Herstellung externer Standardreihen für die real time PCR

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Genexpression durch eine absolute Quantifizierung der in der quantitativen real time PCR (3.7.4) gemessenen Produkte vorgenommen. Dazu wurde von jeder Zielsequenz ein externer Standard, ein so genanntes Messplasmid hergestellt. Es wurden Genabschnitte der jeweiligen Zielkomponenten mit spezifischen Primern amplifiziert und in einen Vektor (9.5.2) kloniert. Mit dem rekombinanten Plasmid wurde ein chemisch kompetenter E.coli-Stamm transformiert, in dem das Plasmid vervielfältigt wurde. Nach Extraktion aus den Bakterien wurden Länge und Sequenz des klonierten Genabschnitts verifiziert. Standardreihen der linearisierten Messplasmide wurden parallel zu den Proben in der qRT-PCR gemessen und zur Berechnung der Kopienzahl der jeweiligen Gene herangezogen.

Gewinnung der Zielsequenzen

Die für die Klonierung erforderlichen Sequenzen der zu untersuchenden Komponenten wurden aus der cDNA porciner Zellen erhalten. Dazu wurden porcine mononukleäre Zellen (MNC) aus venösem Blut separiert und in vitro kultiviert. Die Produktion von Zytokinen und Chemokinen wurde durch die Stimulation der Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS, 1 µg/ml) und Staphylokokken Enterotoxin A (SEA, 1 ng/ml) angeregt. Die RNA der Zellen wurde wie unter 3.7.1 beschrieben extrahiert und in cDNA umgeschrieben.

Amplifikation der cDNA mittels konventioneller RT-PCR

Die Amplifikation der Zielsequenzen für die nachfolgende Klonierung erfolgte mittels konventioneller PCR in einem Biometra T-Gradient Gerät (9). Für jede Zielsequenz wurde eine PCR-Reaktion mit 5 µl cDNA und dem in Tab. 6 dargestellten Mastermix in einem sterilen 200 µl PCR-Röhrchen angesetzt. Zu Beginn der PCR wurde die cDNA für 3 min. bei 94°C vollständig denaturiert. Danach erfolgten 30 Zyklen, die sich aus einem Denaturierungsschritt für 45 sek. bei 94°C, der Primer-Anlagerung für 30 sek. bei 58°C und der Verlängerung des Produkts für 1 min. 30 sek. bei 72°C zusammensetzten. Abschließend erfolgte die finale Extension für 10 min. bei 72°C, um sicherzustellen, dass der für die nachfolgende Klonierung erforderliche Adeninüberhang am 3`Ende des Amplikons durch die Taq-Polymerase synthetisiert wird. Die Proben wurden unmittelbar nach Ablauf der PCR für die Klonierung verwendet.

Tab. 6: Mastermix für Biometra T-Gradient.

Reagenz Volumen Endkonzentration

10x PCR Rxn Puffer ohne MgCl21 5 µl 1x

10 mmol/l dNTP Mix ¹ 1 µl 0,2 mmol/l

50 mmol/l MgCl21 1,5 µl 1,5 mmol/l

Primer Mix (jeweils 10 µmol/l) 2,5 µl 0,5 µmol/l Taq Polymerase (5 U/µl) ¹ 0,25 µl 1 U RNAse/DNAse-freies Wasser ² 34,75 µl

Klonierung der Zielsequenz in den Vektor

Zur weiteren Vervielfältigung der Zielsequenz wurde diese in ein Plasmid kloniert, das nachfolgend zur Transformation von Bakterien genutzt wurde. Plasmide sind ringförmige, doppelsträngige DNA-Moleküle, die in der Bakterienzelle unabhängig von der chromosomalen DNA vermehrt werden. In dieser Arbeit wurde das Plasmid pCR®2.1-TOPO® (9.5.2) mit einer Länge von 3931 Nukleotiden verwendet. Es verfügt sowohl über ein Gen für Ampicillinresistenz als auch über ein lacZ Gen an der Ligationsstelle. Bei der TOPO® Cloning Reaktion wurden 3 µl des frischen PCR Produktes, 1 µl Salzlösung, 1 µl Wasser (RNase-/DNase-frei) mit 1 µl TOPO® Vektor für 15 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde nach Ablauf der Inkubationszeit umgehend für die Transformation chemisch kompetenter E. coli verwendet.

Transformation chemisch kompetenter E. coli

Nach der Ligation erfolgte die Transformation des Plasmids in chemisch kompetente E. coli (non-K-12 Wildtyp, W-Stamm, ATCC # 9637, S.A. Waksman). Das Einbringen des Vektors erfolgte mittels Hitzeschocktransformation. Dazu wurden 2 µl des frischen Ligationsansatzes mit 50 μl der Bakterien gemischt und für 30 min. auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte die Öffnung der Zellwand und Aufnahme der Plasmide durch Hitzeschock bei 42°C im Heizblock für 30 Sekunden. Nach Zugabe von 250 μl S.O.C. Medium (9.5.1.3) wurde der Ansatz für 1 Stunde auf einem Schüttler bei 37°C und 200 rpm inkubiert. In dieser Zeit konnten die transformierten Bakterien, die das Gen für die Ausbildung einer Ampicillinresistenz mit dem Vektor erhalten hatten, die Antibiotika-Resistenz ausbilden, bevor sie auf einer vorgewärmten LB-Agarplatte (9.3) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Nur diejenigen Bakterien, die erfolgreich mit dem Plasmid transformiert wurden, konnten sich zu Kolonien auf dem Ampicillin-haltigen Agar entwickeln. Um zusätzlich eine Aussage darüber treffen zu können, ob das transformierte Plasmid rekombinant ist, also die Zielsequenz enthält, besaß der Vektor ein lacZ-Gen, das für das Enzym β-Galaktosidase kodiert. Innerhalb dieses Genes lag der Ligationsbereich des Vektors, so dass bei einer erfolgreichen Ligation dieses Gen nicht mehr funktionsfähig war. Dem Festagar wurden x-Gal (9.4), ein chromogenes Substrat für ß-Galaktosidase, das bei Umsetzung blau erscheint sowie IPTG (9.4), ein Galaktose-Derivat, das als künstlicher Induktor des Laktose Operons fungiert und nicht in den

Metabolismus der Bakterien eingeht, beigesetzt. So konnten die Bakterienkolonien mit erfolgreich ligierten Plasmiden das x-Gal nicht umsetzen und erschienen weiß, während die Kolonien mit intaktem lacZ-Gen durch IPTG Galaktosidaseaktivität entwickelten und durch die Umsetzung von x-Gal eine blaue Färbung aufwiesen. Dies ermöglicht die Vorselektion der gewünschten Bakterienkolonien, die dann direkt isoliert und in LB-Flüssigmedium (9.4) vermehrt wurden.

Extraktion der Plasmide

Zur Untersuchung des Vorhandenseins rekombinanter Plasmide in den Bakterien wurden einzelne Kolonien in 3 ml Ampicillin-haltiges Medium überführt und für 12-16 h bei 37°C und 225 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Jeweils 1 ml der Suspension wurde bei 4°C bis zum Abschluss der Untersuchungen aufbewahrt, um ggf. für die Herstellung eines Glyzerolstocks zur Verfügung zu stehen. Die verbleibenden 2 ml der Bakteriensuspension wurden für die Plasmidextraktion mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (9.4) verwendet. Die Methode basiert auf einer Lyse der Bakterien unter alkalischen Bedingungen (BIRNBOIM u. DOLY 1979) und der anschließenden Adsorption der DNA auf einer Silica-Membran in einem System aus einer Mini-Säule und einem Auffangbehälter. Die Bakterien wurden dafür zunächst für 10 min. bei 8500 xg pelletiert und der Überstand abgenommen. Das Bakterienpellet wurde in 250 µl Puffer P1 resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt. Anschließend wurden 250 µl Puffer P2 hinzugefügt und durch mehrmaliges Schwenken durchmischt. Zur Kontrolle war dem Puffer P1 Lyse-Blau-Reagenz zugesetzt, die in P1 präzipitert und sich bei Mischung mit P2 löst und blau erscheint. Die Proben wurden solange geschwenkt, bis sie eine gleichmäßige blaue Färbung aufwiesen. Nach Zugabe von 350 µl Puffer N3 wurde die Probe unter mehrmaligem Schwenken farblos. Danach erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 16000 xg. Der Überstand wurde dann in ein im Kit enthaltenes Säulen-System pipettiert und nochmals 1 min. bei 16000 x g zentrifugiert und der Durchlauf verworfen. Das Säulen-System wurde anschließend einmal mit 500 µl Puffer PB (1 min., 16000 xg) und ein zweites Mal mit 750 µl Puffer PE (1 min., 16000 xg) gewaschen, der Durchlauf wurde jedes Mal verworfen. Zur Entfernung von Waschpufferresten wurde die Probe einmal leer zentrifugiert.

Die Säule wurde dann in ein frisches Eppendorf-Gefäß gesetzt und mit 50 µl Puffer EB

eluiert. Das Vorhandensein der klonierten Sequenz in den extrahierten Plasmiden wurde umgehend in der konventionellen PCR und mittels anschließender Agarosegelelektrophorese (s.u.) überprüft. Bakterienkolonien, die das gewünschte rekombinante Plasmid enthielten, wurden für die Anlage eines Glyzerolstocks (850 µl Bakteriensuspension + 50 µl Glyzerol) in 1 ml Kryoröhrchen verwendet. Die Bakterienstocks wurden bei -95°C eingefroren. Zur Überprüfung der Vollständigkeit der klonierten Sequenz wurden 600-700 ng der Plasmid-DNA mit 5 pmol M13 Vorwärtsprimer aus dem TOPO Cloning Kit zur Sequenzierung (SEQLAB, Göttingen) eingeschickt.

Agarose-Gelelektrophorese

Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit dem Farbstoff DNA Star sichtbar gemacht. Anhand eines mitgelaufenen Größenstandards konnte geprüft werden, ob die Größen der Amplifikate mit denen der klonierten Zielsequenzen übereinstimmen. Im elektrischen Feld wandern die DNA-Fragmente abhängig von ihrer Größe, der Stromstärke und der Spannung, den Pufferbedingungen und der Agarose-Konzentration im Gel unterschiedlich schnell und weit. Je kleiner die aufzutrennenden Fragmente sind, desto schneller bewegen sie sich im elektrischen Feld. Der dem Gel zugesetzte Farbstoff interkaliert mit der doppelsträngigen DNA, wodurch diese im UV-Licht sichtbar wird. Das Agarosegel wurde wie unter 9.5.1.3 beschrieben hergestellt und in die Gelelektrophoresekammer, in die ein Kamm für die Probetaschen gesteckt war, gegossen. Nach Erkalten des Gels wurde der Kamm herausgezogen. Auf einem Stück Parafilm wurden 10 µl der DNA-Probe mit 4 µl Blaumarker (9.5.1.3) gemischt und dann in die entsprechende Probentasche des Gels gegeben. Der Blaumarker ermöglichte zum einen die Kontrolle der Lauffront während der Gelelektrophorese, zum anderen wurde durch das in ihm enthaltene Glycerin die Probe beschwert und sank besser in die Probentasche ab. In eine Tasche des Gels wurden 3 µl eines 1 Kb-DNA-Längenstandards (9.4) zur Bestimmung der Größe der DNA-Fragmente pipettiert. Die Agarose-Gelelktrophorese wurde in 1x TBE-Laufpuffer bei einer Spannung von 85 V über 45 min. durchgeführt. Anschließend wurden im UV-Licht die Banden kontrolliert und mit einem Gel-Imager (9) fotografiert.

Linearisierung der Messplasmide

Aufgrund der physikalisch schlechteren Bindung der Primer an das ringförmige Messplasmid wird die dsDNA liniarisiert. Es wurden nur Restriktionsenzyme gewählt, deren Schnittstellen sich nicht in den Zielsequenzen befanden, um eine Fragmentierung der gewünschten Gene zu vermeiden. Für die Linearisierung von Messplasmiden wurden die Restriktionsenzyme Hind III und Sca I verwendet (Hind III schneidet zwischen: 5'-A↓AGCTT-3' und 3'-TTCGA↑A-5' und Sca I schneidet zwischen 5'-AGT↓ACT-3' und 3'-TCA↑TGA-5'). Hind III wurde aus Haemophilus influenzae Rd und Sca I aus Streptomyces caespitosus isoliert. Zusammen mit dem 10-fach konzentrierten Puffer „REact® 2“ (9.4) schneiden die Restriktionsenzyme 1 µg der dsDNA in einer Stunde bei 37°C. Nach der Linearisierung wurde das Amplikon mit dem QIAquick® PCR Purification Kit (9.4) aufgereinigt. Das Kit entfernt über ein System von Wasch- und Trennsäulen enzymatische Rückstände und adsorbiert die DNA unter alkalischen Bedingungen (pH≥7,5) an eine Silica-Membran. Alle Zentrifugationsschritte fanden über 1 min. bei 16000 xg und Raumtemperatur statt. Zunächst wurde die Probe in einem Eppendorf-Gefäß im Verhältnis 1:6 mit Puffer PBI gemischt. Das Einhalten des pH-Werts von ≥7,5 wurde durch die gelbe Farbe der Lösung angezeigt. Die Probe wurde auf ein mitgeliefertes Säulen-System gegeben und zentrifugiert. Nach Verwerfen des Durchlaufs wurde die Säule einmal mit 750 µl Puffer PE gewaschen und einmal leer zentrifugiert. Der Durchlauf wurde jedes Mal verworfen. Für die Elution der DNA wurde die Säule in ein frisches Eppendorf-Gefäß gesetzt, mit 50 µl Puffer EB bestückt und zentrifugiert. Von den aufgereinigten Messplasmiden wurden nach der Prüfung der Reinheit umgehend Verdünnungsreihen hergestellt.

Berechnung der Kopienzahl

Für die Herstellung einer Verdünnungsreihe der Messplasmide musste die Anzahl der Kopien pro µl bestimmt werden. Durch die Messung der optischen Dichte bei 260 nm (OD260) am Eppendorf Biophotometer wurde die Konzentration (C) der doppelsträngigen Plasmid DNA entsprechend der oben beschriebenen Formel (3.7.1) berechnet. Mittels dieser Information und der bekannten Länge der Zielsequenz war es möglich, die genaue Kopienzahl mit folgender Formel zu errechnen:

MW = P x 660g/mol

6x10²³[Kopien/mol] x DNA[g/µl]

MW[g/mol]

S[Kopien/µl] =

MW = Molekulargewicht des PCR-Produkts P = PCR-Produktlänge in Basenpaaren S = Standardkonzentration

DNA = im Photometer gemessene DNA Konzentration

660 g/mol = Durchschnittliches molekulares Gewicht der Basen

Aus der Stocklösung mit der berechneten Anzahl von Kopien pro µl wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt (10 - 100 Kopien/μl), die anschließend in der real time PCR getestet wurde. Die Standardreihe wurde bei -20°C gelagert. Nach 3-maligem Auftauen wurden die Verdünnungen verworfen und neu angesetzt.