Quantitative real time PCR (qRT-PCR)

Prinzip der qRT-PCR

Bei der qRT-PCR findet eine Quantifizierung der PCR-Produkte in „Echtzeit“, das heißt während der Amplifikationszyklen statt. In den Reaktionsansätzen befindet sich der Farbstoff SYBR Green, der nach der Anlagerung an die kleine Windung doppelsträngiger DNA grün fluoresziert. Die Fluoreszenz steht dabei in direktem Verhältnis zur Menge der amplifizierten DNA und wird über die gesamte Laufzeit durch die StepOneTM Software Version 2.0 aufgezeichnet. Wie eine konventionelle PCR besteht auch die qRT-PCR aus der Wiederholung der drei Reaktionsschritte: 1) Aufschmelzen der doppelsträngigen DNA, 2) Anlagerung der Primer und 3) Verlängerung des Produkts. Der Ablauf der drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. Eine vollständige PCR umfasst 40 bis 50 Zyklen. In den frühen Zyklen der PCR kommt es lediglich zu einem basalen Fluoreszenzsignal, das auch als Hintergrundsignal bezeichnet wird. In Abhängigkeit von der initialen Menge an DNA im Reaktionsansatz steigt nach einer bestimmten Zyklenzahl die Fluoreszenz des PCR-Produkts exponentiell an. Der Zyklus, an dem die Fluoreszenz aus dem Hintergrundsignal in eine exponentielle Phase übergeht, wird als Cycle threshold (Ct) (Abb.

13, B) bezeichnet und korreliert direkt mit der ursprünglichen Kopienzahl der Proben. Die

exponentielle Phase geht im weiteren Verlauf der PCR aufgrund von Inhibition durch Reaktionsprodukte und Enzymlimitierung zunächst in eine lineare Phase und letztendlich in eine Plateauphase über (Abb. 13, B). Da SYBR Green unspezifisch an jede doppelsträngige DNA bindet, muss nach den Amplifikationszyklen eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden (Abb. 13, A). Dabei werden die Proben schrittweise denaturiert. Abhängig von der Größe der Amplifikationsprodukte zerfallen diese zu einem bestimmten Zeitpunkt und es findet ein schlagartiger Abfall der Fluoreszenz statt. Befinden sich verschiedene Produkte im Reaktionsansatz, wird dies durch eine mehrgipfelige Schmelzkurve sichtbar.

Abb. 13: Schmelzkurve und Amplifikations-Plot einer qRT-PCR.

Dargestellt wurden:

A) die Schmelzkurve von CXCL8 in Abhängigkeit von der Temperatur und B) der Anstieg des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit der PCR-Zyklenanzahl einer Standardverdünnungsreihe von CXCL8 (Amplifikations-Plot).

Primeroptimierung

Die optimale Konzentration von Vorwärts- und Rückwärts-Primern ist je nach Primer und Gerät unterschiedlich. Daher wurden vor der Messung der Proben die optimalen Primer-Konzentrationen für die zu untersuchenden Gene ermittelt. Entsprechend der Matrix aus Abb.

Ausgewählt wurde diejenige Kombination von Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Konzentration, bei der eine höchstmögliche Sensitivität bei niedriger oder fehlender Amplifikation in der Negativkontrolle vorlag.

Rückwärts-Primer (nmol/l)

50 300 900

Vorwärts- Primer (nmol/l) 300

900

Abb. 14: Matrix für die Primeroptimierung.

Kombination der einzelnen Konzentrationen von Vorwärts- und Rückwärts-Primern (nmol/l).

Messung der Ovarproben

In der qRT-PCR wurde die Beeinflussung der Genexpression der Zytokine TNF-α, TGF-β, GM-CSF, IL-6, IL-10, des Chemokins CXCL8 und der Enzyme Prostaglandin-G/H-Synthase-2 und Lipoxygenase-5 in ovariellem Gewebe nach Injektion von TNF-α oder PBS (Kontrolle) getestet. Für die Durchführung wurde der SYBR Green® PCR Master Mix verwendet. Die Proben wurden wie in 3.7 beschrieben extrahiert, auf eine Konzentration von einheitlich 150 ng/µl Gesamt-RNA eingestellt und in cDNA umgeschrieben. Für jede Messung wurden mindestens fünf Punkte der Standardreihe (100 Kopien–10 Kopien) und eine Negativkontrolle (Mastermix + Wasser) eingesetzt. In eine Micro Amp TM Fast 96-well PCR-Platte wurde pro Vertiefung jeweils 1 µl cDNA und 24 µl des entsprechenden Mastermix (Tab. 7, Tab. 8, Tab.

9, Tab. 10, Tab. 11) pipettiert. Alle Ansätze wurden in Duplikaten angelegt. Zu Beginn der PCR wurden die Proben zur vollständigen Denaturierung der DNA einmalig für 10 Minuten auf 95°C erhitzt. Danach erfolgten 40 Zyklen mit je einer Denaturierung der Proben bei 95°C über 15 Sekunden und der Anlagerung der Primer und der Verlängerung des Produkts bei 60°C über 1 Minute. Nach Ablauf der Amplifikationszyklen wurde eine

Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Dabei wurden die Proben von 60°C in Schritten von 0,3°C unter ständiger Aufzeichnung der Fluoreszenz auf 95°C erhitzt.

Tab. 7: Mastermix für TGF-ß.

Reagenz Volumen (µl)

SYBR Green® PCR Master Mix 12,5 Wasser (RNAse-DNAse-frei) 9,75 Vorwärts-Primer (5 µmol/l) 1,5 Rückwärts-Primer (5 µmol/l) 0,25 Tab. 8: Mastermix für GM-CSF, IL-10, IL-6.

Reagenz Volumen (µl)

SYBR Green® PCR Master Mix 12,5 Wasser (RNAse-DNAse-frei) 8,5 Vorwärts-Primer (5 µmol/l) 1,5 Rückwärts-Primer (5 µmol/l) 1,5 Tab. 9: Mastermix für TNF-α, CXCL8.

Reagenz Volumen (µl)

SYBR Green® PCR Master Mix 12,5 Wasser (RNAse-DNAse-frei) 5,5 Vorwärts-Primer (5 µmol/l) 1,5 Rückwärts-Primer (5 µmol/l) 4,5 Tab. 10: Mastermix für Lipoxygenase-5.

Reagenz Volumen (µl)

SYBR Green® PCR Master Mix 12,5 Wasser (RNAse-DNAse-frei) 6,75 Vorwärts-Primer (5 µmol/l) 4,5 Rückwärts-Primer (5 µmol/l) 0,25

Tab. 11: Mastermix für Prostaglandin-G/H-Synthase-2.

Reagenz Volumen (µl)

SYBR Green® PCR Master Mix 12,5 Wasser (RNAse-DNAse-frei) 5,5 Vorwärts-Primer (5 µmol/l) 4,5 Rückwärts-Primer (5 µmol/l) 1,5

Auswertung

Die StepOneTM Software zeichnet die Fluoreszenz von SYBR Green auf und legte für die einzelnen Proben die Ct-Werte fest. Für die eingesetzten Punkte des externen Standards mit bekannter Kopienzahl wurden ebenso die Ct-Werte festgelegt. Durch die logarithmische Darstellung der ermittelten Ct-Werte (Ct) gegen die Kopienzahl der Standardpunkte entstand eine Standardkurve (Regressionsgerade), anhand derer die in den Proben enthaltene Kopienzahl abgeleitet wurde.

Zur Validierung der PCR wurden die Parameter Steigung der Regressionsgraden, Effizienz, Bestimmtheitsmaß (R2) und Güte der Schmelzkurve herangezogen. Aus der von der Software berechneten Steigung der Geraden lässt sich die Effizienz der Amplifikation ermitteln. Bei einer Steigung von -3,32 liegt eine 100%ige Effizienz der Amplifikation vor, das heißt das Produkt verdoppelt sich in jedem Zyklus. Steigungen von -3,1 bis -3,6 (entspricht einer Effizienz von 90-110%) gelten als auswertbar (Abb. 15). Ist die Amplifikation nicht ausreichend effizient, so können die Ausgangsmengen nicht exakt berechnet werden.

Zusätzlich wird von der Software das Bestimmtheitsmaß berechnet. So kann der lineare Zusammenhang zwischen Ct-Werten und eingesetzter Kopienzahl überprüft werden, dabei sollte R2 Werte >0,985 annehmen. Bei der Analyse der Schmelzkurve durfte lediglich ein einzelner Peak auftreten, um sicherzustellen, dass nur ein Produkt amplifiziert wurde (Abb.

13, A). Nur wenn die genannten Parameter den vorgegebenen Kriterien entsprachen, wurden die von der Software nach der Regressionsgerade berechneten Kopienzahlen der unbekannten Proben für die weitere Auswertung verwendet.

Quantity

C

100 10³ 10⁴ 10⁵ 10⁶ 10⁷ 10⁸ 12

14 16 18 20 22 24 28

Abb. 15: Regressionsgerade einer Standardreihe in der qRT-PCR.

Dargestellt sind Messplasmide des Chemokins CXCL1 in den Verdünnungen 1x10³ Kopien bis 1x10⁷ Kopien. Die Ct-Werte (Cycle threshold) sind gegen die Kopienzahlen aufgetragen und ergeben die Regressionsgerade mit der Steigung s = -3,429; einer Effizienz von 93,3% und mit R2 = 0,994.