Follikelflüssigkeit zur Bestimmung von Histamin durch einen

Radioimmunoassay 58 3.6.1 Kompetitiver Histamin-Radioimmunoassay (RIA) 58

3.7 Molekularbiologische Verfahren 61

3.7.1 Aufbereitung von mRNA aus Ovargewebe für die real time PCR 61 3.7.2 Synthese von cDNA durch Reverse Transkription 62 3.7.3 Herstellung externer Standardreihen für die real time PCR 63

3.7.4 Quantitative real time PCR (qRT-PCR) 69

3.8 Statistische Auswertung 74

4 ERGEBNISSE 76

4.1 Etablierung des In-vivo-Modells 76

4.1.1 Anatomie der A. ovarica 76

4.1.2 Verteilung von FITC-gekoppeltem Albumin im Ovar nach Injektion 77 4.1.3 Verteilung von Evan´s Blue im Ovar nach Injektion (intra vitam) 79

4.2 Histologische Befunde 80

4.2.1 Ergebnisse der Quantifizierung der Ovargewebestrukturen 80

4.2.2 Mastzelldichte 85

4.2.3 Mastzellverteilung 90

4.2.4 Expression des Tumor-Nekrose-Faktor Rezeptor I im Ovar 94 4.2.4.1 Primordial-, Primär- und Sekundärfollikel 96

4.2.4.2 Tertiär- und Graaf- Follikel 99

4.2.4.3 Restgelbkörper, Gefäßwände, Serum, Fibroblasten 104

4.2.4.4 TNF-RI-positive Einzelzellen 105

4.2.5 Expression von TNF-α im Ovar 108

4.2.5.1 Tertiär- und Graaf-Follikel 109

4.2.5.2 TNF-α-positive Makrophagen 112

4.2.6 TNF-RI und TNF-α ko-exprimierende Zellen im Ovar 118 4.3 Histamingehalte in der Follikelflüssigkeit 123 4.4 TNF-α-modulierte mRNA-Expression von Zytokinen, Chemokinen und

Enzymen 125

5 DISKUSSION 129

5.2.2.1 Nachweis von Mastzellen im Ovar und Bestimmung der Mastzelldichte 133

5.2.2.2 Eosinophile Granulozyten 136

5.2.2.3 Nachweis von TNF-α-positiven Makrophagen 136 5.2.3 TNF-RI und TNF-α-Expression in Ovarstrukturen 137

5.2.3.1 TNF-RI-Expression in Ovarstrukturen 137

5.2.3.2 TNF-α-Expression in Ovarstrukturen 139

5.2.4 Zusammenhang der TNF-RI- und TNF-α-Expression in Ovarstrukturen 141 5.2.5 Expression von TNF-RI und TNF-α in immunrelevanten Zellen des Ovars 143 5.3 Nachweis von Histamin in der Follikelflüssigkeit und die Beeinflussung der

Histamingehalte durch TNF-α 145 5.4 Expression und Regulation von Zytokinen, Chemokinen und Enzymen im Ovar

147

5.5 Schlussfolgerungen und Ausblick 149

6 ZUSAMMENFASSUNG 151

7 SUMMARY 154

8 LITERATURVERZEICHNIS 157

9 ANHANG 181

9.1 Geräte 181

9.2 Klinikbedarf 184

9.3 Laborbedarf 186

9.4 Medikamente und Reagenzien 187

9.5 Antikörper 191

9.5.1 Puffer und Lösungen 192

9.5.1.1 Lösungen für die Operationen und Zytokininjektionen 192

9.5.1.2 Lösungen für die Histologie 193

9.5.1.3 Puffer und Lösungen für die DNA-Analyse 195 9.5.2 Plasmid für die Herstellung von Standardreihen 196

9.5.3 Primer 196

µ mikro (x10^-6) Abb. Abbildung Ach Acetylcholin

ALOX5 Arachidonat-5-Lipoxygenase Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) ATP Adenosin-5′-triphosphat

Bdgw. Bindegewebe bp base pairs (Basenpaare)

BSA Bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

C3a Fragment der Komplementkomponente C3 C5a Fragment der Komplementkomponente C5 ca. circa

cAMP Cyclisches Adenosin-5´-monophosphat

CCL β-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle in Folge („CC“) CD Cluster of differentiation (System zur Bezeichnung zellulärer

Differenzierungsantigene)

cDNA complementary DNA (komplementäre DNA) CL Corpus luteum (Gelbkörper)

cm Zentimeter

CSF Colony-stimulating factor (Kolonie-stimulierender Faktor) Ct Cycle threshold (Schwellenwert-Zyklus)

CXCL α-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle werden von beliebiger Aminosäure (X) getrennt

CXCL8 Interleukin-8

DAB 3,3´-Diaminobenzidintetrahydrochlorid DAO Diaminoxidase

DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate dsDNA doppelsträngige DNA

E. coli Escherichia coli

eCG Equines Chorion Gonadotropin

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest) et al. et alii (lateinisch: und andere)

Fc Fragment crystalline (konstante Region von Immunglobulinen) FITC Fluoresceinisothiocyanat

for forward

FSH Follikelstimulierendes Hormon g Gramm

G Gauge: Maßeinheit für den Außendurchmesser von Kanülen

G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor (Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) GF growth factors (Wachstumsfaktoren)

Injektion von 2 ng TNF-α in die A. ovarica der Versuchsovarien h hora (lateinisch: Stunde)

H₂O Wasser

hCG Humanes Chorion Gonadotropin HDC Histidin-Decarboxylase

HE Hämatoxylin-Eosin

HMT Histamin N-Acetyltransferase i.m. intramuskulär

i.v. intravenös

IF Immunfluoreszenz IFN Interferon

Ig Immunglobulin IHC Immunhistochemie IL Interleukin

IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid ISH In-situ-Hybridisierung

k Kilo

kB kilo Basen

kDA kilo Dalton

Kontrollovar Ovar, in dessen A. ovarica PBS injiziert wurde l Liter

LB lysogeny broth (Nährmedium zur Kultivierung von Bakterien)

LH Luteinisierendes Hormon

LIF Leukemia inhibitory factor (Leukämie-hemmender Faktor) Lig. Ligamentum

LPS Lipopolysaccharid

LSMEANS Least Squares Means (gewichtetes Mittel), hier: Mittelwerte der Versuchsovarien korrigiert um die Werte der Kontrollovarien

LTB4 Cysteinyl-freies Leukotrien B4

LTC4 Peptido-(Cysteinyl-)Leukotrien C4

m milli (x10^-3)

m Meter

mAK monoklonaler Antikörper MAX Maximum

MC Mast cells (Mastzellen)

MCP Monocyte chemotactic protein (Monozyten anziehendes Protein)

M-CSF Macrophage colony-stimulating factor (Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) MHC Major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)

MHZ Megahertz, Maßeinheit für Millionen Schwingungen pro Sekunde MIN Minimum

min. Minute(n)

MMP Matrixmetalloproteinase

MNC Mononuclear cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes)

mRNA messenger RNA

MW Mittelwert

MW Molecular weight (Molekulargewicht)

N nano (x10^-9)

N= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen

PAF Platelet activating factor (Plättchenaktivierender Faktor) pAk polyklonaler Antikörper

PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

PE Phycoerythrin pg Pikogramm PGE2 Prostaglandin E2

PGF2α Prostaglandin F2α

pH pondus Hydrogenii, Maß für die Stärke der sauren bzw. basischen Wirkung einer wässrigen Lösung

PTGS2 Prostaglandin G/H Synthase-2 (Cyclooxygenase-2) qrtPCR quantitative real time PCR

R. Ramus (Gefäßast)

R1, R2, R3, R4 Ovarregion Nr. 1, 2, 3, 4 RANTES CCL5

rev reverse

RIA Radioimmunoassay

rpm Rounds per minute

Rr. Rami (Gefäßäste)

RT Raumtemperatur S. aureus Staphylococcus aureus

s.o. siehe oben

s.u. siehe unten

SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A sek. Sekunde

spinozell. spinozellulär

STD Standardabweichung Summen-MW Summenmittelwerte

Tab. Tabelle

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TGF-β Transforming growth factor-beta

T_H T-Helfer

TLR Toll-like receptor (Toll-ähnlicher-Rezeptor) TNF Tumor necrosis factor (Tumornekrosefaktor)

TNF-RI Tumor necrosis factor receptor I (Tumornekrosefaktor-Rezeptor I) TNF-RII Tumor necrosis factor receptor II (Tumornekrosefaktor-Rezeptor II)

u.a. unter anderem

UV ultra violett

V. Vena.

v.a. vor allem

v/v Volumen pro Volumen

Versuchsovar Ovar, in dessen A. ovarica TNF-α injiziert wurde w/v Gewicht pro Volumen

xg multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)

1 Einleitung

Der Prozess der Ovulation wird in der Literatur häufig mit einer inflammatorischen Reaktion verglichen (ESPEY 1980, 1994). Dabei kommt es zur Migration verschiedener Leukozytenpopulationen (Mastzellen, neutrophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) in das Ovargewebe und das Gewebe sprungreifer Graaf-Follikel sowie zur lokalen Produktion von Zytokinen, wie z.B. TNF-α (BRÄNNSTRÖM et al. 1993;

BRÄNNSTRÖM u. NORMAN 1993; BRÄNNSTRÖM u. ENSKOG 2002). In früheren Studien konnte nachgewiesen werden, dass Seminalplasma den Ovulationszeitpunkt vorverlegen kann (WABERSKI et al. 1995). Die Art und die Mechanismen der Signalübertragungswege sind hierbei noch nicht genau geklärt. Ein Counter current transfer zwischen der A. ovarica und V. ovarica ist beim Schwein beschrieben (KRZYMOWSKI et al.

1982; KRZYMOWSKI et al. 1990; STEFANCZYK-KRZYMOWSKA et al. 2002). Nach Induktion in Epithelzellen und anderen Zellen des Uterus gebildete Zytokine wie TNF-α (LAIRD et al. 1996; TABIBZADEH et al. 1999) könnten über diesen lokalen Transfer in das Ovar gelangen. Im in-vitro-Rattenovarperfusionsmodell wurde die ovulationsinduzierende Wirkung von TNF-α nachgewiesen (BRÄNNSTRÖM et al. 1995). Gleichartige Untersuchungen zur ovulationsinduzierenden Wirkung von TNF-α beim Schwein wurden bisher nicht durchgeführt.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es zunächst, ein Tiermodell zu entwickeln, das eine Untersuchung TNF-α-vermittelter Effekte auf präovulatorische Ovarien von Schweinen erlaubt. Besondere Aufmerksamkeit sollte dabei der Rolle von Mastzellen im Ovulationsgeschehen gewidmet werden, da sie als rasche lokale Signalvermittler und -geber fungieren können und in Ovarien verschiedener Spezies nachgewiesen wurden (KRISHNA et al. 1989). Im Tiermodell sollte die Arbeitshypothese geprüft werden, ob TNF-α, wenn es über die A. ovarica das porcine Ovar erreicht, die Degranulation und Mediatorsekretion (Histamin) von residenten Mastzellen induziert und darüber präovulatorische Prozesse fördert. Weitere Analysen sollten die Gen-induzierende Wirkung des verabreichten TNF-α zeigen und prüfen, ob im Sinne einer Verstärkerreaktion, TNF-α selbst und/oder der Rezeptor für TNF-α moduliert exprimiert wird.

2 Literaturübersicht

2.1 Uterus und Ovar beim Schwein

2.1.1 Gefäßversorgung der Ovarien und des Uterus beim Schwein

Die weiblichen Geschlechtsorgane des Schweines werden durch die in Abb. 1 schematisch dargestellten Gefäße versorgt.

Abb. 1: Arterielle Gefäßversorgung der Ovarien, des Uterus und der Vagina beim Schwein, aus NICKEL et al. (2005).

Relevante Arterien: 1) Aorta abdominalis, 2) A. ovarica, 3) R. tubarius, 4) R. uterinus, 20) A.

umbilicalis, 21) A. uterina, 22) R. uretericus, 30) A. vaginalis, 31) R. uterinus.

Die A. ovarica entspringt beim Schwein im Bereich des 5. Lendenwirbels seitlich aus der Aorta abdominalis und verläuft anschließend stark geschlängelt im Mesovarium (GINTHER

Uterushorns beteiligt sind. Der R. tubarius dient der Vaskularisierung der Tuba uterina und der Bursa ovarica. (NICKEL et al. 2005). Einige Zentimeter vor Erreichen des Hilus ovarii teilt sich die A. ovarica in zwei stark geschlängelte Gefäßäste, die sich am Hilus selbst jeweils noch einmal in 2-4 Äste aufteilen (ANDERSEN 1926) und insgesamt ein kegelförmiges Konvolut bilden (NICKEL et al. 2005).

Der Uterus wird über die eben genannten Rr. uterini der A. ovarica, über die A. uterina und über den R. uterinus der A. vaginalis versorgt. Die A. uterina bildet im Lig. latum uteri mehrere Äste, die kranial gerichteten anastomosieren hierbei mit dem R. uterinus der A.

ovarica und die kaudal gerichteten mit dem R. uterinus der A. vaginalis (NICKEL et al.

2005).

Die V. ovarica dextra und sinistra münden beim Schwein in die V. cava caudalis, und verlaufen jeweils mit der A. ovarica im Mesovarium. Beim Schwein entlässt die V. ovarica zuerst die V. uterina, anschließend den R. tubarius und schlussendlich den starken R. uterinus, über den die hauptsächliche venöse Entsorgung des Uterus verläuft. Der R. uterinus anastomosiert mit der V. uterina. Der R. uterinus der V. vaginalis bildet beim Schwein das kaudale Gefäß des Uterus (NICKEL et al. 2005).

Die Lymphgefäße der Ovarien werden von den Lymphonodi iliaci mediales sowie von den Lymphonodi lumbales aortici aufgenommen (NICKEL et al. 2005). Die Lymphgefäße des Uterus treten in den Lymphonodus uterinus, die Lymphonodi ileofemorales und die Lymphonodi iliaci mediales ein.

2.1.2 Counter current transfer (Gegenstromprinzip)

Bei dem sogenannten Counter current transfer handelt es sich um einen passiven Transportmechanismus, bei dem Energie (Wärme) oder biologisch wirksame Substanzen durch das Gegenstromprinzip aus venösem Blut, interstitieller Flüssigkeit und Lymphe in das arterielle Blut zurückkehren (EINER-JENSEN u. HUNTER 2005).

Die Bedeutung des Counter current transfers liegt in der lokalen Regulation von Organfunktionen, insbesondere der Temperaturregulation und Regulation der endokrinen Funktion (EINER-JENSEN u. HUNTER 2005). Aufgrund der gemeinsamen Drainage von Teilen des Uterus und Ovars durch die V. ovarica bevorzugt GINTHER (1974) bei Rindern, Schafen, Pferden und Schweinen die ältere Bezeichnung „V. utero-ovarica“. Der Transport

von Energie und Substanzen findet zwischen der „V. utero-ovarica“ oder Lymphe und der A.

ovarica statt (EINER-JENSEN u. HUNTER 2005).

Ein uteroovarieller Transportmechanismus wurde bei Menschen, Rindern, Schafen, Schweinen, Meerschweinchen, Ratten und Hamstern beobachtet, bei denen die Ovararterie in engem Kontakt zur V. ovarica liegt. STEFANCZYK-KRZYMOWSKA u. KRZYMOWSKI (2002) fassen Arterien, Venen, Kapillaren und Lymphgefäße des Mesovars und der Mesosalpinx als periovariellen Gefäßkomplex zusammen und betonen dessen Rolle im Zusammenhang mit dem retrograden Transfer von Ovarhormonen. Ihrer Meinung nach scheinen zwei Prozesse am retrograden Transfer ovarieller Hormone zum Ovar beteiligt zu sein: zum einen der direkte Transport von Hormonen von der V. ovarica mit der in sie mündenden V. uterina zur A. ovarica mit ihren Rr. uterini, zum anderen ein indirekter Transport von der Lymphe über die V. ovarica in die A. ovarica.

Beim Rind, Schwein und Schaf wurde über den direkten, lokalen veno-arteriellen Counter current transfer der in Tab. 1 aufgeführten Substanzen berichtet:

Tab. 1: Counter current transfer verschiedener Hormone und anderer Mediatoren von der V. uterina, V. ovarica oder ovariellen Lymphgefäßen in die A. ovarica.

Substanz Referenz

PGF_2α (MCCRACKEN et al. 1972; KOTWICA 1980; ZÖTTL 1988;

KRZYMOWSKI et al. 1990; STEFANCZYK-KRZYMOWSKA et al. 1998;

KRZYMOWSKI u. STEFANCZYK-KRZYMOWSKA 2008) PGE₂ (STEFANCZYK-KRZYMOWSKA et al. 2005)

Testosteron und

Östradiol

(KRZYMOWSKI et al. 1981; KRZYMOWSKI et al. 1982; STEFANCZYK- KRZYMOWSKA et al. 1998; STEFANCZYK-KRZYMOWSKA u.

KRZYMOWSKI 2002; STEFANCZYK-KRZYMOWSKA et al. 2002;

WASOWSKA u. STEFANCZYK-KRZYMOWSKA 2006)

Progesteron (KRZYMOWSKI et al. 1982; STEFANCZYK-KRZYMOWSKA u.

KRZYMOWSKI 2002; STEFANCZYK-KRZYMOWSKA et al. 2002) Oxytocin (SCHRAMM et al. 1986b)

Relaxin und Tyrosin (SCHRAMM et al. 1986a)

Die Vorraussetzung für einen solchen Counter current transfer ist eine ausgeprägte

beim Schwein durch die Lokalisation der Arterie zwischen zwei Ästen der V. ovarica gegeben ist (GINTHER 1974). DEL CAMPO und GINTHER (1974) berichten bei Schafen von signifikant dünneren Wänden der Arterie und Vene im Bereich der Kontaktfläche. Beim Schwein waren einige Millimeter ins Lumen der A. ovarica hineinragende Tuberculi zur Oberflächenvergrößerung auszumachen (DOBOSZYNSKA 1986). In Lymphgefäßen wurden kleine Poren nachgewiesen, die abhängig von der Zyklusphase des Schweines ihre Größe verändern konnten (DOBOSZYNSKA et al. 1999).

Die Effizienz des PGE2-Transfers in die A. ovarica war bei Untersuchungen von STEFANCZYK-KRZYMOWSKA et al. (2005) nach Infusion in lymphatische Gefäße höher als nach Infusion in Äste der uterinen Vene.

Die Regulation des Blutflusses spielt im System des Counter current transfers eine bedeutende Rolle. Neben einer unbedeutenderen cholinergen Innervation (Ach) und einer noch nicht gesicherten nitrergen (Nitritoxid) und peptidabhängigen Innervation konnten in der Ovar- und Uterusarterie α1- und α2-Rezeptoren nachgewiesen werden (GARCIA-PASCUAL et al. 1996). STEFANCZYK-KRZYMOWSKA et al. (1997) zeigten, dass die Stimulation von α1-Rezeptoren keinen Effekt auf die lokale Steroidhormonkonzentration in der Ovararterie besaß, das Blockieren der Rezeptoren allerdings den Counter current transfer von Steroidhormonen förderte. Desweiteren nimmt das Endothel selbst an der Regulation des vaskulären Tonus durch Freisetzung von relaxierenden und kontraktilen Faktoren teil (GARCIA-PASCUAL et al. 1996). Das relaxierende Histamin von im adrenergen Plexus befindlichen Mastzellen und das antagonistische 5-Hydroxytryptan sind nach GARCIA- PASCUAL et al. (1996) auch an der regulatorischen Veränderung des Blutflusses während des Östruszyklus beteiligt.

2.2 Ovulationsmechanismus

2.2.1 Ablauf der Ovulation

Im Verlauf des Zyklus gibt es bei der Sau aufgrund einer sehr niedrigen basalen Sekretion von FSH und LH (DÖCKE 1994) nur eine Follikelwachstumswelle. Bereits kurz nach der Ovulation wachsen durch den hypophysären FSH-Anstieg ca. 30 Follikel auf eine Größe von

≥3 mm heran. Die Selektion sprungreifer Follikel erfolgt während des Diöstrus und frühen

Proöstrus bei Jungsauen auf ca. 10 bis 15 und bei Altsauen auf 15 bis 20 Follikel (SCHNURRBUSCH et al. 1990). Die FSH-Sekretion verringert sich in der präovulatorischen Phase. Die Sensitivität der Granulosazellen sprungreifer Follikel auf FSH wird mit zunehmender Entwicklung verstärkt. Eine ausreichende Wirksamkeit von FSH auf diese Follikel bezüglich Follikelreifung und Östrogensynthese wird damit trotz des sinkenden Plasmaspiegels sichergestellt. Für die Reifung der restlichen Follikel ist die Plasmakonzentration von FSH zur Follikelausreifung zu gering (DÖCKE 1994), so dass bei diesen Follikeln die Atresie einsetzt. Mit fallendem Östradiolspiegel wird ein LH-Anstieg induziert, der vor, während oder nach Brunstbeginn auftreten kann (VAN DE WIEL et al.

1981; KIRSCH et al. 1985; HELMOND et al. 1986). In der Theca follicularis und vermindert auch in der Granulosazellschicht kommt es durch gemeinsamen Einfluss von FSH und Östradiol zur Erhöhung der LH-Rezeptoren (NAKANO et al. 1977; DAGUET 1979). Das Intervall zwischen LH-Peak und Ovulation beträgt durchschnittlich 30 ± 3 Stunden (SOEDE et al. 1996).

Die Ovulation wird in der Literatur häufig mit einem inflammatorischen Prozess verglichen (ESPEY 1980). So konnten Leukozyten im Uterus, im Eileiter und Ovar nachgewiesen werden, deren Anzahl und Subtypus sich während des Östruszyklus verändern (BULMER et al. 1991). Die Migration von Leukozyten und die Produktion von Zytokinen scheinen nach NORMAN und BRÄNNSTRÖM (1994) eine wichtige Rolle im Rahmen der Ovarphysiologie zu spielen. So führte bei Mäusen eine neonatale Thymectomie zur Sterilität und veränderte die Gonadotropinsekretion (NISHIZUKA u. SAKAKURA 1969). Eine Infusion von Leukozyten in ein perfundiertes Rattenovar führte verglichen zu einer alleinigen LH-Infusion zu einer ansteigenden Ovulationsrate (HELLBERG et al. 1991).

Mastzellen, neutrophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Makrophagen und Lymphozyten konnten im Ovar nachgewiesen werden (GAYTAN et al. 1991; STANDAERT et al. 1991; BRÄNNSTRÖM et al. 1993; BRÄNNSTRÖM u. ENSKOG 2002). Residente Leukozyten setzen nach BUKULMEZ und ARICI (2000) Zytokine frei, die ihrerseits weitere zirkulierende Leukozyten rekrutieren und aktivieren sowie durch Aktivierung von Integrinen rekrutierter Leukozyten die Adhäsion an ovarielles Gewebe ermöglichen.

Leukozyten sezernieren u.a. proteolytische Enzyme, die extrazelluläre Matrixproteine verdauen und zu strukturellen Veränderungen der Follikelwand führen und schließlich in der Ovulation enden (BUKULMEZ u. ARICI 2000).

Klassischerweise ist eine Entzündung durch Rötung, Schwellung, Wärme und Schmerz gekennzeichnet (WEISSMANN 1992). Die Rötung und Schwellung sind Folge eines lokalen Anstiegs des Blutvolumens und eines Ödems bedingt durch Vasodilatation und erhöhte Gefäßpermeabilität (ESPEY 1994). Im Follikel findet eine ähnliche hyperämische Reaktion zwischen LH-Anstieg und Ovulation statt (TANAKA et al. 1989). Zudem wurden in ovariellem Gewebe vasodilatatives Bradykinin, Histamin und PAF (platelet-activating-factor) wie auch Prostaglandine und Leukotriene nachgewiesen, die sich am Ovulationsprozess ebenso beteiligen wie im Rahmen einer Entzündung (ESPEY 1980, 1994) (Abb. 2). Ruhende thecale Fibroblasten werden zur Proliferation angeregt, setzen anschließend proteolytische Enzyme wie Kallikrein, Plasmin und Kollagenase frei und tragen damit zur Degradierung der Follikelwand bei (ESPEY 1994). Neben einer reinen inflammatorischen Antwort des adaptiven Immunsystems beziehen LIU et al. (2008) das angeborene Immunsystem als regulatorisches System während der Ovulation mit ein. Es wurden Toll-like-Rezeptoren (2 und 4) in Granulosa- und Cumuluszellen nachgewiesen, die durch Pathogene oder aber auch durch endogene Liganden aktiviert werden und damit zur Induktion und Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen führen, die zur Cumulus-Zell-Oozyten-Expansion, Ovulation, zum Transport und zur Befruchtung beitragen können (LIU et al. 2008).

Abb. 2: Ovulation als inflammatorischer Prozess - modifiziert nach ESPEY (1980) und DE ASUA (1975).

Vereinfachtes Modell des ovulatorischen Prozesses: Der LH-Anstieg führt innerhalb von Sekunden zu einer vermehrten cAMP-Bildung im reifen Follikel, die die Steroidgenese und die Synthese von Prostaglandinen (PGE₂ und PGF_2α) in Follikeln induziert. Desweiteren kommt es durch LH zu einer Freisetzung von Histamin, Serotonin, und Bradykinin, die neben den Prostaglandinen für die Vasodilatation und Hyperämie im Follikel verantwortlich gemacht werden. PGF_2α kann in bestimmten

2.2.2 TNF-α als Ovulationsinduktor

Das Zytokin Tumornekrosefaktor-α ist ein nicht-glykolysiertes Protein mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, welches zur TNF-α-Super-Familie gehört (SAKUMOTO u.

OKUDA 2004).

TNF-α wird von Makrophagen, Monozyten, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten nach Aktivierung durch bakterielle Lipopolysaccharide gebildet. Außerdem wird TNF-α von glatten Muskelzellen, Fibroblasten und Endothelzellen produziert.

Im Ovar wurde TNF-α in Mastzellen nachgewiesen, wo das Zytokin in Granula vorliegt, so dass diese Zellen TNF-α sofort nach Stimulation freisetzen können (MACHELON u. EMILIE 1997). Daneben wurde TNF-α in Oozyten, Granulosazellen und Thecazellen der Maus (CHEN et al. 1993), der Ratte (SANCHO-TELLO et al. 1992) und des Menschen (ROBY u.

TERRANOVA 1990) nachgewiesen (Tab. 2). Der Gehalt von TNF-α in der Follikelflüssigkeit beim Menschen wird in der Literatur kontrovers diskutiert. WANG et al.

(1992) zeigten einen deutlich messbaren Gehalt an TNF-α, während dessen die TNF-α- Konzentration bei Untersuchungen durch BUSCHER et al. (1999) unter dem Detektionslimit (15 pg/ml) blieb. Bei Kühen konnten hohe Konzentrationen von bioaktivem TNF-α in der Flüssigkeit dominanter Follikel nachgewiesen werden (ZOLTI et al. 1990).

TNF-α wirkt über zwei unterschiedliche Rezeptoren: TNF-Rezeptor-Typ I (TNF-RI, 55 kDA) und TNF-Rezeptor-Typ-II (TNF-RII, 75 kDA) (SAKUMOTO u. OKUDA 2004). Die Bindung von TNF-α an TNF-RI führt zur Zytotoxizität, die Bindung an beide Rezeptortypen führt zu einer Differenzierung von Zellen, welche beide Rezeptortypen exprimieren (HIGUCHI u. AGGARWAL 1994). Das Vorkommen von TNF-α-Rezeptoren im Ovar verschiedener Spezies ist in Tab. 3 aufgelistet.

Tab. 2: TNF-α im Ovar verschiedener Spezies¹⁾.

Spezies Quelle Gelbkörperphasen Nachweismethode

Rind

Follikelflüssigkeit Bioaktivität

Thecazellen IHC

CL Regressionsphase MDS/RIA

CL durchgehend RT-PCR/ELISA

CL Trächtigkeit RT-PCR

Schwein

Makrophagen Blütephase, spät IHC Endothelzellen spät, Trächtigkeit IHC/Western blot CL durchgehend,

Trächtigkeit

RT-PCR

CL Blütephase, spät IHC

CL spät, Trächtigkeit IHC/Western blot Mensch

Follikelflüssigkeit ELISA

Granulosazellen IHC

Thecazellen ISH

CL durchgehend IHC

Schaf

Endothelzellen IF-Mikroskopie

Thecazellen IF-Mikroskopie

CL Regressionsphase Bioaktivität

Ratte Granulosazellen IHC

Maus

Granulosazellen ISH/IHC

Thecazellen ISH/IHC

CL ISH/IHC

Tab. 3: TNF-α-Rezeptoren im Ovar verschiedener Spezies¹⁾.

Spezies Quelle Gelbkörperphasen Nachweismethode

Rind

Granulosazellen RRA

Thecazellen RRA

Endothelzellen RRA, RT-PCR

CL (TNF-RI) durchgehend RT-PCR / RRA

CL Trächtigkeit RRA

CL Blütephase RRA

große, kleine

Luteinzellen (TNF-RI)

durchgehend RT-PCR

Schwein

Granulosazellen IHC

große, kleine Luteinzellen

spät RRA CL durchgehend,

Trächtigkeit

RRA Ratte Ovarzellen (TNF-RI,

TNF-RII)

Trächtigkeit RT-PCR / RRA

1) nach Sakumoto und Okuda (2004). CL = Corpus luteum; IHC = Immunhistochemie; MDS = Microdialyse System; RIA = Radioimmunoassay; RRA = Radioreceptor-assay; RT-PCR = Reverse

BRÄNNSTRÖM et al. (1995) wiesen mithilfe des Rattenovarperfusionsmodells die ovulationsinduzierende Wirkung von TNF-α nach. Nach intrafollikulärer Injektion eines TNF-α-Antikörperserums konnten MURDOCH et al. (1997) die Ovulation bei Schafen blockieren. In derselben Studie zeigte sich 20 Stunden nach GnRH-Gabe eine geringere Immunfluoreszenz bezüglich TNF-α in Endothelzellen der apikalen Regionen der Theca follicularis, so dass von einer TNF-α-Sekretion in umgebendes interstitielles Gewebe ausgegangen wurde (MURDOCH et al. 1997). Die Arbeitsgruppe geht davon aus, dass TNF- α beim Schaf für die apoptotische Degeneration apikaler Follikelzellen vor der Ovulation verantwortlich ist, da die intrafollikuläre Verabreichung von TNF-α-Antikörpern die apikalen Follikelzellen vor DNA-Fragmentation schützte (MURDOCH 1995). Der genaue Regulationsmechanismus der TNF-α-Expression und Freisetzung aus residenten Ovarzellen ist noch nicht abschließend geklärt (MURDOCH et al. 1997). SANCHO-TELLO et al. (1993) gehen von einer direkten Aktivierung von follikulärem TNF-α aus. Ein anderer, indirekter Regulationsmechanismus wurde durch MURDOCH et al. (2000) untersucht. Durch Gonadotropine wurde die Sekretion des Plasminogen-Aktivators aus ovariellem Oberflächenepithel stimuliert, was zu einer Aktivierung von Kollagenasen und der Sekretion von TNF-α thecalen Ursprungs führte. Über die Induktion einer verstärkten Expression von Matrixmetalloproteinasen trug TNF-α außerdem zu Kollagenolyse sowie zu Epithel- und Gefäßauflösung bei. TNF-α hat auch Einfluss auf die ovarielle Hormonproduktion. In der Theca follicularis präovulatorischer Follikel der Ratte induziert es die Progesteronproduktion und die Synthese von Prostaglandinen (ROBY u. TERRANOVA 1990).

2.2.3 Rolle des Seminalplasmas

Seminalplasma ist Transportmedium für Spermien, bietet Nährstoffe und schützt Spermien durch protektive Stoffe (MANN 1964). Es gilt zudem als ein wichtiges Mittel zur Kommunikation zwischen männlichem und weiblichem Reproduktionstrakt und ist ein Schlüsselfaktor in der Vorbereitung des weiblichen Reproduktionstraktes auf die Trächtigkeit (ROBERTSON 2007).

Die transzervikale Verabreichung von Seminalplasma am Beginn des Östrus konnte das Intervall zwischen Östrus und Ovulation um 14 Stunden vorverlegen (WABERSKI et al.

1995). Bei Natursprüngen zu Beginn des Östrus konnte eine um 2,8 Stunden reduzierte Ovulationsdauer im Vergleich zu nicht bedeckten Sauen festgestellt werden (SIGNORET et al. 1972). In Herden mit geringer Reproduktionsleistung oder auch einer weniger optimalen Zuchtpraxis kann Seminalplasma durch Naturpaarung mit einem gesunden Eber zur Verbesserung der Reproduktionsleistung führen (ROBERTSON 2007).

Nach Insemination wurde ein Influx inflammatorischer Zellen in den Uterus beobachtet. Die neuroendokrine Stimulation durch den Paarungsakt selbst ist nach O´LEARY et al. (2004) nicht für diese Reaktion notwendig. Die inflammatorische Antwort des Uterus auf eine Insemination wurde zunächst bei Kaninchen (TAYLOR 1982), später jedoch auch bei anderen Spezies (ROBERTSON 2005) nachgewiesen. Bei Mäusen konnte nach Interaktion von Seminalplasma mit zervikalen und uterinen Epithelzellen eine Aktivierung proinflammatorischer Zytokine wie GM-CSF, IL-6, MCP-1 sowie des Chemokins CXCL8 (Interleukin-8) beobachtet werden (ROBERTSON et al. 1996a; ROBERTSON et al. 1998), die zu einem Influx von Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten in den Uterus führt (ROBERTSON et al. 1996a). Vor allem Makrophagen beeinflussen durch freigesetzte Enzyme und Signalmoleküle die endometriale Umgebung, um die Implantation und die plazentare Entwicklung zu fördern (ROBERTSON 2005). BOLLWEIN et al. (2003) konnten eine geringere inflammatorische Antwort im Uterus von Stuten feststellen, die eine intrauterine Infusion mit Samenverdünner erhielten verglichen mit Stuten, denen Seminalplasma oder reiner Samen appliziert wurde. Auch bei Sauen bewirkten intrauterine Seminalplasmainfusionen verglichen zu PBS-Infusionen die Synthese von GM-CSF, IL-6, MCP-1 und PTGS2 und führten somit zu einer Infiltration von Makrophagen, MHC II positiven Makrophagen sowie dendritischen Zellen (O'LEARY et al. 2004).

Verschiedene Studien zeigten, dass TGF-β im Seminalplasma für die Induktion der inflammatorischen Uterusantwort bei Nagern verantwortlich ist (TREMELLEN et al. 1998;

ROBERTSON et al. 2002). Nach ROBERTSON et al. (2002) wird es bei Mäusen testosteronabhängig in der Seminalblasendrüse gebildet, ist im Seminalplasma vorwiegend in einer latenten Form vorhanden, um dann im weiblichen Reproduktionstrakt durch Plasmin und andere Enzyme aktiviert zu werden. TGF-β wurde in hohen Konzentrationen im Seminalplasma von Ebern entdeckt (O'LEARY et al. 2002), wo es nach ROBERTSON et al.

Hyporeaktivität gegenüber paternalen MHC-Klasse-I-Molekülen sorgt. Neben dem gerade erwähnten TGF-β zeigte CLAUS (1990), dass Seminalplasma von Ebern reich an Östrogen ist (>11,5 µg/Ejakulat). Nach intrauteriner Infusion physiologischer Mengen an Östrogen konnte eine um das 2,5-fache höhere Frequenz der Kontrakilität des Uterus nachgewiesen werden, die durch die Freisetzung von PGF2α bedingt war (CLAUS 1990) und zur Förderung des passiven Spermientransportes beitragen kann (O'LEARY et al. 2002). Zudem stieg die periphere Östrogenkonzentration an, und die LH-Freisetzung wurde beeinflusst. Weiterhin wurde nach Östrogeninfusion PGF2α in Uterusvenen gemessen, welches über den Counter current transfer in den Eierstock gelangt (CLAUS 1990) und damit an der Regulation der Ovarfunktion (Follikelentwicklung und Ovulation) beteiligt sein kann. Eine transzervikale Verabreichung von Prostaglandinen selbst hatte allerdings keinen Einfluss auf den Ovulationszeitpunkt (WABERSKI et al. 1995). Daneben wiesen GUTSCHE et al. (2003) CXCL8 im Seminalplasma des Menschen nach, welches zusammen mit TGF-β die Synthese von IL-1β, IL-6 und LIF (leucocyte inhibitory factor) induziert.

Die Effekte des Seminalplasmas sind nicht nur im Uterus erkennbar, sondern weiten sich auf die Ovarfunktion aus. So konnte eine größere Menge an MHC-II⁺-Makrophagen und/oder dendritischen Zellen im Stroma sowie in der Theca follicularis prä- und periovulatorischer Follikel in Schweinen gefunden werden, die mit Seminalplasma behandelt wurden (O'LEARY et al. 2002). Dagegen wurde durch Seminalplasma kein Effekt auf die Anzahl ovulierender Oozyten beobachtet. Das Gewicht von Corpora lutea war bei Schweinen, die Seminalplasmainfusionen 2 Stunden nach hCG-Injektion (eCG/hCG Synchronisation) erhielten, höher. Zudem induzierte Seminalplasma bei diesen Tieren einen Anstieg des Plasmaprogesterons zwischen Tag 5 und 9 nach der Infusion. In vitro reagierten Granulosa- und Thecazellen von präovulatorischen Follikeln, die von mit Seminalplasma behandelten Tieren stammten, stärker mit Proliferation und Progesteronanstieg auf Wachstumsfaktoren (GF) und Gonadotropin (O'LEARY et al. 2006). Der Einfluss des Seminalplasmas auf die Ovarfunktion kann nach Robertson (2007) zum einen durch den lokalen Transport von Bestandteilen des Seminalplasmas und zum anderen durch Samen-induzierte Effektormoleküle stattfinden. Laut WABERSKI et al. (1995) impliziert die Ovulationsvorverlegung durch Seminalplasma keinen systemischen Kommunikationsweg, sondern einen lokalen.

2.3 Immunrelevante Zellen im Ovar

2.3.1 Überblick

Eine Anzahl verschiedener Leukozytenpopulationen einschließlich Mastzellen, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten wurden im Ovar beschrieben (BUKULMEZ u. ARICI 2000). Auf Lokalisationen und Funktionen der Mastzellen sowie der Monozyten/Makrophagen im Ovar wird weiter unten eingegangen (2.3.2, 2.3.3).

Bei neutrophilen Granulozyten handelt es sich um hoch spezialisierte Phagozyten, die als primäre Effektorzellen bei akuten Entzündungen im Vordergrund stehen. Sie sind durch ihren gelappten Kern gekennzeichnet und besitzen fünf verschiedene Granulatypen, die Proteine enthalten, welche der Abtötung und Verdauung von Mikroorganismen dienen.

(HOLLÄNDER 2006). Neutrophile Granulozyten wurden bei Ratten in der Medulla, der Theca follicularis, Granulosa der Follikel und im Gelbkörper des Ovars nachgewiesen (BRÄNNSTRÖM et al. 1993). Sie stellen neben den Makrophagen den hauptsächlichen Leukozytensubtyp im Ovar dar (BUKULMEZ u. ARICI 2000). Bei Menschen (BRÄNNSTRÖM et al. 1994b), Schafen (CAVENDER u. MURDOCH 1988) und Schweinen (STANDAERT et al. 1991) wurde innerhalb weniger Stunden nach dem LH-Peak die Migration neutrophiler Granulozyten in präovulatorische Follikel nachgewiesen.

BRÄNNSTRÖM et al. (1993) stellten um den Ovulationszeitpunkt herum einen 3-fachen Anstieg der Dichte neutrophiler Granulozyten in der Medulla und einen 8-fachen Anstieg innerhalb der Theca follicularis ovulierender Follikel bei Ratten fest. Neutrophile Granulozyten scheinen sich in der Theca follicularis interna zu konzentrieren und sind zahlreich in der apikalen Region des Follikels zu finden (BRÄNNSTRÖM u. ENSKOG 2002).

Eosinophile Granulozyten kommen vorwiegend in der Haut und im Bereich der Mukosa der Lunge und des Gastrointestinaltraktes vor. Nur ein kleiner Teil hält sich im Blut auf. Sie spielen sowohl in der Abwehr mehrzelliger Parasiten als auch in der Pathogenese allergischer Erkrankungen eine Rolle. Ihre Funktion liegt in der Bildung und Exozytose von

und eosinophilen Granulozyten beschränkte Vorläuferzellen (HOLLÄNDER 2006). Bei Schweinen (STANDAERT et al. 1991) und Schafen (CAVENDER u. MURDOCH 1988) wurden eosinophile Granulozyten mittels Giemsafärbung und Elektronenmikroskopie im Ovar entdeckt. Beim Schwein sind eosinophile Granulozyten der prominenteste Zelltyp in der Theca follicularis präovulatorischer Follikel und im Restgelbkörper. In den übrigen Gelbkörperphasen sind sie nur wenig vertreten (STANDAERT et al. 1991). CAVENDER und MURDOCH (1988) sprechen beim Schaf ebenso von einer Migration eosinophiler Granulozyten in die Theca follicularis zum Ovulationszeitpunkt.

Lymphoide Zellen umfassen T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen. T-Zellen konnten im Rattenovar nachgewiesen werden (BRÄNNSTRÖM et al. 1993). Ihre Anzahl steigt vor allem in der Theca follicularis nach der Ovulation. T-Zellen, die in das Ovar migrieren, sind CD8⁺-positiv. Insofern wird eine selektive Infiltration des Ovars mit CD8⁺-Zellen vermutet (BRÄNNSTRÖM et al. 1993). BRÄNNSTRÖM et al. (1994b) beschrieben, dass beim Menschen T-Lymphozyten in nur geringer Zahl in präovulatorischen Follikeln und in Corpora lutea vorhanden waren und keine Veränderungen in ihrer Dichte während des Zyklus zu beobachten waren. ZHOU et al. (2009) wiesen in der Theca follicularis der Maus eine neue CD8αα⁺-Population nach, deren Ursprung wahrscheinlich im Thymus liegt. Ein großer Influx dieser Zellen in Follikel wurde zum Zeitpunkt der Ovulation festgestellt. In einer Studie von BEST et al. (1996) dagegen konnten beim Menschen keine T-Lymphozyten in entwickelnden Follikeln nachgewiesen werden, allerdings in Blutgefäßen, die die Theca follicularis versorgen. In der Theca follicularis und Granulosa atretischer Follikel sowie in frisch gebildeten Gelbkörpern wurden wenige T-Zellen nachgewiesen. In Restgelbkörpern nimmt nach BEST et al. (1996) deren Anzahl zu. B-Lymphozyten und natürliche Killerzellen wiesen BRÄNNSTRÖM et al. (1994b) in geringen Anzahlen nach, die keinen zyklusbedingten Schwankungen unterlagen.

2.3.2 Mastzellen

Mastzellen sind gewebeständige Sensor- und Effektorzellen des angeborenen Immunsystems.

Zum einen besitzen sie die Fähigkeit, schnell und selektiv geeignete Mediatoren zu produzieren, zum anderen verstärken sie durch ihre Nähe zu Blutgefäßen die Effektorzellrekrutierung. Zusätzlich können sie Induktionsprozesse adaptiver

Immunantworten steuern (MARSHALL 2004). Eine Anzahl an Faktoren einschließlich Zytokinen ist an der Regulation der Mastzellaktivierung, -reifung, -differenzierung und - proliferation beteiligt (GALLI 1993). Mastzellen kommen vorwiegend in der Haut, in den Atemwegen sowie im Darm vor. Früher wurden Mastzellen des Mucosatyps, die in der Darm- oder Atemwegsmukosa vorkommen, von den Mastzellen der Haut und der Peritonealhöhle, die als sogenannter Bindegewebetyp bezeichnet wurden, unterschieden. Heute werden die Mastzellen beim Menschen aufgrund des Proteasengehaltes der Granula in zwei Subtypen klassifiziert, zum einen in die MC^T, die nur Tryptase enthalten und zum anderen in die MC^TC, die sowohl Tryptase als auch Chymase enthalten. Die MC^T können eher auf der mucosalen Seite gefunden werden (MARSHALL 2004).

Neben den oben genannten Lokalisationen konnten Mastzellen auch im Ovar bei Menschen (BRÄNNSTRÖM u. ENSKOG 2002), Mäusen (KRISHNA u. JAISWAL 1994), Ratten (JONES et al. 1980; PARSHAD u. KATHPALIA 1990; BATTH u. PARSHAD 2000), Hamstern (KRISHNA et al. 1989), Rindern (NAKAMURA et al. 1987), Ziegen (KARACA et al. 2008) und Vögeln (PARSHAD u. KATHPALIA 1993) gefunden werden.

Im menschlichen Ovar ist dieser Zelltyp vorwiegend in der Medulla lokalisiert. Zum Zeitpunkt der Ovulation kommt es zu einem Anstieg der Aktivität (BRÄNNSTRÖM u.

ENSKOG 2002). Bei der Ratte wurden Mastzellen im Ovar in der Medulla und im Hilus ovarii sowie im Eileiter nachgewiesen. In der Medulla konnten Mastzellen in der Nähe von Blut- und Lymphgefäßen beobachtet werden. Die histochemisch erkennbare Anzahl an Mastzellen in der Medulla stieg während des Östrus an, sank während des Diöstrus und Metöstrus, um dann während des Proöstrus extrem niedrig zu sein. Die Mastzellanzahl im ovariellen Hilus und im Eileiter der Ratte unterlag keinen zyklischen Schwankungen (JONES et al. 1980). Nach JONES et al. (1980) kommt es bei der Ratte während des Proöstrus in der Medulla zu einer Degranulation der Mastzellen und damit verbunden zu einer signifikanten Reduktion der unter dem Lichtmikroskop sichtbaren Zellen. Auch BATTH und PARSHAD (2000) bestätigen bei der Ratte eine höhere Anzahl an Mastzellen während des Östrus, jedoch auch während des Diöstrus im Vergleich zu den restlichen Zyklusphasen. PARSHAD und KATHPALIA (1990) wiesen Mastzellen in der Wand atretischer Follikel und im Gelbkörper nach. Bei Ziegen wurden Mastzellen zwar nicht im Gelbkörper und Follikel, aber im

NAKAMURA et al. (1987) fanden bei Rindern Mastzellen in der Medulla, im Bereich des Hilus, aber auch in der Theca follicularis externa der Follikel, wie auch im Corpus luteum.

Die Arbeitsgruppe stellte einen signifikanten Anstieg der Mastzellen in der Theca follicularis externa des dominanten Follikels am Tag 19 des Zyklus fest, wie auch ein signifikantes Absinken der Anzahl an Tag 4 der Gelbkörperphase. Das Vorkommen von Mastzellen im Cortex und in der Medulla des Ovars wurde auf ein gut entwickeltes interstitielles kortikales Stroma und einen langen Östruszyklus zurückgeführt (NAKAMURA et al. 1987). Bei Hühnern konnten Mastzellen in der Medulla, im Hilus, aber auch in der Theca follicularis nicht atretischer und atretischer Follikel nachgewiesen werden, wobei die Anzahl an Mastzellen im Bereich der Follikelwand signifikant geringer als im Bereich des Hilus und Stromas war. GUPTA und GILBERT (1988) stellten eine Verringerung der Anzahl an Mastzellen in der Follikelwand nach der Ovulation fest. Kurzzyklische Tiere wie Ratten, Hamster und Mäuse wiesen Mastzellen nur in der Medulla auf (JONES et al. 1980;

KRISHNA et al. 1989). Genaue Untersuchungen bezüglich der Mastzelllokalisationen im Ovar des Schweines wurden bisher noch nicht durchgeführt.

Mastzellen besitzen drei Hauptklassen an Mediatoren, über die sie ihre Wirkung entfalten können (MARSHALL 2004):

1) vorgeformte Granula-assoziierte Mediatoren (Proteasen, vasoaktive Amine, z.B. Histamin und Proteoglykane, z.B. Heparin)

2) neu erzeugte Lipidmediatoren (z.B. LTC4 steigert die Gefäßpermeabilität und hilft bei der Rekrutierung von eosinophilen Granulozyten, LTB4 fördert die Neutrophilenrekrutierung) 3) eine große Vielfalt an Zytokinen und Chemokinen (klassisch proinflammatorische

Zytokine wie TNF-α und IL-1β und Zytokine mit antiinflammatorischen oder immunmodulatorischen Effekten wie IL-10 und TGF-β)

Mastzellen sind eine Quelle von TH2-Typ-Zytokinen einschließlich IL-4, IL-5, IL-13, aber auch TH1-Typ-Zytokinen wie IFN-γ, IL-12 und IL-18, sowie von Chemokinen wie CCL5, CXCL8 und CXCL10 (MARSHALL 2004).

Zu den zahlreichen Rezeptoren auf der Oberfläche von Mastzellen gehören die konstitutiv exprimierten hochaffinen Rezeptoren für IgE, mäßig affine Rezeptoren für IgG (CD32),

Rezeptoren für C3a und C5a (HOLLÄNDER 2006) sowie Rezeptoren für Pathogene (TLR-2, TLR-4) (MARSHALL 2004). Nach einer Stimulation mit IFN-γ exprimieren sie zudem hochaffine Rezeptoren für IgG (CD 64) (WOOLHISER et al. 2001).

Neben vielen weiteren Rezeptoren besitzen Mastzellen auch TNF-Rezeptoren. VAN OVERVELD et al. (1991) prüften die Effekte von humanem rekombinanten TNF-α auf humane Mastzellen und konnten eine konzentrationsabhängige Freisetzung von Histamin und Tryptase beobachten. Mastzellkulturen von Ratten, die über Nacht mit TNF-α inkubiert wurden, produzierten hohe Konzentrationen des Chemokins RANTES (CCL5), welches chemoattraktiv und aktivierend für Monozyten, T-Zellen und Mastzellen ist (KEMPURAJ et al. 2005).

KRISHNA und TERRANOVA (1985) beobachteten bei Hamstern einen Anstieg an degranulierenden Mastzellen zum Zeitpunkt des LH-Peaks. Zudem wurden verglichen mit Proben, die vor und nach dem LH-Peak gewonnen wurden, signifikant höhere Histaminkonzentrationen während des LH-Peaks gemessen. Auf das in den Granula vorhandene Histamin und seine Bedeutung im Ovulationsgeschehen wird unter 2.4.1 näher eingegangen. Es konnten bei Hamstern in der Nähe von hilaren Mastzellen Substanz P und Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) enthaltene Nerven beobachtet werden. Substanz P sowie VIP induzierten die Degranulation von Mastzellen in vitro (NAKAMURA u.

TERRANOVA 1987).

2.3.3 Makrophagen

Bei Makrophagen handelt es sich um organständige Effektorzellen, welche in zahlreichen Geweben angesiedelt sind. Die Vorläuferzellen der Makrophagen sind die Monozyten, die sich im Knochenmark aus hämatopoetischen Vorläuferzellen entwickeln. Anschließend wandern sie in die Blutgefäße, in denen sie im Blutstrom durch den Körper zirkulieren. Durch Transmigration in unterschiedliche Gewebe differenzieren sie sich abhängig von lokal aktiven Faktoren, die sowohl die Funktion als auch den Phänotyp bestimmen, zu gewebespezifischen Makrophagen. Sie dienen der Phagozytose von Mikroorganismen und Gewebedebris und können die unspezifische Immunantwort mit der Ausbildung einer antigenspezifischen T-

sezernieren (GORDON 1999). Typische Bestandteile ihrer im Zytoplasma vorhandenen Lysosomen sind zahlreiche hydrolytische Enzyme wie Lysozym, ß-Glucoronidase, saure Phosphatase, Ribonukleasen, Lipasen, Kathepsin, Hydrolasen, Esteroproteasen und neutrale Proteasen. Diese können zum Teil als Antwort auf über Fc- und Komplementrezeptoren aktivierende Signale sowie als Antwort auf eine Zytokinstimulation sezerniert werden.

Daneben verfügen Makrophagen über Rezeptoren für IgG, IgE, sowie Komplementrezeptor 3, Makrophagen-Mannose-Rezeptor, Scavenger-Rezeptoren, CD14, Toll-like-Rezeptoren sowie Chemokinrezeptoren, die ein gezieltes und kontrolliertes Einwandern in spezifische Gewebe ermöglichen. Über M-CSF (macrophage colony-stimulating-factor), GM-CSF (granulocyte- macrophage-stimulating factor) und CSF-1 (colony-stimulating factor-1)-Rezeptoren wird das Wachstum und die Differenzierung der Makrophagen gesteuert. Makrophagen besitzen spezifische Rezeptoren für IFN-γ, IL-4, GM-CSF und TNF-α (HOLLÄNDER 2006). Sie produzieren proinflammatorische Zytokine wie IL-1, IL-6, CXCL8, TNF-α, und GM-CSF (BRÄNNSTRÖM u. NORMAN 1993).

In diversen Spezies konnten Makrophagen im Ovar nachgewiesen werden. So endeckte HUME et al. (1984) Makrophagen in der Medulla und im Bereich präovulatorischer Follikel der Maus. Später beschrieben BRÄNNSTRÖM et al. (1993) die Lokalisation von Makrophagen in der Medulla und weniger zahlreich in der Theca follicularis präovulatorischer Follikel bei der Ratte. Im humanen Ovar wurden Makrophagen im Stroma, in der Tunica albuginea und der Theca follicularis, wie auch in der Follikelflüssigkeit nachgewiesen (BRÄNNSTRÖM u. ENSKOG 2002). Daneben wurden auch bei Hamstern (KASUYA u. KAWABUCHI 1998), Schafen (CAVENDER u. MURDOCH 1988) und bei Vögeln (BARUA et al. 1998) ovarielle Makrophagen beobachtet. Beim Schwein gelten Makrophagen als der dominante Leukozytensubtyp im Ovar (STANDAERT et al. 1991).

ARAKI (1996) beobachtete bei op/op-Mäusen, die eine Mutation im M-CSF-Gen besitzen und sich damit durch eine Reduktion der Monozyten und Makrophagenzahl auszeichnen, eine geringere Fruchtbarkeit. Makrophagen spielen nach WU et al. (2004) vermutlich eine Rolle bei der Follikulogenese, bei dem Gewebeumbau während der Ovulation und bei der Bildung und Regression des Gelbkörpers (Abb. 3).

Abb. 3: Beeinflussung der Ovarfunktion durch Makrophagen- nach WU et al. (2004).

(1) Makrophagen sind Phagozyten, die an der Entfernung von Zelltrümmern beteiligt sind, sie präsentieren antigene Peptide und aktivieren T-Zellen. (2) Die Zellen setzen Zytokine und Wachstumsfaktoren frei, welche vielfältige funktionelle Aspekte von Granulosa- und Thecazellen regulieren. (3) Die Freisetzung von Chemokinen führt zur Migration und Aktivierung weiterer Monozyten, neutrophiler Granulozyten und T-Zellen. (4) Makrophagen sezernieren eine Vielzahl an Proteasen, die an der Matrixauflösung beteiligt sind.

Bisher wurden direkte Interaktionen zwischen Primordialfollikeln und Makrophagen nicht beobachtet, was WU et al. (2004) zu dem Schluss führt, dass Makrophagen frühe Follikelphasen nicht beeinflussen. Während späterer Follikelphasen dagegen verändert sich bei der Maus die Verteilung und Anzahl der Makrophagen, die nun zunehmend in der Theca follicularis lokalisiert sind. Es wird vermutet, dass Makrophagen über die Bildung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen die Zellproliferation und das Follikelwachstum beeinflussen (WU et al. 2004). Bei der Ratte wurde ein fünffacher Anstieg der Makrophagenanzahl in präovulatorischen Follikeln kurz vor der Ovulation festgestellt (BRÄNNSTRÖM et al. 1993). Auch beim Menschen konnte ein Anstieg in der Anzahl der Makrophagen in der Theca follicularis nachgewiesen werden (BRÄNNSTRÖM et al. 1994b).

STAENDAERT et al. (1991) beobachteten beim Schwein einen signifikanten Anstieg der Makrophagendichte in präovulatorischen Follikeln, wobei sich der relative Anteil an Makrophagen an Gesamtleukozyten im Ovar während des Zyklus nicht veränderte. Die

Modulation der Chemokinproduktion zu sein. So wies diese Arbeitsgruppe die Induktion von MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) durch LH / hCG im Rattenovar nach.

Koinkubationen mit humanen Granulosazellen bestätigten dieses Ergebnis (ARICI et al.

1997). Makrophagen setzen einige Zytokine wie IL-1β (ADASHI 1998) und TNF-α frei (BRÄNNSTRÖM et al. 1995), die im Ovulationsprozess eine Rolle spielen. Neben Chemokinen wie MCP-1 und MCP-3, die im präovulatorischen Follikel der Ratte hochreguliert werden (WONG et al. 2002), sind auch die von Makrophagen produzierten proteolytischen Enzyme bei der Ovulation von Bedeutung. So konnten Matrixmetalloproteinasen (MMP) in den Ovarien einiger Spezies (Menschen, Ratten, Rinder, Schafe, Pferde, Schweine) nachgewiesen werden (LIU et al. 1999; RILEY et al. 2001;

GOTTSCH et al. 2002; IMAI et al. 2003; LIND et al. 2006; RIBEIRO et al. 2006; KLIEM et al. 2007). MMP-2, MMP-9 und MMP-1 werden z.B. in der Theca follicularis im Zusammenhang mit der Ovulation exprimiert und aktiviert (HAGGLUND et al. 1999;

CURRY u. OSTEEN 2001). Im Rahmen eines Rattenovarperfusionsmodells resultierte eine Hemmung der Aktivität der Kollagenasen und Proteinasen in einer Hemmung der Ovulation (BRÄNNSTRÖM et al. 1988).

2.4 Lösliche Mediatoren im Ovar

2.4.1 Histamin

Histamin ist ein vasoaktives Amin, welches in Mastzellen, basophilen Granulozyten, enterochromaffinen Zellen, Neuronen und in Endothelzellen des Blutgefäßsystems enthalten ist und eine lokale Erweiterung von Blutgefäßen sowie Kontraktionen glatter Muskulatur verursacht. Histamin wird aus L-Histidin von einer L-Histidin-Decarboxylase (HDC) synthetisiert. Inaktiviert wird es hauptsächlich durch zwei Enzyme: Histamin N- Acetyltransferase (HMT) über eine Methylierung (im zentralen Nervensystem und in der Peripherie) und Diamin-Oxidase (DAO) über die oxidative Deamination (nur in der Peripherie) (MASLINSKI 1975a, b). Der Effekt von Histamin wird über Rezeptoren vermittelt, die G-Protein gekoppelt sind: H1, H2, H3 und H4.

Mastzellen sind in Ovarien verschiedener Spezies (Ratten, Hamster, Rinder, Menschen, Rhesusaffen, Schweine) vorhanden (KRISHNA et al. 1989). Neben Heparin gilt Histamin als

ein wichtiges Produkt von Mastzellen (ATKINS et al. 1985). In Ovarien von Ratten wurden Konzentrationen von 0,7-1,29 µg Histamin /g Ovar gemessen (SZEGO u. GITIN 1964), bei Hamstern 1-5 µg Histamin /g Ovar (KRISHNA u. TERRANOVA 1985), bei Kaninchen <1-6 µg Histamin /g Ovar (KRISHNA et al. 1989) und beim Menschen 3-10 µg Histamin /g Ovar (MORIKAWA et al. 1981). Histamin wird für den präovulatorischen Anstieg der Kapillarpermeabilität, des Blutflusses und für die Vasodilatation im Ovar verantwortlich gemacht (KRISHNA et al. 1986). Der durch LH induzierte Anstieg des ovariellen Bluflusses, der eine wichtige Rolle beim Follikelwachstum und bei der Ovulation spielt, wird nach JONES et al. (1980) vermutlich durch die Freisetzung ovariellen Histamins verursacht.

SZEGO und GITIN (1964) beschrieben bei Ratten eine Reduktion der Histaminkonzentration nach Gonadotropinstimulation, was mit einer stärkeren Degranulation ovarieller Mastzellen verbunden ist (JONES et al. 1980). Histamin selbst, wie auch H1- und H2-Agonisten induzierten im Rattenperfusionsmodell Ovulationen, die allerdings in ihrer Anzahl geringer waren als die durch LH hervorgerufenen (SCHMIDT et al. 1988). Ebenso konnten KNOX und BECK (1976) bei Kaninchen nachweisen, dass Chlortrimeton, ein H1-Blocker, in vivo die Ovulation hemmen kann. Bei Kontrolltieren wurden zehn Tage nach hCG-Injektion im Mittel 10 Gelbkörper pro Tier gefunden, bei den Versuchstieren dagegen nur ein Gelbkörper pro Tier. Zusätzlich wurden in den Sera der Versuchstiere geringere Progesteronspiegel festgestellt. In vitro stimulierte die Perfusion präovulatorischer Follikel mit Histamin (3 mmol/l) die Progesteronsekretion (SCHMIDT et al. 1987a). Histamin führt in glatten Muskelzellen, die aus bovinen Follikeln gewonnen wurden zu konzentrationsabhängigen Kontraktionen, weswegen nach SCHMIDT et al. (1987b) eine Rolle des Histamins während der Ovulation wahrscheinlich ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass in vitro Histamin- induzierte Kontraktionen in der späten follikulären und in der ovulatorischen Phase stärker waren als in anderen zyklischen Phasen (KRISHNA et al. 1989).

2.4.2 Zytokine, Chemokine und Enzyme 2.4.2.1 Zytokine

Zytokine sind Proteine, die als Mediatoren von Zellen des Immunsystems und anderen Zellen

autokrine und endokrine Art und Weise ausüben zu können (BRÄNNSTRÖM u. NORMAN 1993). Inflammatorische Zytokine und Chemokine erhöhen z.B. die bakterizide Aktivität von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, fördern die Immigration von neutrophilen Granulozyten in infizierte Gewebe, induzieren die Reifung von dendritischen Zellen und kontrollieren die Antwort des erworbenen Immunsystems (SORDILLO et al. 1991).

Antiinflammatorische Zytokine hemmen die Synthese proinflammatorischer Zytokine und vermindern die Intensität der inflammatorischen Kaskade (TRACEY 2007). Im porcinen Ovar wurden in der vorliegenden Arbeit die pro-inflammatorischen Zytokine GM-CSF, IL-6 und TNF-α sowie die anti-inflammatorischen Zytokine TGF-β und IL-10 untersucht. Im Folgenden wird deren Bedeutung im Hinblick auf ihre Rolle im Ovar dargestellt.

Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)

GM-CSF wird durch immigrierende Leukozyten, Fibroblasten, wie auch Endothelzellen im Ovar gebildet (BRÄNNSTRÖM u. NORMAN 1993). GM-CSF stimuliert die Proliferation und Differenzierung von Makrophagen, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten und begünstigt bei reifen neutrophilen Granulozyten und Makrophagen die Synthese von Zytokinen wie IL-1, IL-6, G-CSF, M-CSF, PAF (HOLLÄNDER 2006).

Verschiedene Arbeitsgruppen konnten GM-CSF in Follikeln und Follikelflüssigkeit von Frauen nachweisen, wobei der größte Anteil an GM-CSF-mRNA und auch die stärkste Proteinsynthese in der Theca follicularis ermittelt wurde (ZHAO et al. 1995; JASPER et al.

1996). BRÄNNSTRÖM et al. (1994a) wiesen bei Ratten eine erhöhte GM-CSF-Syntheserate um den Ovulationszeitpunkt nach. Anhand von GM-CSF-knockout-Mäusen stellten JASPER et al. (2000) zwar eine ähnliche Ovulationsrate wie bei Wildtyp-Mäusen fest, allerdings war ihr Zyklus länger, die Steroidsynthese reduziert und die Anzahl aktivierter Makrophagen innerhalb des ovariellen Stromas und in der Theca follicularis zum Zeitpunkt der Ovulation vermindert. Die GM-CSF-Produktion von Mäusen wird nach ROBERTSON et al. (1996b) durch Gonadotropine und ovarielle Steroidhormone reguliert. Östradiol fördert die mRNA- Expression und Sekretion in uterinen Epithelzellen, wohingegen Progesteron einen hemmenden Effekt besitzt. Bei Ratten konnte GM-CSF in Gegenwart von IL-1β die Histaminfreisetzung von präovulatorischem ovariellen Gewebe induzieren (TAMURA u.

KOGO 1999).

Interleukin-6 (IL-6)

IL-6 wird von T-Lymphozyten, mononukleären Phagozyten, Fibroblasten, Mastzellen, Epithelzellen und Endothelzellen gebildet. Es handelt sich um ein endogenes Pyrogen, welches außerdem die Produktion von hepatischen Akut-Phase-Proteinen induziert (HOLLÄNDER 2006). IL-6-mRNA wurde in Ovarien von Mäusen nachgewiesen (MOTRO et al. 1990). BRÄNNSTRÖM et al. (1994a) konnten mithilfe eines Rattenovarperfusionsmodells die Bildung von IL-6 im Ovar messen, die allerdings keine zyklusbedingten Schwankungen zeigte. Eine mögliche ovulatorische Rolle von IL-6 liegt nach MARUO et al. (1992) in der Förderung der Gefäßpermeabilität. IL-6 reduziert außerdem die Proliferation von bovinen Granulosazellen in vitro und ist in die Regulation der Steroidsynthese und Sekretion involviert (ALPIZAR u. SPICER 1994).

Tumornekrosefaktor-α (TNF-α)

Lokalisationen und Funktionen von TNF-α im Ovar sind unter 2.2.2 beschrieben.

Transforming growth factor-β (TGF-β)

Das antiinflammatorische Zytokin TGF-β wird hauptsächlich von aktivierten T-Zellen, Monozyten und Makrophagen synthetisiert (HOLLÄNDER 2006). Es wird nach HUNTER (2003) sowohl in Theca - als auch in Granulosazellen des Ovars produziert und hemmt nach ROBERTS und SKINNER (1991) die Proliferation von Granulosa- und Thecazellen in bovinen Follikeln, steigert aber die Gonadotropin-vermittelte Steroidsynthese.

Interleukin-10 (IL-10)

IL-10 ist ein Zytokin, welches sowohl immunsuppressive als auch immunmodulatorische Eigenschaften besitzt und vor allem von TH2-polarisierten CD4⁺ und CD8⁺-T-Zellen gebildet wird, aber auch von Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen (HOLLÄNDER 2006).

Es konnten Konzentrationen von 0,7-10,8 pg/ml in humaner Follikelflüssigkeit gemessen werden. Es ergaben sich allerdings keine signifikanten Korrelationen zwischen Fruchtbarkeitsraten, Zellteilungsraten und follikulären IL-10-Konzentrationen (CERKIENE et al. 2008). IL-10 wurde außerdem in humanen Oozyten nachgewiesen (HUNTER 2003).

2.4.2.2 Chemokine

Bei Chemokinen handelt es sich um Moleküle mit chemotaktischer Aktivität. Sie regulieren die Migration der Leukozyten und beeinflussen die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren durch diese Zellen. Aufgrund der Anordnung von Cysteinen (C) in der Aminosäureabfolge des Moleküls werden die Chemokine in die vier Unterfamilien CXC , CC, C und CX3C eingeteilt (HOLLÄNDER 2006).

CXCL8

CXCL8 wird hauptsächlich von Monozyten und Makrophagen produziert (ZEILHOFER u.

SCHORR 2000) und ist an der Rekrutierung und Aktivierung neutrophiler Granulozyten sowie an der Zellproliferation und Angiogenese (RUNESSON et al. 2000) und auch am Ovulationsprozess beteiligt (BRÄNNSTRÖM u. ENSKOG 2002). UJIOKA et al. (1998) stellten eine Reduktion der Ovulationsrate durch blockierende CXCL8-spezifische Antikörper fest. Nach GOTO et al. (1997) scheint CXCL8 bei der Migration neutrophiler Granulozyten in Follikel zum Ovulationszeitpunkt eine Rolle zu spielen. So wurde bei Ratten ein dreifacher Anstieg an neutrophilen Granulozyten in der Medulla und ein achtfacher Anstieg in der Theca follicularis präovulatorischer Follikel zum Ovulationszeitpunkt nachgewiesen (BRÄNNSTRÖM et al. 1993). RUNESSON et al. (2000) konnten eine 5-10 fach höhere Konzentration an CXCL8 in der humanen Follikelflüssigkeit in der ovulatorischen Phase im Gegensatz zur follikulären Phase messen. In humaner Follikelflüssigkeit wurden CXCL8- Konzentrationen von 200 pg/ml festgestellt, im Serum dagegen 20 pg/ml (GOTO et al. 1997).

Vor allem Thecazellen, aber auch Granulosazellen sezernieren CXCL8 (RUNESSON et al.

2000). Die CXCL8-Produktion konnte in Granulosazellen durch FSH, in Theca- und Granulosazellen durch IL-1 verstärkt werden (RUNESSON et al. 2000). BUKULMEZ und ARICI (2000) wiesen einen Anstieg der CXCL8-mRNA-Kopien in ovariellen Stromazellen und Granulosa-Luteinzellen des Menschen nach hCG/LH-Gaben nach. GOTO et al. (1997) identifizierten im humanen Ovar CXCL8-produzierende Zellen hauptsächlich als Mastzellen.

2.4.2.3 Ausgewählte Enzyme des Arachidonsäurezyklus

Die Beteiligung von Prostaglandin-G/H-Synthasen (Cyclooxygenasen) und Lipoxygenasen am Ovulationsgeschehen wurde nachgewiesen (GAYTAN et al. 2006).

Prostaglandin-G/H-Synthase-2 (PTGS2)

Prostaglandin-G/H-Synthasen katalysieren die Bildung von Prostaglandin H2 (PGH2), aus dem über verschiedene weitere Isomerasen und Oxidoreduktasen bioaktive Prostaglandinisomere entstehen (SIMMONS et al. 2004). Die Expression der Prostaglandin- G/H-Synthase-2 (PTGS2) als eine Isoform der Prostaglandin G/H Synthase wird in präovulatorischen Follikeln durch LH induziert (SIROIS et al. 2004). Verschiedene Arbeitsgruppen konnten mithilfe von nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) als Hemmer von Prostaglandin-G/H-Synthasen die Ovulation bei vielen Säugetieren hemmen (GAYTAN et al. 2006). DAVIS et al. (1999) beobachteten, dass Prostaglandin-G/H-Synthase-2- defiziente Mäuse nicht ovulierten und eine abnormale Implantation aufwiesen. Eine Gonadotropinstimulation und gleichzeitige Gabe von PGE2 oder IL-1β konnten bei diesen Mäusen wieder Ovulationen hervorrufen. Prostaglandin-G/H-Synthase-2 ist nach DAVIS et al. (1999) für den Gonadotropin-induzierten ovariellen Prostaglandin-Spiegel erforderlich.

Ebenso sind Prostaglandin-G/H-Synthase-2-Prostanoide für die Stabilisation des Cumulus oophorus während der Ovulation notwendig (DAVIS et al. 1999).

Lipoxygenase-5 (ALOX5)

Lipoxygenase-5 nimmt eine zentrale Rolle in der Biosynthese von Leukotrienen ein (SAMUELSSON et al. 1987). Diese stellen inflammatorische Mediatoren dar, die an der Chemotaxis von Phagozyten (LTB4) und der Förderung der Gefäßpermeabilität (Cystenyl- Leukotriene) beteiligt sind (RADMARK et al. 2007). Lipoxygenase-5 wird in Granulozyten, Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert (RADMARK et al.

2007). In Homogenaten aus Rattenovarien und Graaf-Follikeln konnten REICH et al. (1985) mittels Chemilumineszenz Lipoxygenaseaktivität messen, die nach Stimulation mit hCG im Ovarhomogenat auf das zweifache und im Follikelhomogenat auf das fünffache anstieg.

TSAFRIRI (1995) beschrieb eine dosisabhängige Blockade der Ovulation durch

Follikel festgestellt werden, weswegen nach TSAFRIRI (1995) Eicosanoide für die LH- vermittelte Stimulation der follikulären Kollagenase verantwortlich zu sein scheinen.

KURUSU et al. (2009) konnten Lipoxygenase-5 sowohl in Theca- als auch in Granulosazellen präovulatorischer Follikel von Ratten immunhistochemisch nachweisen und hier einen Anstieg der Reaktivität nach hCG-Stimulation verzeichnen. Eine spezifische Hemmung der Lipoxygenase-5 führte auch in Studien dieser Arbeitsgruppe zu einer gestörten Ovulation.