Vorkommen von immunrelevanten Zellen im Ovar

5.2.2.1 Nachweis von Mastzellen im Ovar und Bestimmung der Mastzelldichte

In der vorliegenden Studie wurden die Toluidinblaufärbung, die Mastzellen aufgrund des starken metachromatischen Effektes der im Heparin veresterten Schwefelsäure rotviolett färbt (FREUND 2008), sowie die Färbung nach Pappenheim zur Identifizierung der Mastzellen durchgeführt. Beide Färbemethoden waren für die Identifizierung von Mastzellen geeignet.

Da die Färbung nach Pappenheim die Möglichkeit bot, sowohl eosinophile Granulozyten als auch Mastzellen innerhalb eines Schnittes zu erkennen, wurde diese für den Nachweis und die Bestimmung der Mastzelldichte verwendet. Verschiedene Studien setzten zur Darstellung von Mastzellen ausschließlich die Toluidinblaufärbung ein (JONES et al. 1980; KRISHNA u.

TERRANOVA 1985; NAKAMURA et al. 1987; KRISHNA et al. 1989). Hiermit wurden Mastzellen in den Ovarien von Menschen, Rhesusaffen, Mäusen sowie auch bei Schweinen nachgewiesen. Dagegen waren Mastzellen mit dieser Methode in Ovarien von Schafen, Meerschweinchen und Kaninchen nicht nachweisbar (KRISHNA et al. 1989). REIBIGER und SPANEL-BOROWSKI (2000) setzten in Ovarien von Rindern die Toluidinblaufärbung zur Identifizierung von Mastzellen und die Sirius Red-Färbung zur Identifizierung von eosinophilen Granulozyten ein. KARACA et al. (2008) wandte zum Nachweis von

Mastzellen in Ovarien von Ziegen eine kombinierte Färbung aus Toluidinblau sowie Alzianblau-Safranin an. Mittels Alzianblau-Safranin konnten sie das Ausmaß der Sulfatierung der Mastzellmatrix prüfen. Mucosamastzellen färben sich dabei blau, da sie nur gering-sulfatierte Glykosamine enthalten, Bindegewebsmastzellen färben sich rot, da sie hoch sulfatierte-Glykosamine enthalten (ZHUANG et al. 1999). So war es ihnen möglich die beiden Mastzellsubtypen (Mucosamastzelle, Bindegewebsmastzelle) zu unterscheiden. Beim Schwein allerdings war es in Untersuchungen durch XU et al. (1993) nicht möglich die zwei Mastzellsubtypen durch eine Färbung mit Alzianblau zu unterscheiden. KRISHNA et al.

(1989) konnten nach Fixierung mit Formalin und Färbung mit Toluidinblau geringer und stärker gefärbte Mastzellpopulationen in Ovarien von Menschen, Rindern und Schweinen unterscheiden. Sie gehen dabei von heterogenen Mastzellpopulationen aus, die z.T. ihre Anfärbbarkeit mit Toluidinblau durch Formalinfixierung verlieren. Insofern war die in der vorliegenden Studie letzlich zur Auswertung herangezogene Pappenheim-Färbung der sichere Weg zur Identifizierung der Mastzellen.

In dieser Arbeit wurden Mastzellen ausschließlich im Bindegewebe der Zona vasculosa nachgewiesen (4.2.2). Sie waren vorwiegend in der Nähe von Blutgefäßen lokalisiert.

KRISHNA et al. (1989) beobachteten Mastzellen beim Menschen, Rhesusaffen und auch beim Schwein in der Medulla, im Hilus ovarii, aber auch in der Theca follicularis externa und im Gelbkörperbereich ähnlich wie beim Rind (NAKAMURA et al. 1987). Nach REIBIGER und SPANEL-BOROWSKI (2000) befinden sich Mastzellen von Tieren mit einem ausgeprägten interstitiellen kortikalen Stroma und einem langen Zyklus (z.B. Kühe) sowohl im Kortex als auch in der Medulla des Ovars (2.3.2). Dagegen sollen Mastzellen bei Tieren mit einem kurzen Zyklus wie z.B. Ratten, Mäusen und Hamstern nur in der Medulla liegen.

Diese Einteilung beruht auf Untersuchungen von NAKAMURA et al. (1987) für das Rind und Untersuchungen von JONES et al. (1980) sowie KRISHNA et al. (1989) für Ratten und Hamster. Studien durch KARACA et al. (2008) unterstützten diese Unterteilung von REIBIGER und SPANEL-BOROWSKI (2000) durch Untersuchungen an Ziegen, die Mastzellen sowohl im Rindenstroma als auch in der Medulla zeigten. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist die Einteilung von REIBIGER und SPANEL-BOROWSKI (2000) zumindest für das Schwein in Frage zu stellen, da das Schwein mit einer

Zyklus als die Ziege aufweist (SCHNORR u. KRESSIN 2001).

In der vorliegenden Studie wurde der gesamte Schnitt mäanderförmig mikroskopiert und alle Mastzellen eines Schnittes wurden dabei erfasst (3.5.7). Da Mastzellen nur im Bindegewebe der Zona vasculosa lokalisiert waren (4.2.2), wurde die Mastzelldichte als Mastzellen/mm² Bindegewebe der Zona vasculosa berechnet. KARACA et al. (2008) untersuchten die Mastzellverteilung in der Medulla und im Cortex von Ziegenovarien. In 10 zufällig ausgewählten Bereichen pro Schnitt wurde hierbei die Anzahl an Mastzellen bestimmt.

Schlussendlich wurde die Anzahl der Mastzellen/mm² Gesichtsfeldgröße angegeben. Ebenso quantifizierten NAKAMURA et al. (1987) die Mastzellen in Ovarien von Kühen. In jedem untersuchten Schnitt zählten sie 7 Gesichtsfelder aus. JONES et al. (1980) wählten individuell einen optisch dichten Mastzellbereich in Schnitten von Rattenovarien aus, auf den sie ein Messraster (0,083 mm²) projizierten. Einzig in diesem Bereich wurden Mastzellen bestimmt.

Im Gegensatz zu den genannten Studien wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig alle Mastzellen eines Schnittes gezählt und nicht nur in willkürlich gewählten Bereichen erfasst.

Zusätzlich wurde ihre Anzahl auf das Gewebe, in dem sie lokalisiert waren, bezogen. Diese beiden Punkte waren zur Bestimmung einer relevanten Mastzelldichte von großer Bedeutung.

Ein Bezug auf die Gesamtfläche von Gesichtsfeldern wäre wenig zielführend gewesen, da das Bindegewebe der Zona vasculosa als ausschließliche Mastzellokalisation beim Schwein ungleichmäßig verteilt war. Insbesondere lag eine hohe Intraschnittvariabilität vor, zusätzlich eine relativ hohe Variabilität zwischen Schnitten verschiedener Tiere. Aber auch bezogen auf die Anzahl Mastzellen/mm² Bindegewebe der Zona vasculosa war eine sehr heterogene Verteilung der Mastzellen in den Schnitten auffällig. In vielen Gesichtsfeldern (40%) kamen im Bindegewebe der Zona vasculosa keine Mastzellen vor, in anderen Gesichtsfeldern waren massenhaft Mastzellen (bis zu 193 Mastzellen/mm² Bdgw. der Zona vasculosa) zu finden.

Verteilungsstudien zeigten, dass in allen Schnitten Gesichtsfelder mit keinen, wenigen (1-8 Mastzellen/mm² Bdgw. Zona vasculosa), mäßig vielen (9-64) und vielen bis sehr vielen (65-193) Mastzellen vorkamen. Das „typische“ Gesichtsfeld war nicht vorhanden, so dass erst die Auszählung aller Gesichtsfelder zu einem repräsentativen Wert der Mastzelldichte führen konnte.

Mit dieser Methodik wurden im Mittel in Kontrollovarien 18 und in Versuchsovarien 17 Mastzellen/mm² Bindegewebe der Zona vasculosa gezählt (4.2.2). Vergleichbare Studien bei

Schweinen liegen in der verfügbaren Literatur nicht vor. NAKAMURA et al. (1987) wiesen im Stroma von Rinderovarien im Mittel 10,15 Mastzellen pro Gesichtsfeld (0,0123 mm²/Gesichtsfeld) nach, im Hilus ovarii waren es 7,51 Mastzellen pro Gesichtsfeld. In Follikeln und Gelbkörpern waren es hier deutlich weniger Mastzellen (3,70 und 2,65 Mastzellen/Gesichtsfeld).

Ein signifikanter Einfluss der TNF-α-Injektion in die A. ovarica auf die Anzahl residenter Mastzellen konnte in der vorliegenden Studie nicht festgestellt werden (4.2.2). In dieser Studie wurden die Ovarien 45 Minuten nach der TNF-α-Injektion entnommen. Nicht auszuschließen ist, dass ein Einfluss auf die Mastzelldichte zu einem späteren Zeitpunkt auftreten könnte. Dieser Einfluss könnte entweder in der Einwanderung von Mastzellvorläufern und deren Ausdifferenzierung, in der Ausdifferenzierung bereits vorhandener unreifer Mastzellen oder in der Proliferation reifer, residenter Mastzellen bestehen. BATH und PARSHAD (1996) wiesen unreife Mastzellen mittels Alzianblaufärbung in allen Zyklusphasen adulter Ratten nach. Die höchste Anzahl unreifer Mastzellen entdeckten sie während des Östrus, weniger während des Diöstrus und Metöstrus, am wenigsten während des Proöstrus. Diese Ergebnisse sprechen für die Ausdifferenzierung neuer Mastzellpopulationen während des Zyklus bei der Ratte. CURRY et al. (1998) konnten die Formierung mitotischer Spindeln, die Chromosomenseparation und die Zellteilung bei reifen granulierten Mastzellen des Hundes beobachten.

5.2.2.2 Eosinophile Granulozyten

Eosinophile Granulozyten wurden in der vorliegenden Studie nur sehr selten und ausschließlich im Randbereich von Restgelbkörpern nachgewiesen (4.2.2). Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu den Untersuchungen von STANDAERT et al. (1991), die eosinophile Granulozyten als den häufigsten Leukozytensubtyp in der Theca follicularis präovulatorischer Follikel und in zurückbildenden Gelbkörpern beim Schwein beschreiben.

5.2.2.3 Nachweis von TNF-α-positiven Makrophagen

In der Serienschnittanalyse zur Untersuchung der Ko-Lokalisation TNF-RI- und TNF-α-exprimierender Zellen im Ovar (4.2.6) wurden TNF-α-positive Einzelzellen morphologisch