R 1Mastzellen / mm2 Bdgw. Zona vasculosapro Schnitt
5.5 Schlussfolgerungen und Ausblick
In der vorliegenden Studie konnte die Expression von TNF-RI in unterschiedlichen Ovarstrukturen nachgewiesen werden. TNF-α kann über diese Wirkorte am Ovulationsprozess beteiligt sein. TNF-α kann im Ovar selbst synthetisiert werden oder im Uterus synthetisiertes TNF-α kann das Ovar über die A. ovarica als Bestandteil des Counter current transfers erreichen. Mastzellen konnten in der vorliegenden Studie zwar
nachgewiesen werden, exprimierten zum Untersuchungszeitpunkt allerdings weder TNF-α noch TNF-RI. Insofern kann eine TNF-α-vermittelte Aktivierung der Mastzellen ausgeschlossen werden. Aufgund des Vorkommens von Mastzellen im Ovar und des Nachweises von Histamin in der Follikelflüssigkeit ist eine Rolle von Mastzellen im Ovulationsgeschehen weiterhin denkbar. Darüberhinaus stehen eine Vielzahl anderer Zellen im Ovar mit positivem TNF-Rezeptor I-Nachweis als potentielle Zielzellen für TNF-α zur Verfügung. Die selektive tendenzielle Hochregulation des proinflammatorischen PTGS2 und die selektive Herunterregulation anderer proinflammatorischer Mediatoren wie TNF-α und CXCL8 nach TNF-α-Applikation spiegeln das Bild einer nicht klassischen inflammatorischen Reaktion wider.
In weiteren Untersuchungen wäre die Gewinnung von Ovarien, die keinerlei Injektion und damit Manipulation erhielten, zur Untersuchung einer „basalen“ Mastzelldichte, eines
„basalen“ TNF-RI-/TNF-α-Nachweises und einer mRNA-Basisexpression von Zytokinen, Chemokinen und Enzymen erstrebenswert. Zusätzliche Studien zur Lokalisation von Mastzellen im Ovar auch in unterschiedlichen Zyklusstadien könnten Aufschluss über eine mögliche Rolle von Mastzellen im Ovulationsgeschehen des Schweines geben. Neben Lokalisationsstudien wären auch histologische und immunhistochemische Untersuchungen zur Erfassung des Granulationszustandes der Mastzellen wünschenswert. Die Ergebnisse der qRT-PCR zeigen, dass nachfolgende Untersuchungen möglichst den Einsatz der Laser microdissection-Technik nutzen sollten, um die mRNA-Expression der Zytokine, Chemokine, Enzyme einzelnen Zellen zuordnen zu können. Weiterführende Untersuchungen, die unterschiedliche Probeentnahmezeitpunkte berücksichtigen, wären auch hier wünschenswert.
6 Zusammenfassung
Maren Krüger:
Untersuchung TNF-α vermittelter Effekte auf präovulatorische Ovarien bei Jungsauen Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Arbeitshypothese zu prüfen, dass Zytokine (TNF-α) in die A. ovarica als Bestandteil des Counter current transfers appliziert, das Ovar erreichen, im Ovar mit Hilfe von Mastzellen eine inflammatorische Reaktion auslösen und so hypothetisch einen ovulationsfördernden Effekt besitzen.
Insgesamt 14 Jungsauen wurden nach Feststellung der Brunst unter Inhalationsanästhesie operiert. Nach einem Medianschnitt in der Linea alba wurden die Ovarien vorgelagert und die jeweilige A. ovarica im Bereich ihres Gefäßkonvoluts stumpf frei präpariert. Nach dem Anbringen von zwei Haltezügeln wurde der Gefäßast mit einer Irisschere eingeschnitten und der Katheter eingeführt sowie anschließend über die zwei Haltezügel fixiert. Innerhalb der ersten zehn Stunden nach der Entdeckung des Östrus wurde 1 ml rekombinantes porcines TNF-α (entweder 2 ng/ml oder 20 ng/ml TNF-α) in die A. ovarica injiziert. In die kontralaterale A. ovarica erfolgte die Injektion von 1 ml PBS. Die Ovarektomie wurde 45 Minuten nach Injektionsbeginn durchgeführt.
Nach Ovarektomie wurde die Follikelflüssigkeit von vier Graaf-Follikeln pro Ovar für die Untersuchung des Histamingehaltes im Radioimmunoassay aspiriert. Das Ovargewebe wurde in vier Regionen unterteilt. Die Proben für die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurden in Bouin-Lösung fixiert, die qRT-PCR-Proben wurden in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Der Nachweis und die quantitative Bestimmung von Mastzellen erfolgte durch die Färbung nach Pappenheim. Um eine relevante Bezugsgröße für die Mastzelldichte zu erhalten, wurden zunächst die verschiedenen Gewebestrukturen des Ovars quantitativ erfasst. TNF-α-produzierende Zellen und TNF-RI-exprimierende Zellen wurden immunhistochemisch mit anti-TNF-α- und anti-TNF-RI-Antikörper detektiert. Die mRNA-Expression von TNF-α, GM-CSF, TGF-β, IL-10, CXCL8, IL-6, PTGS2 und ALOX5 wurde mithilfe der qRT-PCR untersucht.
In den Ovarien wurden zahlreiche Mastzellen nachgewiesen, die jedoch ausschließlich im Bindegewebe der Zona vasculosa (26% des gesamten Ovargewebes) zu finden waren. Die Mastzelldichte lag im Mittel bei 16,5 bzw. 17,7 Mastzellen/mm2 Bindegewebe der Zona vasculosa und unterschied sich nicht signifikant zwischen behandelten Ovarien und Kontrollovarien. Die Mastzellen exprimierten weder TNF-RI noch TNF-α. TNF-RI wurde in Follikelepithelzellen von Primordial-, Primär- und Sekundärfollikeln sowie in Granulosa- und Thecazellen von Tertiär-/Graaf-Follikeln nachgewiesen. Alle Follikeltypen zeigten in den mit TNF-α behandelten Ovarien eine etwas stärkere Reaktivität, ohne dass der Unterschied das Signifikanzniveau erreichte. Teilweise reagierten Restgelbkörper, Fibroblasten, und Gefäßwände positiv. Des Weiteren waren sowohl in der Zona vasculosa als auch in der Zona parenchymatosa TNF-RI- positive-Einzelzellen zu finden. TNF-α-positive Ovarstrukturen waren die Theca follicularis von Tertiär-/Graaf-Follikeln, geringgradig auch die Gefäßwände.
Wiederum reagierte die Theca follicularis behandelter Ovarien etwas stärker, aber der Einfluss der TNF-α Injektion war nicht statistisch signifikant. Darüber hinaus befanden sich in der Zona vasculosa und in der Zona parenchymatosa TNF-α-positive Makrophagen; diese waren jedoch nur teilweise mit den TNF-RI positiven Einzelzellen ko-lokalisiert.
Histamin war in der aspirierten Follikelflüssigkeit nachweisbar (6,8-13,3 ng/ml). Ein signifikanter Einfluss von TNF-α auf die Histaminkonzentration in der Follikelflüssigkeit war nicht feststellbar.
Zum Zeitpunkt der Ovarektomie wurde im Rahmen der qRT-PCR-Untersuchungen keine mRNA-Expression von GM-CSF, IL-10 und nur geringfügig von ALOX5 gemessen. Die mRNA-Expression von TNF-α, TGF-β, CXCL8, IL-6, ALOX5 und PTGS2 variierte zwischen den Ovarregionen stark. TNF-α-Injektionen führten nicht zu einer signifikanten Modulation der mRNA-Expression der untersuchten Zytokine, des Chemokins und der Enzyme. Tendenziell führte die Applikation von 20 ng/ml TNF-α zu einer Herrunterregulation der TNF-α- und CXCL8-mRNA-Expression und einer leichten Hochregulation der mRNA-Expression von PTGS2. Nach Durchführung einer
Ein Tiermodell zur Untersuchung zytokinvermittelter Effekte auf das Ovar wurde entwickelt.
In der vorliegenden Studie wurde kein direkter Nachweis einer durch Mastzellen vermittelten TNF-α-abhängigen Wirkung auf präovulatorische Follikel bei zyklischen Jungsauen erbracht.
Allerdings ist eine TNF-α-Wirkung auf Mastzellen in präovulatorischen Ovarien des Schweines nicht auszuschließen. Darüberhinaus stehen eine Vielzahl anderer Zellen im Ovar als Zielzellen für TNF-α zur Verfügung. Die selektive tendenzielle Hochregulation des proinflammatorischen PTGS2 und die selektive Herunterregulation anderer proinflammatorischer Mediatoren wie TNF-α und CXCL8 im Ovar nach TNF-α-Applikation spiegeln das Bild einer nicht klassischen inflammatorischen Reaktion wider.
7 Summary
Maren Krüger:
Investigations on TNF-α mediated effects in preovulatory ovaries of gilts
The process of ovulation has been linked to an inflammatory reaction, which includes the infiltration of different leukocyte populations into the tissue of mature Graafian follicles, the activation of resident immune cells and the local production of cytokines. Hypothetically, cytokines produced in the nearby uterus may reach the ovary via a so called counter current transfer, in parts where the uterus vein is neighboured by the arteria ovarica.
The nature of signal transfer is essentially unknown. Signal pathways could involve locally induced cytokines such as TNF-α and GM-CSF by epithelial cells or other cells present in the uterus. In the rat model, TNF-α has been shown to trigger events leading to ovulation. In the present study, we tested the hypothesis that TNF-α reaching the porcine ovary via the arteria ovarica triggers resident mast cells and thereby induces degranulation and mediator secretion which eventually promote preovulatory events.
A bilateral surgical approach in the pig using 14 spontaneous cycling gilts under general anaesthesia was used. Recombinant porcine TNF-α at 2 or 20 ng in one ml was injected into the ovarian artery of one side and PBS into the contralateral side up to 10 h after the detection of oestrus. The ovaries were ectomized 45 min later. Four Graaf follicles from each ovary were aspirated and the follicular fluid was analysed by radio-immunoassay for histamine concentrations. Ovarian tissue was dissected into four regions to be analysed by histology, immunohistochemistry and quantitative RT-PCR. The Pappenheim stain was used for the quantitative analysis of mast cells. To obtain a relevant basis for mast cell density the different tissue structures in the ovary were quantified. Immunohistochemistry was performed using specific anti-TNF-α and anti-TNF-α receptor I antibodies. The mRNA expression of eight chemokines, cytokines and enzymes (TNF-α, GM-CSF, TGF-ß, IL-10, CXCL8, IL-6, PTGS2, lipoxygenase-5) was analysed by qRT-PCR.
Mast cells were only found in connective tissue in the zona vasculosa (26% of all ovarian tissue). The mean density of mast cells /mm2 connective tissue was found to be between 16,5 (control) and 17,7 (treated), respectively. Differences were not statistically significant.
Furthermore, in this study the mast cells expressed neither TNF-α nor TNF-α receptor I, whereas TNF-RI positive structures were found to be follicular epithelium cells of primordial and primary follicles, additionally granulosa and theca cells in tertiary and Graaf-follicles. All stages of follicles stained slightly stronger for the receptor in TNF-α treated ovaries (differences were not significant). In part, regressive corpora lutea, fibroblasts and vessel walls were positive for TNF-RI. Throughout the whole ovary single individual cells were found to be positive as well.
Detection of TNF-α itself was possible, positive structures were the theca follicularis of late stage follicles, and with less intensity blood vessel walls. Structures in treated ovaries were stained more intensively – again differences were not significant. Finally, resident macrophages in both the zona vasculosa and parenchymatosa were found to be positive for TNF-α, in part they could be colocalised with the single cells positive for TNF-RI, mentioned above.
Histamine concentrations in follicular fluids did not differ significantly between treated and control sides (6,8-13.3 ng/mL).
Interestingly the expression of lipoxygenase-5, IL-6, TGF-ß and IL-10 as well as GM-CSF remained unaffected, the latter two showed no expression at all. The mRNA expression of TNF-α, TGF-β, CXCL8, IL-6, ALOX5 and PTGS2 varied between different ovarian regions.
Injections of TNF-α did not result in significantly altered mRNA productions concerning the products investigated here – although we could find by trend a downregulation of TNF-α (induction fold 0.38) and CXCL8 (induction fold 0.43) in the higher dosage group. The only upregulated gene appeared to be PTGS2 (induction fold 2.6; 3695 ± 1856 versus 1406 ± 398 copy numbers).
An in vivo model for delivering cytokine-mediated effects (here: TNF-α) to the porcine ovary was established successfully. In this study no evidence was found for a direct action of mast cell-mediated TNF-α dependent effects on preovulatory follicles of cycling gilts. Nontheless, we cannot rule out, that TNF-α may have influence on preovulatory follicles in the porcine
system - a variety of cells located in ovarian tissue may act as a target for direct TNF-α mediated effects. The selective upregulation of the pro-inflammatory PTGS2 and the selective down-regulation of other pro-inflammatory mediators (TNF-α, CXCL8) caused by TNF-α-application indicates that the ovulatory cascade is not a classical inflammatory response.
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