Anna Wagner
Effekt selektiver und nicht selektiver nicht steroidaler Antiphlogistika auf die Ent-zündungsreaktion von durch Ischämie und Reperfusion geschädigtem equinem Jejunum in vivo
Bereits in vorangegangenen Studien konnte durch Ischämie und Reperfusion eine deutliche Entzündungsreaktion des equinen Jejunums beobachtet werden. Der Effekt selektiver und nicht selektiver nicht steroidaler Antiphlogistika (NSAIDs) auf die Entzündungsreaktion in der Tunica mucosa und in der Tunica muscularis sowie in der Tunica serosa zeigte jedoch uneinheitliche Ergebnisse. Der Einsatz des nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin erbrachte in mehreren Studien das Ergebnis, dass es zu einer Regenerationshemmung der Darmbarriere kommt.
Aufgrund dessen wird über den bisher noch unüblichen Einsatz selektiver NSAIDs in der Koliktherapie des Pferdes diskutiert. In einer vorangegangenen Studie konnte jedoch kein Unterschied bezüglich des Effekts auf die Reduktion der Infiltration neutrophiler Entzündungszellen zwischen dem nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin und dem selektiven NSAID Firocoxib beobachtet werden.
Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von experimentell angelegter Ischämie und sich anschließender Reperfusion zur Simulation einer partiellen Strangulation, welche unter klinischen Bedingungen am häufigsten in Zusammenhang mit der Entwicklung eines Post-operativen Ileus (POI) beschrieben wird, auf die Infiltration der Tunica muscularis des equinen Jejunums mit neutrophilen und eosinophilen Granulozyten qualitativ und quantitativ zu unter-suchen. Des Weiteren sollte der Effekt selektiver und nicht selektiver NSAIDs auf die Ent-zündungszellinfiltration untersucht werden. Zudem erfolgte die Charakterisierung der Cyclooxygenasen-Expression innerhalb der Tunica muscularis nach Ischämie und Reperfusion.
Hierzu wurde der Versuchsaufbau von FRANZ (2013) modifiziert.
Zwölf Warmblutpferde ohne klinische Anzeichen einer gastrointestinalen Erkrankung wurden in Allgemeinanästhesie einer neunzigminütigen partiellen Ischämie und im Anschluss einer dreißigminütigen Reperfusion des mittleren Jejunumabschnittes unterzogen. Die Applikation des nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin (1,1 mg/kg KGW i. v.) und des selektiven NSAID Firocoxib (0,09 mg/kg KGW i. v.) erfolgte im Unterschied zur Studie von FRANZ (2013) 60 Minuten vor Beginn der Ischämie. Es wurden Proben der gesamten Darmwand vor Anlegen der Ischämie, nach der Ischämie und nach der Reperfusion entnommen. Zudem erfolgten weitere Probenentnahmen des ungeschädigten proximalen und distalen Jejunums sowie des Ileums und zweier Kolonlokalisationen im Anschluss an die Reperfusion. Die Darstellung der eosinophilen Granulozyten erfolgte mit Hilfe der histologischen Luna-Färbung. Mittels immunhistochemischer Nachweismethoden erfolgte darüber hinaus die Darstellung der neutrophilen Granulozyten (Calprotectin-Immunhistochemie) und der Cyclooxygenase-1 (COX-1) bzw. Cyclooxygenase-2 (COX-2) exprimierenden Zellen innerhalb der Tunica muscularis und Tunica serosa.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass es nach Ischämie und Reperfusion zu keinem signifikanten Anstieg eosinophiler Granulozyten in den Muskelschichten der Tunica muscularis zu allen Probeentnahmezeitpunkten kam. Damit kann den eosinophilen Granulozyten eine untergeordnete Rolle im ischämischen Entzündungsgeschehen des Jejunums beigemessen werden. In den K-Proben wurden keine neutrophilen Granulozyten nachgewiesen. Die Zahl neutrophiler Granulozyten stieg hingegen in der Longitudinalmuskulatur der Tunica muscularis in den Ischämie-Reperfusions-Proben signifikant im Vergleich zur vor anlegen der Ischämie entnommenen K-Probe an. In der Zirkulärmuskulatur wurden allerdings keine signifikanten Zunahmen dieses Zelltyps beobachtet. Auch in den weiteren Proben des ungeschädigten Jejunums, Ileums und Kolons wurden in der deskriptiven Auswertung deutlich mehr neutrophile Granulozyten in der Longitudinalmuskulatur als in der Zirkulärmuskulatur und insgesamt deutlich mehr neutrophile Zellen im Vergleich zu den K-Proben aus dem Jejunum vor Anlegen der Ischämie beobachtet. Resümierend kann festgehalten werden, dass es in der vorliegenden Untersuchung zu einer generalisierten Entzündungsreaktion kam und die Ergebnisse der vorangegangenen Studie von FRANZ (2013) bestätigt wurden. Ein Effekt der beiden NSAIDs bzw.
ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden NSAIDs auf die neutrophile Zellzahl konnte in der Studie nicht beobachtet werden. Die deskriptive Auswertung der COX-1-Expression zeigte, dass COX-1 bereits konstitutiv in ungeschädigtem Jejunum exprimiert wird. In der Zirkulärmuskulatur wurde im Vergleich zur Longitudinalmuskulatur eine ausgeprägte perinukleäre Reaktion der glatten Muskelzellen zu allen Probezeitpunkten beobachtet. COX-2 bestätigte sich in dieser Studie als induzierbares Enzym und wurde erst in den ischämisch geschädigten Proben exprimiert. Anders als COX-1 exprimierten vor allem andere Zelltypen (wahrscheinlich Fibroblasten, Lymphozyten, Makrophagen) innerhalb der Longitudinal-muskulatur COX-2. Auch in den final entnommenen weiteren Darmproben wurde die Expression von COX-2 in den Zellen durch die ischämische Schädigung des mittleren Jejunumabschnittes induziert.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass eine durch Ischämie und Reperfusion bedingte Ent-zündungsreaktion des equinen Jejunums kein regional begrenzter Prozess ist und dass es zu einer generalisierten Entzündungszellinfiltration mit neutrophilen Granulozyten sowohl in der Tunica muscularis als auch in der Tunica serosa kommt. Inwieweit insbesondere aus der Infiltration der Longitudinalmuskulatur mit neutrophilen Granulozyten ein Zusammenhang zur Entwicklung eines postoperativen Ileus (POI) hergestellt werden kann, sollte in weiteren Untersuchungen evaluiert werden. Der Applikationszeitpunkt der NSAIDs hat keinen Einfluss auf die Reduzierung der Entzündungsreaktion. Es konnte sowohl für das nicht selektive NSAID Flunixin-Meglumin als auch für das selektive NSAID Firocoxib kein Effekt auf die Infiltration mit neutrophilen Granulozyten festgestellt werden. Auch wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den eingesetzten NSAIDs beobachtet. Die vorliegende Studie belegt des Weiteren, dass COX-1 im equinen Jejunum nach ischämischer Schädigung in der Tunica muscularis und Tunica serosa konstitutiv exprimiert wird und die COX-2-Expression durch die ischämische Schädigung induziert wurde.
Anna Wagner
Effect of selective and non-selective non-steroid antiphlogistics on inflammatory reactions in tissue of the equine jejunum damaged by ischaemia and reperfusion, in vivo
In earlier studies it was already observed that ischaemia and reperfusion have a noticable inflammatory effect on the equine jejunum. The effects of selective and non-selective NSAID´s on the inflammatory response of the mucosa and the muscularis externa as well as the serosa only produced inconsistent results. In several studies the use of the non-selective NSAID´s Flunixin Meglumin resulted in an inhibition of regeneration of the intestinal barrier. Based on those studies, the uncommon use of selective NSAID´s for the therapy of horses suffering from colics is discussed in this paper. Previous studies did not show any differences using the non-selective NSAID Flunixin Meglumin and the non-selective NSAID Firocoxib in order to reduce the inflammatory response. The aim of this study is to characterise the inflammatory reactions in tissues of the equine jejunum damaged by ischaemia and reperfusion with the usage of selective and non-selective NSAID´s. The experiments were performed using a modified version of the test set-up from FRANZ (2013).
12 warmblood horses without gastrointestinal conditions underwent an ischaemia for a duration of 90 minutes in general anesthesia followed by a 30 minute long reperfusion of the mid-jejunum. Samples were taken from the jejunum wall before the ischaemia, after the ischaemia and after the reperfusion. Additionally, further samples were taken in untreated areas of the jejunum and colon after the reperfusion. The application of the non-selective NSAID´s Flunixin Meglumin (1,1 mg/kg bodyweight i. v.) and the selective NSAID Firocoxib (0,09 mg/kg bodyweight i. v.) were conducted in distinction from FRANZ (2013) 60 minutes before the ischaemia started. The illustration of eosinophilic granulocytes was performed using a histological coloring (LUNA). Using the immunohistochemical reference methods neutrophilic granulocytes and COX-1 / COX-2 the presenting cells were illustrated.
The results showed that there was no increase in the amount of eosinophilic granulocytes at any given time after the ischaemia and the reperfusion. Therefore eosinophilic granulocytes may not have a significant role in this type of intestinal inflammatory processes. The number of neutrophilic granulocytes increased significantly in the muscular and serous membrane of the ischaemia-reperfusion treated samples and the samples of the untreated areas taken from the jejunum and the colon in comparison to the control sample. An effekt of both NSAID´s on the number of cells was not observed. Therefore an inflammatory response is possibly not linked to NSAID´s after all. In the descriptive evaluation of COX-1 and COX-2 presenting cells within the muscularis externa and serosa, a distinct perinuclear reaction of the COX-1 and COX-2 presenting muscle cells was observed in the circular layer in contrast to the longitudinal layer.
Other COX-1 and COX-2 presenting celltypes (possibly fibroblasts, lymphocytes and macrophages) were noticed especially in the longitudinal layer and serosa.
The results of this study show that inflammatory reactions caused by ischaemia and reperfusion in the equine jejunum are not a local process and an inflammatory infiltration takes place not only in the serosa but also in the muscularis externa. To what extent a link to the development of a POI is given, needs to be evaluated in future experiments. There were no effects of the non-selective NSAID Flunixin Meglumin or the non-selective NSAID Firocoxib on the infiltration with neutrophilic granulocytes ascertained. In addition, no significant differences between the NSAID´s were observed. The application time of NSAID´s has no influence on the reduction of the inflammatory reaction. This study also shows that the COX-1 expression in the muscular and serous membrane is constitutiv and the COX-2 expression is being induable.